Name: Izolacja fibroblastów/miofibroblastów CD 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Naucz się izolować fibroblasty i miofibroblasty CD90+ z zamrożonych tkanek przewodu pokarmowego. Ta metoda umożliwia opóźnione przetwarzanie próbek i prowadzenie badań nad naprawą tkanek oraz fibrozą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) oraz Institute for Translational Sciences na University of Texas Medical Branch, a także Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

Protokół pobierania odrzuconych tkanek ludzkich od pacjentów chirurgicznych i zakładania kultur pierwotnych został zatwierdzony przez Oddział Medyczny Uniwersytetu Teksańskiego i Instytucjonalne Komisje Rewizyjne Uniwersytetu Nowego Meksyku. Ogólne wymagania dotyczące pobierania próbek tkanek ludzkich opisano poniżej. Należy pamiętać, że ponieważ MF mogą być izolowane z zamrożonych tkanek, biobanki i dostawcy komercyjni są również realnymi opcjami.
1. Uzyskanie tkanki ludzkiej
<ol>
	<li>Przedłożyć protokół uzyskania ludzkiej tkanki jelita grubego do zatwierdzenia przez instytucjonalną komisję rewizyjną.</li>
	<li>Nawiązanie współpracy z chirurgami ogólnymi i/lub chirurgami jelita grubego w celu pozyskania tkanek ludzkich do badań. Obowiązkowa jest również współpraca z działem patologii, ponieważ będzie on określał tkankę, która nie jest wymagana do diagnozy i może być przeznaczona do badań.</li>
	<li>Poradź patologowi, aby dostarczył tkankę z nowotworu, a następnie ogólnie normalną błonę śluzową co najmniej 5 cm od guza. Natychmiast umieścić próbki w lodowatym podłożu myjącym i umieścić na lodzie. Patolog określi ilość tkanki, którą można bezpiecznie oddać do badań. Minimalna tkanka wymagana do izolacji MF wynosi 1,5mm2.</li>
	<li>Otrzymaną tkankę należy natychmiast wykorzystać do założenia kultur pierwotnych lub zamrozić i umieścić w temperaturze -80 °C w celu przyszłej izolacji.
	<ol>
		<li>W przypadku zamrażania w celu późniejszej izolacji, pokrój tkankę na około 1 - 2 mm2 kawałki, umieść w probówce kriogenicznej z 1 ml pożywki do zamrażania (patrz poniżej) i przechowuj w temperaturze -80 °C. Uwaga: Korzystając z tego protokołu, zaobserwowano pomyślną izolację MF z tkanki zamrożonej przez ponad 4 lata.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotuj odczynniki
<ol>
	<li>Dla roztworu kolagenazy: Przygotuj 100 j./ml kolagenazy I, II i IV w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) z Ca2+/Mg2+ (patrz tabela materiałów). UWAGA: Stężenie i czystość jednostki aktywnej kolagenazy może się różnić w zależności od dostawcy, co może utrudniać efektywność trawienia tkanek i/lub zachowanie epitopu na powierzchni komórek błony śluzowej. Aby zapobiec tym potencjalnym pułapkom, należy stosować kolagenazę o najwyższym stopniu czystości (≥95%) i przygotować roztwór podstawowy w oparciu o stężenie jednostek aktywnych.</li>
	<li>Przygotować wodny roztwór podstawowy DNazy o stężeniu 10 mg/ml (3,55 UA/mg).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do mycia: (MEM: 89 ml, Antybiotyk-Antybiotyk, 100x: 1 ml; FCS inaktywowany termicznie: 10 ml)</li>
	<li>Przygotuj pożywkę wzrostową fibroblastów: MEM: butelka 500 ml; L-glutamina (200 mM): 5 ml; Aminokwasy endogenne MEM, 100x roztwór: 5 ml; chlorowodorek cyprofloksacyny (10 mg/ml): 570 μl; Antybiotyk-Przeciwgrzybiczy, 100x roztwór: 10 ml; pirogronian sodu (100 mM): 5 ml; Aktywowany termicznie FCS: 50 ml</li>
	<li>Przygotować pożywkę do zamrażania: pożywkę wzrostową fibroblastów (odczynnik 2.4) z dodatkiem 10% sulfotlenku dimetylu (DMSO), a następnie przefiltrować i sterylizować filtrem 0,22 μm.</li>
</ol>
3. Enzymatycznie trawiona tkanka ludzka
<ol>
	<li>Jeśli tkanka została zamrożona w pożywce zamrażającej, umieść kriowial w ciepłej (~ 37 °C) wodzie, aż tkanka i podłoże zostaną rozmrożone.</li>
	<li>Na 4 - 5 kawałków chusteczki o średnicy 2 mmnależy przemyć chusteczkę dwukrotnie 10 ml HBSS bez Ca2+/Mg2+.</li>
	<li>Gdy tkanka osiądzie grawitacyjnie, ostrożnie wyrzucić supernatant bez wirowania próbki.</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu kolagenazy do próbki i przenieść mieszaninę tkanka-roztwór do sterylnej probówki wolnej od DNaz/RNaz z wbudowanymi wirnikami do dysocjacji próbki. Użyj kolagenazy do dysocjacji macierzy zewnątrzkomórkowej, która otacza podstawowy aspekt komórek nabłonka i tworzy niekomórkową frakcję właściwej blaszki błony śluzowej.</li>
	<li>Szczelnie zamknij rurkę i przymocuj ją do góry nogami na tulei dysocjatora (np. GentleMAC). Jeśli laboratorium nie ma dostępu do wyżej wymienionego sprzętu, wydłuż czas każdego etapu trawienia, aby uzyskać porównywalne wyniki.</li>
	<li>Uruchom program h_tumor_01, wstępnie ustawiony profil dołączony do maszyny (całkowity czas trwania 36 sekund, z przerywanymi impulsami w zakresie od 1,000 do 4,000 obr./min, z 268 rundami na bieg).</li>
	<li>Po zakończeniu programu odłącz rurkę od dysocjatora.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 45 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłym obrocie na wytrząsarce z prędkością 140 obr./min. Uwaga: W przypadku różnych ilości próbek tkanek czas trawienia może być proporcjonalnie skrócony lub wydłużony (tj. większe ilości tkanek mogą wymagać dodatkowego czasu).</li>
	<li>Przymocuj rurkę do góry nogami na tulei dysocjatora.</li>
	<li>Wybierz i uruchom h_tumor_02 Program (całkowity czas trwania 37 sekund, z przerywanymi impulsami w zakresie od 1,000 do 4,000 obr./min, z 235 rundami na bieg).</li>
	<li>Po zakończeniu programu odłącz rurkę od dysocjatora.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu podstawowego DNazy. Użyj DNAzy do dysocjacji/usunięcia martwych komórek i frakcji DNA szczątków komórkowych, która prowadzi do zlepiania się komórek.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłym obrocie na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min.</li>
	<li>Ponownie przymocuj rurkę do góry nogami na tulei dysocjatora.</li>
	<li>Wybierz i uruchom h_tumor_03 Program (całkowity czas trwania 37 sekund, z przerywanymi impulsami w zakresie od 1,000 do 4,000 obr./min, ze 168 rundami na bieg). 
	Uwaga: Jeżeli tkanka nie jest całkowicie strawiona, odwirować przy 250 × g przez 10 minut w temperaturze 20 °C, odrzucić supernatant, ponownie zawiesić w 2 ml roztworu do dysocjacji komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórkową przez sterylne sitko do komórek o wielkości 70 μm.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 250 × g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Przepłukać osad komórkowy dwukrotnie 25 ml HBSS bez Ca2+/Mg2+ i odrzucić sklarowany nad osadem.</li>
	<li>Przed ostatnim myciem należy policzyć liczbę komórek za pomocą automatycznego systemu zliczania komórek dostępnego w laboratorium lub ręcznie za pomocą hemocytometru. W przypadku generowania kultur pierwotnych MF należy postępować zgodnie z krokiem 3.19.1, a w przypadku analizy lub sortowania MF za pomocą cytometrii przepływowej należy postępować zgodnie z krokiem 3.19.2.
	<ol>
		<li>W celu izolacji i wzrostu czystej kultury MF (ryc. 1) odrzucić supernatant z ostatniego wirowania, ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości pożywki izolacyjnej fibroblastów potrzebnej do wysiewu do 4 x 106 komórek w 3 ml pożywki na basenie w 6 dołkach, płytkach poddanych działaniu kultur komórkowych. Przejdź do kroku 3.20.</li>
		<li>W celu analizy lub sortowania MF przy użyciu cytometrii przepływowej umieścić maksymalnie 2 x 106 w 2 ml pożywki do izolacji fibroblastów w 24-dołkowej płytce o niskim stopniu wiązania i inkubować O/N w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Ma to na celu przywrócenie epitopów na powierzchni komórki, które mogą być dotknięte procedurą enzymatyczną. Następnie zbierz zawiesinę komórek i policz odzyskane komórki, a następnie przejdź do analizy barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 2 - 3 dni, aż do powstania ~ 80% zlewającej się monowarstwy MF (rysunek 1D-E).</li>
	<li>Komórki pasażowe w kolbach T25 z płytką 6-dołkową w stosunku 1:1 i rosną przez ~ 10 - 14 dni w pożywkach wzrostowych fibroblastów, aby osiągnąć 80 - 100% konfluencji.</li>
	<li>Rozszerz hodowlę przez pasażowanie komórek od komórek T25 do T75 w stosunku 1:2. Gdy komórki osiągną konfluflucję, użyć jednej kolby do analizy izolowanej czystości MF przy użyciu cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej5. Zamrażać lub przepuszczać przez inną kolbę T75 kultury MF w stosunku 1:3, 
	Uwaga: Po przeanalizowaniu za pomocą cytometrii przepływowej oczekuje się, że MF zrębu błony śluzowej przewodu pokarmowego pochodzenia mezenchymalnego podczas wzrostu w kulturze będzie miał następujący fenotyp: EpCAM-, CD31-, CD45-, wimentyna+, α-SMA+, CD90+.</li>
</ol>

<ol><li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Fibroblasts+Mediate+Extracellular+Matrix+Remodeling+and+Invasion+of+Scirrhous+Gastric+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells.</a> PLoS ONE. 9, e85485(2014).</li>
<li>Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Colonic+Myofibroblasts+Are+Resistant+to+Clostridium+difficile+Toxin+A-Induced%2C+but+Not+Toxin+B-Induced%2C+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death.</a> Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).</li>
<li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Cells+of+the+Intestinal+Lamina+Propria.+Annu+Rev+Physiol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol+%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol.</a> Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).</li>
<li>Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+prevent%2C+reduce+or+reverse+intestinal+fibrosis+in+IBD%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Rev+Med+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD?</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).</li>
<li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li>
<li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li>
<li>Roncoroni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+fibroblasts+from+endoscopic+duodenal+biopsies+of+celiac+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients.</a> J Transl Med. 7 (40), (2009).</li>
<li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cells+Induce+Th17+during+Helicobacter+pylori+Infection+and+in+the+Gastric+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment.</a> PLoS ONE. 8, e53798(2013).</li>
<li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+chemoattractant+protein-1+production+by+intestinal+myofibroblasts+in+response+to+staphylococcal+enterotoxin+a%3A+relevance+to+staphylococcal+enterotoxigenic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease.</a> J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).</li>
<li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li>
<li>Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+carcinoma-associated+fibroblast-derived+proteins+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology.</a> J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).</li>
<li>Minonzio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+maintain+high+capability+to+grow+and+differentiate%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate.</a> Cryobiology. 69, 211-216 (2014).</li>
<li>Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Myofibroblasts+from+Mouse+and+Human+Esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus.</a> J. Vis. Exp. (95), e52215(2015).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> J. Vis. Exp. (80), e50611(2013).</li>
<li>Schiller, J. H., Bittner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Tumorigenic+Phenotype+with+in+Vitro%2C+but+not+in+Vivo%2C+Passaging+of+a+Novel+Series+of+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Lines%3A+Possible+Role+of+an+%CE%B15%2F%CE%B21-Integrin-Fibronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction.</a> Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).</li>
<li>Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+a+perspective+from+in+vitro+cultures+to+in+vivo+migration+and+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches.</a> Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).</li>
<li>Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+preservation+and+expansion+of+human+limbal+epithelial+stem+cells+on+amniotic+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.</a> Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).</li>
<li>Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż protokół ten został opracowany wyłącznie do zastosowań badawczych, w świetle rosnącego krytycznego znaczenia komórek zrębu jako potencjalnych biomarkerów prognostycznych raka i celu terapeutycznego, możliwość zamrożenia "funkcjonalnych" próbek biologicznych do późniejszego wykorzystania oferuje znaczącą przewagę. Stanowi to unikalną zaletę dla tworzenia klinicznego repozytorium biologicznego, które może służyć jako dodatkowe narzędzia służące postępowi w rozwoju medycyny spersonalizowanej10, 11. Podobn...

Miofibroblasty/fibroblasty (MF) reprezentują obfitą populację komórek w błonie śluzowej przewodu pokarmowego (GI). Te komórki zrębu znajdują się tuż pod nabłonkiem i tworzą połączoną sieć w blaszce właściwej błony śluzowej w jelitach. MF są nie tylko odpowiedzialne za odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej, ale poprzez regulację parakrynną mogą wpływać na transport elektrolitów, restytucję i funkcję barierową sąsiedniego nabłonka1, 2. Ponadto wykazano, że MF odgrywają kluczową rolę w stanach zapalnych i przebudowie tkanek3, 4. Miofibroblasty są krytyczną częścią mikrośrodowiska guza, gdzie są również znane jako fibroblasty związane z rakiem i przyczyniają się do wzrostu komórek nowotworowych i służą jako nisza dla rakowych komórek macierzystych3. Pojawiające się dane sugerują, że MF mogą również służyć jako lokalne komórki prezentujące antygen. Ponadto MF działają jako ważne regulatory wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, wytwarzając różnorodne cytokiny i czynniki wzrostu5.
U zdrowych osób uważa się, że komórki MFs odróżniają się od mezenchymalnych komórek macierzystych i wyrażają na powierzchni swoich komórek mezenchymalny marker, CD903, 5. Komórki te są również dodatnie dla wimentyny, ale ujemne dla markera komórek nabłonkowych i krwiotwórczych, odpowiednio EpCAM i CD45. Sugeruje się, że miofibroblasty są aktywowaną formą fibroblastów i można je odróżnić od nieaktywowanych fibroblastów na podstawie ekspresji α-SMA5.
W ciągu ostatniej dekady opublikowano wiele podejść do izolacji miofibroblastów z ludzkiej błony śluzowej okrężnicy - głównie opartych na metodzie pierwotnie opisanej przez Mahidę i wsp. 5-8. Podczas gdy poszczególne badania opisują procedury izolacji z różnych błon śluzowych jelit, nie opublikowano uniwersalnego protokołu izolacji MF z wielu obszarów przewodu pokarmowego (tj. błony śluzowej żołądka, jelita cienkiego i grubego). Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół został przetestowany i z powodzeniem stosowany dla wszystkich trzech typów tkanek wymienionych powyżej. . Ponadto nie opisano procedur izolacji MF z zamrożonej błony śluzowej przewodu pokarmowego.
Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę, która opiera się na trawieniu enzymatycznym, a jednocześnie pozwala na izolację MF błony śluzowej ludzkiego jelita do hodowli i analizy cytometrii przepływowej w świeżo strawionych, jednokomórkowych preparatach błony śluzowej. Technika ta niezawodnie daje kultury pierwotne o fenotypie MF. Co więcej, te same metody można zastosować do izolacji MF z zamrożonych próbek tkanek żołądka i jelita cienkiego. Izolacja miofibroblastów ze świeżej tkanki przewodu pokarmowego została już wcześniej opisana; Jednak wykorzystanie zamrożonych próbek ma wiele zalet. Mianowicie, naukowcy byliby w stanie zbierać i przechowywać tkanki od dowolnej liczby współpracowników z całego świata, którzy mają możliwość wysyłania zamrożonych próbek tkanek. Co więcej, naukowcy mogą uznać, że pobranie wyrzuconych tkanek z sali operacyjnej i/lub sali endoskopii oraz natychmiastowe przetworzenie tkanki w celu izolacji koliduje z ich obecnym harmonogramem eksperymentów. Ponadto, ze względu na nieprzewidywalny charakter operacji, pobranie tkanek może nastąpić bardzo późno w ciągu dnia, co ograniczy czas pozostały do przetworzenia tkanki. Zamrożenie tkanek do późniejszego przetwarzania złagodzi te wyzwania.
Na koniec, te metody zostały z powodzeniem wykorzystane do izolacji miofibroblastów okrężnicy, żołądka i jelita cienkiego w stanach chorobowych takich jak rak jelita grubego i choroby zapalne jelit.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Cyprofloksacyna HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol roztwór (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z&nbsp; Clostridium histolyticum, typ I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z&nbsp; Clostridium histolyticum, typ II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum, typ IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dysocjacji komórek Accumax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Rurki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dysocjator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (70 &micro; m)</td> <td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka Vimentin</td><td>BD Biosciences</td><td>562337</td><td>klon RV202</td></tr><tr><td>FITC Monoklonalna antyaktyna, i alfa-mięśnie gładkie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3777</td><td>Klon 1A4</td></tr><tr><td>Mysz APC Anti-Human CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>Klon 5E10</td></tr></tbody></table>

izolacja fibroblastów/miofibroblastów cd 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasty/miofibroblasty (MF) zyskują coraz większą uwagę ze względu na ich rolę w patogenezie i ich wkład zarówno w gojenie się ran, jak i promowanie mikrośrodowiska guza. Chociaż obecnie istnieje wiele technik izolacji MF z tkanek przewodu pokarmowego (GI), protokół ten wprowadza nowy element izolacji tych komórek zrębu z zamrożonej tkanki. Zamrażanie próbek tkanek przewodu pokarmowego nie tylko pozwala badaczowi na pozyskiwanie próbek od współpracowników na całym świecie, biobanków i dostawców komercyjnych, ale także pozwala na opóźnione przetwarzanie świeżych próbek. Opisany protokół pozwoli konsekwentnie uzyskać charakterystyczne komórki w kształcie wrzeciona z fenotypem MF, które wyrażają markery CD90, α-SMA i wimentynę. Ponieważ komórki te pochodzą z próbek pobranych od pacjentów, zastosowanie komórek pierwotnych przynosi również korzyści ze ścisłego naśladowania MF ze stanów chorobowych, a mianowicie raka i chorób zapalnych jelit. Technika ta została zwalidowana w generowaniu pierwotnych kultur MF żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy. Pierwotne hodowle MF mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie eksperymentów na przestrzeni wielu pasaży, a ich czystość ocenia się zarówno za pomocą immunocytochemii, jak i analizy cytometrii przepływowej.

Stosując ten protokół trawienia enzymatycznego, byliśmy w stanie w sposób powtarzalny izolować i hodować populację MF komórek zrębu śluzówki jelita CD90+ z chirurgicznych preparatów i biopsji przewodu pokarmowego (Rysunek 1). Widoczną proliferację kolonii MF można było zaobserwować od 2. do 5. dnia po wysianiu zawiesiny komórek mononuklearnych na płytki 6-dołkowe (Rysunek 1A-B). Pierwotne hodowle MF osiągają ~ 50 - 70 % konfluencji między 7. a ...

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i tworzenia pierwotnych kultur fibroblastów/miofibroblastów (MF) z zamrożonych komórek tkanki żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy o fenotypie MF. Komórki te wyrażają CD90, α-SMA i wimentynę. MF mogą być używane do różnych testów funkcjonalnych, w tym aktywności enzymatycznej i produkcji cytokin.

Izolacja fibroblastów/miofibroblastów CD 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Ogólnym celem tej metody jest wyizolowanie żywotnych miofibroblastów i fibroblastów błony śluzowej z zamrożonych próbek tkanki przewodu pokarmowego, pierwotnie uzyskanych z biopsji lub próbek chirurgicznych. Wyizolowanie miofibroblastów i fibroblastów z odpowiednio zamrożonej tkanki przewodu pokarmowego pozwala na opóźnienie przetwarzania świeżych próbek. Ułatwia to korzystanie z próbek z różnych źródeł na całym świecie.Jeśli tkanka została zakonserwowana w pożywce zamrażającej, umieść kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż tkanka i podłoże zostaną rozmrożone. W przypadku czterech do pięciu dwumilimetrowych fragmentów tkanek dodaj 10 mililitrów HBSS bez wapnia i magnezu, szczelnie zamknij pokrywkę i umyj chusteczkę, delikatnie odwracając rurkę jeden raz. Gdy tkanka osiądzie grawitacyjnie, ostrożnie wyrzuć supernatant i ponownie umyj tkanki.Następnie dodaj 10 mililitów roztworu kolagenazy do probówki i przenieś zawiesinę tkankową do sterylnej probówki wolnej od DNaz / RNaz z wbudowanymi wirnikami. Szczelnie zamknij rurkę wirnika i przymocuj ją do góry nogami na tulei dysocjatora. Następnie uruchom wstępnie ustawiony program H-tumor zero one.Po zakończeniu programu inkubować zawiesinę tkanek przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, obracając się z prędkością 140 obr./min na wytrząsarce. Następnie zwróć rurkę do dysocjatora i uruchom program H-tumor zero dwa. Po drugiej dysocjacji dodaj 50 mikrolitrów roztworu podstawowego DNA do roztworu komórkowego przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pod ciągłym obrotem 60 obr./min na wytrząsarce.Pod koniec drugiej inkubacji uruchom program H-tumor zero trzy. Teraz przefiltruj zawiesinę przez sterylne sitko komórkowe o średnicy 70 mikronów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów w celu odwirowania. Wyrzuć supernatant i przemyj osad komórkowy w 25 mililitrach HBSS bez wapnia i magnezu dwa razy, licząc komórki po pierwszym płukaniu.W celu wytworzenia pierwotnej kultury miofibroblastów, ponownie zawieś osad w maksymalnie 4 x 10 do 6 komórek na trzy mililitry pożywki i umieść je na 6-dołkowych płytkach poddanych działaniu hodowli komórek. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla, zmieniając podłoże co dwa do trzech dni, aż do utworzenia 80-procentowej zlewającej się monowarstwy miofibroblastów. Komórki są następnie gotowe do pasażowania w kolbach hodowlanych T25.Aby przeanalizować lub posortować izolowane miofibroblasty za pomocą cytometrii przepływowej, należy umieścić do 2 x 10 do 6 komórek na dwa mililitry pożywki izolacyjnej fibroblastów na 24-dołkowej płytce o niskim poziomie wiązania do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. Korzystając z tego protokołu trawienia enzymatycznego, miofibroblasty i fibroblasty uzyskały CD-90-dodatnie populacje komórek zrębu błony śluzowej, mogą być konsekwentnie izolowane i hodowane z próbek chirurgicznych przewodu pokarmowego i biopsji. Podczas gdy po zamrożeniu wycinków chirurgicznych obserwuje się nieznaczny spadek żywotności preparatu jednokomórkowego błony śluzowej, następuje wzrost wydajności wytwarzania miofibroblastów i kultur fibroblastów ze względu na jednoczesny spadek stężenia bakterii i grzybów.Po dwóch pasażach miofibroblasty i fibroblasty są dodatnie dla CD90, markera linii markerów mezenchymalnych, wimentyny i aktyny mięśni gładkich, markera zróżnicowanych komórek mezenchymalnych, jak określono zarówno za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak i analizy cytometrii przepływowej. Po opanowaniu, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, technikę tę można ukończyć w ciągu około dwóch godzin. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby dać organizmowi niezbędny czas na pełne trawienie enzymatyczne tkanki.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa, immunocytochemia i różne testy funkcjonalne. Mogą być wykorzystywane do określania udziału miofibroblastów i fibroblastów w homeostazie błony śluzowej jelit, a także w patologii ostrej i przewlekłej choroby zapalnej przewodu pokarmowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować miofibroblasty i fibroblasty z zamrożonej tkanki przewodu pokarmowego.Nie zapominaj, że nieutrwalona tkanka ludzka może zostać skażona przez chorobotwórcze mikroorganizmy. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachowywać uniwersalne środki ostrożności podczas pracy z ludzkimi próbkami biologicznymi.

isolation-cd-90-fibroblastmyofibroblasts-from-human-frozen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Miofibroblast jest wpływową komórką zrębu przewodu pokarmowego, która reguluje ważne procesy fizjologiczne zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym. Opisujemy technikę, która pozwala na izolację pierwotnych miofibroblastów zarówno z mysjej, jak i ludzkiej tkanki okrężnicy, którą można wykorzystać do eksperymentów in vitro.

Izolacja pierwotnych miofibroblastów z tkanki okrężnicy myszy i człowieka

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Przedstawiamy protokół generowania pierwotnych kultur mysich i ludzkich komórek zrębu przełyku z fenotypem miofibroblastów. Hodowane komórki mają morfologię wrzecionowatą, wykazują ekspresję α-SMA i wimentyny oraz nie mają markerów powierzchni komórek nabłonkowych, krwiotwórczych i śródbłonkowych. Scharakteryzowane komórki zrębu mogą być wykorzystane w badaniach funkcjonalnych oddziaływań nabłonkowo-zrębowych.

Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej.  Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych.  Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

To badanie opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czystych i żywotnych fibroblastów.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej

Naucz się izolować fibroblasty i miofibroblasty CD90+ z zamrożonych tkanek przewodu pokarmowego. Ta metoda umożliwia opóźnione przetwarzanie próbek i prowadzenie badań nad naprawą tkanek oraz fibrozą.

Izolacja fibroblastów/miofibroblastów CD 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Przeglądaj więcej filmów