Name: Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Poznaj metodę analizy aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3 zależnej od fosforylacji przy użyciu elektroforezy SDS-PAGE i natywnej z immunodetekcją. Technika ta pozwala rozróżnić różne formy aktywowanego IRF3 w odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują byłym i obecnym członkom laboratorium za opracowanie protokołów. Prace były finansowane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) [grant # MOP-130527] oraz przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych [NSERC-355306-2012]. NG jest laureatem Tier II Canada Research Chair. AR jest stypendystą programu szkoleniowego Sieci Badań nad Zdrowiem Układu Oddechowego z Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

UWAGA: Protokół został tutaj opisany z wykorzystaniem komórek A549 zainfekowanych wirusem Sendai (SeV). Jednakże protokół SDS-PAGE i natywnego PAGE działa również we wszystkich przetestowanych dotychczas typach komórek ludzkich i mysich, w szczególności w komórkach mieloidalnych stymulowanych różnymi bodźcami aktywującymi IRF3 9,15,19,24,25.
1. Infekcja komórek A549
<ol>
	<li>Hodować komórki A549 w płytce 15 cm w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w 20 ml pożywki F12K/Ham zawierającej 10% inaktywowanej cieplnie płodowej surowicy bydlęcej (HI-FBS) oraz 1% L-glutaminy (pełna pożywka F12K/Ham). 
	UWAGA: Wszystkie roztwory stosowane do hodowli komórkowej i zabiegów muszą być sterylne.</li>
	<li>Na 24 godziny przed infekcją odessać pożywkę i przemyć komórki 10 ml destylowanego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (D-PBS) w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Do każdej płytki dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA tak, aby pokryć komórki, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 min.</li>
	<li>Przerwać inkubację w momencie, gdy komórki zaczną odrywać się od płytki, delikatnie opukując ją dłonią. Inaktywować trypsynę, dodając 10 ml uprzednio podgrzanej pełnej pożywki F12K/Ham na płytkę, a następnie przenieść komórki do stożkowej probówki 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 350 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 8 ml pełnej pożywki F12K/Ham, aby uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiać komórki w gęstości 1 x 106 komórek na płytkę 60 mm w 4 ml uprzednio podgrzanej pełnej pożywki F12K/Ham. Inkubować przez 20–24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po 20–24 godzinach komórki tworzą monowarstwę o 90% konfluencji (co odpowiada 1,5 x 106 komórkom).</li>
	<li>Usunąć pożywkę i przemyć komórki 2 ml bezzsrytkowej pożywki F12K/Ham (SFM). Dodać 2 ml świeżej pożywki SFM na płytkę 60 mm.</li>
	<li>Rozmrozić na lodzie alikwot wirusa Sendai (SeV) (przechowywany w alikwotach w temperaturze -80 °C) i krótko wymieszać na wortexie.</li>
	<li>Rozcieńczyć wirusa w uprzednio podgrzanej pożywce SFM, aby uzyskać stężenie 60 HAU/100 µl. Wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie dodać 100 µl rozcieńczonego wirusa na płytkę, aby przeprowadzić infekcję w dawce 40 HAU/106 komórek. Do płytki kontrolnej nieinfekowanej nie dodawać wirusa.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Podczas pierwszej godziny infekcji potrząsać płytkami ręcznie 3 lub 4 razy lub użyć automatycznego wytrząsarki orbitalnej bądź kołyszącej umieszczonej bezpośrednio w inkubatorze.</li>
	<li>Po 2 godzinach od infekcji dodać 2 ml pożywki F12K/Ham zawierającej 20% HI-FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 10% HI-FBS.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 1, 4 i 7 godzin, aby osiągnąć całkowity czas infekcji wynoszący odpowiednio 3, 6 i 9 godzin. W każdym z tych punktów czasowych przejść do kroku 2.1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktów z całych komórek (WCE)
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę do infekcji. Zebrać komórki poprzez zdrapywanie w 1 ml lodowatego D-PBS i przenieść zawiesinę komórkową do schłodzonej rurki do wirowania o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Osadzić komórki poprzez wirowanie przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 s i ostrożnie odlać wszystkie pozostałości D-PBS. 
	UWAGA: Na tym etapie osad komórkowy można bezpośrednio poddać ekstrakcji białek lub zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie lub w kąpieli z suchego lodu i etanolu, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu lizy.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy zawierający 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% glicerolu i 1% Nonidet P-40 w wodzie dejonizowanej (ddH2O). Bezpośrednio przed użyciem dodać inhibitory proteaz (1 µg/ml leupeptyny i 2 µg/ml aprotininy) oraz inhibitory fosfataz (5 mM fluorku sodu, 1 mM aktywowanego ortowanadanu sodu, 2 mM p-nitrofenylofosforanu i 10 mM β-glicerofosforanu pH 7,5). 
	UWAGA: Bufor do lizy bez inhibitorów można przechowywać w temperaturze 4 °C. Specyficzny protokół aktywacji ortowanadanu sodu opisano w Tabeli specyficznych odczynników/sprzętu.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 70 µl buforu do lizy. Zazwyczaj stężenie lizatu będzie wynosić około 2 µg/µl.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 20 min. Zamrozić gwałtownie lizat poprzez inkubację w kąpieli z ciekłego azotu przez 15 s. Rozmrozić lizat w RT do całkowitego rozpuszczenia i mieszać na vortexie przez 10 s. Powtórzyć cykl zamrażania/rozmrażania/mieszania 3 razy.
	<ol>
		<li>Alternatywnie etap zamrażania można przeprowadzić w kąpieli z etanolu i suchego lodu przez 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Przenieść nadsącz (odpowiadający WCE) do nowej, schłodzonej rurki do wirowania o pojemności 1,5 ml. Przechowywać WCE przez cały czas na lodzie.</li>
	<li>Oznaczyć ilość białek, stosując dowolną procedurę kwantyfikacji białek kompatybilną z buforem do lizy, taką jak test białek metodą Bradforda26.</li>
</ol>
3. Rozdział WCE za pomocą wysokorozdzielczego SDS-PAGE
<ol>
	<li>Przygotuj trzy żele do elektroforezy denaturującej.
	<ol>
		<li>Do detekcji form IRF3 wlej dwa żele o długości co najmniej 16 cm z żelem rozdzielającym składającym się z 7,5% akryloamidu/bis-akryloamidu (37,5:1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 1% persiarczanu amonu i 0,1% TEMED w ddH2O oraz żelem koncentrującym składającym się z 4% akryloamidu, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% persiarczanu amonu i 0,1% TEMED w ddH2O. 
		Uwaga! Akryloamid, TEMED i SDS są toksyczne i/lub drażniące. Należy nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.</li>
		<li>Do detekcji białek SeV wlej jeden żel o długości co najmniej 8,5 cm o charakterystyce podobnej do żelu opisanego w punkcie 3.1.1, z wyjątkiem tego, że żel rozdzielający zawiera 12% akryloamidu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdenaturuj WCE otrzymany w kroku 2.6, dodając w stosunku 1:4 (v/v) 5x bufor do nakładania (125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p/v) glicerolu, 0,0005% błękitu bromofenolowego i 25% β-merkaptoetanolu w ddH2O), a następnie podgrzej w temperaturze 100 °C przez 10 min. Krótko odwiruj probówki, aby zebrać kondensat utworzony w zakrętce. 
	Uwaga! β-merkaptoetanol jest toksyczny przy wdychaniu. Należy nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.</li>
	<li>Zamontuj żele w aparaturze do elektroforezy. Wypełnij komory górną i dolną buforem do prowadzenia zawierającym 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS i 192 mM glicyny w wodzie destylowanej (dH2O).</li>
	<li>Nałóż 14 µl standardu masy cząsteczkowej do jednego dołka każdego żelu 16 cm oraz 7 µl standardu masy cząsteczkowej do jednego dołka żelu 8,5 cm. Nałóż 30 µg zdenaturowanego WCE (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 3.2) na dołek dwóch żeli przygotowanych w kroku 3.1.1 do detekcji form IRF3. Nałóż 8 - 10 µg zdenaturowanego WCE (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 3.2) na dołek żelu przygotowanego w kroku 3.1.2 do analizy SeV.</li>
	<li>Prowadź elektroforezę przy stałym prądzie 30 mA, aż front migracji dotrze do dna żelu. 
	UWAGA: Migracja trwa zazwyczaj około 3 h dla żelu 16 cm i 45 min dla żelu 8,5 cm.</li>
	<li>Przejdź do transferu na membrany nitrocelulozowe (krok 5).</li>
</ol>
4. Analiza dimeryzacji IRF3 metodą Native-PAGE
UWAGA: Metoda ta została pierwotnie opisana przez zespół dr. T. Fujity27.
<ol>
	<li>Przygotować bufory do elektroforezy do komory górnej (-) i dolnej (+). Bufor do komory górnej składa się z 25 mM Tris-HCl pH 8.4 (RT), 192 mM glicyny i 1% deoksycholanu sodu (DOC) w ddH2O. Bufor do komory dolnej zawiera 25 mM Tris-HCl pH 8.4 (RT) i 192 mM glicyny w ddH2O. 
	UWAGA: Bufory do elektroforezy do komory górnej i dolnej można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Należy jednak upewnić się, że zostały one ogrzane do temperatury RT przed przeprowadzeniem elektroforezy.</li>
	<li>Odlać niedenaturujący żel rozdzielający o długości co najmniej 8,5 cm zawierający 7,5% akryloamidu/bis-akryloamidu (37,5:1), 375 mM Tris-HCl pH 8.8 (RT), 1% persiarczanu amonu i 0,1% TEMED w ddH2O.</li>
	<li>Przeprowadzić wstępny rozbieg żelu przy stałym natężeniu prądu 40 mA przez 30 min w lodzie. Wcisnąć aparat elektroforetyczny w lód mniej więcej do poziomu buforu w komorze dolnej. Ważne jest, aby żel nie znajdował się w lodzie.</li>
	<li>Podczas wstępnego rozbiegu zmieszać WCE przechowywany w lodzie z 2x buforem do nakładania native-PAGE w stosunku 1:1 (v/v), zawierającym 125 mM Tris-HCl pH 6.8 (RT), 30% glicerolu i 0,1% błękitu bromofenolowego w ddH2O.</li>
	<li>Niezwłocznie po zakończeniu wstępnego rozbiegu nanieść 8 - 10 µg WCE (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 4.4).</li>
	<li>Prowadzić elektroforezę przy stałym natężeniu prądu 25 mA w lodzie, zgodnie z opisem wstępnego rozbiegu, aż front migracji dotrze do dolnej krawędzi żelu (około 40 min).</li>
</ol>
5. Analiza immunoblottingu gatunków IRF3
<ol>
	<li>Przygotować bufor do transferu zawierający 25 mM Tris-Base i 192 mM glicyny w ddH2O. Bufor do transferu schłodzić do 4 °C przed użyciem.</li>
	<li>Namoczyć trzy arkusze membrany nitrocelulozowej, docięte do rozmiaru nieco większego niż żele, w pudełku plastikowym lub szklanym zawierającym bufor do transferu. Oznaczyć orientację membrany poprzez odcięcie jednego narożnika. Bufor do transferu można wykorzystać ponownie do 3 razy. Bufor przechowywać w temperaturze 4 °C pomiędzy użyciami.</li>
	<li>Wyjąć żele z form (SDS-PAGE i native-PAGE) i odciąć jeden narożnik każdego żelu w celu właściwej orientacji.
	<ol>
		<li>W przypadku native-PAGE inkubować żel w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu przez co najmniej 30 min w buforze do elektroforezy SDS-PAGE, aby usunąć DOC przed przeniesieniem do buforu do transferu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować żele (SDS-PAGE i native-PAGE) w buforze do transferu przez 5 - 10 min.</li>
	<li>Zmontować kanapkę transferową dla każdego żelu w kasecie do transferu z membraną skierowaną w stronę elektrody dodatniej (podkładka z pianki/papier filtracyjny/membrana/żel/papier filtracyjny/podkładka z pianki). Należy uważać, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza spomiędzy warstw kanapki.</li>
	<li>Przeprowadzić transfer zgodnie z zaleceniami producenta dla użytego urządzenia do transferu. 
	UWAGA: Wszystkie inkubacje i płukania w kolejnych krokach należy przeprowadzać na platformie z wytrząsarką kołyszącą lub orbitalną.</li>
	<li>Po zakończeniu czasu transferu inkubować membrany przez 15 min w roztworze utrwalającym zawierającym 7% kwasu octowego, 40% etanolu i 3% glicerolu w ddH2O. Płukać membrany 3x przez 5 min w PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4 w dH2O). 
	Ostrzeżenie! Kwas octowy jest toksyczny, drażniący i łatwopalny. Należy stosować rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem. 
	UWAGA: Roztwór utrwalający można wykorzystać wielokrotnie.</li>
	<li>W przypadku membrany z native-PAGE przejść bezpośrednio do kroku 5.11.</li>
	<li>Szybko opłukać trzy membrany SDS-PAGE w dH2O przed inkubacją przez 1 min w roztworze czerwieni ponceau zawierającym 6,57 mM czerwieni ponceau i 1% kwasu octowego w ddH2O. 
	UWAGA: Roztwór czerwieni ponceau można wykorzystać kilkukrotnie.</li>
	<li>Płukać membrany w dH2O, aż tło będzie wystarczająco białe, aby widoczne były czerwone prążki białek. Zaznaczyć markery ołówkiem i odciąć nadmiar membrany wokół białek. Odbarwić membrany poprzez inkubację przez 5 min w PBS przy mieszaniu.</li>
	<li>Inkubować membrany przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc&#160;w 4 °C w roztworze blokującym (PBS zawierający 0,05% Tween 20 i 5% beztłuszczowego mleka w proszku (PBS-T-milk). Płukać membrany 3x przez 5 min w PBS-T. 
	UWAGA: Płukanie w PBS-T jest opcjonalne i wymagane tylko w przypadku stosowania przeciwciał rozcieńczonych w PBS-T zawierającym 5% albuminy surowicy bydlęcej (PBS-T-BSA) (Rysunek 1 i Tabela 1) w następnym kroku.</li>
	<li>Inkubować cztery membrany (z SDS-PAGE i native-PAGE) z przeciwciałami pierwszorzędowymi zgodnie z kolejnością szczegółowo opisaną na Rysunku 1 i w Tabeli 1. Przeprowadzić płukanie 5x przez 5 min w PBS-T.</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 1" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig1.jpg" /> 
Rysunek 1. Sekwencja analiz immunoblottingowych. Schemat przedstawia poszczególne żele SDS-PAGE oraz native-PAGE wymagane do wykrycia różnych form fosforylowanych oraz monomerów/dimerów IRF3. Opisano konkretną kolejność stosowania przeciwciał na membranie uzyskanej z każdego żelu w procedurze immunoblottingu. Należy zauważyć, że przeciwciała anty-aktynowe są stosowane w pierwszej kolejności, aby zapewnić równą ilość naniesionych próbek przed zastosowaniem innych specyficznych przeciwciał. Alternatywna sekwencja, w której przeciwciała anty-aktynowe są stosowane po przeciwciałach anty-phospho-IRF3, również jest skuteczna. Etap strippingu jest przeprowadzany pomiędzy przeciwciałami anty-aktynowymi a anty-SeV lub pomiędzy przeciwciałami anty-phospho-IRF3 a anty-IRF3 ze względu na nakładanie się sygnałów o podobnej masie cząsteczkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53723/53723fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Przeciwciała pierwszorzędowe</td>
			<td >Rozcieńczenie</td>
			<td >Bufor do rozcieńczania</td>
			<td >Inkubacja</td>
			<td >Przeciwciała drugorzędowe</td>
			<td >Uwagi</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Anti-Actin</td>
			<td >1/10,000</td >
			<td >PBS-T-BSA</td >
			<td >15 min w RT</td >
			<td >Anti-mouse</td >
			<td >Stosować po SDS-PAGE&#160; 
			Rozcieńczone przeciwciała można wykorzystać wielokrotnie, jeśli są przechowywane w 4 °C w obecności 0.02 % azotku sodu.</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Anti-IRF3-P-Ser386</td>
			<td >1/200</td >
			<td >PBS-T-BSA</td >
			<td >O/N w 4 °C</td >
			<td >Anti-rabbit</td >
			<td >Stosować po Native-PAGE.&#160; 
			Nie zaleca się ponownego wykorzystania rozcieńczonego przeciwciała&#160;</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Anti-IRF3-P-Ser396</td>
			<td >1/10,000</td >
			<td >PBS-T-BSA</td >
			<td >O/N w 4 °C</td >
			<td >Anti-rabbit</td >
			<td >Stosować po SDS-PAGE.&#160; 
			Nie zaleca się ponownego wykorzystania rozcieńczonego przeciwciała. Anti-IRF3-P-396 jest również dostępne w firmie Cell Signaling. Optymalne rozcieńczenie dla tego przeciwciała określono jako 1/1,000, lecz może ono różnić się w zależności od partii.&#160;&#160;</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Anti-IRF3-P-Ser398</td>
			<td >1/10,000</td >
			<td >PBS-T-BSA</td >
			<td >O/N w 4 °C</td >
			<td >Anti-rabbit</td >
			<td >Stosować po SDS-PAGE.&#160; Nie zaleca się ponownego wykorzystania rozcieńczonego przeciwciała&#160;</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Anti-IRF3 full length</td>
			<td >1/7,500</td >
			<td >PBS-T-milk</td >
			<td >3 h w RT</td >
			<td >Anti-rabbit</td >
			<td >Stosować po SDS-PAGE.&#160;&#160; Przeciwciało Anti-IRF3 full length można stosować po native-PAGE, jednak jest ono mniej czułe w wykrywaniu monomeru. Rozcieńczone przeciwciała można wykorzystać wielokrotnie, jeśli są przechowywane w 4 °C w obecności 0.02 % azotku sodu.&#160;&#160;</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Anti-IRF3-NES</td>
			<td >0.5&#160; μg/ml</td >
			<td >PBS-T-milk</td >
			<td >3 h w RT</td >
			<td >Anti-rabbit</td >
			<td >Stosować po Native-PAGE. Rozcieńczone przeciwciała można wykorzystać wielokrotnie, jeśli są przechowywane w 4 °C w obecności 0.02 % azotku sodu.</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Anti-SeV</td>
			<td >1/14,000</td >
			<td >PBS-T-BSA</td >
			<td >3 h w RT</td >
			<td >Anti-rabbit</td >
			<td >Stosować po SDS-PAGE. Rozcieńczone przeciwciała można wykorzystać wielokrotnie, jeśli są przechowywane w 4 °C w obecności 0.02 % azotku sodu.</td >
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="6">UWAGA: Rozcieńczenie i bufor stosowany dla przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP muszą zostać zoptymalizowane, ponieważ różnią się one w zależności od producenta.</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Specyfikacja przeciwciał użytych w procedurze immunoblottingu.
<ol start="13">
	<li>Inkubować membrany z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) zgodnie ze szczegółami podanymi na Rysunku 1 i w Tabeli 1. Przemyć membrany 5x&#160;5 min w PBS-T, a następnie 2x&#160;5 min w PBS, aby całkowicie usunąć ślady Tweeny.</li>
	<li>Inkubować membrany przez 1 min w objętości odczynnika do wzmocnionej chemiluminescencji wystarczającej do całkowitego pokrycia membran. Osuszyć membrany za pomocą papieru filtracyjnego.</li>
	<li>Umieścić membrany w analizatorze obrazu luminescencyjnego, aby zwizualizować prążki immunoreaktywne.
	<ol>
		<li>Alternatywnie można przeprowadzić detekcję prążków immunoreaktywnych przy użyciu czułych filmów rentgenowskich.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć membrany 3x 5 min w PBS. 
	UWAGA: Na tym etapie membrany można przechowywać w stanie suchym. Jeśli jednak wymagane jest dalsze usuwanie przeciwciał (stripping), lepiej przeprowadzić stripping przed wysuszeniem membrany. Membrany można również przechowywać krótkoterminowo w PBS.</li>
	<li>W przypadku membran, które nie wymagają strippingu pomiędzy inkubacjami z przeciwciałami (patrz Rysunek 1), przejść bezpośrednio do kroku 5.20.</li>
	<li>Gdy stripping jest wymagany pomiędzy przeciwciałami (patrz Rysunek 1), inkubować membrany w uprzednio podgrzanym roztworze do strippingu zawierającym 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) oraz 0,7% β-merkaptoetanolu w ddH2O w temperaturze 50 °C przez 20 min przy regularnym mieszaniu. Przemyć membrany 3x 5 min w PBS. 
	UWAGA: Mieszanie podczas procedury strippingu jest kluczowe. Stripping można przeprowadzić w piecu do hybrydyzacji. Alternatywnie stripping można wykonać, zamykając membrany w plastikowych workach i zanurzając je w łaźni wodnej. W takim przypadku ważne jest przemieszanie membran 4–5 razy podczas inkubacji.</li>
	<li>Inkubować membrany przez 1 h w RT lub przez noc w 4 °C w PBS-T-milk.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.12 do 5.16 zgodnie z Rysunkiem 1.</li>
</ol>

<ol><li>Juang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+activation+of+interferon+A+and+interferon+B+gene+transcription+by+interferon+regulatory+factory-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).</li>
<li>Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+casein+kinase+II+phosphorylation+in+the+regulation+of+IRF-1+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity.</a> Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).</li>
<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+interferon+regulatory+factor+3+target+genes%3A+direct+involvement+in+the+regulation+of+interferon-stimulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes.</a> J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).</li>
<li>Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+receptors+and+the+innate+immune+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection.</a> Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).</li>
<li>Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+antiviral+response%3A+from+viral+invasion+to+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion.</a> Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).</li>
<li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Signaling+Pathways+Leading+to+the+Phosphorylation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3.</a> J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).</li>
<li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+IRF-3+reveals+mechanism+of+autoinhibition+and+virus-induced+phosphoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystal+structure+of+IRF-3+and+its+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Ser-386+of+interferon+regulatory+factor+3+as+critical+target+for+inducible+phosphorylation+that+determines+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation.</a> J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).</li>
<li>Clement, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+IRF-3+on+Ser+339+generates+a+hyperactive+form+of+IRF-3+through+regulation+of+dimerization+and+CBP+association%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association.</a> J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).</li>
<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+interferon-regulatory+factor+3-dependent+innate+antiviral+response+by+the+prolyl+isomerase+Pin1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1.</a> Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).</li>
<li>Wathelet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+infection+induces+the+assembly+of+coordinately+activated+transcription+factors+on+the+IFN-beta+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo.</a> Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).</li>
<li>Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor-3+is+an+in+vivo+target+of+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TAK1-JNK+cascade+is+required+for+IRF3+function+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response.</a> Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).</li>
<li>Solis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+TBK1+and+IKKepsilon+in+lipopolysaccharide-induced+activation+of+the+interferon+response+in+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages.</a> Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).</li>
<li>Soucy-Faulkner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NOX2+and+reactive+oxygen+species+for+efficient+RIG-I-mediated+antiviral+response+through+regulation+of+MAVS+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).</li>
<li>Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-dependent+phosphorylation+of+the+IRF-3+transcription+factor+regulates+nuclear+translocation%2C+transactivation+potential%2C+and+proteasome-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation.</a> Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).</li>
<li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+triggering+of+the+type+I+interferon+system+by+virus+infection%3A+activation+of+a+transcription+factor+complex+containing+IRF-3+and+CBP%2Fp300%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300.</a> EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).</li>
<li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimal+phosphoacceptor+site+required+for+in+vivo+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+response+to+virus+and+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA.</a> J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).</li>
<li>Bergstroem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+in+vivo+virus-targeted+phosphorylation+site+in+interferon+regulatory+factor-3+%28IRF3%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3).</a> J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser386+phosphorylation+of+transcription+factor+IRF-3+induces+dimerization+and+association+with+CBP%2Fp300+without+overall+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change.</a> Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).</li>
<li>Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modification+of+interferon+regulatory+factor+3+following+virus+particle+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry.</a> J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).</li>
<li>McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+inhibit+IRF3+phosphorylation+in+response+to+Toll-like+receptor-3+and+-4+by+targeting+TBK1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).</li>
<li>Oliere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+evades+type+I+interferon+antiviral+signaling+by+inducing+the+suppressor+of+cytokine+signaling+1+%28SOCS1%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1).</a> PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).</li>
<li>Kato, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li>
<li>tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+the+measles+virus+nucleocapsid+as+a+mechanism+of+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation.</a> J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).</li>
<li>Bibeau-Poirier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+I%7Bkappa%7DB+Kinase+%28IKK%29-Related+Kinases+Tank-Binding+Kinase+1%2FIKKi+and+Cullin-Based+Ubiquitin+Ligases+in+IFN+Regulatory+Factor-3+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation.</a> J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).</li>
<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół, który tutaj opisujemy, składa się z kombinacji SDS-PAGE i native-PAGE o wysokiej rozdzielczości w połączeniu z użyciem kilku przeciwciał fosfospecyficznych w celu rozróżnienia monomerycznych/dimerycznych i fosfoform I-IV IRF3. Odpowiednie wykrycie tych gatunków IRF3 jest niezbędne do pełnego scharakteryzowania aktywacji IRF3 w określonych warunkach. Na przykład, stymulacja LPS aktywowanych makrofagów prowadzi do powstania dimerycznego, fosforylowanego IRF3 Ser396/398, który wykazuje hipofosforylowany (forma II)...

Czynnik regulacyjny 3 (IRF3) powszechnie i konstytutywnie wyrażany czynnik transkrypcyjny interferonu (IFN) jest krytyczny dla pierwszej linii obrony przed patogenami, głównie poprzez indukcję IFNβ, ale także poprzez indukcję ligandu 5 (CCL5) chemokiny (motyw C-C) i kilku białek przeciwwirusowych, w tym białka indukowanego przez IFN z powtórzeniami tetratrikopeptydu IFIT1/2/31-3. Zgłaszano aktywację IRF3 po zakażeniu licznymi wirusami lub ekspozycji na kwas poliinozyno-policytydylowy (poli I:C) lub lipopolisacharyd (LPS)4. Co ważne, większość badanych wirusów wyewoluowała mechanizmy unikania odpowiedzi za pośrednictwem IRF3, a tym samym ucieczki wrodzonejobrony immunologicznej gospodarza5. W związku z tym monitorowanie aktywacji IRF3 ma ogromne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów molekularnych wrodzonej obrony przeciwwirusowej gospodarza, ale także dla zidentyfikowania strategii stosowanej przez wirusy w celu przeciwdziałania tej odpowiedzi.
Wiele opublikowanych raportów dostarcza jednak tylko ograniczoną analizę aktywacji IRF3 przeprowadzoną przez monitorowanie indukcji genu docelowego IRF3 (IFNB1 i IFIT1) i/lub test genu reporterowego lucyferazy w połączeniu z analizą IRF3 metodą elektroforezy IRF3 z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Jednak liczne badania biochemiczne, analiza zachowania różnych mutantów IRF3 i wyjaśnienie struktury krystalicznej IRF3 6-11 przyczyniły się do ustalenia, że IRF3 jest poddawany złożonemu zestawowi sekwencyjnych modyfikacji potranslacyjnych przez fosforylację w wielu miejscach. Zestaw fosforylacji biorący udział w aktywacji IRF3 wydaje się być zależny od bodźca i najprawdopodobniej od typu komórki. W niezakażonych komórkach IRF3 współistnieje jako nieufosforylowane i hipofosforylowane gatunki zawierające fosforeszty, w tym Thr135 i Ser173, w regionie N-końcowym 1-198 aa6,12-14. Akumulacja tej hipofosforylowanej formy IRF3 jest indukowana przez induktory stresu, czynniki wzrostu i czynniki uszkadzające DNA6. Fosforylacja reszt Ser / Thr w regionie C-końcowym IRF3 zawierającym domenę transaktywacji jest wyzwalana po aktywacji przez wirusy, poli I:C lub LPS w sposób zależny od typu komórki15-17. C-końcowa fosforylacja IRF3 obejmuje nie mniej niż 7 odrębnych miejsc fosfoakceptorowych zorganizowanych w dwóch głównych klastrach, Ser385 / Ser386 i Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, z których każde przyczynia się do aktywacji IRF3 poprzez dimeryzację, akumulację jądrową, asocjację z koaktywatorami białka wiążącego CREB (CBP) / p300, wiązanie DNA z sekwencjami konsensusowymi wrażliwego elementu odpowiedzi IFN (ISRE) i transaktywację docelowych genów9,10,17-19. Uważa się również, że fosforylacja Thr390 przyczynia się do indukowanej przez wirusa aktywacji IRF320. Analizy spektrometrii mas IRF3 wykazały, że reszty Ser386, Thr390, Ser396 i Ser402 są bezpośrednio fosforylowane przez inhibitor kinaz kinazy ε κB (IKKε)/ kinazy wiążącej TANK 1 (TBK1)9,10. Fosforylacja reszt C-końcowych jest również wymagana do zakończenia aktywacji IRF3 poprzez poliubikwitynację i degradację za pośrednictwem proteasomu10. Proces ten jest również zależny od fosforylacji w Ser339, która jest niezbędna do rekrutacji izomerazy propylowej Pin110,11. Gatunki IRF3 zawierające co najmniej reszty fosfo-Ser339/386/396 są uważane za formy hiperfosforylowane. Dokładna sekwencja i funkcja każdego z tych miejsc pozostaje kwestią dyskusyjną 10,21. Jest teraz jasne, że aktywowany IRF3 nie reprezentuje stanu jednorodnego, ale że istnieją różne aktywowane gatunki wykazujące różne cechy fosforylacji lub dimeryzacji 10,22.
Aby zapewnić pełne zrozumienie aktywacji IRF3 w odpowiedzi na określone patogeny, konieczne jest scharakteryzowanie, które z aktywowanych gatunków są indukowane. Udowodniono, że indukcja docelowych genów IRF3, IFNB1 i IFIT1, zapewnia wiarygodny odczyt aktywacji IRF3. Jednak monitorowanie ekspresji tych genów nie rozróżnia różnych stanów aktywacji IRF3. Kompleksowa analiza stanów aktywacji IRF3 w określonym otoczeniu opiera się na szczegółowej charakterystyce jego stanu fosforylacji i dimeryzacji10. Nieufosforylowane (forma I), hipofosforylowane (forma II) i hiperfosforylowane (formy III i IV) formyIRF3 6,18,23 mogą być z powodzeniem rozwiązane przez ograniczoną mobilność w analizie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości. Monomeryczne i dimeryczne gatunki IRF3 można skutecznie zidentyfikować za pomocą natywnej analizy PAGE. Podejścia te są znacznie ulepszone, gdy są stosowane w połączeniu z przeciwciałami fosfospecyficznymi skierowanymi przeciwko różnym miejscom fosfoakceptorowym IRF3.
Standardowe protokoły pozwalają na niską rozdzielczość białek, co nie pozwala na efektywną separację różnych form fosforylowanych IRF3. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę osiągania najwyższej rozdzielczości w celu monitorowania indukcji odrębnych gatunków IRF3 aktywowanych przez wirusa za pomocą SDS-PAGE sprzężonego z natywnym PAGE w połączeniu z immunoblot przy użyciu przeciwciał całkowitych i fosfospecyficznych. Rozróżnianie in vivo między różnymi aktywowanymi formami IRF3 przeprowadza się na podstawie ich zmian ruchliwości zaobserwowanych na SDS-PAGE. Dodatkowo monomer i dimer IRF3 można odróżnić za pomocą elektroforezy niedenaturującej. Połączenie tych dwóch uzupełniających się technik z immunoblot okazuje się niedrogim i czułym podejściem do uzyskania wszystkich niezbędnych informacji do pełnej analizy aktywacji IRF3 za pośrednictwem fosforylacji.

<table><tbody><tr><td>F12/Ham</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel przed użyciem.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA 0,25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Wirus Sendai Cantell Szczep</td><td>Charles River Laboratories</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>Odetnij końcówkę końcówki i pipetuj powoli, ponieważ jest bardzo gruba.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>Zarejestrowany znak towarowy odpowiadający detergentowi z poli(etylenoksy)etanolu (Nonidet P-40) oktylofenoksy</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bioshop</td><td>LEU001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bioshop</td><td>APR600.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Aktywacja ortowanadanu sodu 0,2 M: 1) Dostosować pH do 10,0 za pomocą 1 N NaOH lub 1 N HCl. Początkowe pH roztworu ortowatanu sodu może się różnić w zależności od dużej ilości substancji chemicznej. 2) Roztwór jest żółty przy pH 10,0. 3) Gotować do uzyskania bezbarwności. 4) Schłodzić do temperatury RT. 5) Ponownie ustawić pH do 10,0 i powtarzać kroki 3-4, aż roztwór pozostanie bezbarwny i ustabilizuje się na poziomie 10,0. Przechowywać aktywowane podwielokrotności ortowananadanu sodu w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>sól disodowa fosforanu p-nitrofenylu sześciowodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Beta-glicerofosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6376&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek Bio-Rad&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006&nbsp;</td><td>Cytotoksyczne</td></tr><tr><td>Akrylamid/Bis-Akrylamid (37,5 : 1) 40%</td><td>Bioshop</td><td>ACR005&nbsp;</td><td>Cytotoksyczne</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&nbsp;</td><td>Praca pod wyciągiem. Działa toksycznie i drażniąco.</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1&nbsp;</td><td>Drażniące.</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Działa toksycznie i drażniąco.</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Praca pod wyciągiem. Działa toksycznie na układ nerwowy, błony śluzowe. Może działać toksycznie na górne drogi oddechowe, oczy, ośrodkowy układ nerwowy.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Bioshop</td><td>SHY700&nbsp;</td><td>Drażniące.</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa (0,45 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.4</td><td>Praca pod wyciągiem. Toksyczny, drażniący i łatwopalny.</td></tr><tr><td>Pąs czerwony</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911&nbsp;</td><td>Do kompozycji PBS do immunoblot.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>Do kompozycji PBS do immunoblot.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662&nbsp;</td><td>Do kompozycji PBS do immunoblot.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Do kompozycji PBS-T-BSA do immunoblot.</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Goździk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly sorbate 20 (Tween)</td><td>MP Biomedicals</td><td>103168</td><td>Odetnij końcówkę końcówki i pipetuj powoli, ponieważ jest bardzo gruba.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 oC. Unikać zamrażania/rozmrażania.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>Domowej roboty19</td><td></td><td>Przechowywać pod ciśnieniem -80 oC. Unikać zamrażania/rozmrażania.</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4947s</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 oC.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>Domowej roboty15</td><td></td><td>Przechowywać w temperaturze -80 oC. Unikać zamrażania/rozmrażania.</td></tr><tr><td>Motyw Actif anty-IRF-3 o pełnej długości</td><td></td><td>39033</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 oC. Unikać zamrażania/rozmrażania.</td></tr><tr><td>Anty-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>Sklep o wartości -20 oC.</td></tr><tr><td>Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>LAS4000mini aparatura z kamerą CCD</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Wzorce masy cząsteczkowej, szeroki zakres</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>Przechowywać w podany na -20 oC.</td></tr></tbody></table>

metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji irf3 zależnej od fosforylacji

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Czynnik transkrypcyjny IRF3 jest krytyczny dla pierwszej linii obrony przed patogenami, głównie poprzez β interferonu i ekspresję genów przeciwwirusowych. Szczegółowa analiza aktywacji IRF3 jest niezbędna, aby zrozumieć, w jaki sposób patogeny indukują lub unikają wrodzonej odpowiedzi przeciwwirusowej. Różne aktywowane formy IRF3 można rozróżnić na podstawie ich fosforylacji i statusu monomeru i dimeru. Dyskryminację in vivo między różnymi aktywowanymi gatunkami IRF3 można osiągnąć poprzez oddzielenie form fosforylowanych IRF3 na podstawie ich przesunięć ruchliwości na SDS-PAGE. Dodatkowo poziomy monomeru i dimeru IRF3 można monitorować za pomocą elektroforezy niedenaturującej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę osiągania najwyższej rozdzielczości, aby uzyskać jak najwięcej informacji na temat statusu aktywacji IRF3. Osiąga się to poprzez połączenie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i natywnej PAGE sprzężonej z immunoblotami przy użyciu wielu przeciwciał całkowitych i fosfospecyficznych. Ta eksperymentalna strategia stanowi przystępne cenowo i czułe podejście do uzyskania wszystkich informacji niezbędnych do pełnej analizy aktywacji IRF3 za pośrednictwem fosforylacji.

Rycina 2 przedstawia typowy obraz immunoblotingu białka IRF3 wykrytego za pomocą przeciwciał całkowitych przeciwko IRF3 oraz przeciwciał fosfospecyficznych przeciwko Ser396 i Ser398 po rozdzieleniu WCE metodą wysokorozdzielczego SDS-PAGE. W niestymulowanych komórkach A549 IRF3 jest wykrywane jako dwa prążki o masach 50 i 53 kDa w SDS-PAGE, odpowiadające nieufosforylowanej (forma I) i hipofosforylowanej (forma II) postaci IRF3. Ekspozycja komórek A549 na SeV przez okres od...

Tutaj opisujemy procedurę pozwalającą na szczegółową analizę zależnej od fosforylacji aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3. Osiąga się to poprzez połączenie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i natywnej PAGE sprzężonej z immunoblotami przy użyciu wielu przeciwciał fosfospecyficznych.

Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie szczegółowej analizy zależnej od fosforylacji aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3. Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące interferonu pośredniczącej we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Na przykład patogen aktywuje lub atakuje ekspresję beta interferonu zależną od IRF3.Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi niedrogie i czułe podejście do rozróżniania różnych form aktywowanych IRF3, które mogą powstać po różnych stymulacjach. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w infekcję wirusową komórek ludzkich, może być również stosowana do tkanek myszy lub ludzi poddanych działaniu innych patogenów lub wzorców molekularnych związanych z patogenami. Procedurę zademonstrują Alexa Robitaille i Melissa Mariani, dwie ekspertki od komórek Simulink z mojego laboratorium.Komórki A549 użyte w tej procedurze są utrzymywane w hodowli na 15-centymetrowej płytce w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w kompletnej pożywce F-12K Ham. Dwadzieścia cztery godziny przed zakażeniem trypsynizuj komórki zgodnie z opisem w tekście protokołu i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wirować przy 350 x G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w ośmiu mililitrach kompletnej pożywki z szynką F-12K, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową. Po zliczeniu komórek za pomocą hemoktiometru, wysiewaj komórki o gęstości od jednej dziesiątej do szóstej komórki na 60-milimetrową płytkę i cztery mililitry podgrzanej kompletnej pożywki do szynki F-12K. Inkubować przez 20 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięć procent dwutlenku węgla.Po 20 do 24 godzinach komórki powinny utworzyć monowarstwę zlewającą się w 90%. Usuń pożywkę i umyj komórki dwoma mililitrami pożywki F-12K Ham bez surowicy lub SFM. Dodaj dwa mililitry świeżego SFM na 60-milimetrową płytkę.Rozcieńczyć do rozmrożonej podwielokrotności wirusa Sendai we wstępnie podgrzanym SFM w celu uzyskania 60 jednostek hemaglutynacji lub HAU na 100 mikrolitrów. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie dodawać 100 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa kropla po kropli do każdej płytki, aby przeprowadzić infekcję w dawce 40 HAU na 10 do szóstej komórki. Nie dodawać wirusa do niezakażonej płytki kontrolnej.Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięciu procent dwutlenku węgla. W ciągu pierwszej godziny infekcji należy ręcznie poruszyć płytki trzy lub cztery razy. Po dwóch godzinach od infekcji dodać dwa mililitry pożywki F-12K Ham zawierającej 20% ciepła i aktywowany FDS, aby uzyskać końcowe stężenie 10% ciepła i aktywowanego FDS.Inkubuj komórki w inkubatorze przez jeszcze jedną, cztery i siedem godzin, aby osiągnąć całkowity czas infekcji wynoszący odpowiednio trzy, sześć i dziewięć godzin. Komórki zostaną zebrane w każdym z tych punktów czasowych w celu przygotowania ekstraktów z całych komórek, jak pokazano w następnym segmencie filmu. Rozpocznij tę procedurę od usunięcia pożywki infekcyjnej.Zbierz komórki, zeskrobując jeden mililitr lodowatego DPBS. Przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 20 sekund.I ostrożnie zdekantować wszelkie ślady DPBS. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 70 mikrolitrach buforu do lizy. Inkubować na lodzie przez 20 minut.Błyskawiczne zamrożenie lizatu przez inkubację w kąpieli ciekłego azotu przez 15 sekund. Następnie rozmrozić lizat w temperaturze pokojowej, aż całkowicie się rozpuści. Wiruj przez dziesięć sekund.Powtórz ten cykl zamrażania-rozmrażania-wiru trzy razy. Wirować przy 16 000 x g w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Przenieś supernatant, który jest ekstraktem z całych komórek, do nowej, wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.Ważne jest, aby przez cały czas trzymać ekstrakty z całych komórek na lodzie. Aby rozpuścić ekstrakty z całych komórek za pomocą SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości, przygotuj trzy denaturujące żele do elektroforezy, dwa 16-centymetrowe żele do wykrywania form IRF3 i jeden 8,5-centymetrowy żel do wykrywania białek wirusa Sendai. Załaduj 14 mikrolitrów wzorca masy cząsteczkowej do jednego dołka każdego 16-centymetrowego żelu.Następnie załaduj 30 mikrogramów denaturowanego ekstraktu z całych komórek do dołka z dwóch 16-centymetrowych żeli. Załaduj siedem mikrolitrów wzorca masy cząsteczkowej do jednego dołka żelu o średnicy 8,5 centymetra. Załaduj od ośmiu do dziesięciu mikrogramów denaturowanego ekstraktu z całych komórek na studzienkę 8,5-centymetrowego żelu.Uruchom żele przy stałym prądzie 30 miliamperów, aż front migracji dotrze do dna żelu. Migracja technicznie trwa około trzech godzin w przypadku żelu o średnicy 16 centymetrów i 45 minut w przypadku żelu o średnicy 8,5 centymetra. Analizę tę należy rozpocząć od przygotowania niedenaturującego żelu rozdzielczego o długości co najmniej 8,5 centymetra, postępując zgodnie z procedurą opisaną w tekście protokołu.Wciśnij pracujące urządzenie w lód w przybliżeniu do poziomu bufora elektroforezy w dolnej komorze, ale upewnij się, że żel nie znajduje się w lodzie. Uruchom żel przy stałym prądzie 40 miliamperów przez 30 minut na lodzie. Podczas wstępnego uruchomienia wymieszaj ekstrakty z całych komórek trzymane na lodzie jeden do jednego z buforem ładującym Two-X Native-PAGE.Natychmiast po zakończeniu cyklu wstępnego załaduj do żelu od ośmiu do dziesięciu mikrogramów ekstraktu z całych komórek. Ważne jest, aby załadować próbki blisko dna studzienki, aby nie zakłócić pasmowania. Uruchom żel przy stałym prądzie 25 miliamperów na lodzie, jak pokazano dla biegu wstępnego, aż front migracji dotrze do dna żelu.Zajmie to około 40 minut. Po zakończeniu wszystkich przebiegów żelowych białka są przenoszone do membran nitrocelulozowych i utrwalane. Procedura przekazania jest opisana w załączonym tekście protokołu.Trzy membrany SDS-PAGE, ale nie membrana Native-PAGE, są barwione czerwonym roztworem Ponceau w celu identyfikacji markerów masy cząsteczkowej. Po inkubacji wszystkich czterech błon z SDS-PAGE i Native-PAGE w roztworze blokującym, należy inkubować błony z pierwszorzędowymi przeciwciałami zgodnie z kolejnością pokazaną na tym schemacie. Błony muszą przejść pięć pięciominutowych płukań w PBS-T przed inkubacją z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową.Po usunięciu śladów animacji za pomocą PBS, inkubować membrany przez jedną minutę w objętości wzmocnionego odczynnika chemiluminescencji wystarczającej do całkowitego pokrycia błon. Użyj bibuły filtracyjnej do wysuszenia membran, a następnie umieść je w analizatorze obrazu luminescencyjnego, aby uwidocznić pasma immunoreaktywne. Przed inkubacją z kolejnymi przeciwciałami pierwszorzędowymi należy przemyć błony trzy razy w PBS przez pięć minut za każdym razem.Gdy wymagane jest oddzielanie między przeciwciałami, inkubować błony we wstępnie podgrzanym roztworze do oddzielania w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut przy regularnym mieszaniu. Szczegółowe informacje na temat analizy immunoblot można znaleźć w dołączonym tekście protokołu. Pokazano tutaj typowy obraz immunoblot IRF3 wykryty z całkowitymi przeciwciałami IRF3 i przeciwciałami fosfospecyficznymi IRF3 przeciwko Ser396 i Ser398, po wysokiej rozdzielczości ekstraktów z całych komórek.W komórkach niestymulowanych IRF3 jest wykrywany jako dwa prążki odpowiadające niefosforylowanym i hipofosforylowanym gatunkom IRF3. Narażenie komórek na wirusa Sendai powoduje zależne od czasu przejście do wolno migrujących hiperfosforylowanych form trzech i czterech, które są również specyficznie immunowykrywane za pomocą fosfospecyficznych przeciwciał przeciwko Ser396 i Ser398. Następny rysunek przedstawia profil wykrywania IRF3 uzyskany z ekstraktów z całych komórek rozpuszczonych przez natywny PAGE, a następnie immunoblot przy użyciu przeciwciał anty-IRF3 NES i przeciwciał fosfospecyficznych przeciwko Ser386.W komórkach niestymulowanych IRF3 jest wykrywany jako pojedyncze prążko odpowiadające formie momomerycznej. Po zakażeniu wirusem Sendai poziom monomeru IRF3 zmniejsza się przy jednoczesnej akumulacji powoli migrującego prążka, który odpowiada dimerycznej formie IRF3, która jest również specyficznie immunowykrywana przy użyciu fosfospecyficznych przeciwciał przeciwko Ser386. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że skład i długość różnych żeli ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia odpowiedniej rozdzielczości fosfoform IRF3.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wiązanie DNA lub kwasy reporterowe genów, w celu oceny aktywności IRF3. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozróżnić różne aktywne formy IRF3. Nie zapominaj, że praca z patogenami może być niebezpieczna, a manipulacje powinny być wykonywane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego instytucji goszczącej.

a-high-resolution-method-to-monitor-phosphorylation-dependent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Ten film demonstruje czułą technikę fosforylacji białek za pomocą testu ściągania pojedynczej cząsteczki. Funkcjonalizacja glikolu polietylenowego-biotyny i zastosowanie znakowanych przeciwciał zwiększa wykrywalność fosforylowanej tyrozyny ze swoistością.

Test jednocząsteczkowy pull-down do analizy fosforylacji białek: wysokoprzepustowa technika ilościowego określania fosforylacji białek w lizacie komórkowym

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Opisano natywną metodę Western blot do analizy dimeryzacji endogennego czynnika regulacyjnego interferonu 5 w linii komórek dendrytycznych plazmocytoidu CAL-1. Protokół ten można również zastosować do innych linii komórkowych.

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Analiza immunoblot endogennej dimeryzacji IRF5

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Aktywacja wielofunkcyjnej kinazy Ser/Thr AURKA jest charakterystyczna dla jej autofosforylacji na Thr288. Sondy fluorescencyjne polegające na FRET mogą rozróżniać między jego stanem nieaktywnym i aktywowanym. Tutaj ilustrujemy niektóre strategie inżynierii sondy, wraz z szybkim protokołem FRET, aby śledzić aktywację kinazy przez cały czas trwania mitozy.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji kinazy A zorzy polarnej za pomocą konformacyjnych biosensorów FRET w żywych komórkach

Protokoły testów opartych na komórkach rezonansu rezonansu Förstera z rozdzielczością czasową są opisane dla prostej, specyficznej, czułej i solidnej kwantyfikacji endogennych fosforylowanych białek przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT) 1/3/4/5/6 w lizatach komórkowych w formacie 384-dołkowym.

Czasowo-rozdzielcze rezonansowe testy transferu energii Förstera do pomiaru endogennych fosforylowanych białek STAT w komórkach ludzkich

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Poznaj metodę analizy aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3 zależnej od fosforylacji przy użyciu elektroforezy SDS-PAGE i natywnej z immunodetekcją. Technika ta pozwala rozróżnić różne formy aktywowanego IRF3 w odpowiedzi immunologicznej.

Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji

Przeglądaj więcej filmów