Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych

Ogólnym celem stosowania tego sprzętu jest hodowla komórek macierzystych w określonych warunkach atmosferycznych z maksymalną sterylnością. To, co zamierzamy dzisiaj zademonstrować, to zastosowanie zamkniętego urządzenia do hodowli komórkowej, które pozwala na znakomitą kontrolę parametrów hodowli komórkowej. W naszym laboratorium wykorzystujemy ten obiekt do hodowli multipotencjalnych komórek macierzystych i pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Główną zaletą tej metody jest to, że komórki są wystawione na działanie stałego środowiska bez względu na to, gdzie się znajdują podczas ich przetwarzania. Niezależnie od tego, czy chodzi o manipulowanie komórkami, w inkubatorze czy pod mikroskopem, ich ekspozycja na tlen CO2 w temperaturach jest stała przez cały cykl. Procedurę zademonstruje Alexander Stover, pracownik naukowy w moim laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, kliknij moduł, aby dostosować stężenie gazu. W nowym oknie wyświetlającym aktualne ustawienia kliknij istniejącą wartość zadaną tlenu poniżej Wartość zadana i wprowadź wymagane stężenie tlenu dla tego modułu. Następnie kliknij zielony znacznik wyboru, aby potwierdzić wartość zadaną.

Powtórz ten stan dla dwutlenku węgla i wprowadź nastawę 5% dwutlenku węgla dla wszystkich modułów z wyjątkiem komór buforowych, które są regulowane tylko dla tlenu. Następnie monitoruj aktualne stężenia gazów, które są oznaczone jako wartości procesowe, aby upewnić się, że osiągnęły nowe wartości zadane. Następnie dostosuj nastawy gazu we wszystkich modułach do odpowiednich wartości.

Dopasuj poziomy dwutlenku węgla i tlenu w komorach, które będą wystawione na wzajemne działanie. Na przykład dostosuj komorę procesową do 5% tlenu przed otwarciem inkubatora, w którym komórki rosną przy 5% tlenu. Dostosuj również komorę buforową, która jest używana do dodawania przedmiotów do komory procesowej, do 5% tlenu.

Następnie ustaw temperaturę komory procesowej na 37 stopni Celsjusza, korzystając z tego samego ekranu do regulacji gazu. Następnie ustaw temperaturę podłogi komory procesowej na 37 stopni Celsjusza. Kliknij na banki modułów inkubacyjnych pod każdym inkubatorem i dostosuj temperaturę banków do 37 stopni Celsjusza.

W okapie laminarnym spryskaj wszystkie materiały wprowadzane do systemu 70% etanolem i pozwól im wyschnąć. Delikatnie przetrzyj kolby lub płytki komórek sterylną gąbką z gazy nasączoną 70% etanolem. Następnie upewnij się, że zarówno zewnętrzne, jak i wewnętrzne drzwi komory buforowej są dobrze zamknięte, a następnie otwórz drzwi zewnętrzne i umieść przedmioty w środku przed ich zamknięciem.

Korzystając z oprogramowania, wybierz moduł buforowy i kliknij zakładkę Dilution Factor. Wprowadź jeden w polu Log Factor, a następnie kliknij start. Gdy interfejs graficzny przestanie migać współczynnikiem rozcieńczenia, otwórz wewnętrzne drzwiczki komory buforowej i przenieś materiały do komory procesowej.

Aby usunąć przedmioty z komory procesowej, należy najpierw upewnić się, że komora buforowa została poddana współczynnikowi rozcieńczenia. Następnie otwórz drzwi wewnętrzne, umieść w środku przedmioty, które mają zostać usunięte, i zamknij je. Następnie otwórz drzwi zewnętrzne i wyjmij przedmioty.

Umieść trzy szalki Petriego w misce wodnej u podstawy każdego inkubatora. Napełnij te naczynia sterylną wodą i utrzymuj poziom wody w tych naczyniach, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla utrzymania nastawy wilgotności względnej w inkubatorze. W interfejsie graficznym kliknij inkubator.

Następnie kliknij istniejącą wartość wilgotności względnej pod wartością zadaną i wprowadź 85%Następnie kliknij zielony znacznik wyboru, aby zaakceptować tę wartość. Następnie dostosuj komory buforowe, komorę procesową i inkubator do nastaw gazu wymaganych dla typu wprowadzanych komórek. Oczyść powierzchnię komory procesowej sterylną gazą i niepalnym środkiem dezynfekującym, takim jak produkt na bazie chlorku benzalkoniowego.

Następnie wyczyść rękawice i powierzchnie, które są często dotykane, takie jak klamki drzwi. Następnie oczyść powierzchnię okapu laminarnego i komory buforowej 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Następnie umieść kolbę lub płytkę z komórkami w kapturze i krótko przetrzyj jej zewnętrzną powierzchnię sterylną gąbką z gazy nasączoną etanolem.

Następnie umieścić kolbę lub płytkę w komorze buforowej i uruchomić współczynnik rozcieńczenia. Po zakończeniu należy natychmiast przenieść kolbę lub płytkę do odpowiedniego inkubatora. Ponieważ inkubator znajduje się z tyłu komory procesowej, należy wyciągnąć półkę do komory procesowej w celu umieszczenia komórek i unikać niepotrzebnego otwierania drzwi inkubatora przez dłuższy czas.

Na tym etapie przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych. Pozwolić, aby pożywka zrównoważyła się z poziomami dwutlenku węgla i tlenu obecnymi w systemie, pozostawiając pojemnik na pożywkę lekko niezamknięty na 20 minut. Następnie usuń stare podłoże z dołków.

W przypadku pluripotencjalnych komórek macierzystych należy usunąć prawie całą starą pożywkę, pozostawiając niewielką ilość starej pożywki, aby zapobiec wysuszeniu podczas procesu karmienia. W przypadku nerwowych komórek macierzystych usuń połowę starego podłoża. Następnie dodaj świeżą pożywkę do płytek do kultur komórkowych i umieść płytki z powrotem w wyznaczonym inkubatorze.

Poniżej przedstawiono obraz komórek iPSC. Oto iPSC barwione na żywo AF594 oznaczone jako Trial 160 z rozcieńczeniem od 1 do 100 w pożywce. Wszystkie iPSC zostały transdukowane w zakładzie produkcji komórek w 5% tlenu z wirusem Sendai.

A oto obraz z kontrastem fazowym nerwowych komórek macierzystych pochodzących z iPSC, które były hodowane w temperaturze 5% tlenu w szkiełkach komorowych. Komórki następnie utrwalono w 4% paraformaldehydzie i wybarwiono przeciwciałem pierwszorzędowym Anti-Human Nestin i przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488. Po opanowaniu ten zestaw technik można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o prawidłowym ustawieniu stężeń gazu przed rozpoczęciem. Po procedurze można wykonać inne metody, takie jak przeprogramowanie i różnicowanie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ hipoksji na pluripotencję lub multipotencję. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych do zbadania klinicznej produkcji komórek w leczeniu zaburzeń neurodegeneracyjnych u dzieci.