Name: Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj bardzo czułą metodę qRT-PCR do pomiaru przyłączania cząstek arenavirusa do komórek Vero E6. Technika umożliwia ilościowe badanie zakażenia wirusowego i mechanizmów wnikania wirusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Markusowi Thali, Nathanowi Royowi, Christopherowi Zieglerowi, Emily Bruce i Benjaminowi Kingowi za pomocne dyskusje, a także National Institutes of Health za wsparcie tych badań poprzez granty T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB) i P20RR021905 (JB).

Uwaga: Niezwykle ważne jest, aby opisany protokół był przeprowadzany przy użyciu ścisłej techniki pre-PCR (patrz 28, aby uzyskać doskonały przegląd tego, jak założyć laboratorium pre-PCR i jak przeprowadzać eksperymenty przy użyciu dobrej techniki pre-PCR). Konieczne jest, aby wszystkie odczynniki i sprzęt były wolne od amplifikowanego DNA zawierającego sekwencję docelową qPCR oraz aby istniały odpowiednie kontrole w celu wykrycia takiego zanieczyszczenia. Przegląd protokołu przedstawiono na rysunku 1.
1. Przygotuj pożywkę i komórki nasienne na płytkach 48-dołkowych
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml kompletnego roztworu buforowego Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny i 1% roztworu buforowego HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy), dodając 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i po 5 ml 100 x roztworu buforowego penicyliny-streptomycyny i 100 x roztworu buforowego HEPES do 500 ml DMEM. Odczynnik ten może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy.</li>
	<li>Wysiew 2,5 x 104 komórek Vero E6 na basenik na 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w końcowej objętości 500 μl kompletnego DMEM. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze zawierającym 5% CO2 przez 10 do 18 godzin.
	<ol>
		<li>Wysiewaj talerz pod koniec dnia pracy. Przetestuj każdą próbkę wirusa w zduplikowanych lub potrójnych studzienkach. 
		Uwaga: Chociaż opisana jest platforma oparta na 48 dołkach dla tego testu, powinno być możliwe zmniejszenie skali testu do użycia na płytkach 96- lub 384-dołkowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przeprowadzanie dołączania komórek wirusa
Uwaga: Wirus użyty w tym protokole, szczep JUNV Candid #1 (C#1), został z powodzeniem wykorzystany jako żywa atenuowana szczepionka w celu zapobiegania chorobie JUNV29. JUNV C#1 został uzyskany ze zjadliwego szczepu JUNV XJ poprzez szeregowe pasaż zarówno in vivo, jak i in vitro i różni się od rodzicielskiego szczepu XJ o 12 aminokwasów30. Ponieważ JUNV C#1 jest patogenem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2, prace opisane w tej sekcji muszą być wykonywane przy użyciu odpowiednich praktyk BSL-231. Obejmuje to stosowanie środków ochrony osobistej (np. ochrony oczu, fartuch laboratoryjny, podwójne rękawice), komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II oraz zapewnienie, że cały personel przeszedł szkolenie instytucjonalne i uzyskał zezwolenia wymagane do bezpiecznego obchodzenia się z tym organizmem.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć próbkę (próbki) JUNV C#1 do pożądanych PFU lub jednostek tworzących ognisko w lodowato kompletnym DMEM i przechowywać na lodzie do momentu, gdy będą gotowe do dodania do każdej studzienki. 
	Uwaga: Jako alternatywę dla prowadzenia badań wiązania z wirusem rozcieńczonym w kompletnym DMEM, należy użyć minimalnej pożywki zawierającej PBS o obniżonym stężeniu w surowicy (2%) i odpowiednim buforze w celu ustalenia, czy surowica może powodować zakłócenia w przyłączaniu się wirusa. Podobne protokoły przyłączania dla alternatywnych wirusów donosiły o użyciu pożywki RPMI 1640 bez wodorowęglanu, zawierającej 0,2% albuminy surowicy bydlęcej, 10 mM (kwas 2-(morfolino)etanosulfonowy) i 10 mM HEPES, pH 6,832. Ten środek wiążący może być lepszy, aby zapobiec zmianom pH, które mogą wystąpić, gdy pożywka jest usuwana ze środowiska CO2 w inkubatorze.
	<ol>
		<li>Zaszczepij studzienki PFU w zakresie od 200 do 2,000, aby ograniczyć nieproduktywne zdarzenia przyłączeniowe. Jak pokazano na rysunku 2, test ten jest w stanie wykryć przyłączenie przy użyciu zaledwie 20 PFU (lub aż 2 x 106 PFU).</li>
		<li>Stwórz główną mieszankę wirusa do zaszczepienia na komórkach. Każda próbka wirusa zostanie zaszczepiona do zduplikowanych studzienek w objętości 50 μl na studzienkę. Dlatego, jeśli pożądane jest dodanie 2 000 PFU wirusa na studzienkę, należy rozcieńczyć 4 800 PFU do całkowitej objętości 120 μl lodowatego kompletnego DMEM.
		<ol>
			<li>Aby kontrolować specyficzność testu, należy użyć dopasowanej pary linii komórkowych jajnika chomika chińskiego, które albo nie wyrażają TfR1 (TRVb), albo wyrażają hTfR1 (TRVb-1), ponieważ przyłączenie JUNV do tych komórek powinno być albo zmniejszone, albo nie, odpowiednio13,33. Alternatywnie, potraktuj komórki proteazą, taką jak proteinaza K, aby zapobiec przyłączeniu arenawirusa34 lub wpisowi35. Można również wziąć pod uwagę rozpuszczalny hTfR1 lub przeciwciało jednookrężnicze ch128.1, które jest specyficzne dla hTfR1, ponieważ wiadomo, że blokują one wejście JUNV do komórek13,36. Dodatkowo, wstępne traktowanie komórek wolną mannozą14 lub inkubacja cząstek z przeciwciałami neutralizującymi specyficznymi dla JUNV37 może zahamować wnikanie wirusa.</li>
			<li>Należy jednak pamiętać, że te ostatnie odczynniki i podejścia, pomimo blokowania wejścia do JUNV, nie zostały potwierdzone w celu zablokowania przyłączenia, chociaż jest to prawdopodobne wyjaśnienie. Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do formalnego określenia, czy te różne podejścia wpływają na przyłączanie wirionu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć płytki z inkubatora o temperaturze 37 °C i umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C lub na lodzie na 15 minut, aby zahamować zdolność posianych komórek do przeprowadzania endocytozy.</li>
	<li>Następnie odessać cały DMEM z każdej studzienki i szybko przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie za pomocą 100 μl lodowatego PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) o pH 7,4. Następnie dodać 50 μl wstępnie rozcieńczonych próbek wirusa (przygotowanych w kroku 2.1) do odpowiednich studzienek.</li>
	<li>Zawiń talerz w folię spożywczą i natychmiast umieść go z powrotem na lodzie lub w lodówce o temperaturze 4 °C na 1 do 1,5 godziny, aby umożliwić przyczepienie się wirusa. Na tym etapie utrzymuj płytkę, bufor do płukania i próbki wirusa w niskiej temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji w temperaturze 4 °C, odessać inokulum wirusa i przemyć każdą studzienkę 3 razy 200 μl lodowatego PBS.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja wirusowego RNA
<ol>
	<li>Oczyść wirusowe RNA z cząstek JUNV C#1 przyczepionych do monowarstw za pomocą zestawu komercyjnego (np. zestawu RNeasy Mini) zgodnie z protokołem producenta. W szczególności postępuj zgodnie z "oczyszczaniem całkowitego RNA z komórek zwierzęcych przy użyciu protokołu technologii spinowej" na stronach 23-28 w RNeasy Mini Handbook (4 wydanie, kwiecień 2006) z modyfikacjami wymienionymi poniżej.
	<ol>
		<li>Poddać komórki lizie zgodnie z zaleceniami w kroku 1B, dodając 350 μl buforu do lizy RLT bezpośrednio do każdej studzienki. Wymieszaj bufor kilka razy, aby zapewnić lizę komórek. Należy pamiętać, że komórki łatwo ulegają lizie w tym buforze, a całkowitą lizę można zweryfikować, oglądając studzienki pod odwróconym mikroskopem.</li>
		<li>Przenieś powstały lizat komórkowy do kolumny zestawu (krok 3a) i postępuj zgodnie z resztą protokołu zgodnie z opisem. W tym momencie wirus został zneutralizowany przez bufor do lizy, więc pozostałe etapy protokołu można wykonać poza komorą bezpieczeństwa biologicznego klasy II, pod warunkiem, że probówki zestawu nie były zanieczyszczone zakaźnym wirusem.</li>
		<li>Uwzględnij opcjonalny krok 9 z protokołu producenta, który polega na dodatkowym odwirowaniu kolumny wirującej w celu wyeliminowania ewentualnego przeniesienia buforowego RPE.</li>
		<li>W ostatnim etapie zgodnie z protokołem producenta (krok 10) wymyj oczyszczony RNA z kolumny wirowej przy użyciu 30 μl ddH2O. Przechowuj RNA w temperaturze -80 °C w tym momencie lub użyj bezpośrednio w teście qRT-PCR. Aby zapobiec degradacji oczyszczonych próbek wirusowego RNA przez nukleazy, należy używać odczynników i sprzętu bez nukleaz i przechowywać rozmrożone próbki RNA na lodzie. 
		Uwaga: RLT i RW1 zawierają sól guanidyny i nie należy ich mieszać z wybielaczem. Bufor RW1 zawiera etanol.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar genomu wirusa metodą qRT-PCR
<ol>
	<li>Aby przekształcić RNA segmentu JUNV C#1 S w cDNA w celu późniejszego qPCR, należy poddać wirusowe RNA (wygenerowane w kroku 3.1.4) RT w całkowitej objętości 50 μl.
	<ol>
		<li>Aby ustawić reakcję RT, najpierw utwórz mieszaninę główną zawierającą każdy z następujących odczynników na reakcję: 6,75 μl wolnego od nukleaz ddH2O, 5 μl 2 μM zapasu startera RT S 2098- do 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3'), który jest komplementarny do regionu NP genomowego RNA segmentu S, 5 μl buforu 10X PCR II, 11 μl roztworu 25 mM MgCl2, 1,25 μl (62,5 jednostki) enzymu RT, 1 μl (0,4 jednostki) inhibitora RNazy i 10 μl 500 μM zapasu dNTPs. 
		Uwaga: W trakcie replikacji arenawirusa generowane są 4 gatunki wirusowego segmentu S: genomowy RNA o pełnej długości (vRNA), antygenomiczny RNA o pełnej długości (vcRNA) (czyli odwrotne dopełnienie vRNA) oraz dwa subgenomowe mRNA kodujące odpowiednio geny NP i GP. Wymieniony tutaj starter RT jest specyficzny tylko dla vRNA segmentu S, ale nie dla vcRNA, NP mRNA lub mRNA GP.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać główną mieszankę RT, a następnie podaszkę 40 μl do pojedynczych probówek PCR o pojemności 0,2 ml. Dodaj 10 μl wirusowego RNA do każdej probówki. Obejmują i) probówkę kontrolną bez matrycy (np. dodać 10 μl ddH2O bez nukleaz do 40 μl mieszanki wzorcowej) oraz ii) kontrolę enzymu bez RT (np. dodać 10 μl znanej dodatniej próbki wirusowego RNA do 40 μl mieszanki wzorcowej, która nie otrzymała żadnego enzymu RT) w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem zanieczyszczenia odczynników RT amplifikowanym DNA zawierającym docelową sekwencję wirusa. Dołącz RNA wyekstrahowane z niezakażonych komórek z pełną mieszanką główną RT w celu kontroli swoistości testu w obecności komórkowego RNA.</li>
		<li>Dodatkowo należy dołączyć znaną dodatnią próbkę wirusowego RNA do pełnej mieszanki wzorcowej, aby zweryfikować jakość odczynników RT. Należy pamiętać, że objętość reakcji RT można w razie potrzeby zmniejszyć do 25 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj probówki RT następującym warunkom cyklicznym: 25 °C przez 10 minut, 48 °C przez 30 minut i 95 °C przez 5 minut. Należy pamiętać, że próbki można w tym momencie przechowywać w temperaturze -20 °C lub pozostawić na noc w termocyklerze, dodając co 4 °C.</li>
	<li>Wykonać qPCR w całkowitej objętości 25 μl.
	<ol>
		<li>Sporządzić główną mieszankę qPCR, łącząc następujące elementy: 2,5 μl (z 9 μM zapasu) każdego startera do PCR od S1937+ do 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3') i startera do odwróconego PCR S 2001- do 1982- (5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 μl (z 2 μM) sondy qPCR S 1960+ do 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'), i 12,5 μl uniwersalnej mieszanki masterowej qPCR 2X. Należy zauważyć, że opisany tutaj starter do przodu, który jest specyficzny dla JUNV C#1, różni się o 1 nt od pierwotnie zgłoszonej sekwencjistartera 38, która jest ukierunkowana na zjadliwy szczep JUNV Romero.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj roztwór, a następnie dodaj 20 μl do każdego dołka qPCR. Dodać 5 μl każdej reakcji RT do odpowiednich studzienek qPCR. Przeprowadzić qPCR w trzech egzemplarzach dla każdej badanej próbki. Należy pamiętać, że objętość reakcji PCR można w razie potrzeby zmniejszyć nawet do 12,5 μl. 
		Uwaga: Oprogramowanie powiązane z maszyną qPCR wygeneruje bezwzględną liczbę kopii genomowego RNA segmentu JUNV C#1 S, porównując wartość każdej nieznanej próbki z serią standardowych rozcieńczeń plazmidu kodującego gen JUNV C#1 NP, który jest celem startera qPCR i zestawu sondy. Test qPCR może zapewnić ilościowe określenie ilościowe tylko dla wartości, które mieszczą się w zakresie krzywej wzorcowej. Z tego powodu należy uwzględnić następujące ilości plazmidu (w trzech studzienkach): 5, 50, 5 x 103, 5 x 105 i 5 x 107 kopii na studzienkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załadować płytkę qPCR do termocyklera i uruchomić następujące warunki reakcji: 95 °C przez 10 minut i 40 cykli po 95 °C przez 15 sekund i 60 °C przez 1 minutę.
	<ol>
		<li>Zbierz i przeanalizuj dane, aby określić ilość wirusowego RNA obecnego w każdej próbce zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ustalić krzywą wzorcową przy użyciu nowo oczyszczonej próbki plazmidu zawierającej sekwencję docelową qPCR, najpierw określ liczbę kopii plazmidu w tym roztworze.
	<ol>
		<li>Oblicz masę cząsteczkową plazmidu. Jeśli znana jest sekwencja całego plazmidu, oblicz ją za pomocą następującego wzoru: MW = ([A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13). Pamiętaj, aby podać całkowitą liczbę określonego nukleotydu znajdującego się na każdej nici dwuniciowego plazmidu.</li>
		<li>Jeśli rozmiar plazmidu jest znany, ale jego dokładna sekwencja nie jest znana, oblicz MW przy założeniu, że każda para zasad dsDNA ma MW 600, 
		Uwaga: Zastosowany tutaj plazmid pCAGGS-JUNV C#1 NP ma MW 4,2 x 106.</li>
		<li>Po określeniu MW plazmidu należy obliczyć, ile kopii na μl jest obecnych w podstawowym roztworze plazmidu.</li>
		<li>Najpierw oblicz całkowity μg plazmidu w roztworze, a następnie przelicz go na mole plazmidu (np. jeśli 69 μg plazmidu zawiera się w 300 μl wody, to 6,9 x 10-5 g plazmidu * 1 mol/4,2 x 106 g plazmidu = 1,6 x 10-11 moli plazmidu), które można przekształcić na liczbę kopii (np. 1,6 x 10-11 moli plazmidu * 6,022 x 1023 cząsteczki/mol = 9,8 x 1012 cząsteczek (lub kopii)).</li>
		<li>Podziel całkowitą liczbę kopii plazmidu w roztworze plazmidu przez objętość tego roztworu, aby uzyskać kopie na μl (np. 9,8 x 1012 kopii/300 μl = 3,28 x 1010 kopii).</li>
		<li>Rozcieńczyć ten roztwór odpowiednio, tak aby na płytkę PCR można było nabrać objętości 5 μl w celu uzyskania zakresu liczby kopii potrzebnej do wyznaczenia krzywej wzorcowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Childs, J. C., Peters, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChilds%2C+JC+%22The+Arenaviridae%22">The Arenaviridae</a>. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).</li>
<li>Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+reservoirs+of+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mammalian reservoirs of arenaviruses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).</li>
<li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).</li>
<li>Parodi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sobre+la+etiologia+del+brote+epidemico+de+Junin+%28Nota+previa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dia+Medico%22%5BJournal%5D)">Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa).</a> Dia Medico. 30, (1958).</li>
<li>Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lassa+fever%2C+a+new+virus+disease+of+man+from+West+Africa.+I.+Clinical+description+and+pathological+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).</li>
<li>Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Lymphocytic+Choriomenigitis+Virus%22">Lymphocytic Choriomenigitis Virus</a>. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).</li>
<li>Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+choriomeningitis+virus%3A+emerging+fetal+teratogen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).</li>
<li>Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFischer%2C+SA+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 354, 2235-2249 (2006).</li>
<li>Palacios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).</li>
<li>Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arenaviruses%3A+genomic+RNAs%2C+transcription%2C+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).</li>
<li>Meyer, B. J., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+heterogeneity+in+the+termini+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+genomic+and+antigenomic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs.</a> J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).</li>
<li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10, e0120043(2015).</li>
<li>Radoshitzky, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+1+is+a+cellular+receptor+for+New+World+haemorrhagic+fever+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses.</a> Nature. 446, 92-96 (2007).</li>
<li>Martinez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+human+DC-SIGN+and+L-SIGN+for+entry+and+infection+of+host+cells+by+the+New+World+arenavirus%2C+Junin+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).</li>
<li>Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Junin+arenavirus+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Junin arenavirus cell entry.</a> J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).</li>
<li>Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+cellular+proteins+in+Junin+arenavirus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry.</a> Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).</li>
<li>Nunberg, J. H., York, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Curious+Case+of+Arenavirus+Entry%2C+and+Its+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition.</a> Viruses. 4, 83-101 (2012).</li>
<li>Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBotten%2C+J+%22Viral+Hemorrhagic+Fevers%22">Viral Hemorrhagic Fevers</a>. , CRC Press. 233-260 (2013).</li>
<li>Klaus, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+cargo+receptor+ERGIC-53+is+required+for+the+production+of+infectious+arenavirus%2C+coronavirus%2C+and+filovirus+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles.</a> Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).</li>
<li>Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+entry+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).</li>
<li>Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+screen+for+genes+that+affect+Junin+virus+entry+uncovers+voltage-gated+calcium+channels+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target.</a> Sci Transl Med. 5, 204ra131(2013).</li>
<li>Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+superinfection+of+Vero+cells+persistently+infected+with+Junin+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus.</a> Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).</li>
<li>Brandenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+poliovirus+entry+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging poliovirus entry in live cells.</a> PLoS Biol. 5, e183(2007).</li>
<li>Petersen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Major+Cellular+Sterol+Regulatory+Pathway+Is+Required+for+Andes+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection.</a> PLoS pathogens. 10, e1003911(2014).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+studies+of+virus+interaction+at+the+host+cell+surface+using+enteroviruses+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR.</a> Virol J. 6, 217(2009).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+attachment+mediated+by+apolipoprotein+E+binding+to+cell+surface+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate.</a> J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).</li>
<li>Shannon-Lowe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-induced+B-cell+transformation%3A+quantitating+events+from+virus+binding+to+cell+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth.</a> J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).</li>
<li>Mifflin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+up+a+PCR+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Setting up a PCR laboratory.</a> CSH Protoc. 2007, pdb top14(2007).</li>
<li>Maiztegui, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+a+live+attenuated+vaccine+against+Argentine+hemorrhagic+fever.+AHF+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group.</a> J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).</li>
<li>Goni, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+features+of+attenuated+Junin+virus+vaccine+strain+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate.</a> Virus Genes. 32, 37-41 (2006).</li>
<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChosewood%2C+LC+%22Biosafety+in+microbiological+and+biomedical+laboratories%22">Biosafety in microbiological and biomedical laboratories</a>. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).</li>
<li>White, J., Matlin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fusion+by+Semliki+Forest%2C+influenza%2C+and+vesicular+stomatitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses.</a> J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).</li>
<li>McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+human+transferrin+receptor+cDNA+in+Chinese+hamster+ovary+cells+deficient+in+endogenous+transferrin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor.</a> J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).</li>
<li>Borrow, P., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-binding+protein%28s%29%3A+a+candidate+cellular+receptor+for+the+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus.</a> J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).</li>
<li>Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+cellular+receptors+for+the+South+American+hemorrhagic+fever+viruses+Junin%2C+Guanarito%2C+and+Machupo%5BTitle%5D)+AND+%22346%22%5BJournal%5D)">Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo.</a> 346. , 476-491 (2006).</li>
<li>Helguera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+recognizing+the+apical+domain+of+human+transferrin+receptor+1+efficiently+inhibits+the+entry+of+all+new+world+hemorrhagic+Fever+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses.</a> J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).</li>
<li>Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junin+virus+monoclonal+antibodies%3A+characterization+and+cross-reactivity+with+other+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses.</a> J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).</li>
<li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses%2C+arenaviruses%2C+and+New+World+hantaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).</li>
<li>Helenius, A., Marsh, M., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Semliki+forest+virus+penetration+by+lysosomotropic+weak+bases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases.</a> J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).</li>
<li>Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+membrane+fusion+and+nucleocapsid+delivery+into+the+cytoplasm+are+distinct+events+in+some+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses.</a> PLoS pathogens. 9, e1003585(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany przez nas protokół jest prosty i solidny, pod warunkiem że przestrzegane są następujące krytyczne względy. Po pierwsze, należy zastosować ścisłą technikę pre-PCR (patrz 28 w celu uzyskania doskonałej recenzji). Konieczne jest, aby wszystkie odczynniki i sprzęt były wolne od amplifikowanego DNA zawierającego sekwencję docelową qPCR oraz aby istniały odpowiednie kontrole w celu wykrycia takiego zanieczyszczenia. Po drugie, w przypadku części protokołu dotyczącej przyłączania się wirusa do komórki, wirus,...

Arenawirusy to rodzina otoczkowych, jednoniciowych wirusów RNA, które występują głównie u gryzoni w naturze1-3. Podczas gdy wirusy te zazwyczaj wywołują bezobjawową, uporczywą infekcję w rezerwuarach gryzoni1,2, mogą powodować ciężką chorobę u ludzi3. Do ważnych gatunków chorobotwórczych należą wirus Junin z Nowego Świata (JUNV)4 i wirus Lassa ze Starego Świata5, które są czynnikami etiologicznymi odpowiednio argentyńskiej gorączki krwotocznej w Ameryce Południowej i gorączki Lassa w Afryce. Wirus limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV), prototypowy wirus z rodziny6, występuje na całym świecie i jest odpowiedzialny za różne stany chorobowe, w tym aseptyczne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u osób immunokompetentnych6, poważne wady wrodzone u rozwijającego się płodu7 lub wysoką śmiertelność u osób z obniżoną odpornością po przeszczepieniu narządów litych8,9. Brak szczepionek zatwierdzonych przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) lub skutecznych leków przeciwwirusowych do zwalczania tych wirusów podkreśla krytyczną potrzebę opracowania nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na te pojawiające się/ponownie pojawiające się patogeny.
Genom arenawirusa składa się z dwóch jednoniciowych segmentów RNA, dużego (L) (~7,2 kb) i małego (S) (~3,6 kb) segmentu10. Segment S koduje nukleoproteinę wirusa (NP) i glikoproteinę otoczki (GP), podczas gdy segment L koduje polimerazę wirusa (L) i białko macierzy (Z). Segmenty genomowego RNA L i S (vRNA) są upakowane w wiriony10-12. Początkowym etapem zakażenia arenawirusem jest przyłączenie cząstek wirusa do komórek gospodarza poprzez interakcję między wirusowym GP a odpowiadającymi mu receptorami komórek gospodarza, które w przypadku JUNV obejmują ludzki receptor transferyny 1 (hTfR1)13,14. Po przyłączeniu cząsteczki JUNV są wprowadzane do komórki przez endocytozę za pośrednictwem klatryny15. Cząstki następnie przemieszczają się do późnego endosomu, gdzie niskie pH tego przedziału wyzwala aktywację GP16,17. Po aktywacji peptyd fuzyjny kodowany przez GP wprowadza się do błony endosomalnej, inicjując fuzję między błoną wirusową i endosomalną. Udana fuzja powoduje uwolnienie vRNA upakowanych w wirion do cytoplazmy, gdzie służą one jako matryce do replikacji genomowej i transkrypcji. Gdy wytworzone zostaną wystarczające ilości białek strukturalnych wirusa i vRNA, nowe cząsteczki gromadzą się i pączkują z zainfekowanej komórki, aby zakończyć cykl życiowy18.
Aby ułatwić odkrywanie nowych strategii terapeutycznego zwalczania patogennych arenawirusów, nasza grupa skupiła się na identyfikacji czynników gospodarza, które są krytyczne dla rozprzestrzeniania się wirusa, ale są zbędne dla gospodarza. W tym kontekście określenie dokładnego etapu (etapów) cyklu życiowego wirusa kontrolowanego przez takie czynniki gospodarza jest niezbędne do ukierunkowania rozwoju strategii przeciwwirusowych. W niniejszym artykule opisujemy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR, który można wykorzystać do pomiaru przyłączenia arenawirusa do komórki w celu określenia, czy wybrane białka gospodarza i / lub cząsteczki przeciwwirusowe wpływają na ten początkowy etap wnikania wirusa19. Alternatywne podejścia do pomiaru przyłączenia arenawirusa do komórek obejmowały wiriony znakowane biotyną20, barwnikami fluorescencyjnymi21 lub izotopami promieniotwórczymi22. Wady tych metod mogą obejmować wymóg stosowania dużych ilości wirusa wejściowego (np. duża wielokrotność infekcji (MOI)), użycie radioaktywności i/lub dodatkowe kroki w celu przygotowania wirusa wejściowego (np. stężenie i/lub znakowanie wirusa). W szczególności stosowanie wysokiego MOI utrudnia rozróżnienie produktywnych i nieproduktywnych zdarzeń związanych z przywiązaniem15,23. Opisany tutaj test oparty na qRT-PCR może wykryć zdarzenia przyczepiania przy użyciu zaledwie 20 jednostek tworzących płytkę (PFU) wirusa, co przekłada się na MOI 0,0004 dla płytki 48-dołkowej. W związku z tym silna czułość testu przewyższa wymóg wysokiego MOI, a także wszelkich etapów znakowania wirusa lub koncentracji. Ponadto test może być i) dostosowany do pomiaru endocytozy wirionu, a także uwalniania genomu wirusa do cytoplazmy po fuzji oraz ii) dostosowany do stosowania z innymi wirusami poprzez opracowanie specyficznych dla wirusa odczynników qRT-PCR (na przykład, patrz 24-27).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>100x</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES Life</td><td>Technologies</td><td>15630-130</td><td>100x</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>1x</td></tr><tr><td>komórki Vero E6</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>nie mieszaj RLT lub&nbsp; RW1 z wybielaczem</td></tr><tr><td>Homogenizator QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>Multiscribe Odwrotna transkryptaza (50U/&mikro; l)</td> <td>Life Technologies</td><td>4311235</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina dNTP (10 mM; 2,5 mM każdy dNTP)</td> <td>Life Technologies</td><td>N808-0260</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp 10X PCR Buffer II i 25 mM roztwór MgCl2</td> Life <td>Technologies</td><td>N808-0010</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy (5000U/100 &micro; l)</td> <td>Podkład Life Technologies</td><td>N808-0119</td><td></td></tr><tr><td>RT 5'-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>250 nmol DNA oligo</td><td>standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>Forward qPCR starter&nbsp; 5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standardowe odsalanie</td></tr><tr><td>Odwrócony starter qPCR 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standardowa sonda odsalania</td></tr><tr><td>TaqMan 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'</td><td>Life Technologies</td><td>4316033</td><td>Oczyszczona</td></tr><tr><td>HPLC 96-dołkowa płytka reakcyjna MicroAmp Fast Optical (0,1 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>System StepOnePlus do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Life Technologies</td><td>4376598</td><td>lub inny instrument qPCR</td></tr></tbody></table>

bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenawirusy to rodzina wirusów otoczkowych RNA, które powodują poważne choroby u ludzi. Pierwszym krokiem w cyklu życiowym arenawirusa jest przyłączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Podczas gdy przyłączenie wirusa do komórki można zmierzyć za pomocą wirionów znakowanych biotyną, izotopami radioaktywnymi lub barwnikami fluorescencyjnymi, podejścia te zazwyczaj wymagają dużej wielokrotności infekcji (MOI), aby umożliwić wykrycie związanego wirusa. Opisujemy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR, który mierzy przyłączenie szczepu wirusa Junin Candid 1 poprzez ilościowe oznaczanie genomowego RNA wirusa upakowanego w wirion. Test ten ma kilka zalet, w tym wyjątkową czułość i zdolność do pomiaru przyłączenia w szerokim zakresie dynamicznym MOI bez konieczności oczyszczania lub znakowania wirusa wejściowego. Co ważne, podejście to można łatwo dostosować do stosowania z innymi wirusami dzięki zastosowaniu specyficznych dla wirusa odczynników qRT-PCR. Co więcej, test ten można zmodyfikować, aby umożliwić pomiar endocytozy cząstek i odsłaniania genomu. Podsumowując, opisujemy prosty, ale solidny test do bardzo czułego pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa.

Aby zademonstrować czułość i zakres dynamiczny testu qPCR, znane ilości plazmidu kodującego gen NP JUNV C#1 (zakres 5-5 x 107 kopii) poddano analizie qPCR zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu. Test jest czuły i pozwala na niezawodne wykrycie nawet 5 kopii docelowego kwasu nukleinowego (Rycina 2). Co więcej, zakres dynamiczny testu jest szeroki i, jak pokazano na Rycynie 2, może obejmować co najmniej 7 rzędów wielkości matrycy. Choć nie przedst...

Pierwszym krokiem w cyklu życia arenawirusa jest dołączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Przedstawiamy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR do ultraczułego wykrywania i ilościowego oznaczania zdarzeń związanych z przyłączeniem arenawirusa.

Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ilościowe pomiar przyłączania cząsteczek arenawirusów do komórek gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka czułość. Może ona zostać również dostosowana do pomiaru endocytozy wirionów, a także uwalniania genomu do cytoplazmy po fuzji.Aby rozpocząć, w celu przygotowania pełnej pożywki DMEM, do butelki o pojemności 500 ml DMEM należy dodać 50 ml inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej oraz po 5 ml 100X penicyliny-streptomycyny i 100X buforu HEPES. Na koniec dnia, w 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, należy wysiać komórki Vero E6 w zagęszczeniu 2,5 × 10⁴ komórek na dołek, w trzech powtórzeniach dla każdego wirusa, w końcowej objętości 500 µL pełnej pożywki DMEM. Płytkę należy inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2 przez okres od 10 do 18 godzin.W komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy 2, używając schłodzonej do temperatury lodu pożywki DMEM, rozcieńcz próbki wirusa Junin Candid 1 przeznaczone do badań do stężenia od 200 do 2 000 jednostek tworzących ogniska lub jednostek tworzących plaki. W dalszej części protokołu jednostki tworzące plaki będą określane jako PFU. Na przykład, aby

highly-sensitive-assay-for-measurement-of-arenavirus-cell-attachment

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Klaus, J. P. et al. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the extraction of viral RNA from surface-bound virions on epithelial cells using silica spin columns. The method includes chemical lysis, RNA stabilization, and membrane-based purification for downstream quantification of virus-cell attachment.

Extraction of Viral RNA from Surface-Bound Virions Using a Silica Spin Column

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

W tym filmie demonstrujemy test kolorymetryczny in vitro do wykrywania obecności przeciwciał neutralizujących przeciwko wektorom rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 6 (rAAV6) w próbkach surowicy owczej. Test wykorzystuje reakcję między AAV kodującym ludzki gen fosfatazy alkalicznej łożyska a jego substratem w celu wytworzenia nierozpuszczalnego fioletowego produktu.

Test przeciwciał neutralizujących AAV na bazie komórek: technika kolorymetryczna do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko specyficznym wirusom związanym z adenowirusami w surowicy

Ten film demonstruje test przyczepiania wirusów do badania przesiewowego związków przeciwwirusowych. Wykorzystując genetycznie zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C i lucyferazy, ocenia hamujący wpływ na przyłączanie się wirusa, na co wskazuje niższe natężenie światła w studzienkach poddanych działaniu kooperacji w porównaniu ze studzienkami leczonymi samym wirusem.

Test przyłączania wirusa do badań przesiewowych związków przeciwwirusowych

Ten film demonstruje test do oceny środków przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na określone etapy wnikania wirusa do komórek gospodarza i fuzji z endosomem. Komórki są inkubowane w niskiej temperaturze, a następnie zakażone HCV. Niska temperatura umożliwia wiązanie wirusa z komórkami gospodarza, ale hamuje internalizację poprzez endocytozę. Dodaje się testowy związek przeciwwirusowy, a komórki inkubuje się w temperaturze fizjologicznej. To przejście do wyższej temperatury ułatwia wnikanie...

Test do oceny wpływu badanych związków na wnikanie wirusa i fuzję w komórkach gospodarza

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Prezentujemy protokół opisujący półilościową metodę pomiaru zarówno przyczepiania wirusa grypy A do komórek A549, jak i internalizacji cząsteczek wirusa do komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje prosty test punktowy do ilościowego oznaczania mian wirusów związanych z adenowirusem (AAV) i jego zastosowanie do badania roli białek aktywujących składanie (AAP), nowej klasy niestrukturalnych białek wirusowych występujących we wszystkich serotypach AAV, w promowaniu składania kapsydów pochodzących z pokrewnych i heterologicznych serotypów AAV.

Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem

Kompleksowy protokół laboratoryjny i przepływ pracy analizy są opisane dla szybkiego, opłacalnego i prostego testu kolorymetrycznego opartego na komórkach do wykrywania elementów neutralizujących przeciwko AAV6.

Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

Poznaj bardzo czułą metodę qRT-PCR do pomiaru przyłączania cząstek arenavirusa do komórek Vero E6. Technika umożliwia ilościowe badanie zakażenia wirusowego i mechanizmów wnikania wirusa.

Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa

Przeglądaj więcej filmów