Name: Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę utraty i wzmocnienia funkcji do badania wczesnych decyzji losu komórek w zarodkach myszy. Technika ta pozwala identyfikować receptory wpływające na różnicowanie masy komórek wewnętrznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby również podziękować grupie dr Xionga z Georgia Health Sciences University za produkcję i udostępnianie konstruktów dla neogeninowych wektorów cDNA i shRNA. Badanie to było wspierane przez granty z Programu Badań Podstawowych (2013R1A1A4A01012572) finansowane przez Koreańską Fundację Badawczą oraz przez grant badawczy z Uniwersytetu Sahmyook.

UWAGA: Wszystkie procedury dotyczące hodowli i opieki nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami IACUC Uniwersytetu Sahmyook, Seul, Korea Południowa.
1. Superowulacja, hodowla i izolacja jajowodu
<ol>
	<li>Utrzymuj myszy wsobne C57BL/6 w następujących warunkach: 22 ± 3 °C, ~60% wilgotności, 12-godzinny cykl światła/ciemności oraz woda i jedzenie ad libitum.</li>
	<li>Wywołaj superowulację u 3-5 tygodniowych samic myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w dawce 0,1 ml / sztukę, a następnie 48 godzin później dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) w dawce 0,1 ml / głowę.</li>
	<li>Bezpośrednio po wstrzyknięciu hCG należy kojarzyć samice wywołane superowulacją z dojrzałymi płciowo samcami tego samego szczepu, trzymając je przez noc w tej samej klatce.</li>
	<li>Następnego ranka potwierdź udane krycie przez obecność zatyczki kryjącej lub czopa pochwowego na żeńskich drogach rodnych.</li>
	<li>Uśmierc ciężarne samice myszy przez zatrucie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy 18-20 godzin po wstrzyknięciu hCG.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną, przecinając cienkimi nożyczkami skórę, a następnie warstwę otrzewnej.</li>
	<li>Podnieś rogi macicy cienkimi kleszczami i delikatnie wyciągnij macicę, jajowód, jajnik i poduszeczkę tłuszczową z jamy ciała.</li>
	<li>Wytnij obszar między jajowodem a jajnikiem cienkimi nożyczkami. Zmień położenie kleszczyków i przetnij macicę w pobliżu jajowodu, pozostawiając co najmniej 1 cm przyczepionej górnej części macicy.</li>
	<li>Przenieść bańkę jajowodową na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą pożywkę M16 w temperaturze pokojowej. Połącz jajowody z kilku myszy w tym samym naczyniu.</li>
	<li>Umieść szalki pod mikroskopem stereoskopowym w celu pobrania zarodków.</li>
</ol>
2. Pobieranie i hodowla zarodków 2-projądrowych (2-PN)
<ol>
	<li>Odetnij koniec igły podskórnej o gramaturze 30 lub 32 G, zmiel ją na końcówkę i użyj jako igły do płukania.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków wsunąć koniec jajowodu na igłę do spłukiwania. Delikatnie dociśnij końcówkę igły płuczącej do dna naczynia, aby utrzymać ją na miejscu. Przepłukać jajowód ~0,1 ml pożywki M16, aby uwolnić zarodki 2-PN na szalkę Petriego.</li>
	<li>Odzyskać zarodki 2-PN wraz z otaczającymi masami wzgórków z przepłukanej pożywki M16 pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą sterylnej szklanej pipety i przenieść je na nową szalkę Petriego.</li>
	<li>Oddzielić wzgórki od zarodków 2-PN przez trawienie enzymatyczne z 1,0 ml 0,1-0,5% hialuronidazy w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.</li>
	<li>Ogołocić zarodki poprzez delikatne pipetowanie szklaną pipetą i fizyczne usunięcie komórek wzgórka.</li>
	<li>Pozbawione zarodków należy przemyć trzykrotnie 30-50 ml świeżej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na zarodek.</li>
	<li>Inkubować zarodki na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm w pożywce M16 uzupełnionej 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA, frakcja V) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze do momentu wykonania mikroiniekcji, co zwykle następuje mniej niż 4 godziny później.</li>
</ol>
3. Odwrotna transkrypcja zarodka (RT) i reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
<ol>
	<li>Zbierz co najmniej 10 zarodków z każdego etapu aż do stadium blastocysty i połącz je w 4,0 μl 5-krotnego roztworu premiksu odwrotnej transkryptazy zawierającego odwrotną transkryptazę, inhibitor RNazy, starter oligo dT, losowe 6mery, mieszaninę dNTP i bufor reakcyjny w probówce do PCR.</li>
	<li>Dodać destylowany H2O bez RNaz do całkowitej objętości 20 μl i sonikować zebrane zarodki przez 30 sekund przy 200 W. Natychmiast rozpocząć reakcję RT w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę, a następnie inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Na każde 5,0 μl wygenerowanego roztworu cDNA należy przeprowadzić normalną amplifikację PCR ze starterami dla neogeniny, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3/4 lub β-aktyny (sekwencje starterów podane w tabeli 1. PCR składa się z 40 cykli 15-sekundowej inkubacji w temperaturze 95 °C, 30 sekund w temperaturze wyżarzania (pokazanej w tabeli 1) i 30 sekund w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Oddziel produkty PCR przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym i uwidocznij żel w świetle UV po zabarwieniu bromkiem etydyny.</li>
	<li>Normalizuj ekspresję genu docelowego w stosunku do poziomów β-aktyny.</li>
</ol>
4. Immunocytochemia zarodków
<ol>
	<li>Utrwalić zarodki z każdego etapu za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 3 razy krótko przepłukać PBS zawierającym 0,01% BSA.</li>
	<li>Przepuszczalność błon komórkowych poprzez inkubację 10 zarodków w 1,0 ml PBS zawierającego 0,1% Tween 20 i 0,1% TritonX-100 w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Aby zablokować niespecyficzne wiązanie, należy inkubować przepuszczalne zarodki w 1,0 ml PBS uzupełnionym 10% normalną surowicą kozią przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować zablokowane zarodki z króliczymi przeciwciałami antyneogenicznymi w rozcieńczeniu 1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po trzech płukaniach przez 30 sekund każde w kroplach PBS, inkubować zarodki z anty-króliczą IgG kozią anty-króliczą Alexa 488 lub Alexa 568-sprzężoną kozią anty-króliczą IgG w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze PBS/BSA przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby uwidocznić filamenty aktynowe, inkubuj zarodki w 1 μg/ml falloidyny w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wybarwić jądra, dodając 5 ml PBS zawierającego 1 μg/ml DAPI (dichlorowodorek 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj zarodki trzy razy krótko PBS.</li>
	<li>Przenieś zarodki na szkiełko podstawowe i zalej je kroplą oleju mineralnego.</li>
	<li>Wykonuj zdjęcia w powiększeniu 1,000x za pomocą mikroskopu konfokalnego ze wzbudzeniem o odpowiedniej długości fali.</li>
</ol>
5. Przygotowanie plazmidów Neogenin-RFP i Neogenin-siRNA GFP
<ol>
	<li>Subklon cDNA kodujący mysią neogeninę do wektora zawierającego białko czerwonej fluorescencji (RFP), co skutkuje RFP z flagą neogeniny.</li>
	<li>Subklonuj małe RNA spinki do włosów ukierunkowane na neogeninę do wektora zawierającego białko szmaragdowozielone fluorescencyjne (EmGFP), w wyniku czego powstaje neogenina pcDNA-EmGFP-miR-(pokazana na rycinie 1).</li>
	<li>Amplifikuj zarówno plazmidy neogenin-flag-RFP, jak i pcDNA-EmGFP-miR-neogenin i oczyść je konwencjonalnymi metodami.</li>
	<li>Dostosuj końcowe stężenia plazmidów do ~1,0 μg/ml w sterylnym buforze Tris-EDTA (TE).</li>
</ol>
6. Mikroiniekcja plazmidów do zarodków 2-PN
<ol>
	<li>Pozbawione zarodki 2-PN przemyć raz, krótko, świeżą pożywką M16.</li>
	<li>Odwirować zarodki 2-PN przez 10 minut przy 1 000 x g w wirówce stołowej, aby umożliwić obserwację przedjądrzy.</li>
	<li>Inkubować zarodki w mikrokropli 20-30 μl pożywki M16 na zarodek pod olejem mineralnym w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez dodatkowe 1-2 godziny.</li>
	<li>Wytwarzanie pipet iniekcyjnych i pipet przytrzymujących poprzez ciągnięcie rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego (Ø = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) ze ściągaczem mechanicznym.</li>
	<li>Pipety iniekcyjne z końcówkami i polerowanymi otworami o długości końcówki <500 μm i średnicy wewnętrznej końcówki 1-2 μm należy wykonać za pomocą mikroszlifierki i mikrofałszerza.</li>
	<li>Pipety trzymające należy wytwarzać w taki sposób, aby miały końcówki i polerowane otwory o średnicy wewnętrznej 20 μm i średnicy zewnętrznej 100 μm.</li>
	<li>Do pipet iniekcyjnych należy napełnić odpowiednią ilością (>200 nl) roztworu plazmidu o stężeniu 1,0 μg/μl.</li>
	<li>Mikrowstrzyknąć ~ 10 pl roztworu plazmidu dla każdego zarodka 2-PN do jednego z przedjądrzy za pomocą mikrowstrzykiwacza podłączonego do zmotoryzowanego mikromanipulatora; podczas tego procesu utrzymuj zarodki na miejscu, stosując podciśnienie za pomocą pipety trzymającej.</li>
	<li>Po mikroiniekcji należy przemyć zarodki 2-PN 3 razy świeżą pożywką M16 przez mniej niż 1 minutę za każdym razem.</li>
	<li>Hodować zarodki 2-PN w kropli świeżej pożywki M16 na plastikowym naczyniu hodowlanym pokrytym kroplą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu pożywki.</li>
	<li>Obserwuj zarodki w odstępach 24-godzinnych pod mikroskopem odwróconym z kontrastem interferencyjnym (DIC) przy 200-krotnym powiększeniu.</li>
</ol>

<ol><li>Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+molecular+regulation+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst.</a> Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).</li>
<li>Sasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+trophectoderm+fate+specification+in+preimplantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development.</a> Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).</li>
<li>Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tead4+is+required+for+specification+of+trophectoderm+in+pre-implantation+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse.</a> Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).</li>
<li>Ovitt, C. E., Schöler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+Oct-4+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo.</a> Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Oocyte+Microinjection%2C+Maturation+and+Ploidy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment.</a> J. Vis. Exp. (53), e2851(2011).</li>
<li>Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mouse+blastocyst+genes+that+are+down+regulated+by+double-stranded+RNA-mediated+knockdown+of+Oct-4+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression.</a> Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).</li>
<li>Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithin+in+mouse+preimplantation+development%3A+Its+role+in+compaction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction.</a> Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+DNA-Specific+Stain+Methyl+Green+in+the+Fluorescent+Labeling+of+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos.</a> J. Vis. Exp. (99), e52769(2015).</li>
<li>Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neogenin+as+a+receptor+for+early+cell+fate+determination+in+preimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos.</a> PLoS One. 9 (7), e101989(2014).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

W niniejszym protokole demonstrujemy nowatorskie metody mikroiniekcji materiałów genetycznych, cDNA lub shRNA, do zarodków myszy 2-PN w celu zbadania roli neogeniny we wczesnym różnicowaniu komórek podczas embriogenezy myszy. Modyfikacja genetyczna zarodków preimplantacyjnych jest potężną techniką pozwalającą na odkrycie kluczowych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw np. określenia pierwszej linii komórkowej. Modyfikacja genetyczna jest jedną z najczęściej stosowanych metod ustalania funkcji ...

Rozwój embrionalny przed implantacją można podzielić na kilka różnych etapów, od stadium jednokomórkowego do moruli i blastocysty. Wiele dowodów sugeruje, że polaryzacja i wskazówki pozycyjne odgrywają rolę we wczesnym określaniu losu komórek w trofektodermie (TE) i wewnętrznej masie komórkowej (ICM). Jednak natura sygnałów, sposób, w jaki są one przekształcane w sygnały komórkowe, oraz konteksty fizjologiczne, w których takie sygnały są w stanie zainicjować różnicowanie linii komórkowych, nie są znane. Te zróżnicowane komórki ulegają następnie specjalizacji, zaczynając nabierać charakterystycznych struktur i funkcji potrzebnych do prawidłowego powstania zarodka i wzrostu łożyska1-3.
Zarodki przedimplantacyjne są szczególnie podatne na manipulację poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie zmodyfikowanych materiałów genetycznych, takich jak siRNA lub docelowe cDNA, a zatem mogą być wykorzystywane do badania konkretnych cząsteczek docelowych. Coraz powszechniejsze staje się przekonanie, że analiza genetyczna zarodków kręgowców ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat rozwoju embrionalnego4. Precyzyjne wprowadzenie genu typu dzikiego lub zmutowanej formy do zarodka w odpowiednim czasie, aby osiągnąć zysk lub utratę funkcji genu, znacznie ułatwiło badania nad genami regulowanymi rozwojowo. Utrata i wzmocnienie funkcji poprzez mikrowstrzyknięcie materiału genetycznego do poszczególnych wczesnych zarodków zwierząt innych niż ssaki i ssaków jest stosunkowo proste ze względu na ich duże rozmiary i dużą chłonność5. Mikroiniekcja jest zwykle wykonywana przy użyciu wektorów niewirusowych. Szczególną przewagę wykorzystano dzięki łatwości stosowania wektorów niewirusowych w porównaniu z wektorami wirusowymi i transgenami. Opracowano system szybkiej ekspresji utraty lub wzmocnienia funkcji w zarodkach myszy, który pozwala nam na analizę i zrozumienie funkcji genów w embriologii kręgowców6,7.
Fluorescencyjne znakowanie zarodków znacznie ułatwiłoby selekcję mikrowstrzykniętych lub genetycznie modyfikowanych zarodków, a jednocześnie umożliwiłoby pośrednie ilościowe określenie poziomu ekspresji mikroiniekcyjnego siRNA lub cDNA na podstawie intensywności fluorescencji8. Aby osiągnąć to znakowanie, białka fluorescencyjne cDNA, GFP lub RFP, są wstrzykiwane jednocześnie jako konstrukty fuzyjne lub oddzielnie. Intensywność fluorescencji GFP lub RFP ujawnia zakres ekspresji siRNA lub obcego DNA, aby zapewnić, że osiągnięto utratę lub wzmocnienie funkcji.
Tutaj prezentujemy protokół mikromanipulacji dla techniki utraty i wzmocnienia funkcji, który pozwolił nam zidentyfikować neogeninę jako receptor, który przekazuje sygnały zewnątrzkomórkowe ważne we wczesnym różnicowaniu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

<table><tbody><tr><td>M16 średni,</td> <td>Gibco BRL (Grand Island, NY)</td> <td>M7292 LOT # 11A832</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica,&nbsp;</td><td>Dako (Glostrup, Dania)</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Folligon, Intervet, Holandia</td><td>G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td><td></td></tr><tr><td>ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej i surowicy ciężarnej klaczy&nbsp;</td><td>(Intervet, Holandia)</td><td>(invitrogen , 15596-026)</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&reg; III Technologie życia z odwrotną transkryptazą</td><td></td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Premiks PCR</td><td>&nbsp;( Bioneer, Daejon, Korea Południowa)</td><td>GenDEPOT, A0224-050</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (klasa molekularna)</td><td>BioRad</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS</td><td>Affymetrix USA</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>poliklonalne królicze przeciwciało anty-neogeniczne</td><td>Santa Cruz Biotechnology, US</td><td>SC-15337</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 znakowane przeciwciało anty-królicze</td><td>Sondy molekularne (Invitrogen, USA)</td><td>A-11094</td><td></td></tr><tr>Sondy molekularne przeciwciała<td>anty-króliczego znakowane Alexa fluor 555</td><td>(Invitrogen, USA)</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 555</td><td>Sondy molekularne falloidyny (Invitrogen, USA)</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki RGM-C/Hemojuvelin</td><td>R&;D systemy</td><td>3720-RG</td><td></td></tr><tr><td>wszystkie konstrukcje plazmidowe&nbsp;</td><td>Prof. Wen Cheng Xiong na Uniwersytecie Nauk o Zdrowiu w Gruzji (Agusta, Georgia).</td><td></td><td>Do niniejszej sprawy badania zostały uprzejmie dostarczone przez&nbsp;</td></tr><tr><td>Neon&reg; &nbsp; System transfekcji</td><td>lifetech</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscrope</td> System mikrokonserwacji <td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>z mikrowtryskiwaczem Nikon</td><td>Nikon</td><td>Narishige ONM-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Uchwyt</td><td>GASTIGHT #1750</td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Narishige</td><td>IM 16</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Nikon Narishige</td><td>Młynek Narishige MF-900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ściągacz Narishige</td><td>EG400</td><td></td></tr><tr><td>Sutter</td><td>Instrumnet firmy</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>EW-39320-16</td><td></td></tr><tr><td>Veriti&reg; 384-Well Thermal Cycler&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>4388444</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Techniki wyciszania i nadekspresji genów są kluczowe dla identyfikacji genów zaangażowanych w rozwój embrionalny. Bezpośrednia modyfikacja genu docelowego w zarodkach preimplantacyjnych umożliwia badanie mechanizmów leżących u podstaw genów zaangażowanych na przykład w różnicowanie komórek w trofektodermę (TE) i wewnętrzną masę komórkową (ICM). W tym miejscu opisujemy protokół, który bada rolę neogeniny jako autentycznego receptora do wstępnego określania losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy. Po pierwsze, omawiamy eksperymentalne manipulacje, które zostały wykorzystane do uzyskania i utraty funkcji neogeniny poprzez mikroiniekcję neogeniny cDNA i shRNA; Skuteczność tego podejścia została potwierdzona przez silną korelację między poziomami ekspresji białka czerwonej fluorescencji (RFP) lub białka zielonej fluorescencji (GFP) a immunocytochemiczną kwantyfikacją ekspresji neogeniny. Po drugie, nadekspresja neogeniny w preimplantacyjnych zarodkach myszy prowadzi do normalnego rozwoju ICM, podczas gdy knockdown neogeniny powoduje nieprawidłowy rozwój ICM, co sugeruje, że neogenina może być receptorem, który przekazuje sygnały zewnątrzkomórkowe, aby napędzać blastomery do wczesnych losów komórek. Biorąc pod uwagę sukces tego szczegółowego protokołu w badaniu funkcji nowego receptora specyficznego dla stadium rozwoju embrionalnego, sugerujemy, że ma on potencjał, aby pomóc w eksploracji i identyfikacji innych genów specyficznych dla danego stadium podczas embriogenezy.

Odkryliśmy, że neogenina jest przejściowo ekspresjonowana podczas wczesnych etapów rozwoju embrionów myszy przed implantacją, pojawiając się już w stadium 2 komórek i utrzymując się do wczesnej moruli, natomiast staje się niedoborowa w stadium późnej moruli i blastocysty (Ryc. 2A). Ponadto dystrybucja przestrzenna neogeniny była ograniczona głównie do komórek zewnętrznych. Wyniki analizy RT-PCR były zgodne z wczesnym i przejściowym charakterem ekspresji neogeniny, która o...

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie manipulacji polegających na utracie i wzmocnieniu funkcji (loss- and gain-of-function) w celu zidentyfikowania cząsteczek specyficznych dla danego etapu, które kontrolują różnicowanie wewnętrznej masy komórkowej embrionów myszy podczas okresu przedimplantacyjnego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie dotyczące wczesnego wyzwalania losów komórek w podstawowej biologii rozwoju, a także w biologii komórek macierzystych, naukach o zwierzętach i biotechnologii rozrodczej, takiej jak klonowanie zwierząt. Głównym celem tej techniki jest wykorzystanie receptorów specyficznych dla danego etapu oraz odpowiednich ligandów w celu zwiększenia ekspresji wyłącznie czynników specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionu.Niniejszy protokół został opracowany we współpracy z wieloma laboratoriami. Proces ten zaprezentują moi współpracownicy: profesor Sang Jin Lee oraz jego student studiów doktoranckich, Yong Il Cho. Od 18 do 20 godzin po ostatnim wstrzyknięciu należy uśmiercić ciężarne samice poprzez zatrucie dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie szyi.Następnie otwórz stronę grzbietową i przetnij wewnętrzną warstwę za pomocą precyzyjnych nożyczek. Zlokalizuj i chwyć rogi macicy za pomocą precyzyjnej pęsety, a następnie delikatnie wyciągnij je z jamy ciała wraz z macicą, jajowodem, jajnikiem i poduszkami tłuszczowymi. Następnie przetnij obszar między jajowodem a jajnikiem za pomocą precyzyjnych nożyczek.Następnie ponownie ustaw pęsetę i przetnij macicę w pobliżu jajowodu, pozostawiając przytwierdzony co najmniej jeden centymetr górnej części macicy. Teraz przenieś ampułę jajowodu do kropli pożywki M16 pokrytej olejem mineralnym na 35 milimetrowej płytce Petri w temperaturze pokojowej. Zbierz jajowody od kilku myszy na tej samej płytce.Po przygotowaniu igły do strzykawki 1 cc, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy za pomocą precyzyjnej pęsety chwycić i wprowadzić igłę do końca jajowodu. Następnie należy delikatnie nakłuć i wycisnąć masę cumulus w fazie kropli medium. Pod stereomikroskopem, używając sterylnej pipety szklanej, należy odzyskać zarodki 2-PN wraz z otaczającymi je masami cumulus i przenieść je do nowej szalki Petriego.Następnie rozdziel komórki cumulus, kąpiąc tkanki w jednym mililitrze roztworu hialuronidazy. Teraz inkubuj naczynie w temperaturze 37 °C przez 5 do 10 minut. Kolejnym krokiem jest denudacja embrionów.Używając pipety szklanej, delikatnie przepływaj roztwór kąpieli, aby uwolnić komórki cumulus z otaczających embrionów. Następnie przemyj odziomowane embriony 30 do 50 mililitrów świeżego PBS na każdy embrion. Przepłucz je w ten sposób trzykrotnie.Następnie przenieś embriony do 35 milimetrowej plastikowej szalki z pożywką M16 plus BSA i przechowuj je w inkubatorze z nawilżaniem do czterech godzin przed mikroiniekcją. Przed mikroiniekcją krótko przemyj odzierane z komórek cumulusa embriony 2-PN za pomocą 1 ml świeżej pożywki M16. Następnie przenieś embriony wraz z roztworem do probówki do wirowania i wiruj je przy 1 000 G przez 10 minut.Następnie przenieś każdy embrion do naczynia hodowlanego zawierającego od 20 do 30 µL pożywki M16. Spowoduje to uwidocznienie prątni. Przykryj pożywkę cienką warstwą oleju mineralnego i inkubuj embriony w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez jedną do dwóch godzin.W międzyczasie za pomocą mechanicznego wyciągacza przygotować pipety do iniekcji oraz pipety trzymające z kapilar borokrzemianowych. Następnie, używając mikro-szlifierki i mikro-kuźni, wykonać pipety do iniekcji z tępymi końcówkami i wypolerować je do uzyskania otworów o szerokości 2 µm. Długość końcówki powinna być mniejsza niż 500 µm.Podobnie przygotuj pipety trzymające, wykonując tępe końcówki i polerując ich otwory do średnicy wewnętrznej 20 mikronów oraz średnicy zewnętrznej 100 mikronów. Następnie napełnij pipety do wstrzykiwania co najmniej 200 nanolitrami roztworu plazmidu o stężeniu jednego mikrograma DNA na mikrolitr. W dalszej kolejności zamocuj pipetę do wstrzykiwania w zmotoryzowanym mikromanipulatorze.Następnie ustaw wtryskiwacz na impulsy o objętości około 10 picoliterów. W celu przeprowadzenia mikroiniekcji unieruchom embriony, wykorzystując podciśnienie z pipety holdingowej. Następnie przesuń i umieść końcówkę pipety iniekcyjnej przy błonie komórkowej, tuż nad jednym z jąder przednim.Następnie przebij błonę komórkową, wprowadź igłę głębiej do pronukleusu i wykonaj wtrysk 10 picoliter. Po mikroiniekcji zbierz wstrzyknięte embriony i przemyj je trzykrotnie świeżym medium M16. Każde przemywanie może trwać mniej niż minutę.Następnie przystąp do hodowli zarodków, przykrywając pożywkę M16 kroplą oleju mineralnego w celu zapobieżenia jej odparowaniu i umieszczając każdy zarodek na plastikowej płytce hodowlanej na kropli pożywki M16. Co 24 godziny obserwuj zarodki za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego z optyką DIC 488 nanometr lub 555 nanometr przy powiększeniu 200x. Neogenina jest przejściowo ekspresjonowana podczas wczesnych etapów rozwoju przedimplantacyjnego.Pojawia się już na etapie 2 komórek i utrzymuje się do wczesnego etapu moruli. Jego ekspresja jest głównie ograniczona przestrzennie do zewnętrznej strony komórek. Poziomy ekspresji neogeniny modyfikowano poprzez mikroiniekcję zygot 2-PN wektorami cDNA neogeniny lub wektorami zawierającymi krótkie napinki RNA przeciwko neogeninie.Wskaźnikami były koekspresyjne białka RFP i GFP. Poziom ekspresji neogeniny potwierdzono zarówno za pomocą immunofluorescencji, jak i immunoblottingu. Nie stwierdzono istotnych różnic morfologicznych pomiędzy zarodkami z utratą neogeniny a zarodkami z nadekspresją neogeniny; oba typy zarodków rozwijały się w ten sam sposób aż do stadium blastocysty.Jednak rozwój ICM był mniej wyraźny w embrionach z utratą neogeniny, co oceniano na podstawie liczby komórek ICM wykazujących obecność Oct 3 i 4. Ponadto, w embrionach z nadekspresją neogeniny odnotowano większą liczbę komórek ICM wykazujących obecność Oct 3 i 4 na jedną blastocystę. Obserwację tę potwierdzono następnie za pomocą analizy rtPCR.W embrionach z nadekspresją neogeniny poziomy ekspresji Oct3, Oct4, SOX2 oraz Nanog były znacznie podwyższone, w przeciwieństwie do pomijalnych zmian w ekspresji Cdx2 i Tead4. Po opanowaniu techniki, ta część protokołu dotycząca mikroiniekcji może zostać wykonana w około jedną godzinę. Podczas realizacji tego protokołu należy pamiętać, że embriony 2-PN są zamrożone, a optymalizacja izolacji, mikroiniekcji oraz hodowli embrionów ma na celu zminimalizowanie uszkodzeń.Uzupełniając tę metodę proceduralną, można przeprowadzić badania, takie jak studia nad lekami, aby odpowiedzieć na wieloletnie pytania dotyczące szlaków sygnalizacyjnych i innych zagadnień.

loss-gain-function-approach-to-investigate-early-cell-fate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.

Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Poznaj metodę utraty i wzmocnienia funkcji do badania wczesnych decyzji losu komórek w zarodkach myszy. Technika ta pozwala identyfikować receptory wpływające na różnicowanie masy komórek wewnętrznej.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy (Wideo) | JoVE Journal

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Przeglądaj więcej filmów