Name: Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę hodowli ludzkich komórek pluripotencjalnych i nerwowych w zamkniętym systemie zapewniającym sterylność i kontrolę parametrów atmosferycznych. Protokół zgodny z wytycznymi cGMP i cGLP umożliwia badania podstawowe i przedkliniczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować personelowi Biospherix za pomoc w nauce korzystania z systemu zamkniętych hodowli komórkowych Xvivo, szczególnie Mattowi Freemanowi; personelowi Miles & Kelley Construction Company, Inc. za ich pracę przy tworzeniu infrastruktury laboratoryjnej, szczególnie Russowi Hughesowi; personelowi Szpitala Dziecięcego Hrabstwa Orange za ich pracę w koordynowaniu przebudowy laboratorium, zwłaszcza Adama Lukharda i Devina Hugie; personelowi Szpitala Dziecięcego Szpitala Dziecięcego Hrabstwa Orange za pomoc w tworzeniu infrastruktury zarządzania danymi i zdalnego dostępu, w szczególności Viet Tran; Zespołowi Zarządzającemu Szpitala Dziecięcego Hrabstwa Orange za wieloletnie wsparcie dla projektu, w szczególności dr Marii Minon i Brentowi Dethlefsowi. Praca ta została sfinansowana przez Szpital Dziecięcy Hrabstwa Orange i Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej poprzez grant TR3-05476 dla PHS. Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania tej pracy w równym stopniu.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Komórki hodowane w CPF nie obserwują zmian w stężeniu tlenu lub dwutlenku węgla, gdy przemieszczają się z inkubatora do komory procesowej, do komory mikroskopowej i z powrotem. Bardzo ważne jest, aby warunki w każdej komorze były dopasowane do konkretnego inkubatora, w którym komórki są trzymane przed wyjęciem komórek z inkubatora. Atmosfera wewnątrz aparatu jest stale filtrowana przez HEPA i można ją dostosować pod względem stężenia tlenu i dwutlenku węgla. Komórki mogą być hodowane w stężeniach standardowych dla PSC lub NSC, odpowiednio 5% i 9%; lub alternatywne stężenia mogą być wybrane dla różnych typów komórek lub dla konkretnych eksperymentów. W ten sposób aparatura jest zasilana stałymi źródłami tlenu klasy medycznej, dwutlenku węgla i azotu (ryc. 4). Wszystkie trzy z tych gazów są dostarczane przez specyficzne dla gazu systemy kolektorów, które zapewniają stałe zasilanie. Aparat jest również dostarczany z mieszaniną gazów kalibracyjnych składającą się z 10% (± 0,01%) dwutlenku węgla w tlenie. Systemy kolektorów są umieszczone na zewnątrz zakładu produkcji ogniw, a gazy są doprowadzane do zakładu przez sufit. Gaz kalibracyjny znajduje się w obiekcie. Urządzenie jest dodatkowo zasilane odkurzaczem domowym, również przez sufit. Za pomocą elektronicznego systemu monitorowania i bezprzewodowych jednostek nadawczych stale monitorowane są ciśnienia wyjściowe wszystkich rozdzielaczy. W przypadku, gdy jakiekolwiek ciśnienie znajdzie się poza zakresem, operatorzy zakładów produkujących ogniwa są automatycznie wzywani do pracy telefonicznej i powiadamiani, aby można było podjąć odpowiednie działania.
Zapotrzebowanie na moc urządzenia jest zaspokajane przez sześć dedykowanych obwodów 120 V schodzących z sufitu i podłączonych do generatorów rezerwowych szpitala w celu zapewnienia stałego zasilania. Sterowanie pracą aparatury odbywa się za pomocą oprogramowania na komputerze PC zasilanym z zasilacza awaryjnego. Te układy zasilania i komputera zapewniają, że system działa w sposób ciągły nawet w przypadku awarii publicznego systemu zasilania. Oprogramowanie sterujące aparaturą posiada przyjazny dla użytkownika interfejs graficzny (rys. 1), który pozwala na kontrolę stężeń tlenu i dwutlenku węgla oraz temperatury, wilgotności i ciśnienia w komorze. Wartości wszystkich tych parametrów są rejestrowane w sposób ciągły, aby zapewnić bieżący zapis wszystkich parametrów aparatury. Kopia zapasowa tych danych jest tworzona na zdalnym serwerze każdej nocy w celu ochrony ich integralności. Użytkownicy administracyjni mogą uzyskać zdalny dostęp do komputera i oprogramowania w celu oceny i/lub zmiany dowolnego parametru. Dodatkowo, dostęp do komputera i oprogramowania jest możliwy zdalnie, co pozwala na interaktywną ocenę parametrów aparatury i rozwiązywanie problemów z lokalnymi użytkownikami. Dodatkowa jednostka wysyłająca alarmy jest podłączona do aparatury w taki sposób, że operatorzy zakładów produkujących komórki są powiadamiani o każdym stanie aparatury poza zakresem. Możliwości zdalnego dostępu umożliwiają logowanie i ocenę specyfiki stanu poza zasięgiem.
Aparatura została zaprojektowana jako system modułowy zarówno w skali makro, jak i mikro. Poszczególne moduły hodowli komórkowych, takie jak inkubatory i komory procesowe, można dostosować do indywidualnych potrzeb pod względem wymiarów i wymagań, a także pod względem siebie układu. Ponadto większość funkcji sterujących poszczególnych modułów jest sama w sobie modułowa, dzięki czemu na przykład poszczególne regulatory gazów atmosferycznych można łatwo wymienić bez znacznych zakłóceń w systemie.
Specjalistyczne komory obróbcze, takie jak jedna do mikroskopowej wizualizacji i manipulacji kulturami komórkowymi, można łatwo dostosować do systemu. Zarówno mikroskop kontrastu fazowego, jak i mikroskop fluorescencyjny znajdują się wewnątrz systemu (ryc. 6), dzięki czemu komórki mogą być barwione na żywo, a kolonie mogą być preparowane w tych samych warunkach atmosferycznych, co wewnątrz inkubatorów. Prowadzenie kabli przez szczelne przepusty w bocznych ścianach komory przetwarzania pozwala na przechowywanie urządzeń, takich jak zasilacze i komputery, na zewnątrz aparatury, zwykle na wózku (ilustracja 6).
Komory obróbcze w zakładzie produkcji ogniw mają inny wzór przepływu powietrza niż konwencjonalne BSC. W konwencjonalnych BSC przepływ powietrza spływa w dół z centralnego otworu wentylacyjnego i rozdziela się na dwa oddzielne strumienie, które są następnie odbierane przez dwa różne otwory wlotowe w przedniej i tylnej części podłogi szafy. Natomiast CPF ma pojedynczy otwór wentylacyjny w przedniej części sufitu. Powietrze przepływa w dół i w kierunku tylnej części komory, skąd jest następnie zasysane w górę do otworu wlotowego. Chociaż CPF jest z natury bardzo czysty, ten unikalny wzór przepływu powietrza oznacza, że technicy muszą nieznacznie dostosować swoją technikę, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Podobnie jak w przypadku konwencjonalnego BSC, pracownik laboratorium powinien unikać umieszczania rąk przed płytkami do hodowli komórkowych i butelkami z pożywką. Kierunek, który jest w górę rzeki, został jednak zmieniony w CPF
Samo laboratorium w zakładzie produkcji komórek jest dość standardowe i jest wyposażone w zamrażarkę o temperaturze -20 °C, zamrażarkę o temperaturze -80 °C, lodówkę o temperaturze 4 °C, wirówkę i łaźnię wodną. W laboratorium znajduje się również zlew ze sterownikami nożnymi do wygodnej obsługi bez użycia rąk. Aby jednak laboratorium to stało się funkcjonalnym zakładem klinicznej produkcji komórek, konieczne jest jeszcze wprowadzenie kilku dodatkowych modyfikacji. Po pierwsze, sama aparatura musi zostać zmodernizowana, aby mogła monitorować lotne związki organiczne, cząstki stałe i stężenia dwutlenku chloru, który jest używany do odkażania. Po drugie, komora procesowa zawierająca maszynę FACS może być umieszczona i połączona z resztą aparatury za pomocą modułu buforowego. Pozwoli to na sortowanie komórek i oczyszczanie populacji komórek nadających się do przeszczepu w odpowiednich warunkach środowiskowych. Wreszcie, całe urządzenie musi być umieszczone w czystym pomieszczeniu o miękkich ścianach. Zapewnia to środowisko klasy 8 Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO) dla aparatury5.
Wysoka sterylność i sterowany komputerowo charakter CPF sprawiają, że jest to idealny system do przyszłych zastosowań w terapii komórkowej i dobrych procesach produkcyjnych. Ryzyko zanieczyszczenia jest znacznie ograniczone, ale co ważniejsze, warunki ekspansji komórek są automatycznie rejestrowane i archiwizowane przez system komputerowy. Odchylenia w stężeniach gazów, temperaturze, wilgotności i wszystkie zdarzenia związane z dostępem do systemu są rygorystycznie dokumentowane. Może to być bardzo pomocne podczas badania problemów z jakością produktu. Jednak nadal istnieją ograniczenia. Użycie wszelkich odczynników i materiałów eksploatacyjnych (np. składników pożyw, pipet, płytek) musi być udokumentowane oddzielnie. Ponadto istnieje wiele potencjalnych problemów (w tym wiele form błędu ludzkiego), które mogą się pojawić, a które są całkowicie niezwiązane ze zmiennymi udokumentowanymi przez system monitorowania CPF. W związku z tym nadal istnieje zapotrzebowanie na wysoko wykwalifikowany personel i szczegółową ręczną dokumentację zadań.

Standardowe techniki hodowli komórek macierzystych cierpią z powodu kilku ograniczeń środowiskowych, które nadmiernie obciążają komórki i narażają je na niedopuszczalne ryzyko kontaminacji. Wśród stresów, które komórki mogą wytrzymać w standardowych warunkach hodowli komórkowej, są gwałtowne zmiany poziomu dwutlenku węgla i stężenia tlenu3,4. Dzieje się tak, gdy komórki są przenoszone z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i/lub mikroskopu, co może nie być optymalne dla komórek. Wcześniejsze badania potwierdziły korzyści płynące z hodowli zarówno pluripotencjalnych, jak i nerwowych komórek macierzystych w warunkach niedotlenienia4,11, a aby uzyskać najlepsze wyniki, warunki te muszą być ciągłe. Co więcej, ryzyko skażenia komórek jest wyższe, ponieważ środowisko laboratoryjne i personel wpływają na komórki na prawie każdym etapie ich hodowli i manipulacji. Tradycyjne pomieszczenia czyste stanowią jedną ze skutecznych metod znacznego zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia, ale są drogie, zajmują duży ślad węglowy i nie rozwiązują problemów związanych ze stężeniami dwutlenku węgla i tlenu. 
Zakład produkcji komórek, który może zająć się zarówno ryzykiem skażenia, jak i stężeniami gazów, i który może być zakwalifikowany do spełnienia kryteriów cGMP,9 dostarcza wysokiej jakości ogniwa do badań z zakresu nauk podstawowych, jak również do zastosowań klinicznych1,6,7. Taki zakład produkcji komórek składa się co najmniej z następujących elementów: komory procesowej, która działa jak ogrzewane miejsce pracy do karmienia i manipulowania kulturami komórkowymi; okap z przepływem laminarnym do wstępnej sterylizacji odczynników, probówek i narzędzi; dwie komory buforowe śluzy powietrznej pomiędzy okapem a komorą procesową; dwa inkubatory do hodowli komórkowych dostępne z komory procesowej; komora mikroskopowa przylegająca do komory procesowej; i wreszcie oprogramowanie komputerowe do ustawiania i monitorowania warunków w tych modułach. Korzystając z tej podstawowej infrastruktury, można wykonywać wiele różnych zadań, takich jak standardowe karmienie i pasażowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych i multipotencjalnych nerwowych komórek macierzystych, a także bardziej specjalistyczne metody, takie jak przeprogramowanie oparte na wirusie Sendai, badania migracji in vitro i różnicowanie nerwowych komórek macierzystych w celu charakterystyki elektrofizjologicznej.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo System</td><td>Biospherix</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Xvivo Oprogramowanie</td><td>Biospherix</td><td>wersja i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 Kolektor</td><td></td><td>Amico P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 Kolektor</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kamerą DP21 i fluorescencją</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany fosforanem</td><td>hyklon</td> sodowy <td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów 2</td><td>R& D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Protide</td><td>dimetylosulfotlenku</td><td>PP1130</td><td></td></tr> Technologie <tr><td>dysocjacji komórek Hanksa</td><td></td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Suplement surowicy</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Pipeta serologiczna</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipeta serologiczna</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serologiczna</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Pipeta serologiczna</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>353046</td> Płytka 12-dołkowa Corning 353043 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T-75</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &mikro; l końcówki do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l końcówki do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1 000 końcówek do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Ten artykuł opisuje, jak używać specjalnie wyprodukowanego, dostępnego na rynku zamkniętego systemu hodowli komórkowych do badań podstawowych i przedklinicznych. Komory bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i inkubatory od dawna są standardem w hodowli i namnażaniu linii komórkowych do badań podstawowych i przedklinicznych. Jednak w związku z tym, że wiele laboratoriów zajmujących się komórkami macierzystymi przenosi się z badań podstawowych na translację kliniczną, potrzebne są dodatkowe wymagania dotyczące systemu hodowli komórek. Wszystkie procesy muszą być dobrze udokumentowane i spełniać wyjątkowe wymagania dotyczące sterylności i odtwarzalności. W tradycyjnych inkubatorach stężenia gazów i temperatury ulegają znacznym wahaniom za każdym razem, gdy komórki są usuwane w celu karmienia, pasażowania lub innych manipulacji. Takie przerwy przyczyniają się do tworzenia środowiska, które nie jest standardem dla wytycznych cGMP i GLP. Przerwy te muszą być zminimalizowane, zwłaszcza gdy komórki są wykorzystywane do celów terapeutycznych. Motywacją do przejścia ze standardowego systemu BSC i inkubatora na system zamknięty jest to, że takie przerwy mogą być znikome. Systemy zamknięte zapewniają przestrzeń roboczą do karmienia i manipulowania kulturami komórkowymi oraz utrzymywania ich w kontrolowanym środowisku, w którym temperatura i stężenia gazów są stałe. W ten sposób pluripotencjalne i multipotencjalne komórki macierzyste mogą być utrzymywane w optymalnym zdrowiu od momentu ich pozyskania aż do ich ostatecznego wykorzystania w terapii.

Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje instalację do produkcji komórek oraz specyficzne aspekty hodowli komórkowej w systemie zamkniętym. Główną część instalacji do produkcji komórek stanowi wykonane na zamówienie, zamknięte urządzenie do hodowli komórkowej, które zajmuje niewielką powierzchnię i może zostać łatwo umieszczone w pomieszczeniu o wymiarach 6 x 7,5 m2 (Rysunek 2). Komórki znajdujące się w urządzeniu nie mają w żadnym momencie kontaktu z personelem laboratoryjnym ani środowiskiem zewnętrznym. Urządzenie składa się z kilku modułów: komory procesowej, dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, dwóch buforowych śluz powietrznych umieszczonych pomiędzy dygestorium a komorą procesową, dwóch inkubatorów do hodowli komórkowej oraz komory mikroskopowej sąsiadującej z komorą procesową (Rysunek 3). System jest sterowany za pomocą oprogramowania pozwalającego na kontrolę i monitorowanie zmiennych środowiskowych (Rysunek 1). Komputer obsługujący to oprogramowanie jest podłączony do zasilacza bezprzerwowego. Gazy są doprowadzane do systemu za pomocą zestawu kolektorów tlenu, azotu i dwutlenku węgla (Rysunek 4). Gazy dla urządzenia są dostarczane przez systemy kolektorowe, z których każdy posiada dwa zestawy butli – zestaw aktywny i zapasowy. Po wyczerpaniu zestawu aktywnego kolektor automatycznie przełącza się na zestaw zapasowy, a personel zamawia butle zamienne. Zasilanie jest wspierane przez system generatorów awaryjnych.
Komórki pluripotencjalne oraz neuralne komórki macierzyste mogą być hodowane w warunkach hipoksji w tym ośrodku zgodnie z wcześniej opracowanymi protokołami9, z uwzględnieniem dodatkowych komplikacji wynikających z zastosowania nowego sprzętu. Pluripotencjalne komórki macierzyste można uzyskać za pomocą wirusa Sendai, wykorzystując przeciwciała specyficzne dla pluripotencji do identyfikacji w pełni przetransfekowanych kolonii, które są następnie izolowane i namnażane (Rycina 5A i B). Z tych iPSC można wyprowadzić neuralne komórki macierzyste oraz neurony przy użyciu podwójnej inhibicji SMAD, a ich fenotyp zweryfikować za pomocą przeciwciał specyficznych dla NSC (Rycina 5C i D).
<img alt="Zrzuty ekranu interfejsu systemu sterowania; wartości procesowe, punkty nastawy, strojenie urządzeń przemysłowych." src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Interfejs graficzny zakładu produkcji komórek. (A) Graficzna reprezentacja CPF jest ekranem domyślnym i odpowiada rysunkowi CAD przedstawionemu na Rysunku 3. Kliknięcie myszą w Module Buforowym 1 (2F na Rysunku 1) otwiera jego ekran sterowania (B), na którym wartości O2 są ustawiane zgodnie z parametrami komory procesowej (3 na Rysunku 3). Podobnie, kliknięcie w Komorę Procesową lub Inkubator 1 otwiera ich odpowiednie ekrany sterowania (C i D), gdzie można w razie potrzeby zmieniać lub monitorować wartości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Laboratoryjne komory bezpieczeństwa biologicznego, komora dekontaminacyjna, przechowywanie kriogeniczne, jednostka mikroskopowa." src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zakład produkcji komórek. (A) System widziany z perspektywy przednio-prawej. Zwróć uwagę na przyłącza elektryczne i gazowe w suficie oraz wózek z akcesoriami do mikroskopu i komputerem po prawej stronie. (B) Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza z drzwiami dostępowymi do modułów buforowych widocznymi po prawej stronie. (C) Komora procesowa z dwoma inkubatorami (czarne drzwi) widocznymi z tyłu. (D) Widok przez prawą stronę systemu, przedstawiający mikroskop i monitor, z drzwiami do komór buforowych widocznymi w oddali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat ustawienia laboratoryjnego z dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, modułami inkubatorów i modułem UCPC do hodowli komórkowej." src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rysunek CAD instalacji do produkcji komórek. Wszystkie elementy wprowadzane do urządzenia są najpierw przecierane alkoholem i suszone powietrzem w dygestorium z laminarnym przepływem powietrza (1). Następnie elementy są przenoszone do odpowiedniej atmosfery w przednim module buforowym (2F), a następnie przekazywane do modułu UCPC, czyli komory procesowej (3). Komórki są hodowane w dwóch inkubatorach (4, 5). Barwienie żywych komórek, wybieranie kolonii, ocena ogólnej morfologii komórkowej oraz analiza migracji odbywają się w module UPC, czyli komorze mikroskopowej (6). Na koniec odpady opuszczają system poprzez tylny moduł buforowy (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układy butli gazowych do eksperymentów laboratoryjnych, przedstawiające systemy ciśnieniowe i konfiguracje bezpieczeństwa." src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Źródła gazów i zasilania. (A) Kolektor CO2 to układ 4 x 4, ponieważ zasila wszystkie inkubatory w laboratorium. (B) Kolektor O2 to układ 2 x 2, który zasila wyłącznie instalację do produkcji komórek. Azot do systemu jest wytwarzany w parowniku (C, tuż poniżej znaku wyjścia) podłączonym do kolektora azotu w stanie ciekłym (po prawej stronie), który automatycznie napełnia również zamrażarki kriogeniczne (na dole po lewej). Kolektor to układ 2 x 2 zasilany przez dwie pary zbiorników z ciekłym azotem o pojemności 160 L. CO2, O2 oraz N2 są doprowadzane z sufitu poprzez zawory odcinające (D). W tym miejscu dostępna jest również próżnia instalacyjna. Tuż za zaworami odcinającymi gazu widoczna jest para kabli zasilających, które dostarczają energię do systemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii kultur komórkowych z podkreśloną fluorescencją; panele pokazują różne metody barwienia." src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z hipoksji z użyciem wirusa Sendai. (A) iPSC SC187-SF4-2I0-E3 (nazewnictwo według Stover et al.9), kontrast fazowy 10X. (B) iPSC SC88.1-UH1-2I0 barwione na żywo przy użyciu Tra-1-60 znakowanego AF-594, rozcieńczenie 1:100 w pożywce. Wszystkie iPSC zostały przetransdukowane w zakładzie produkcji komórek w 5% O2 za pomocą wirusa Sendai. (C) Kontrast fazowy NSCs pochodzących z iPSC SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6, hodowanych w 5% O2 na szkiełkach komorowych. Komórki następnie utrwalono w 4% paraformaldehydzie i zabarwiono przeciwciałem pierwszorzędowym anty-ludzkim Nestin oraz przeciwciałem drugorzędowym Alex-488. Wszystkie paski skali wynoszą 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Oto protokół do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) i nerwowych komórek macierzystych (NSC) w zamkniętym systemie hodowli komórek, który pozwala na maksymalną sterylność i odtwarzalność, zastępując tradycyjną komorę bezpieczeństwa biologicznego i inkubator. To urządzenie spełnia wytyczne dobrej klinicznej praktyki produkcyjnej (cGMP) i dobrej praktyki klinicznej (cGLP).

Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Ogólnym celem wykorzystania tego urządzenia jest hodowla komórek macierzystych w określonych warunkach atmosferycznych przy zachowaniu maksymalnej sterylności. Dzisiaj zaprezentujemy zastosowanie zamkniętego systemu do hodowli komórkowej, który umożliwia precyzyjną kontrolę parametrów hodowli. W naszym laboratorium wykorzystujemy to urządzenie do hodowli multipotencjalnych komórek macierzystych oraz pluripotencjalnych komórek macierzystych.Główną zaletą tej metody jest to, że komórki są narażone na stałe środowisko niezależnie od miejsca, w którym się znajdują podczas przetwarzania. Niezależnie od tego, czy komórki są manipulowane, znajdują się w inkubatorze czy pod mikroskopem, ich ekspozycja na tlen, CO2 oraz temperaturę pozostaje stała przez cały cykl. Procedurę zaprezentuje Alexander Stover, naukowiec w moim laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, kliknij moduł, aby dostosować stężenie gazu. W nowym oknie wyświetlającym aktualne ustawienia kliknij istniejącą wartość punktu nastawy tlenu poniżej napisu Setpoint i wprowadź wymaganą koncentrację tlenu dla tego modułu. Następnie kliknij zielony znak wyboru, aby zatwierdzić punkt nastawy.Powtórz tę procedurę dla dwutlenku węgla i wprowadź wartość zadaną 5% carbon dioxide dla wszystkich modułów z wyjątkiem komór buforowych, które są regulowane wyłącznie pod kątem tlenu. Następnie monitoruj aktualne stężenia gazów, oznaczone jako Process Values, aby upewnić się, że osiągnęły one nowe wartości zadane. Po tym etapie dostosuj wartości zadane gazów we wszystkich modułach do odpowiednich poziomów.Wyrównaj poziomy dwutlenku węgla i tlenu w komorach, które będą ze sobą kontaktować. Na przykład dostosuj komorę procesową do poziomu 5% tlenu przed otwarciem inkubatora, w którym komórki są hodowane w 5% tlenu. Dostosuj również komorę buforową, służącą do wprowadzania przedmiotów do komory procesowej, do poziomu 5% tlenu.Następnie, korzystając z tego samego ekranu do regulacji gazów, ustaw temperaturę komory procesowej na 37 °C. Po tym ustaw temperaturę dna komory procesowej na 37 °C. Kliknij sekcje modułów inkubacyjnych pod każdym inkubatorem i dostosuj temperaturę tych sekcji do 37 °C.W komorze z laminarnym przepływem powietrza spryskaj wszystkie materiały wprowadzane do systemu 70% ethanol i poczekaj do ich wyschnięcia. Kolby lub płytki z komórkami przetrzyj delikatnie sterylną gazą nasączoną 70% ethanol. Następnie upewnij się, że drzwi zewnętrzne i wewnętrzne komory buforowej są szczelnie zamknięte, po czym otwórz drzwi zewnętrzne i umieść przedmioty wewnątrz, a następnie je zamknij.Używając oprogramowania, wybierz moduł buforu i kliknij kartę Dilution Factor. Wprowadź wartość 1 w polu Log Factor, a następnie kliknij start. Gdy interfejs graficzny przestanie migać napisem Dilution Factor, otwórz wewnętrzne drzwiczki komory bufora i przenieś materiały do komory procesowej.Aby wyjąć elementy z komory procesowej, należy najpierw upewnić się, że komora buforowa przeszła proces rozcieńczenia (Dilution Factor). Następnie należy otworzyć drzwi wewnętrzne, umieścić wewnątrz elementy do wyjęcia i zamknąć drzwi. Po tym kroku należy otworzyć drzwi zewnętrzne i wyjąć elementy.Umieść trzy płytki Petriego w kuwecie z wodą znajdującej się u podstawy każdego inkubatora. Napełnij te płytki sterylną wodą i utrzymuj w nich odpowiedni poziom cieczy, ponieważ jest ona kluczowa dla zachowania zadanej wartości względnej wilgotności w inkubatorze. W interfejsie graficznym kliknij inkubator.Następnie kliknij istniejącą wartość wilgotności względnej pod wartością zadaną i wprowadź 85%. Następnie kliknij zielony znak wyboru, aby zaakceptować tę wartość. W kolejnym kroku dostosuj komory buforowe, komorę procesową i inkubator do punktów nastaw gazu wymaganych dla wprowadzanego rodzaju komórek. Oczyść powierzchnię komory procesowej sterylną gazą i niezapalnym środkiem dezynfekującym, takim jak produkt na bazie chlorku benzalkoniu.Następnie należy wyczyścić rękawice oraz powierzchnie często dotykane, takie jak klamki do drzwi. Kolejno powierzchnię komory laminarnej oraz komorę buforową należy przemyć 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia. Po tym kroku należy umieścić kolbę lub płytkę z komórkami w komorze i krótko przetrzeć ich zewnętrzną powierzchnię sterylną gazą nasączoną etanolem.Następnie umieść kolbę lub płytkę w komorze buforowej i uruchom funkcję Dilution Factor. Po zakończeniu procesu niezwłocznie przenieś kolbę lub płytkę do odpowiedniego inkubatora. Ponieważ inkubator znajduje się z tyłu komory procesowej, wysuń półkę do komory procesowej w celu umieszczenia komórek i unikaj niepotrzebnego otwierania drzwi inkubatora przez dłuższy czas.W tym kroku należy przygotować pożywkę do hodowli komórkowej. Pozostaw pojemnik z pożywką lekko niezakryty przez 20 minut, aby pożywka mogła się wyrównać z poziomem dwutlenku węgla i tlenu obecnym w systemie. Następnie usuń starą pożywkę z dołków.W przypadku pluripotencjalnych komórek macierzystych należy usunąć prawie całą starą pożywkę, pozostawiając niewielką jej ilość, aby zapobiec wysuszeniu podczas procesu dokarmiania. W przypadku neuronalnych komórek macierzystych należy usunąć połowę starej pożywki. Następnie do płytek z hodowlą komórkową należy dodać świeżą pożywkę i umieścić płytki z powrotem w odpowiednim inkubatorze.Przedstawiono tutaj obraz iPSC. Poniżej znajdują się iPSC barwione na żywo Trial 160 znakowanym AF594 w rozcieńczeniu 1:100 w medium. Wszystkie iPSC zostały przetransdukowane w zakładzie produkcji komórek w atmosferze 5%tlenu przy użyciu wirusa Sendai.Oto obraz w kontraście fazowym neuronalnych komórek macierzystych pochodzących z iPSC, które były hodowane w warunkach 5% tlenu na szkiełkach komorowych. Komórki zostały następnie utrwalone w 4% paraformaldehydzie i zabarwione przeciwciałem pierwszorzędowym Anti-Human Nestin oraz przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488. Po opanowaniu tej metody, cały zestaw technik można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli proces przebiega prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przed rozpoczęciem prawidłowo ustawić stężenia gazów. Po zakończeniu procedury można zastosować inne metody, takie jak przeprogramowanie i różnicowanie, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące wpływu hipoksji na pluripotencję lub multipotencję. Po opracowaniu technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie biologii komórek macierzystych drogę do analizy klinicznej produkcji komórek w celu leczenia dziecięcych schorzeń neurodegeneracyjnych.

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zdolność do manipulowania ludzkimi komórkami macierzystymi/prekursorowymi neuronów (hNSPCs) in vitro pozwala badać ich przydatność jako przeszczepów komórkowych do celów terapeutycznych oraz zgłębiać proces rozwoju ludzkiego układu nerwowego. Niniejszy protokół przedstawia metodę hodowli i pasażowania hNSPCs w celu zwiększenia powtarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi.

Pasażowanie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Film przedstawia procedurę utrzymywania kontrolowanego środowiska w stacji roboczej do hodowli komórkowych dla wzrostu i utrzymania neuronalnych komórek macierzystych. Procedury te obejmują ustalenie warunków w komorze, protokoły czyszczenia i przygotowanie pożywki, dzięki czemu zachowano maksymalną sterylność i powtarzalność oraz zastąpiono tradycyjne metody.

Obsługa kultur neuronalnych komórek macierzystych w zakładzie produkcji komórek

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia prosty i skuteczny sposób namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) przy użyciu wyłącznie kondycjonowanych pożywek pochodzących z ludzkiego łożyska w naczyniu pokrytym żelatyną, bez dodatkowej suplementacji egzogennej lub syntetycznych substratów specyficznych dla hPSC.

Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Ten artykuł opisuje protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w laboratoryjnym bioreaktorze zawiesinowym 3D.

Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Tutaj prezentujemy protokół dla zautomatyzowanego systemu hodowli komórek. Ten zautomatyzowany system hodowli zmniejsza nakład pracy i przynosi korzyści użytkownikom, w tym naukowcom niezaznajomionym z obsługą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), od utrzymania komórek iPS po różnicowanie w różne typy komórek.

Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Poznaj metodę hodowli ludzkich komórek pluripotencjalnych i nerwowych w zamkniętym systemie zapewniającym sterylność i kontrolę parametrów atmosferycznych. Protokół zgodny z wytycznymi cGMP i cGLP umożliwia badania podstawowe i przedkliniczne.

Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych (Wideo) | JoVE Journal

Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych

Przeglądaj więcej filmów