Name: System iniekcji ciśnieniowych do badania neurofarmakologii przetwarzania informacji w korze mózgowej makaków zachowujących się w stanie czuwania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj technikę iniekcji ciśnieniowej do neurofarmakologicznych badań kory mózgowej u czuwających makaków. Ta metoda umożliwia manipulację receptorami w pobliżu elektrody rejestrującej, dostarczając wgląd w rolę neuroprzekaźników w procesach poznawczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty Deutsche Forschungsgemeinschaft za pośrednictwem Collaborative Research Center 889 "Cellular Mechanisms of Sensory Processing" dla S.T. (Projekt C04). Dziękujemy Sinie Plümer, Leonore Burchardt, Dirkowi Prüsse, Klausowi Heisigowi i Ralfowi Brockhausenowi za wsparcie techniczne i związane ze zwierzętami oraz naszym współpracownikom z Oddziału Komórek Macierzystych Niemieckiego Centrum Naczelnych, dr Katharinie Debowski i Annie Magerhans, za pomoc techniczną w procesie filtracji.

Opieka nad zwierzętami i wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckimi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i zatwierdzone przez rząd powiatowy Brunszwiku, Dolna Saksonia, Niemcy.
Uwaga: Ze względu na to, że eksperyment przeprowadzany jest in vivo, kluczowe jest zachowanie najwyższych możliwych standardów higieny. Jeśli to możliwe, pracuj w sterylnych warunkach.
1. Przygotowanie systemu iniekcyjnego/rejestrującego
<ol>
	<li>Wysterylizuj probówkę łączącą mikropipetę ze strzykawką. Użyć możliwie najkrótszej rurki w układzie doświadczalnym między pompą wtryskową a elektrofizjologicznym systemem rejestracji.</li>
	<li>Wyczyść rurki prowadzące systemu nagrywania za pomocą przewodów czyszczących. Zanurz je w sterylnym oleju silikonowym i kilkakrotnie przepuść przez poszczególne rurki prowadzące.</li>
	<li>Włóż mikropipetę ze szkła kwarcowego do jednej rurki prowadzącej systemu nagrywania. Zobacz rysunek 1A.</li>
	<li>Po zamocowaniu mikropipety w systemie rejestrującym, przymocuj sterylną rurkę do metalowego trzpienia mikropipety. Trzymaj się; Chociaż mikropipeta jest zamocowana w systemie, może łatwo pęknąć podczas zakładania probówki. Użyj dwóch sterylnych pęset, aby wywrzeć równy nacisk na szpilkę i rurkę.</li>
	<li>Użyj płynnego super kleju, aby uszczelnić połączenie między probówką a mikropipetą. Odczekaj co najmniej 3 godziny, aż klej stwardnieje przed napełnieniem mikropipety płynem.</li>
	<li>Wprowadzić mikroelektrody (np. platynowo-wolframową w izolacji szkłem kwarcowym) w inne pozycje systemu rejestrującego przed lub po włożeniu mikropipety.</li>
</ol>
2. Przygotowanie substancji
<ol>
	<li>Wysterylizuj probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml w celu późniejszego przechowywania roztworów iniekcyjnych za pomocą autoklawu lub innej niezawodnej procedury.</li>
	<li>Zważyć odpowiednią substancję, chlorowodorek skopolaminy, aby przygotować 5 ml roztworu o stężeniu 0,1 molowym. Rozpuścić w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl).</li>
	<li>W sterylnych warunkach w dygestorium przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o wystarczająco dużej średnicy porów, np. 0,2 μm.</li>
	<li>Pod wyciągiem dygestorium podzielić roztwór na objętości wystarczające do przeprowadzenia pojedynczego doświadczenia, np. w przypadku skopolaminy, 500 μl w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Używaj ciemnych rurek, aby chronić substancję przed światłem; Alternatywnie owiń tuby folią aluminiową. W przypadku skopolaminy roztwór należy przechowywać do 14 dni w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Codzienne przygotowanie systemu iniekcyjnego/rejestrującego
Uwaga: Po zamontowaniu w systemie rejestrującym, elektrody i mikropipeta są przechowywane w roztworze enzymu (Tergazyme, 1% roztwór z wodą dejonizowaną) między nagraniami. Przed każdym nagraniem należy wykonać następujące czynności.
<ol>
	<li>Pobrać probówkę z substancją, która ma być wstrzyknięta. Pozwól mu osiągnąć RT, jeśli jest przechowywany w lodówce.</li>
	<li>Wyjąć system iniekcyjny/rejestrujący z roztworu enzymatycznego i przepłukać elektrody oraz mikropipetę wodą dejonizowaną, aby całkowicie oczyścić z roztworu enzymu.</li>
	<li>Zdejmij przednią pokrywę systemu rejestrującego, aby wizualnie sprawdzić uszczelnienie między mikropipetą a probówką.</li>
	<li>Nałóż sterylny olej silikonowy na szczelinę rurki prowadzącej (patrz rysunek 1A) oraz końcówki elektrod i mikropipety, aby nasmarować system w celu zapewnienia płynnego ruchu.</li>
	<li>Sprawdź końcówki elektrod i mikropipet za pomocą mikroskopu, aby upewnić się, że są nienaruszone. Ustawić elektrody i mikropipetę pod mikroskopem tak, aby wystawały z rurek prowadzących o tej samej długości. Wbij je w rury prowadzące, zatrzymując się, gdy tylko przestaną być widoczne. Określa się to jako zerowe położenie elektrody. Ustaw głębokość elektrod i mikropipety na 0 w oprogramowaniu.</li>
	<li>Napełnić sterylną strzykawkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej i wprowadzić igłę do probówki, uważając, aby nie przebić ścianki probówki. Wyjąć mikropipetę z rurki prowadzącej, aby uzyskać wizualną kontrolę przepływu substancji.</li>
	<li>Przepłukać co najmniej 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej przez probówkę i mikropipetę, aby upewnić się, że w strzykawce lub w probówce nie pozostało powietrze. Nie należy wywierać zbyt dużego nacisku na tłok strzykawki. Upewnij się, że połączenie między probówką a mikropipetą jest uszczelnione. Jeśli widoczny jest wyciek, ponownie przyklej złącze (patrz krok 1.5) i odłóż nagrywanie.</li>
	<li>Napełnić nową sterylną strzykawkę roztworem do wstrzyknięcia i wymienić ją na cylinder strzykawki z solą fizjologiczną, tj. trzymać igłę strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną w probówce. Upewnij się, że żadne powietrze nie jest przepuszczane do systemu. Najlepiej osiągnąć to poprzez napełnienie piasty igły solą fizjologiczną po wyjęciu beczki wypełnionej solą fizjologiczną.</li>
	<li>Przepłukać system 250 μl roztworu, który ma być wstrzykiwany, w celu całkowitego usunięcia soli fizjologicznej z probówki.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania sterującego silnikiem wsunąć elektrody i mikropipetę do rurek prowadzących na głębokość co najmniej -500 μm.</li>
	<li>Opuść pierścień rury prowadzącej (Rysunek 1A) na spód rur prowadzących, aby utrzymać ich stałą pozycję względną.</li>
	<li>Oczyść podstawę systemu etanolem, w szczególności w miejscu, w którym będzie dotykać komory nagrywającej małpy.</li>
	<li>Zamknij system nagrywania, zakładając przednią pokrywę i dokręcając.</li>
</ol>
4. Walidacja systemu wtryskowego
Uwaga: Chociaż firma kalibruje system, zaleca się walidację wyrzucanych objętości za pomocą materiałów użytych w konfiguracji eksperymentalnej (probówki, strzykawki itp.).
<ol>
	<li>Przygotuj system zgodnie z opisem w kroku 3, trzymając elektrody i mikropipetę wysunięte z rurek prowadzących. Zalecana jest głębokość co najmniej 7 000 μm, aby uniknąć utraty objętości pomiarowej z powodu przywierania wzdłuż zewnętrznej powierzchni mikropipety i elektrod.</li>
	<li>Ustawić system rejestrujący w pozycji, w której będzie używany podczas eksperymentu i włożyć strzykawkę do pompy do mikroiniekcji. Zamocować strzykawkę na miejscu za pomocą gumowej opaski i regulowanego uchwytu (patrz Rysunek 1A). Przesunąć ruchomą część pompy, aż znajdzie się na swoim miejscu za tłokiem strzykawki.</li>
	<li>Za pomocą sterowanego programowo zespołu silnikowego wysunąć objętość wystarczająco dużą, aby można ją było dokładnie zmierzyć, np. 1 000 nl. Zaleca się użycie jednego kroku do wyrzucenia całej objętości, aby uniknąć skutków działania kapilarnego wzdłuż powierzchni mikropipety. Bardzo niskie prędkości (1 nl/s) mogą również prowadzić do takiego efektu podczas procedury walidacji.</li>
	<li>Zbierz całkowitą objętość do pojemnika umieszczonego pod mikropipetą lub ostrożnie zbierz wyrzuconą kroplę bezpośrednio z końcówki mikropipety. Oszacuj wyrzuconą objętość za pomocą pipety lub ważąc za pomocą precyzyjnej wagi.</li>
	<li>Powtórz procedurę kilka razy, aby potwierdzić pomiary.</li>
</ol>
5. Ostre nagrania
<ol>
	<li>Ustaw pozycję x-y systemu nagrywania. Określa to punkt, w którym rurki prowadzące docierają do opony twardej w przewlekle wszczepionej komorze zapisu. Upewnij się, że rury prowadzące są całkowicie schowane (rura prowadząca z pozycja 0).</li>
	<li>Ustawić system rejestracji na miejscu i umieścić strzykawkę w pompie do mikroiniekcji. Zamocować strzykawkę na miejscu za pomocą gumowej opaski i regulowanego uchwytu (patrz Rysunek 1A). Przesunąć ruchomą część pompy, aż znajdzie się na swoim miejscu za tłokiem strzykawki. Jeśli na końcu rurki prowadzącej widoczna jest kropla substancji, ostrożnie usuń ją za pomocą sterylnego wacika.</li>
	<li>Należy przygotować zwierzę do rejestracji zgodnie z procedurą laboratoryjną (zob.wytyczne w punkcie 18).</li>
	<li>Bezpiecznie zamontuj system nagrywania w komorze nagrywania małpy.</li>
	<li>Powoli ręcznie opuść rurki prowadzące do komory nagrywającej, aż do osiągnięcia opony twardej, a następnie napędzaj elektrody za pomocą oprogramowania sterującego silnikiem.</li>
	<li>Ponieważ nie jest możliwe zmierzenie impedancji mikropipety, należy najpierw przejechać elektrodami i regularnie sprawdzać ich impedancje na różnych głębokościach. Po pomyślnym przeprowadzeniu penetracji opony twardej bez uszkodzenia elektrod, należy przesunąć mikropipetę.</li>
	<li>Skieruj elektrody i mikropipetę na docelową głębokość elektrody, na której spodziewany jest obszar zainteresowania mózgu. Powoli przesuwaj elektrodę, aż znajdzie się wystarczająco blisko, aby zarejestrować aktywność pojedynczej jednostki, o czym świadczy dobry stosunek sygnału do szumu w rejestrowanym sygnale. Co ważne, elektrodę rejestrującą i mikropipetę należy ustawić na tej samej głębokości, aby zapewnić minimalną odległość między elektrodą a mikropipetą.
	<ol>
		<li>Jeśli to możliwe, utrzymuj elektrody i mikropipetę na tej głębokości przez cały czas trwania nagrania. Jeśli jednak jedynym sposobem na utrzymanie jakości sygnału rejestrowanego ogniwa jest przesunięcie elektrod, należy jednocześnie sterować elektrodami i mikropipetą, aby zachować odległość między nimi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Zadanie uwagi przestrzennej
<ol>
	<li>W serii prób przedstaw na ekranie dwa ruchome wzory kropek, jeden umieszczony w polu recepcyjnym zarejestrowanego neuronu, a drugi na zewnątrz, wraz z centralnie przedstawionym punktem fiksacji, który zwierzę musi wyciąć podczas każdej próby19,20, 
	Uwaga: Małpa jest szkolona, aby reagować na zmianę kierunku we wzorze punktów (zdarzenie docelowe), ignorując każdą zmianę kierunku w innym wzorze kropki i jest nagradzana kroplą płynu za każde pomyślne ukończenie próby19,20. W ramach kontroli sensorycznej małpa musi zgłosić zmianę luminancji punktu fiksacji, ignorując oba wzorce poruszających się kropek (patrz rysunek 2 w celu uzyskania bardziej szczegółowego opisu zadania).</li>
</ol>
7. Manipulacja farmakologiczna podczas nagrywania
Uwaga: Podczas gdy małpa wykonuje zadanie, wstrzyknij substancję w sposób blokowy. Zdefiniowane są trzy kolejne bloki: kontrola, która działa jako linia bazowa; iniekcja, podczas której substancja jest wyrzucana; i rekonwalescencja, podczas której komórki, do których doprowadzono wstrzyknięcie, powracają do wartości wyjściowej.
<ol>
	<li>Podczas bloku iniekcyjnego należy wstrzykiwać z góry określoną ilość substancji w regularnych odstępach czasu, np. 2 nl co minutę z szybkością 2 nl/s. W tym przykładzie użyj chlorowodorku skopolaminy. Proces wtrysku jest kontrolowany za pomocą oprogramowania, które zapewnia różne opcje. Na przykład, użyj funkcji krokowej, aby zdefiniować objętość wtrysku i naciskaj przycisk wstrzykiwania co minutę zgodnie z zegarem oprogramowania nagrywającego. 
	Uwaga: Dokładny czas trwania bloku iniekcyjnego zależy od substancji i eksperymentu, np. w przypadku skopolaminy należy wstrzykiwać 2 nl co minutę przez 10 minut (łącznie 20 nl). Zaleca się, aby nie przesuwać elektrod i mikropipety podczas bloku iniekcyjnego.</li>
	<li>Zwróć uwagę na czas i próbę, podczas której substancja jest wstrzykiwana, głębokość elektrod i mikropipety, a także ilość wyrzucanej substancji.</li>
	<li>Po bloku iniekcji należy zastosować blok odzyskiwania, do którego nie wstrzykuje się żadnej substancji. Czas trwania bloku odzyskiwania jest specyficzny dla danej substancji i musi zostać określony w badaniach wstępnych. Monitoruj i utrzymuj jakość nagrywania wybranych pojedynczych jednostek aż do końca bloku odzyskiwania.</li>
	<li>Powtarzaj trzy bloki tak długo, jak pozwala na to jakość nagrania i motywacja małpy.</li>
</ol>
8. Procedury po nagraniu
<ol>
	<li>Po zarejestrowaniu danych wsuń elektrody i mikropipetę do probówek prowadzących, a następnie ręcznie wsuń rurki prowadzące. Wyjmij system nagrywania z komory nagrywania małpy. Zdjąć strzykawkę z pompy iniekcyjnej i przenieść system do obszaru przygotowania w celu oczyszczenia.</li>
	<li>Obchodzić się ze zwierzęciem (w tym czyścić komorę rejestracyjną18) zgodnie ze standardowymi procedurami laboratorium i zwrócić je do pomieszczenia inwentarskiego.</li>
	<li>Opłucz zewnętrzną część rurek prowadzących nadtlenkiem wodoru (3%), a następnie wodą dejonizowaną. Wyjąć elektrody i mikropipetę z rurek prowadzących, spłukać wodą utlenioną, a następnie wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Wymienić cylinder strzykawki na cylinder strzykawki wypełniony sterylnym roztworem soli fizjologicznej, trzymając igłę w probówce. Przepłukać probówkę i mikropipetę 1-2 ml soli fizjologicznej. Po przepłukaniu wyjmij beczkę i napełnij ją powietrzem. Ponownie włożyć cylinder do igły i osuszyć rurkę oraz mikropipetę od wewnątrz, delikatnie przepychając powietrze.</li>
	<li>Rurki prowadzące, przedłużone elektrody i mikropipetę należy przechowywać zanurzone w roztworze enzymu, aby uniknąć wysuszenia, a także zapewnić rozkład materiału organicznego.</li>
</ol>

<ol><li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuromodulators+in+selective+attention%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of neuromodulators in selective attention.</a> Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).</li>
<li>Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+receptor+activation+supports+persistent+firing+in+layer+III+neurons+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex.</a> Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).</li>
<li>Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cholinergic+and+GABAergic+mechanisms+to+direction+tuning%2C+discriminability%2C+response+reliability%2C+and+neuronal+rate+correlations+in+macaque+middle+temporal+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area.</a> J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).</li>
<li>Thienel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+antagonist+effects+on+executive+control+of+attention%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic antagonist effects on executive control of attention.</a> Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).</li>
<li>Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+muscarinic+receptor-G+protein+coupling+is+a+general+property+of+liquid+volatile+anesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics.</a> Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).</li>
<li>Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+and+ion+channels%3A+molecular+models+and+sites+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).</li>
<li>Herr, N. R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+techniques+for+examining+rapid+dopamine+signaling+with+iontophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis.</a> Front Biosci. 5, 249-257 (2013).</li>
<li>Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+contribution+of+iontophoresis+and+electro-osmosis+to+the+electrophoretic+release+of+noradrenaline+from+multi+barrelled+micropipettes+%5Bproceedings%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings].</a> Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).</li>
<li>Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmotic+flow+and+its+contribution+to+iontophoretic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery.</a> Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).</li>
<li>Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+electrode-pipette+design+for+simultaneous+recording+of+extracellular+spikes+and+iontophoretic+drug+application+in+awake+behaving+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys.</a> J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).</li>
<li>Lalley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLalley%2C+PM+%22Microiontophoresis+and+Pressure+Ejection%3A+Modern+Techniques+in+Neuroscience%22">Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience</a>. Johansson, H., Windhorst, U. , 193-209 (1999).</li>
<li>Malpeli, J. G., Schiller, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+reversible+inactivation+of+small+regions+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue.</a> J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).</li>
<li>Malpeli, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+subcortical+sites+by+drug+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection.</a> J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).</li>
<li>Dias, E. C., Segraves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pressure+system+for+the+microinjection+of+substances+into+the+brain+of+awake+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys.</a> J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).</li>
<li>Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+protein+kinase+C+inhibitor+H-7on+membrane+properties+and+synaptic+responses+of+neocortical+neurons+of+awake+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats.</a> Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).</li>
<li>Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lntracellular+injection+of+cGMP-dependent+protein+kinase+results+in+increased+input+resistance+in+neurons+of+the+mammalian+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex.</a> Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).</li>
<li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+microinjectrode+system+for+use+in+behaving+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys.</a> J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).</li>
<li>Association of Primate Veterinarians. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cranial+Implant+Care+Guidelines+for+Nonhuman+Primates+in+Biomedical+Research%22">Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.primatevets.org/Content/files/Public/education/Cranial%20Implant%20Care%20Guidelines.pdf">http://www.primatevets.org/Content/files/Public/education/Cranial%20Implant%20Care%20Guidelines.pdf</a> (2015).</li>
<li>Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature-based+attention+influences+motion+processing+gain+in+macaque+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex.</a> Nature. 399, 575-579 (1999).</li>
<li>Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature-based+attention+increases+the+selectivity+of+population+responses+in+primate+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex.</a> Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj szczegółowo zilustrowaliśmy, jak wykonywać niezawodne i precyzyjne iniekcje oraz wysokiej jakości nagrania jednokomórkowe za pomocą "gotowego" systemu wtrysku ciśnieniowego. Chociaż ta metoda dostarczania leków była wcześniej stosowana u zachowujących się małp (omówiona w17), przedstawiony tutaj system ma zalety, omówione poniżej.
Jak pokazano na rysunku 4A, opisany tutaj system może zapewnić stabilny pomiar aktywności pojedynczego neuronu z zastrzykami farmakologicznymi i bez nich w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca rejestracji. Jak pokazano na rysunku 4B, wstrzyknięcie substancji kontrolnej, soli fizjologicznej, nie doprowadziło do zmiany szybkości wypalania. Ta kontrola pokazuje, że sam proces wstrzykiwania nie ma mierzalnego wpływu na właściwości wypalania zarejestrowanych neuronów.
Konfiguracja przestrzenna neuronu, elektrody rejestrującej i mikropipety ma kluczowe znaczenie w tych eksperymentach. Chociaż dokładny pomiar ich względnego położenia w tkance podczas rejestracji nie jest możliwy, możemy rozważyć i kontrolować możliwe źródła wariancji. Po pierwsze, podczas wstrzykiwania objętości istnieje ryzyko, że interesujący nas neuron może zostać przemieszczony z dala od elektrody rejestrującej, co wpłynie na stabilność rejestrowanych sygnałów. Z tego powodu rozsądne jest porównanie szybkości wypalania przed i po bloku wtrysku w celu sprawdzenia stabilności sygnału. Po drugie, konfiguracja rurki prowadzącej systemu rejestrującego określa odległość między elektrodami a mikropipetą (np. 305 μm w koncentrycznym systemie 3-kanałowym użytym w tym eksperymencie). Ponieważ system zapewnia precyzyjną kontrolę położenia elektrod i mikropipet w tkance, odległość między nimi można zminimalizować poprzez staranną kalibrację głębokości względnej przed zapisem (krok 3.5) i utrzymywanie ich na tej samej głębokości podczas zapisów.
Potencjalne ograniczenia Oprócz wewnętrznej kontroli jakości przez producenta, system musi zostać zweryfikowany w warunkach laboratoryjnych, ponieważ mogą być używane różne marki probówek, strzykawek itp., co może prowadzić do różnic w wyrzucanych objętościach. Chociaż system może być używany do wstrzykiwania bardzo małych objętości, jak w eksperymencie pokazanym tutaj, są one poniżej minimalnej objętości, która może być zwalidowana ze względu na praktyczne limity pomiarowe w normalnym środowisku laboratoryjnym. Jednak większe objętości iniekcji mogą być używane do wnioskowania o relacji między woluminem zdefiniowanym programowo a woluminem wyrzuconym przez sprzęt. W przypadku stosowania przezroczystych probówek możliwa jest dodatkowa kontrola wzrokowa procesu wtryskiwania poprzez pomiar przemieszczenia znacznika wizualnego.
Wprowadzenie mikropipety do systemu jest bardziej wymagające niż wprowadzenie elektrody, ponieważ średnica mikropipety jest nieco większa, a materiał jest bardziej delikatny. Ponadto połączenie rurki z trzpieniem mikropipety jest trudne, ponieważ wiąże się z dużym ryzykiem złamania górnej części mikropipety. Jednak żywotność pomyślnie załadowanej mikropipety wynosi kilka miesięcy, nawet przy codziennym użytkowaniu.
W praktyce nie spotkaliśmy się jeszcze z zatorem w układzie wtryskowym podczas czyszczenia układu po nagraniu. Niemniej jednak kontrola "online" nie jest możliwa i istnieje ryzyko, że fizyczna blokada (taka jak tkanka na końcówce mikropipety) może uniemożliwić wstrzyknięcie substancji. W związku z tym może być wskazane konserwatywne przeanalizowanie danych, na przykład włączenie do dalszej analizy tylko tych komórek, które wykazują znaczące zmiany w szybkości wypalania między blokami kontrolnymi i iniekcyjnymi eksperymentu.
Pomimo swojej małej średnicy, mikroelektrody i pipety przemieszczają tkankę mózgową i mogą powodować miejscowe uszkodzenia tkanek. Można to zminimalizować, ręcznie umieszczając końcówkę rurek prowadzących tuż nad oponą twardą. Elektrody następnie przenikają oponę twardą, a ich nienaruszoność można wywnioskować, mierząc ich impedancję online. Następnie wprowadza się mikropipetę. W przypadku stosowania tego podejścia zaleca się regularne usuwanie tkanki powyżej opony twardej, aby jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko pęknięcia elektrody lub pipety.
Porównanie z metodami alternatywnymi Zastosowany tutaj system wykazuje wyraźne zalety w porównaniu z innymi systemami wtrysku ciśnieniowego. Jedną z mocnych zalet jest średnica mikropipety (około 100 μm), która jest o połowę mniejsza niż w przypadku innych dostępnych sond17 , a tym samym minimalizuje uszkodzenia tkanek nerwowych. W przeciwieństwie do poprzednich konstrukcji, obecny system wykorzystuje przestrzennie oddzieloną elektrodę rejestrującą i mikropipetę. Chociaż inne systemy zapewniają mniejszą odległość między elektrodą a pipetą, opisany tutaj system umożliwia niezależną zmianę głębokości elektrod i pipety, umożliwiając w ten sposób zmienne odległości względne w trakcie sesji nagrywania. Co ważne, nie trzeba iść na żadne kompromisy w kwestii jakości nagrywania, ponieważ system wtryskowy jest rozszerzeniem uznanego urządzenia rejestrującego. Chociaż w tym protokole używana jest tylko jedna mikropipeta, a tym samym jedna substancja, możliwe jest wstrzyknięcie kilku substancji w ramach jednej procedury eksperymentalnej. Aby to osiągnąć, kilka mikropipet można wkręcić w oddzielne rurki prowadzące i podłączyć do strzykawek zamontowanych w poszczególnych pompach iniekcyjnych. Wreszcie, sterowanie systemem jest łatwe, ponieważ do przesuwania elektrod i mikropipety oraz do wykonania wtrysku ciśnienia podczas eksperymentu potrzebny jest tylko jeden program komputerowy.
Porównując wtryskiwanie ciśnieniowe do jonoforezy, istnieją względne zalety i wady. Na przykład wstrzyknięcie ciśnieniowe wymaga wprowadzenia większej objętości do tkanki niż jonoforeza, co zwiększa ryzyko przemieszczenia neuronów. Obecny protokół wykorzystywał objętości w zakresie nL i rzadko doświadczaliśmy zauważalnych zmian w jakości sygnału zarejestrowanej komórki. System pozwala również na wstrzykiwanie większych objętości, co jest potencjalnie przydatne w przypadku manipulacji behawioralnych, ale może mieć wpływ na stabilność zapisu neuronalnego. Niewątpliwą przewagą iniekcji ciśnieniowej nad jonoforezą jest większa różnorodność substancji użytkowych, ponieważ nie ma wymogu stosowania substancji naładowanych. Należy jednak sprawdzać i porównywać wartości pH między substancjami doświadczalnymi i kontrolnymi (np. solą fizjologiczną).
Może pojawić się pytanie, dlaczego stosować od dawna znaną metodę wstrzykiwania ciśnienia zamiast nowszych technik, takich jak optogenetyka do manipulowania aktywnością neuronalną. Chociaż optogenetyka jest dobrze ugruntowana u gryzoni, nie jest jeszcze wiarygodnie ugruntowana u małp rezusów. W szczególności nie pozwala jeszcze na lokalną manipulację komórkami selektywnymi dla określonego typu neuroprzekaźnika. W dłuższej perspektywie widzimy ogromny potencjał dla połączenia zalet manipulacji farmakologicznych z zaletami manipulacji optogennych w wyjaśnianiu neuronalnych podstaw funkcji poznawczych.
Tutaj pokazaliśmy, w jaki sposób wstrzyknięcie ciśnieniowe może być wykorzystane do farmakologicznego manipulowania miejscowo ograniczonym obszarem w mózgu obudzonych, zachowujących się rezusów. Mamy nadzieję, że ta metoda zainspiruje innych naukowców do zbadania neuromodulacyjnego wkładu w dynamikę aktywności neuronalnej.

W obszarach korowych i podkorowych, na aktywność neuronalną wpływają różne neuromodulatory, na przykład acetylocholina1. Ten modulacyjny wpływ na odpowiedzi neuronalne został opisanyw badaniach in vitro2, a także w zapisach elektrofizjologicznych od znieczulonychzwierząt3 i ogólnoustrojowych manipulacjach farmakologicznych uludzi4. Niemniej jednak dokładna rola różnych neuromodulatorów i udział różnych podtypów receptorów są w dużej mierze nieznane. Aby zmierzyć wpływ określonych neuromodulatorów na aktywność pojedynczych neuronów, pożądane jest wywołanie tymczasowej zmiany neuromodulatora jak najbliżej elektrody rejestrującej. Ponadto ważne jest, aby te manipulacje były wykonywane u przytomnych zwierząt, ponieważ funkcje poznawcze są obecne tylko przy braku znieczulenia. Dodatkowo znieczulenie oddziałuje z układem cholinergicznym i GABA-ergicznym5,6 i może prowadzić do zmian w aktywności neuronalnej3.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci rozwinięto i udoskonalono dwie główne metody lokalnego dostarczania leków: jonoforezę i iniekcję ciśnieniową. W obu metodach leki są podawane za pomocą mikropipet wykonanych ze szkła lub stali. W przypadku jonoforezy prąd elektryczny reguluje uwalnianie leku7. Dodatkowo istnieje znaczący udział elektroosmozy w całkowitej ilości wyrzucanych cząsteczek8, korelujący ze średnicą końcówki9 mikropipety, a także ze stężeniem8 użytej substancji. Jonoforeza jest potężnym narzędziem do szybkiego i precyzyjnego manipulowania małymi objętościami tkanki nerwowej. Do iniekcji jonoforetycznych zwykle stosuje się mikropipety wielocylindrowe10, z których jedna działa jako urządzenie rejestrujące, podczas gdy pozostałe pozycje służą jako pipety podające. Ograniczeniem tej metody jest to, że można stosować tylko naładowane cząsteczki, co poważnie ogranicza wybór leków. 
Wtrysk ciśnieniowy wykorzystuje albo sprężanie powietrza, albo ciśnienie mechaniczne do wyrzucania substancji z mikropipety. Za pomocą tej metody można użyć dowolnej substancji rozpuszczalnej, naładowanej lub nienaładowanej, w tym dużych cząsteczek. Metoda wtrysku ciśnieniowego została po raz pierwszy opisana przez Reyniersa w 1933 roku i dalej udoskonalona w latach 50. W latach osiemdziesiątych XX wieku metoda została jeszcze bardziej udoskonalona, aby umożliwić dostarczanie ilości w zakresie nanolitrów (głównie lidokainy12) do określonego obszaru mózgu13, przy jednoczesnym wykonywaniu zapisu pojedynczej komórki. Wyrzucana objętość była zwykle monitorowana poprzez obserwację ruchu markera, takiego jak łąkotka w górnej części pipety13. Iniekcje ciśnieniowe zostały po raz pierwszy zastosowane w latach 90. u obudzonych zwierząt, zarówno zewnątrzkomórkowych14, jak i wewnątrzkomórkowych15,16. Opierając się na skumulowanej wiedzy zdobytej w tych badaniach, możliwe jest obecnie wiarygodne rejestrowanie z różnych struktur mózgu w połączeniu z manipulacją farmakologiczną (patrz17 w celu porównania najnowszych systemów iniekcji ciśnieniowych). 
Nieustającym problemem dla obu metod dostarczania leków jest trudność w określeniu dokładnej objętości wstrzykniętego leku. Jest to jeszcze większe wyzwanie w przypadku eksperymentów z rozbudzonymi, zachowującymi się rezusami, gdzie zwierzę wykonuje zadanie eksperymentalne w oddzielnym pomieszczeniu. Można temu zaradzić, stosując system sterowany programowo, zamiast polegać na wizualnym znaczniku w celu ciągłego monitorowania wstrzyknięcia. 
Opisany tutaj system jest rozszerzeniem dobrze znanego systemu zapisu elektrofizjologicznego (Mini Matrix System) i łączy pipetę iniekcyjną z wieloma równolegle zorientowanymi elektrodami rejestrującymi w określonych odległościach w konfigurowalnym układzie. Farmakologiczna manipulacja tkanką w pobliżu elektrody rejestrującej jest możliwa przy użyciu tylko niewielkiej ilości substancji, co zapewnia szybki powrót do zdrowia i umożliwia wiele bloków wstrzyknięć i kontroli/odzyskiwania w ograniczonym oknie czasowym oferowanym przez zadanie behawioralne zwierzęcia.

<table><tbody><tr><td>(-)-Chlorowodorek skopolaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55-16-3</td><td>Mr 339,81 g/mol</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%&nbsp;</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>3079870</td><td>5ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Terg-a-zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>enzym detergen</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Roth</td><td></td><td>Stosowany w 3% roztworze z wodą dejonizowaną</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Chemie-Vertieb Hannover</td><td>104642</td><td>70%</td></tr> <tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td>dejonizowana</tr><tr><td>Injekt 40 Duo</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9166432V</td><td>Strzykawka i igła&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf Safe-Lock, bursztynowe</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.191</td><td>1,5ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipeta ze szkła kwarcowego</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroda rejestrująca</td><td>Thomas Recording</td><td></td><td>elektroda z włókna kwarcowego/platynowo-wolframowego; wartość impedancji 1-2 M&Omega; &nbsp; i 0,3-0,5 M&Omega;</td></tr><tr><td>PharmedBPT-Schlauch</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics&nbsp;</td><td>3702003</td><td>&nbsp; Rozmiar: 0,25 x 2,05 mm (szer.: 0,9 mm)</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>233641</td><td>Superglue</td></tr><tr><td>Olej silikonowy</td><td>Thomas Recording</td><td>M-1000</td><td></td></tr><tr><td>Minisart RC15</td><td>Sartorius</td><td>17761----------R</td><td>Filtr strzykawkowy</td></tr><tr><td>Wielokanałowy system mikroiniekcji</td><td>Thomas Nagranie</td><td></td><td>wielokanałowy manipulator mikroelektrod " System Eckhorn" wyposażony w mikroelektrody i mikropipety oraz precyzyjną wielokanałową pompę do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Niestandardowe</td><td></td><td>wewnętrzne oprogramowanie laboratoryjne McLab do kontrolowania prezentacji bodźców</td><td></td></tr></tbody></table>

system iniekcji ciśnieniowych do badania neurofarmakologii przetwarzania informacji w korze mózgowej makaków zachowujących się w stanie czuwania

A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex

Odgórna modulacja przetwarzania informacji korowych jest funkcjonalnie ważna dla wielu procesów poznawczych, w tym modulacji przetwarzania informacji sensorycznych przez uwagę. Jednak niewiele wiadomo o tym, które systemy neuroprzekaźników są zaangażowane w takie modulacje. Praktycznym sposobem odpowiedzi na to pytanie jest połączenie zapisu pojedynczej komórki z miejscową i tymczasową manipulacją neurofarmakologiczną w odpowiednim modelu zwierzęcym. W tym miejscu demonstrujemy technikę łączącą ostre zapisy pojedynczych komórek z wstrzyknięciem środków neurofarmakologicznych w bezpośrednie sąsiedztwo elektrody rejestrującej. Film przedstawia przygotowanie systemu wtrysku/rejestracji ciśnieniowej, w tym przygotowanie substancji do wstrzyknięcia. Pokazujemy małpę rezusa wykonującą zadanie uwagi wzrokowej oraz procedurę rejestracji pojedynczej jednostki z blokowymi manipulacjami farmakologicznymi.

Rysunek 2 przedstawia zadanie uwagi przestrzennej, które małpa wykonywała podczas procesu iniekcji. Małpa została przeszkolona, aby skupiać uwagę albo na bodźcu znajdującym się w polu recepcyjnym rejestrowanego neuronu (uwaga-wewnątrz), bodźcu znajdującym się poza polem recepcyjnym (uwaga-zewnątrz) lub punkcie fiksacji (uwaga-fiksacja). Warunki te umożliwiają porównanie aktywności neuronalnej w różnych stanach uwagi.
Rysunek 3 przedstawia histogram czasu okołobodźcowego (PSTH) dla przykładowego neuronu w eksperymencie z użyciem skopolaminy, antagonisty muskarynowego receptorów cholinergicznych. Wykres obrazuje supresję odpowiedzi podczas iniekcji skopolaminy w porównaniu do braku iniekcji, w sytuacji gdy w polu recepcyjnym neuronu prezentowany jest wzór poruszający się w preferowanym przez komórkę kierunku, na którym zwierzę skupia uwagę. Dwa pierwsze piki reprezentują odpowiedź neuronu na początek (on) i koniec (offset) sygnału przestrzennego, który pojawia się w jego polu recepcyjnym. Następnie widoczna jest odpowiedź na poruszający się wzór, który pojawia się na ekranie 500 ms po wystąpieniu sygnału. Szary obszar zacieniony określa okres analizy wykorzystany do obliczenia średniej częstotliwości wyładowań dla każdej próby. Zielony obszar podkreśla supresyjny wpływ iniekcji skopolaminy na częstotliwość wyładowań komórki. Ciemnozielony region pokazuje supresję w obrębie okresu analizy.
Rysunek 4A przedstawia wpływ skopolaminy na średnią częstotliwość wyładowań badanego neuronu w każdym z trzech stanów uwagi. Częstotliwość wyładowań neuronu dla dwóch warunków uwagi przestrzennej (uwaga wewnątrz lub na zewnątrz pola recepcyjnego rejestrowanego neuronu), a także dla warunku sensorycznego (uwaga skupiona na punkcie fiksacji), spadła krótko po pierwszej iniekcji w bloku iniekcji (obszar zacieniony na szaro), a podczas bloku regeneracji wzrosła z opóźnieniem do poziomu sprzed iniekcji.
Rycina 4B przedstawia rejestrację kontrolną z drugiego badanego neuronu, do którego wstrzyknięto sól fizjologiczną (0,9% NaCl), stosując ten sam protokół co w przypadku wstrzyknięcia skopolaminy. W bloku wstrzykiwania nie zaobserwowano zmian w częstotliwości wyładowań neuronu w porównaniu z blokiem kontrolnym.
<img alt="Schemat układu do mikroiniekcji za pomocą mikropipety; rurki prowadzące, mikropompa do precyzyjnej iniekcji biologicznej." src="/files/ftp_upload/53724/53724fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Układ wykorzystywany do manipulacji farmakologicznych podczas rejestracji. (A) Przedstawiono pompę do mikroiniekcji oraz system rejestracji elektrofizjologicznej wyposażony w elektrody i mikropipetę. Powiększono szczelinę w rurce prowadzącej, do której wlewa się olej silikonowy w celu nasmarowania elektrod i mikropipety. (B) Przedstawiono przykładową mikropipetę (u góry) oraz elektrodę rejestrującą (u dołu). W celu porównania wielkości poniżej umieszczono monetę eurocent (średnica: 16 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53724/53724fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Oś czasu eksperymentu przetwarzania wizualnego; schemat sekwencji zdarzeń: fiksacja, wskazówka, ISI, cel." src="/files/ftp_upload/53724/53724fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Projekt zadania służący do kierowania uwagą przestrzenną. Małpy były trenowane w wykrywaniu zmiany kierunku ruchu w zaznaczonym wzorze kropek. Wskazówka była umieszczana albo w obrębie pola recepcyjnego neuronu (uwaga wewnątrz), jak pokazano na rycinie, albo poza nim (uwaga na zewnątrz). Jako kontrolę sensoryczną małpa była trenowana w wykrywaniu zmiany luminancji punktu fiksacji (uwaga na fiksację). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53724/53724fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres częstotliwości wyładowań neuronów; blok kontrolny vs blok z iniekcją; czas po sygnale; zaznaczony okres analizy." src="/files/ftp_upload/53724/53724fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wpływ antagonisty skopolaminy na częstotliwość wyładowań. Przedstawiono peri-stimulus time histogram dla przykładowego neuronu w warunku skupienia uwagi wewnątrz pola recepcyjnego (attend-in) podczas bloku z iniekcją oraz podczas bloku kontrolnego. Oś X przedstawia czas w milisekundach po wystąpieniu sygnału, a oś Y pokazuje częstotliwość wyładowań w spikes/sec. Szary obszar oznacza okres analizy (300-800 ms po wystąpieniu bodźca) wykorzystany do obliczenia średniej częstotliwości wyładowań z prób. Zielony obszar zacieniowany pokazuje supresję częstotliwości wyładowań w dwóch warunkach. Ciemnozielony kolor wyróżnia supresję w obrębie okresu analizy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53724/53724fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres częstotliwości wyładowań neuronalnych, wstrzyknięcie antagonisty względem soli fizjologicznej, pokazujący fazy kontrolną i regeneracji." src="/files/ftp_upload/53724/53724fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wpływ skopolaminy i soli fizjologicznej na częstotliwość wyładowań. (A) Wstrzyknięcie antagonisty skopolaminy. Przedstawiono uśrednioną z prób częstotliwość wyładowań wybranej komórki z Ryciny 3 w trakcie trwania eksperymentu dla bodźca preferowanego we wszystkich trzech warunkach uwagi. Oś x przedstawia czas rozpoczęcia próby w minutach, a oś y pokazuje częstotliwość wyładowań jednostki w impulsach na sekundę. Symbole (<img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0, schemat; koncepcja fizyczna; równoważenie sił; zasób edukacyjny." src="/files/ftp_upload/53724/53724plussign.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Plus"> uwaga skupiona (attend-in), <img alt="Równowaga statyczna; schemat ΣFx=0; koncepcja analizy strukturalnej; scenariusz bez tarcia; badanie mechaniki." src="/files/ftp_upload/53724/53724circle.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Koło"> uwaga na fiksacji (attend-fix), <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, schemat trójkąta, edukacyjny." src="/files/ftp_upload/53724/53724triangle.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Trójkąt"> uwaga rozproszona (attend-out)) reprezentują częstotliwość wyładowań neuronu w okresie analizy w każdej pomyślnie przeprowadzonej próbie, a linie poziome (linia ciągła: attend-in, linia kropkowana: attend-fix, linia przerywana: attend-out) pokazują średnią częstotliwość wyładowań dla trzech różnych bloków eksperymentalnych (kontrolnego, wstrzykiwania, regeneracji). Szary obszar zacieniowany wskazuje blok wstrzykiwania, rozpoczynający się od pierwszej iniekcji i kończący 1 min po ostatniej iniekcji. Podczas bloku wstrzykiwania co minutę podawano 2 nL 0,1 molarnej skopolaminy z prędkością wstrzykiwania 2 nl/s. (B) Wstrzyknięcie soli fizjologicznej. Przedstawiono częstotliwość wyładowań wybranej komórki w trakcie eksperymentu kontrolnego dla bodźca preferowanego we wszystkich trzech warunkach uwagi. Szary obszar zacieniowany wizualizuje blok wstrzykiwania soli fizjologicznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53724/53724fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj pokazujemy wstrzyknięcie ciśnieniowe substancji neurofarmakologicznych podczas rejestracji pojedynczej komórki u przytomnego, zachowującego się makaka. Procedura ta pozwala na manipulację farmakologiczną w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca rejestracji kory mózgowej.

System iniekcji ciśnieniowych do badania neurofarmakologii przetwarzania informacji w korze mózgowej makaków zachowujących się w stanie czuwania

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation ...

Ogólnym celem tej procedury wtryskiwania ciśnieniowego jest niezawodna manipulacja farmakologiczna bezpośrednim sąsiedztwem miejsca rejestracji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki poznawczej, takie jak wykazanie specyficznego wkładu neuroprzekaźników w modulację odgórną (top-down) przetwarzania informacji korowych w przekazie w przód (feedforward). Główną zaletą tej techniki jest możliwość niezawodnej manipulacji bezpośrednim otoczeniem elektrody rejestrującej przez określony czas, przy użyciu szerokiego wyboru agonistów i antagonistów.Modulacja przetwarzania informacji w przesyłach sprzężeń wprost w korze mózgowej ma istotne znaczenie funkcjonalne dla wielu procesów poznawczych, w tym dla odgórnej modulacji przetwarzania informacji sensorycznych przez uwagę. Małpa rezus jest odpowiednim modelem zwierzęcym do badania udziału systemów neurotransmisyjnych w takich modulacjach. Podczas wykonywania przez zwierzę zadania poznawczego przeprowadza się rejestracje z pojedynczych komórek w połączeniu z lokalną i czasową manipulacją neurofarmakologiczną.Opisany tutaj system umożliwia stabilny pomiar aktywności pojedynczego neuronu, z zastosowaniem lub bez zastosowania wstrzyknięć farmakologicznych w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca rejestracji, u budzącej się i wykazującej naturalne zachowania małpy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy oczyścić rurki prowadzące systemu rejestracyjnego, zanurzając druty do czyszczenia w sterylnym oleju silikonowym i przeciągając je kilkakrotnie przez poszczególne rurki prowadzące. Następnie należy wprowadzić kwarcową mikropipetę do rurki prowadzącej systemu rejestracyjnego.Po zamocowaniu mikropipety w systemie rejestracyjnym, przymocuj sterylną probówkę do metalowego pinu mikropipety. Należy uważać, aby nie złamać mikropipety, używając dwóch sterylnych pęset do wywarcia równomiernego nacisku na pin i probówkę. Następnie użyj superkleju, aby uszczelnić połączenie między probówką a mikropipetą.Odczekaj co najmniej trzy godziny do utwardzenia kleju przed napełnieniem mikropipety cieczą. Po wprowadzeniu mikropipety, umieść mikroelektrody w pozostałych pozycjach systemu rejestracyjnego. Przed każdym pomiarem przygotuj probówkę z substancją do wstrzyknięcia i pozwól jej osiągnąć temperaturę pokojową, jeśli była przechowywana w lodówce.Następnie należy nanieść sterylny olej silikonowy na szczelinę rurki prowadzącej oraz na końcówki elektrod i mikropipety, aby nasmarować system i zapewnić płynny ruch. Następnie należy sprawdzić końcówki elektrod i mikropipety pod mikroskopem, aby upewnić się, że są nieuszkodzone. Należy wyrównać elektrody i mikropipetę tak, aby wystawały z rurek prowadzących na tę samą długość.Aby ustawić elektrody i mikropipetę w pozycji zerowej, należy wprowadzić je do rurek prowadzących, aż przestaną być widoczne. Następnie w oprogramowaniu ustaw należyną głębokość elektrod i mikropipety na zero. W kolejnym kroku należy napełnić sterylną strzykawkę sterylną solą fizjologiczną i wprowadzić igłę do rurki, uważając, aby nie przebić jej ścianki.Wysuń mikropipetę z prowadnicy, aby wizualnie kontrolować przepływ substancji. Następnie przepłucz rurkę i mikropipetę co najmniej dwoma mililitrami sterylnej soli fizjologicznej, aby upewnić się, że w strzykawce lub rurce nie pozostało powietrze. Nie wywieraj zbyt dużego nacisku na tłok strzykawki i upewnij się, że połączenie między rurką a mikropipetą jest szczelne.Następnie napełnić nową sterylną strzykawkę roztworem do wstrzyknięcia. Zamienić ją z tuleją strzykawki z solą fizjologiczną, upewniając się, że do układu nie przedostało się powietrze. Aby całkowicie usunąć sól fizjologiczną z rurki, przepłukać układ 250 µl roztworu do wstrzyknięcia.Następnie, korzystając z oprogramowania do sterowania silnikami, wycofaj elektrody i mikropipetę do rurek prowadzących na głębokość co najmniej 500 micrometers. Następnie opuść pierścień rurek prowadzących na dno rurek, aby utrzymać ich stałą pozycję względem siebie. Oczyść podstawę systemu etanolem, w szczególności w miejscu, w którym będzie ona stykać się z komorą rejestracyjną małpy.Następnie zamknij system rejestrujący, zakładając przednią pokrywę i dokręcając śruby. W tej procedurze ustaw pozycję x-y systemu rejestrującego, aby zdefiniować punkt, w którym rurki prowadzące docierają do opony twardej wewnątrz chronicznie implantowanej komory rejestrującej. Upewnij się, że rurki prowadzące są całkowicie cofnięte.Następnie ustaw system rejestracyjny w odpowiedniej pozycji i umieść strzykawkę w pompie do mikroiniekcji. Przesuń ruchomą część pompy, aż zostanie ona stabilnie zablokowana za tłokiem strzykawki. Jeśli na końcach rurek prowadzących widoczna jest kropla substancji, ostrożnie usuń ją za pomocą sterylnego patyczka higienicznego.Następnie stabilnie zamocuj system rejestrujący na komorze rejestracyjnej małpy. Powoli opuść rurki prowadzące do komory rejestracyjnej, aż dotrą do twardówki. Następnie wprowadź elektrody, korzystając z oprogramowania do sterowania silnikiem.Regularnie sprawdzaj impedancję elektrod na różnych głębokościach. Po pomyślnym przebiciu opony twardej przez elektrody, wysuń mikropipetę. Wprowadź elektrody i mikropipetę do głębokości obszaru zainteresowania.Następnie powoli przesuwaj elektrody i mikropipetę, aż elektroda znajdzie się wystarczająco blisko, aby rejestrować aktywność pojedynczej jednostki z dobrym stosunkiem sygnału do szumu, pamiętając o umieszczeniu elektrody rejestrującej i mikropipety na tej samej głębokości, aby zapewnić minimalną odległość między nimi. Podczas bloku wstrzykiwania podawaj zdefiniowaną ilość substancji w regularnych odstępach czasu, określając objętość wstrzykiwania za pomocą funkcji skokowej. Następnie naciskaj przycisk wstrzykiwania co minutę, zgodnie z zegarem oprogramowania do rejestracji.Zanotuj czas i numer próby, podczas której wstrzyknięto substancję, głębokość wprowadzenia elektrod i mikropipety, a także ilość podanej substancji. Po bloku iniekcji przeprowadź blok regeneracji, podczas którego nie podaje się żadnej substancji. Monitoruj i utrzymuj jakość rejestracji wybranych pojedynczych jednostek aż do końca bloku regeneracji.Po zakończeniu rejestracji wycofaj elektrody i mikropipetę do rurek prowadzących, a następnie ręcznie wycofaj rurki prowadzące. Następnie usuń system rejestracyjny z komory rejestracyjnej małpy. Potem odłącz strzykawkę od pompy wtryskowej i przenieś system do obszaru przygotowawczego w celu czyszczenia.Użyliśmy tego systemu do zbadania efektów farmakologicznych na aktywność neuronalną w różnych stanach uwagi. Rysunek ten przedstawia wpływ skopolaminy na średnią częstotliwość wyładowań badanego neuronu w każdym z trzech warunków uwagi. Częstotliwość wyładowań neuronów dla dwóch warunków uwagi przestrzennej, jak również dla warunku sensorycznego, spadła krótko po pierwszym wstrzyknięciu w bloku iniekcyjnym, a następnie w bloku regeneracyjnym, po pewnym opóźnieniu, wzrosła do poziomu sprzed iniekcji.Rysunek ten przedstawia zapis kontrolny z drugiego neuronu próbnego, w którym wstrzyknięto sól fizjologiczną zgodnie z tym samym protokołem, co w przypadku wstrzyknięcia skopolaminy. Podczas bloku wstrzykiwania nie zaobserwowano zmian w częstotliwości wyładowań neuronu w porównaniu z blokiem kontrolnym. W tym miejscu szczegółowo zilustrowano sposób przeprowadzania niezawodnych, precyzyjnie odmierzonych wstrzykiwań oraz wysokiej jakości rejestracji z pojedynczych komórek przy użyciu gotowego systemu wstrzykiwania ciśnieniowego.Mamy nadzieję, że ta metoda zainspiruje innych naukowców do badania neuromodulacyjnego wpływu na dynamikę aktywności neuronalnej.

a-pressure-injection-system-for-investigating-neuropharmacology

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Elektrofizjologiczna charakterystyka odpowiedzi neuronalnych jest istotna dla zrozumienia funkcji mózgu oraz dla precyzyjnego wyznaczania miejsc podawania barwników do śledzenia szlaków neuronalnych. Jednak wiele badań przeprowadzanych jest na zwierzętach poddanym znieczuleniu. Aby zrozumieć funkcje mózgu bez stosowania środków znieczulających, opracowaliśmy metodę rejestracji właściwości odpowiedzi neuronalnych oraz wstrzykiwania barwników u budzącej się myszy.

Przygotowanie budzącej się myszy do rejestracji odpowiedzi neuronalnych i wstrzykiwania znaczników

Ten protokół opisuje montaż i użycie iniekcji do precyzyjnego dostarczania leku do wybranych obszarów mózgu znieczulonego szczura, a następnie monitorowanie aktywności neuronalnej za pomocą zarejestrowanych sygnałów elektrycznych.

Mikroiniekcja leku z zapisem elektrofizjologicznym w mózgu szczura

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały...

Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Ten protokół opisuje projektowanie i chirurgiczne wszczepienie mechanizmu krępującego głowę do monitorowania aktywności neuronalnej w podkorowych strukturach mózgu u szczurów czujnych.  Wyznacza procedury izolowania pojedynczych neuronów w konfiguracji przyściennej i skutecznego identyfikowania ich lokalizacji anatomicznych.

Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Tutaj pokazujemy wspomagane dostarczanie wektorów wirusowych do kory mózgowej za pomocą rezonansu magnetycznego (MR) jako skuteczne i uproszczone podejście do osiągnięcia ekspresji optogenetycznej w dużych obszarach korowych w mózgu makaka.

Konwekcja wzmocniła dostarczanie optogenetycznego wektora wirusowego związanego z adenowirusem do kory mózgowej makaka rezusa pod nadzorem obrazów MRI online

Prezentujemy system mikroiniekcji przeznaczony do elektrofizjologii i wspomaganego dostarczania eksperymentalnych sond (tj. nanosensorów, mikroelektrod), z opcjonalnym wlewem leku. Powszechnie dostępne składniki mikroprzepływowe są sprzężone z kaniulą zawierającą sondę. Dołączony jest protokół krok po kroku dotyczący budowy mikroiniekcji, z wynikami podczas infuzji muscymolu w korze makaka.

System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

Zgodnie z obecną implementacją, optogenetyka u naczelnych wymaga wstrzyknięcia wektorów wirusowych do mózgu. Optymalna metoda iniekcji powinna być niezawodna i, w przypadku wielu zastosowań, zdolna do celowania w pojedyncze miejsca o dowolnej głębokości, które można łatwo i jednoznacznie zidentyfikować w histologii pośmiertnej. Przedstawiono metodę iniekcji o tych właściwościach.

Wstrzyknięcia wektorów AAV do optogenetyki w znieczulonym i przytomnym, zachowującym się mózgu naczelnych innych niż człowiek

Szczegółowo opisana jest nowa procedura funkcjonalnego obrazowania u szczurów obudzonych z głową.

Implanty głowy do neuroobrazowania u przytomnych, nieruchomych szczurów

Protokół ten przedstawia skrzynkę behawioralną opartą na mikrokontrolerze do oceny hamowania przedimpulsowego (PPI) poprzez zbieranie danych o przyspieszeniu z czujnika znajdującego się pod skrzynką. Dane te oceniają deficyty bramkowania sensorycznego u społecznie izolowanych szczurów, z dodatkową metodą synchronizacji danych z aktywnością neuronalną w celu przyspieszenia badań neurofizjologicznych nad zaburzeniami zachowania.

Opracowanie pudełka behawioralnego do oceny hamowania prepulsu i aktywności neuronalnej w psychiatrycznych modelach zwierzęcych

Poznaj technikę iniekcji ciśnieniowej do neurofarmakologicznych badań kory mózgowej u czuwających makaków. Ta metoda umożliwia manipulację receptorami w pobliżu elektrody rejestrującej, dostarczając wgląd w rolę neuroprzekaźników w procesach poznawczych.

System iniekcji ciśnieniowych do badania neurofarmakologii przetwarzania informacji w korze mózgowej makaków zachowujących się w stanie czuwania (Wideo) | JoVE Journal

System iniekcji ciśnieniowych do badania neurofarmakologii przetwarzania informacji w korze mózgowej makaków zachowujących się w stanie czuwania

Przeglądaj więcej filmów