Name: Analiza retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj metodę FISH do analizy retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra w liniach komórkowych HepG2. Technika ta umożliwia dokładne określenie wskaźników i wzorców retrotranspozycji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 i ES017274) oraz AstraZeneca dla KSR.

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej. Zapoznaj się z sekcją Odczynniki, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania poszczególnych odczynników.
1. Etykietowanie sond L1
UWAGA: Sondy mogą być oznaczone za pomocą etykietowania chemicznego lub PCR.
<ol>
	<li>Etykietowanie substancji chemicznych
	<ol>
		<li>Przygotować 0,7-1% żelu agarozowego w buforze Tris-acetate-EDTA (TAE), podgrzać w kuchence mikrofalowej do stopienia, pozostawić żel do ostygnięcia, a następnie dodać bromek etydyny (0,5 μg/ml). Wlej do tacki na żel, dodaj grzebienie i pozwól żelowi zastygnąć w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Oznacz sondę SNeo (1-2 μg) CY3 lub FITC w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę zgodnie z protokołem producenta. 
		UWAGA: SNeo oznacza gen Neomycyny z wiązaniem Sulegający ekspresji po pełnym cyklu retrotranspozycji. Sonda ma rozmiar ~1,000 pz. SNeo może być amplifikowany metodą PCR z dowolnego wektora lub z genomowego DNA. Patrz Tabela materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat odczynników do znakowania Streptavidin-CY3/FITC.</li>
		<li>Wymieszaj znakowany roztwór sondy SNeo z 1x buforem ładującym DNA, załaduj do każdej studzienki i pracuj pod napięciem 75-100 woltów przez 15-20 minut.</li>
		<li>Wizualizacja pasma sondy za pomocą oświetlacza ultrafioletowego (UV). Należy pamiętać, że rozmiar sondy SNeo można regulować, a także dodawać kwas jądrowy Lock (LNA) (rysunek 2).</li>
		<li>Wytnij oznaczoną sondę SNeo z żelu za pomocą czystego ostrza, rozpuścij i oczyść sondę SNeo z żelu za pomocą zestawu PCR Clean-Up zgodnie z protokołem producenta. 
		UWAGA: Przykryj każdą odsłoniętą część ciała osłonami ochronnymi (tj. fartuchami laboratoryjnymi i przezroczystą maską na twarz UV) podczas oglądania i krojenia żelu. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat żelowego oczyszczania produktów PCR.</li>
		<li>Ponownie przeprowadź 5 μl sondy znakowanej SNeo z nieznakowaną sondą SNeo na 0,7% żelu agarozowym (patrz 1.1.1), aby potwierdzić zwiększenie rozmiaru i utratę intensywności sygnału (rysunek 2).</li>
		<li>Określić ilościowo ilość znakowanej sondy SNeo, mierząc absorbancję przy 260 nm i rozcieńczyć sondę SNeo do 10 podwielokrotności ng/μl w H2O. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowanie PCR (alternatywna metoda etykietowania sondy)
	<ol>
		<li>Połącz startery specyficzne dla SNeo (5'-ggatagcattgggagatatacct-3' i 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') z odczynnikami PCR w jednej probówce: 13,6 μl H2O wolne od nukleazy; 0,1 μl dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 μl dTTP (10 nM); 0,05 μl dUTP-biotyna/dUTP-FITC/CY3 (10 nM); 4 μl bufor Go Tag 5x; 0,4 μl polimerazy Go Tag; 1 μl matrycy SNeo (10 ng). Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat odczynników PCR.</li>
		<li>Dostosuj ilość każdego odczynnika, mnożąc przez całkowitą liczbę próbek.</li>
		<li>Użyj następujących parametrów cyklicznych PCR, aby wzmocnić i oznaczyć sondy SNeo: 95 °C przez 2 min; 35 cykli po 95 °C przez 30 sekund, 62 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 60 sekund; 72 °C przez 2 min; Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony. 
		UWAGA: Temperaturę wyżarzania można dostosować lub wykonać gradientowy PCR w celu określenia optymalnych temperatur wyżarzania dla innych sond.</li>
		<li>Zrobić 0,7-1% żelu, jak w sekcji 1.1.1, załadować i zwizualizować opaskę sondy jak w sekcji 1.1.4.</li>
		<li>Wyciąć i oczyścić oznaczoną sondę SNeo, jak w rozdziale 1.1.5.</li>
		<li>Ponownie uruchom 5 μl sondy znakowanej SNeo z nieznakowaną sondą SNeo, aby potwierdzić wzrost rozmiaru i utratę intensywności sygnału (patrz rysunek 2).</li>
		<li>Określić ilościowo ilość znakowanej sondy SNeo, mierząc absorbancję przy 260 nm i rozcieńczyć sondę SNeo do 10 podwielokrotności ng/μl w wolnym od nukleazH2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozkładów chromosomowych
<ol>
	<li>Generowanie stabilnych klonów wykazujących ekspresję szkieletu wektorowego (kontrola) lub kompetentnej retrotranspozycji L1 przy użyciu standardowych metodologii selekcji. 12,16 Podczas gdy reporterzy nieepizodyczni zostali użyci do skorelowania wyników z badaniami transkrypcji, można również użyć wektorów epizodycznych. Hoduj komórki stabilnie wyrażające wektor kontrolny lub wektor L1 (1 x 106 komórek na 10 cm płytkę, z dostosowaniem rozmiaru płytki w razie potrzeby) w kompletnej pożywce wzrostowej. W przypadku komórek HepG2 należy użyć RPMI-1600, 10% FBS i 200 μg/ml higromycyny. Uprawiaj kultury do 70% konfluencji w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Wybór pożywki wzrostowej zależy od typu komórki. Biorąc pod uwagę, że użyte tutaj plazmidy przenoszą kasety selekcyjne zarówno dla higromycyny, jak i neomycyny, stabilną selekcję klonów można również przeprowadzić za pomocą neomycyny po selekcji na higromycynie, ale ilość neomycyny musi zostać zoptymalizowana, aby ustalić poziomy tolerancji dla każdego typu komórek.</li>
	<li>Dodać colcemid (0,4 μg/ml) do pożywki hodowlanej i inkubować przez 90 minut w celu zatrzymania komórek w metafazie. W przypadku stosowania różnych typów komórek należy empirycznie określić optymalne stężenie colcemidu i czas ekspozycji (60, 90 i 120 min) w celu optymalnego zatrzymania metafazy.</li>
	<li>Umyj komórki 2x 10 ml 1x PBS Dulbecco (DPBS), trypsynizuj dodając 3-5 ml 0,25% roztworu trypsyny do komórek i inkubuj przez 5 minut w celu odłączenia komórek. Dezaktywuj trypsynę równą ilością pożywki zawierającej 10% FBS.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 2 minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C, odessać pożywkę z osadu komórkowego i przemyć komórki DPBS. Odessać wszystkie DPBS, pozostawiając 200 μl DPBS do ponownego zawieszenia komórek. Upewnij się, że komórki są dobrze wymieszane i że wszystkie grudki są rozproszone. Używaj migotania lub delikatnego pipetowania, aby wymieszać i rozproszyć grudki i uniknąć wirowania.</li>
	<li>Dodać kroplami 5 ml roztworu hipotonicznego (tj. 75 mM KCl), który jest wstępnie ogrzany do temperatury 37 °C, obracając probówkę o pojemności 15 ml w poziomie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje o tym, jak uzyskać i przygotować roztwór hipotoniczny.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 120 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i powtórzyć kroki 2,4 - 2,5 3x, pozostawiając około 200 μl roztworu hipotonicznego do ponownego zawieszenia komórek po każdym myciu. Upewnij się, że pod koniec 3 prań granulka jest widocznie biała i spuchnięta.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 200 μl roztworu utrwalającego Carnoya i rozcieńczyć 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 w roztworze utrwalającym Carnoy. Upuść 10 μl każdego rozcieńczenia na suche, czyste szkiełko podstawowe z wysokości około 1 cm i natychmiast wystawij stronę wolną od rozprowadzania na działanie gorącej pary z wrzącej wody przez 30 sekund. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat przygotowania roztworu utrwalającego Carnoya.</li>
	<li>Wysuszyć pasty w temperaturze pokojowej, zabarwić 0,1 μg/ml Hoechst-33342 zanurzając na 15-20 min w słoiku Coplin i umyć 3x DPBS. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat przygotowania roztworu Hoechst-33342.</li>
	<li>Widok rozkładów na mikroskopie fluorescencyjnym/kontrastowym fazowym przy 40-krotnym powiększeniu. Po zoptymalizowaniu przygotowania do rozprowadzania, smarowidła nie muszą być barwione Hoechst-33342. Wyświetl rozrzuty na mikroskopie z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu, aby określić jakość rozrzutu i separację, jak opisano w sekcji Wyniki (patrz rysunek 3).</li>
	<li>Wybierz i zakreśl dobre rozkłady za pomocą znacznika Diamond Point po przeciwnej stronie szkiełka (tj. po stronie bez spreadu).</li>
	<li>Przechowywać pasty do smarowania w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca. Unikaj narażenia na wilgoć.</li>
</ol>
3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
<ol>
	<li>Smary stabilizujące i odwadniające 
	UWAGA: Chromosom metafazy równowagi rozprzestrzenia się do temperatury pokojowej, jeśli jest przechowywany w temperaturze -20 °C. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje o tym, jak uzyskać i wykonać odczynniki.
	<ol>
		<li>Inkubować chromosom metafazy rozprzestrzenia się z 200 μl RNazy A przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przemyć szkiełka w buforze 2x-SSC dwa razy przez 5 minut każde, a następnie przepłukać 10 mM roztworem HCl.</li>
		<li>Inkubować rozsiewy z 1% pepsyną przez 10 minut w temperaturze 37 °C, płukać dejonizowanymH2Oi przemywać dwukrotnie buforem 2x-SSC przez 5 minut każdy.</li>
		<li>Inkubować rozsiewy z 4% paraformaldehydem przez 10 minut i przemywać w 2x buforze SSC dwa razy po 5 minut każdy.</li>
		<li>Odwodnić rozprzestrzenianie się przez inkubację przez 2 minuty w seriach etanolu: 70%, 80% i 95% etanolu.</li>
		<li>Zjeżdżalnie suche na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja rozprzestrzenia się za pomocą sond retrotranspozycyjnych znakowanych L1 (tj. SNeo) 
	UWAGA: W przypadku sond z etykietą bezpośrednią należy zawsze trzymać z dala od światła. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje o tym, jak uzyskać i wykonać odczynniki.
	<ol>
		<li>Dodać 30 ng SNeo do buforu hybrydyzacyjnego, ogrzewać w temperaturze 72 °C przez 10 minut i schłodzić przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Do każdego smarowania dodać 30 μl roztworu sondy SNeo, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić krawędzie cementem gumowym. Upewnij się, że nie tworzy się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Podgrzewać szkiełko w temperaturze 72 °C przez 5 minut na bloku grzewczym, stopniowo obniżać temperaturę do 37 °C i inkubować przez noc w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie i oglądanie (lub dodanie przeciwciała drugorzędowego) 
	UWAGA: W przypadku sond z bezpośrednim znacznikiem należy zawsze trzymać z dala od światła. 
	UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje o tym, jak się przygotować. Zaleca się stosowanie wystarczającej objętości, aby pokryć całe rozprzestrzenianie się chromosomów. Pamiętaj, że nadmiar objętości zostanie utracony po dodaniu szkiełka nakrywkowego.
	<ol>
		<li>Zanurz szkiełka w buforze 2x SSC, aby usunąć szkiełka nakrywkowe.</li>
		<li>Szkiełka myć przez zanurzenie w buforze 2x-SSC w temperaturze 45 °C na 5 min.</li>
		<li>Myć szkiełka przez zanurzenie w buforze do płukania w temperaturze 45 °C na 5 min, 2x.</li>
		<li>Szkiełka myć przez zanurzenie w 0,1x buforze SSC w temperaturze 45 °C na 10 min.</li>
		<li>Szkiełka myć przez zanurzenie w 2x buforze SSC w temperaturze 45 °C przez 10 min. 
		UWAGA: Umieść słoik Coplin zawierający zalecany bufor w łaźni wodnej, ustaw temperaturę do 45 °C.</li>
		<li>Schłodzić szkiełka do temperatury pokojowej i zrównoważyć szkiełka w buforze detekcji.</li>
		<li>W przypadku sond z etykietą bezpośrednią przejdź do kroku 3.4.10.</li>
		<li>W przypadku sond znakowanych pośrednio należy zablokować bufor blokujący na 20-30 min i przemyć 3x w DPBS.</li>
		<li>Inkubować z 50 μl przeciwciała drugorzędowego (np. 5 μg/ml streptawidyny-FITC lub αCY3 w buforze blokującym) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj szkiełka w 2x SSC przez 5 minut dwa razy.</li>
		<li>Barwienie przeciwdziałające roztworem Hoechst-33342 (0,1 μg/ml) przez 10 min. 
		UWAGA: to barwienie ma na celu barwienie chromosomów w celu kolokalizacji za pomocą sondy.</li>
		<li>Umyj w DPBS 3x, dodaj kroplę podłoża montażowego, umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelnij brzegi lakierem do paznokci.</li>
		<li>Analizuj retrotranspozycję L1 za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 40-krotnym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254, 1808-1810 (1991).</li>
<li>Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+retrotransposon+encodes+a+conserved+endonuclease+required+for+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition.</a> Cell. 87, 905-916 (1996).</li>
<li>Clements, A. P., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+LINE-1+reverse+transcriptase%3Aeffect+of+deletions+outside+the+common+reverse+transcriptase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain.</a> Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).</li>
<li>Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+for+an+essential+protein+in+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).</li>
<li>Khazina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+and+flexibility+of+the+L1ORF1+protein+in+human+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).</li>
<li>Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+defines+distinct+functional+domains+for+protein-protein+and+nucleic+acid+interactions+in+the+ORF1+protein+of+mouse+LINE-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1.</a> J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).</li>
<li>Martin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+particles+with+LINE-1+RNA+in+mouse+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).</li>
<li>Hohjoh, H., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+ribonucleoprotein+complexes+containing+human+LINE-1+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA.</a> EMBO J. 15, 630-639 (1996).</li>
<li>Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+element+target-primed+reverse+transcription+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro.</a> EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).</li>
<li>Szak, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+archeology+of+L1+insertions+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular archeology of L1 insertions in the human genome.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li>
<li>Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease-independent+insertion+provides+an+alternative+pathway+for+L1+retrotransposition+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome.</a> Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+HepG2+genome+by+long+interspersed+nuclear+element-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1.</a> Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).</li>
<li>Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ty+elements+transpose+through+an+RNA+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ty elements transpose through an RNA intermediate.</a> Cell. 40, 491-500 (1985).</li>
<li>Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indicator+gene+to+demonstrate+intracellular+transposition+of+defective+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses.</a> PNAS. 85, 2219-2223 (1988).</li>
<li>Moran, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+retrotransposition+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells.</a> Cell. 87, 917-927 (1996).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+LINE-1+retrotransposition+in+HepG2+cells+preferentially+targets+gene+poor+regions+of+chromosome+13%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13.</a> Genomics. 104, 96-104 (2014).</li>
<li>Rozen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+gene+conversion+between+arms+of+palindromes+in+human+and+ape+Y+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes.</a> Nature. 423, 873-876 (2003).</li>
<li>Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+gene+content+of+human+sex+chromosomes+evolved%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Gen+Develop%22%5BJournal%5D)">How the gene content of human sex chromosomes evolved.</a> Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).</li>
<li>Leem, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+Tf1+is+targeted+to+Pol+II+promoters+by+transcription+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators.</a> Mol Cell. 30, 98-107 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Levin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+retrotransposon+integration+provides+a+saturated+profile+of+target+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genome Res. 20, 239-248 (2010).</li>
<li>Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+regulates+integration+of+the+yeast+Ty5+retrotransposon+into+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin.</a> Mol Cell. 27, 289-299 (2007).</li>
<li>McClintock, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+behavior+of+mutable+loci+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The origin and behavior of mutable loci in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).</li>
<li>Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-induced+gene+activation+as+a+mechanism+generating+cluster+shape+somatic+variation+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine.</a> Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).</li>
<li>Garcia-Perez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+engineered+L1+retrotransposition+events+in+human+embryonic+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells.</a> Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).</li>
<li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductual+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma.</a> Nat Med. 21 (9), (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak potencjalnych konkurencyjnych interesów.

Do badania retrotranspozycji L1 zastosowano takie metodologie, jak sekwencjonowanie całego genomu, odwrócony PCR i southern blot. Chociaż metodologie te są niezwykle cenne w lokalizowaniu miejsc insercji L1 w genomach, wyzwaniem dla wszystkich z nich jest potrzeba programowania in-silico w celu ponownego złożenia sekwencji. Opisana tu metodologia FISH ma na celu uzupełnienie tych metod, szczególnie w przypadku badań wymagających analizy ektopowej retrotranspozycji L1 w hodowanych komór...

Długo przeplatany Ludzki Pierwiastek Jądrowy-1 (Linia-1 lub L1) jest autonomicznym ruchomym pierwiastkiem, który rozprzestrzenia się w obrębie genomu poprzez mechanizm retrotranspozycji "kopiuj i wklej". Typowy ludzki L1 ma ~6 kb długości i składa się z 5'UTR (Nieprzetłumaczony Region), który służy jako promotor, dwóch otwartych ramek odczytu (ORF): L1-ORF1 i L1-ORF2 oraz 3'UTR z ogonem polyA. Białko L1-ORF1 ma trzy odrębne domeny: domenę cewka-cewka, motyw rozpoznawania RNA i domenę C-końcową, podczas gdy białko L1-ORF2 ma endonukleazę, odwrotną transkryptazę i domeny bogate w cysteinę1,2,3,4,5. L1-ORF1 wykazuje aktywność opiekuńczą kwasu nukleinowego, podczas gdy L1-ORF2 zapewnia aktywność enzymatyczną, przy czym oba białka są niezbędne do retrotranspozycji1,2,6.
Cykl retrotranspozycji L1 rozpoczyna się od transkrypcji z 5'UTR mRNA bicystronicznego L1 przez polimerazę RNA II, translokacji do cytoplazmy i translacji. W cytoplazmie L1-ORF1 wykazuje albo wiązanie cis, w którym pakuje własne RNA, albo wiązanie trans, w którym pakuje inne RNA (tj. SINE / SVA / pseudogeny), tworząc cząstkę rybonukleoproteiny (RNP) z L1-ORF2p7,8. RNP przemieszczają się do jądra, gdzie aktywność endonukleazy L1-ORF2p nacina genomowe DNA (gDNA), aby odsłonić grupę OH- 9, która z kolei jest wykorzystywana przez odwrotną transkryptazę do wstępnej i odwrotnej syntezy RNA do DNA z końca 3'. Podczas syntezy odwrotnej druga nić DNA jest nacinana 7-20 pz od pierwotnego miejsca nacięcia, aby utworzyć rozłożone w czasie przerwy, które są wypełniane, tworząc charakterystyczne sekwencje insercji L1 (np. TTTTAA) zwane duplikacjami miejsca docelowego (TSD)9,10. Proces ten jest znany jako docelowa pierwotna odwrotna transkrypcja (TPRT) i prowadzi do wstawienia pełnych lub skróconych kopii L1 / innych DNA z TSD na obu końcach wstawionej sekwencji. Wykazano również, że retrotranspozycja L1 odbywa się za pośrednictwem niehomologicznego łączenia końców podobnych do TPRT w niektórych typach komórek11.
Wektor retrotranspozycji L1 zastosowany w naszych badaniach jest nieepisomalny i składa się z oznaczonych L1-ORF1&2p napędzanych przez połączone promotory CMV-L1-5'UTR (Rysunek 1)12. Wcześniejsze wersje tego konstruktu zostały opisane w badaniach z użyciem drożdży i kultur komórek ludzkich13,14,15. Dwa odrębne promotory CMV znajdujące się na końcach 5' i 3' wektora, przy czym koniec 3' umieszczony jest w odwrotnej orientacji, aby sterować ekspresją neomycyny po splicingu i integracji. Kaseta wskaźnika retrotranspozycji na końcu 3' składa się z genu neomycyny wprowadzonego antysensownie do L1-ORF i unieaktywnionego przez rozdzielenie na dwie połówki przez intron globiny z lokacjami spliced donor (SD) i spliced acceptor (SA) (Figura 1). Po integracji z chromosomem L1 jest transkrybowany ze wspólnego promotora w celu wytworzenia mRNA, które składa się z mRNA bicystronicznego i nieaktywnego mRNA neomycyny. Podczas przetwarzania RNA intron globiny jest wycinkany z genu neomycyny w celu przywrócenia w pełni funkcjonalnego genu neomycyny. Hybrydowe mRNA jest pakowane w RNP w cis i translokowane do jądra, gdzie jest integrowane z genomem jako insercja o pełnej długości lub skrócone za pomocą TPRT.
Tutaj opisujemy metodologię, która wykorzystuje fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) z sondami skierowanymi specjalnie na splicing genu neomycyny (SNeo) do śledzenia wzorców retrotranspozycji L1 i szybkości insercji na poziomie pojedynczego jądra. Skuteczność i swoistość detekcji potwierdzono przy użyciu kompetentnych i niekompetentnych konstruktów i sond do retrotranspozycji do wykrywania SNeo lub złącza intronowego16 neomycyny i globiny. Metodologia ta wyjaśnia niektóre niedociągnięcia testów retrotranspozycji opartych na hodowlach komórkowych, takie jak wielokrotne insercje, oporność kolonii i korzystna ekspansja klonu.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Sondy do znakowania</td></tr><tr><td>Go Tag DNA polimeraza Promega</td><td></td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x bezbarwny bufor</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Indywidualny dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Dostosuj stężenie dATP, dGTP, dCTP do 2&nbsp; mM i dTTP do 1,5&nbsp; mM w wodzie wolnej od nukleaz.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotyna (0,5&nbsp; mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0,5&nbsp; mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0,5&nbsp; mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td> Zestaw do etykietowania MIRUS FISH Zestaw do etykietowania MIRUS MIR3625 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH</td> Zestaw do czyszczenia <td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>Zamiast zestawu do czyszczenia PCR NucleoSpin PCR Clean Up Kit można użyć dowolnego odczynnika</td></tr> do <tr><td>PCR Do</td><td></td><td></td><td>wzmocnienia produktu etykietowego można użyć dowolnego termocyklera.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przygotowanie spreadów chromosomowych</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Dodać Colcemid bezpośrednio do pożywki wzrostowej do końcowego stężenia 0,4&nbsp; &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp; M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Rozcieńczony 1&nbsp; M KCl rozwiązanie do 75&nbsp; Roztwór mM do przygotowania roztworu hipotonicznego</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>utrwalający Carnoya</td><td>Wymieszaj 3 objętości metanolu i 1 objętość kwasu octowego, aby uzyskać roztwór utrwalający Carnoya. Zrób świeżość za każdym razem.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Rozpuścić Hoechst-33342 w PBS do końcowego stężenia 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Marker Diamond Point</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Matowe slajdy</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Technologie życia&nbsp;</td><td>R001100</td><td>Aby zdetechizować komórki, inkubuj komórkę w trypsynie przez 5 minut i nieaktywną z równą objętością kompletnego podłoża.</td></tr><tr><td>Prowadnice pokrywy</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td> grzewczy <td>Do tego celu można użyć dowolnego bloku grzewczego, chociaż zalecane są bloki montowane do prowadnic grzewczych.</td></tr><tr><td>Zlewka (600&nbsp; ml)</td> <td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Napełnij zlewkę wodą, podgrzej do wrzenia, użyj gorącej pary, aby rozerwać chromosomy.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Nikon</td><td>125690</td><td>Do sprawdzenia jakości rozprowadzania można użyć dowolnego mikroskopu.</td></tr><tr><td colspan="4">Odczynniki i materiały dla RYB</td></tr><tr><td>cytrynian trisodowy</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chroride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran Sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr>Technologie<td>życia DNA plemników łososia</td><td>&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma 322415</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Rozpuścić Hoechst-33342 w PBS do końcowego stężenia 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Uszczelniacz z cementu gumowego/Cytobond&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Siedem słoików z kopliną</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Ciemna komora nawilżana</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka osłonowe</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Suchy cyfrowy blok grzewczy</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>fluorescencyjny</tr><tr><td>20x sól fizjologiczno-cytrynian sodu (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Połącz 175 g NaCl i 88,2&nbsp; g cytrynianu trisodowego z 800 ml klasy cząsteczkowej H2O. Mieszać, dostosowując do pH 7. Gdy wszystkie sole się rozpuszczą, dostosuj objętość do 1 l i przefiltruj przez 0,22 &mikro; m Bibuła filtracyjna. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>1&nbsp; mg/ml Rnazy A</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczyć 20x bufor SSC do 2x bufor SSC. Rozpuścić RNazę A w 2x buforze SSC do końcowego stężenia 1&nbsp; mg/ml. Za każdym razem przygotuj świeże rozwiązanie.</td></tr><tr><td>1% pepsyna</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić pepsynę (W/V) w 10 mM HCl do końcowego stężenia 1% roztworu. Zrób świeże za każdym razem.</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>Odważyć 4,0 g PFA w dygestorium, dodać 50 ml 1xPBS, podgrzać do 60&nbsp; &deg; C mieszając i dostosuj pH kroplami NaOH, aż cały PFA się rozpuści, a roztwór stanie się klarowny. Dostosuj głośność do 100&nbsp; ml, przefiltrować przez 0,22 i mikro; m Filtruj bibułę i przechowuj 5 ml porcji w temperaturze -20&nbsp; &deg;C. Rozmrozić podwielokrotność PFA w 37 &deg; C przez 10-15 minut do kolejnych zastosowań. Dostosuj rozmiar filtra w zależności od ilości paraformaldehydu.</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> płuczący <td>Połącz 100 ml formamidu (20%) z 2,5 ml 20x SSC, dostosuj do pH 7 za pomocą 1,0 M HCl i doprowadź objętość do 500 ml za pomocą klasy cząsteczkowej H2O.</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>hybrydyzacyjny</td><td>Połącz 50% formamidu, 10% siarczanu dekstranu, 0,1% SDS i 300 ng / ml DNA plemników łososia w 2x buforze SSC. Ilość formamidu określa stopień skupienia chromatyd; Miareczkować ilość.</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> detekcji <td>Rozcieńczyć 20x bufor SSC do 4x i dodać 0,2% Tween-20, aby utworzyć bufor detekcji.</td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td></td><td></td><td>Połącz 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z 0,2% Tween-20 w buforze 4x SSC.</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>odwadniający</td><td>Wykonaj 70%, 80% i 95% roztworów etanolu.</td></tr></tbody></table>

analiza retrotranspozycji line-1 na poziomie pojedynczego jądra

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Długi przeplatany pierwiastek jądrowy-1 (Linia-1 lub L1) stanowi około 17% DNA obecnego w ludzkim genomie. Podczas gdy większość L1s jest nieaktywna z powodu obcięć 5', ~ 80-100 tych elementów pozostaje kompetentnych do retrotranspozycji i rozprzestrzenia się do różnych miejsc w całym genomie za pośrednictwem produktów pośrednich RNA. Podczas gdy uważa się, że starsze L1 celują w bogate w AT regiony genomu, cele chromosomalne nowszych, bardziej aktywnych L1 pozostają słabo zdefiniowane. Tutaj opisujemy metodologię hybrydyzacji fluorescencji in situ (FISH), którą można wykorzystać do śledzenia wzorców insercji L1 i szybkości inkorporacji ektopowego L1 na poziomie pojedynczego jądra. W tych eksperymentach sondy neomycyny znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny/cyjaniną-3 (FITC/CY3) zastosowano do śledzenia retrotranspozycji L1 in vitro w komórkach HepG2 stabilnie eksprymujących ektopowy L1. Metodyka ta zapobiega błędom w szacowaniu wskaźników retrotranspozycji spowodowanych toksycznością i uwzględnia występowanie wielokrotnych insercji do pojedynczego jądra.

Schematyczny rysunek wektora retrotranspozycji L1 przedstawiono na Rysunku 1. Wektor składa się z genu neomycyny w orientacji antysensownej względem ORF-ów L1, który jest przerwany intronem globiny w orientacji sensownej i otoczony miejscami SD oraz SA. Po stabilnej integracji z chromosomem, mRNA L1 jest transkrybowane z połączonego promotora CMV i L1-5'UTR (Rysunek 1). Podczas procesu przetwarzania RNA, intron globiny jest wyci...

Tutaj stosujemy metodologię FISH do śledzenia retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczych jąder w rozsiewach chromosomów linii komórkowych HepG2 stabilnie wyrażających syntetyczną LINE-1.

Analiza retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i analiza tempa oraz wzorców retrotranspozycji L-1 na poziomie pojedynczych jąder komórkowych przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, czyli FISH. Główną zaletą tej metodologii jest fakt, że pozwala ona badaczowi uniknąć nadmiernego lub niedoszacowania tempa i wzorców retrotranspozycji, a w połączeniu z innymi metodami umożliwia badanie retrotranspozycji L-1 na poziomie pojedynczych jąder. Procedurę tę przeprowadza dr Pasano Bojang, starszy pracownik naukowy w laboratorium.W pierwszej kolejności, po przygotowaniu żelu agarozy o stężeniu od 0,7% do 1% w buforze TAE zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć CY3 lub FITC do znakowania sondy SNeo i inkubować w temperaturze 37°C przez jedną godzinę zgodnie z protokołem producenta. Roztwór znakowanej sondy SNeo należy zmieszać z 1X buforem do ładowania DNA i nanieść do studzienek żelu agarozy. Następnie należy prowadzić elektroforezę w napięciu od 75 do 100 V przez 15 do 20 minut.Używając iluminatora UV, zwizualizuj prążek sondy. Następnie za pomocą czystego skalpela wytnij oznakowaną sondę SNeo z żelu. Po tym użyj zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta, aby rozpuścić i oczyścić sondę SNeo.Po oczyszczeniu ponownie przeprowadź elektroforezę 5 µL znakowanej sondy SNeo wraz z nieznakowaną sondą SNeo w 0,7% żelu agarozowym, aby potwierdzić zwiększenie rozmiaru oraz spadek intensywności sygnału. W celu ilościowego oznaczenia znakowanej sondy SNeo zmierz absorbancję przy 260 nm i rozcieńcz sondę SNeo do alikwotów o stężeniu 10 ng/µL w wodzie wolnej od nukleaz. Alikwoty przechowuj w temperaturze -20 °C.Po wygenerowaniu stabilnych klonów wykazujących ekspresję L-1 zdolnego do retrotranspozycji lub szkieletu wektora, należy hodować komórki HepG2 stabilnie wykazujące ekspresję wektora kontrolnego lub L-1. Do pożywki hodowlanej należy dodać 0,4 µg/ml kolcemidu. Następnie inkubować przez 90 minut, aby zatrzymać komórki w metafazie.Użyć 10 mililitrów 1X buforu PBS Dulbecco, lub DPBS, aby dwukrotnie wypłukać komórki. Następnie dodać 0,25% roztwór trypsyny i inkubować przez pięć minut. Aby zneutralizować trypsynę, dodano pożywkę zawierającą 10% FBS.Następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 1 000 G i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie odessać medium znad osadu komórkowego i użyć DPBS do przemycia komórek. Odessać cały DPBS z wyjątkiem 200 µL, a następnie wykorzystać go do resuspensji komórek poprzez lekkie potrząsanie probówką lub delikatne pipetowanie, aby upewnić się, że komórki są dobrze wymieszane i nie tworzą skupisk. Obracając probówkę poziomo, dodaj kroplami pięć mililitrów podgrzanego wcześniej roztworu hipotonicznego i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Odwiruj komórki przy 120 ×g i w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Następnie usuń cały roztwór hipotoniczny, pozostawiając jedynie 200 µL.Przemyj trzy razy roztworem utrwalającym, pozostawiając w komórkach około 200 µL roztworu utrwalającego pomiędzy poszczególnymi płukaniami. Po trzech przemyciach sprawdź, czy osad jest widocznie biały i obrzęknięty. Następnie resuspenduj osad w 200 µL roztworu utrwalającego Carnoy i wykorzystaj utrwalacz do przygotowania następujących rozcieńczeń resuspendowanych komórek.Nanieś 10 µL każdego rozcieńczenia na suchy, czysty szkiełko z wysokości około jednego centymetra, a następnie natychmiast wystaw stronę szkiełka bez rozmazanej próbki na gorącą parę z wrzącej wody przez 30 sekund. Po wysuszeniu preparatów w temperaturze pokojowej, zabarw je medium montującym zawierającym DAPI i nałóż szkiełko nakrywkę. Po inkubacji przemyj szkiełka trzy razy, używając DPBS.Aby obejrzeć preparaty, należy użyć mikroskopu kontrastowego z fluorescencją przy powiększeniu 40X. Po zoptymalizowaniu przygotowania preparatów barwienie nie jest konieczne. W celu oznaczenia prawidłowych preparatów należy użyć markera z diamentową końcówką na przeciwległej stronie szkiełka.Aby ustabilizować i odwodnić preparaty chromosomów w metafazie, należy nanieść 200 µL RNazy A na próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Slajdy należy przemyć dwukrotnie 2X SSC przez pięć minut w każdym cyklu, a następnie przepłukać próbki roztworem 10 mM HCl. Następnie do preparatów należy dodać 1% pepsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.Po wypłukaniu preparatów wodą dejonizowaną, przemyj próbki dwukrotnie buforem 2X SSC przez pięć minut każdego razu. Następnie dodaj do preparatów 4%paraformaldehyd i inkubuj przez 10 minut, po czym przeprowadź dwa dodatkowe płukania buforem 2X SSC. Po płukaniu w SSC odwodnij preparaty, inkubując próbki po dwie minuty w następującej serii etanolu.Dodaj 30 nanogramów SNeo do buforu do hybrydyzacji i podgrzewaj w temperaturze 72 °C przez 10 minut, a następnie studź w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Następnie nanieś pipetą 30 µL sondy SNeo na każdy preparat i przykryj próbkę szkiełkiem podstawowym. Za pomocą kleju gumowego uszczelnij krawędzie, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.Pozostaw slajd na bloku grzejnym w temperaturze 72 °C przez pięć minut. Następnie stopniowo obniż temperaturę do 37 °C. Inkubuj przez noc w ciemności, w komorze nawilżonej w temperaturze 37 °C.Aby zastosować przeciwciało wtórne, należy najpierw zanurzyć preparaty w buforze 2X SSC w celu usunięcia szkiełek nakrywkowych. Następnie zanurzyć preparaty w 2X SSC w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez pięć minut w celu ich przemycia, a następnie przenieść próbki do buforu piorącego i przemyć dwukrotnie w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez pięć minut każdorazowo. Następnie zanurzyć preparaty w buforze 0,1X SSC w temperaturze 45 stopni Celsjusza na 10 minut.Następnie przemyć preparaty w buforze 2X SSC w temperaturze 45°C przez 10 minut. Po ochłodzeniu preparatów do temperatury pokojowej, w przypadku sond bezpośrednio znakowanych, przemyć preparaty dwukrotnie buforem 2X SSC przez 5 minut w każdym cyklu. Równoważyć preparaty w buforze detekcyjnym przez 10 minut w RT. Następnie dodać medium montażowe zawierające DAPI i przeprowadzić przeciwbarwienie próbek przez 10 minut.Nałóż szkiełko nakrywkowe i użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie. Na koniec przeanalizuj retrotranspozycję L-1 za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 40X. Jak pokazano tutaj, gęstość preparatów chromosomów w metafazie określono poprzez przygotowanie rozcieńczeń i ocenę każdego preparatu pod kątem gęstości, rozmieszczenia oraz odległości preparatów od jądra komórkowego.Do dalszej analizy wybrano preparaty o niskiej gęstości i równomiernym rozkładzie. Przedstawione obrazy ukazują preparaty chromosomów barwione barwnikiem Hoechst DAPI, a jakość preparatów oceniać polegała na analizie długości chromosomów, okrągłości rozprzestrzenienia oraz odległości między chromosomami. W przypadku zbyt krótkiej inkubacji komórek w roztworze hipotonicznym, preparaty chromosomów stawały się silnie splotowane, co utrudniało wizualizację pojedynczych chromosomów.Jednakże dłuższa inkubacja w roztworze hipotonicznym prowadziła do pękania jąder, rozproszenia chromosomów i/lub ich utraty. Dłuższe inkubacje w colcemidzie zwiększały liczbę komórek w metafazie, ale prowadziły do kondensacji chromosomów. Jak pokazano tutaj, uznano, że optymalnymi warunkami dla uzyskania wysokiej jakości preparatów rozprzestrzeni chromosomowej są: 90-minutowa inkubacja w colcemidzie, 20 minut w roztworze hipotonicznym w temperaturze 37 °C oraz zastosowanie gorącej pary do rozrywania komórek.W tym eksperymencie preparaty rozłożeń chromosomów wybarwiono pod kątem retrotranspozycji L-1, wykorzystując sondy celujące w SNeo. Sonda została znakowana zarówno FITC, jak i CY3, aby wykazać, że w obu przypadkach retrotranspozycja L-1 jest widoczna wyłącznie w komórkach wykazujących ekspresję L-1 typu dzikiego. Po opanowaniu techniki eksperyment ten można przeprowadzić w ciągu sześciu do ośmiu godzin, zwłaszcza jeśli czas hybrydyzacji zostanie skrócony do dwóch-czterech godzin i procedura zostanie wykonana prawidłowo.Podczas wykonywania tej techniki ważne jest dokładne przemywanie, optymalizacja czasów hybrydyzacji oraz chemiczne znakowanie sond dNTP w celu uniknięcia kontaminacji. Aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak lokalizacja chromosomalna insercji, można zastosować dodatkowe techniki, np. sekwencjonowanie L-1 oraz prążkowanie G. Po obejrzeniu tego filmu zdobędziesz wiedzę na temat tego, jak znakować sondy L-1, przygotowywać preparaty rozprzestrzeń chromosomalnych oraz mierzyć wzorce i częstość retrotranspozycji L-1 przy użyciu techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.Technologia ta utorowała drogę do badania wzorców retrotranspozycji L-1, a także miejsc insercji L-1. Należy pamiętać, że podczas pracy z substancjami toksycznymi, odczynnikami biologicznymi oraz światłem ultrafioletowym niezbędne jest zachowanie środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i odzieży ochronnej.

analysis-of-line-1-retrotransposition-at-the-single-nucleus-level

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Olbrzymie komórki trofoblastu (TGC) odgrywają kluczową rolę w łożysku, zapewniając zdrową ciążę. Przedstawiamy protokół oceny statusu transkrypcyjnego genów w TGC poprzez powstającą fluorescencyjną hybrydyzację in situ na skriostatach zarodków poimplantacyjnych lub krótkoterminowych hodowlach embrionalnych czopków ektołożyskowych dnia 7.

Analiza transkrypcyjna za pomocą powstającego RNA FISH gigantycznych komórek trofoblastu in vivo lub krótkoterminowe hodowle in vitro eksplantatów czopków ektołożyskowych

Tutaj prezentujemy protokół techniki etykietowania mozaiki, który pozwala na wizualizację neuronów pochodzących ze wspólnej komórki progenitorowej w dwóch różnych kolorach. Ułatwia to analizę linii neuronalnej z możliwością datowania pojedynczych neuronów na narodziny i badania funkcji genów w tych samych neuronach różnych osób.

Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce

Tutaj opisujemy protokół mapowania całego genomu miejsc integracji wektorów retrowirusowych opartych na wirusie mysiej białaczki Moloneya w komórkach ludzkich.

Skanowanie retrowirusowe: mapowanie miejsc integracji MLV w celu zdefiniowania regionów regulatorowych specyficznych dla komórki

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy podejście bioinformatyczne i analizy mające na celu zidentyfikowanie ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus.

Sekwencjonowanie RNA nowej generacji i proces bioinformatyczny w celu identyfikacji ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus

Ten artykuł przedstawia prosty test oparty na PCR do monitorowania aktywności aktywnej retrotranspozonu LINE-1 i mapowania retrotranspozycji de novo w danym genomie. Korzystając z linii komórkowej MCF7, pokazujemy tutaj, w jaki sposób można zastosować tę metodę do wykrywania aktywności LINE-1 zlokalizowanej w 22q12.1.

Wykrywanie aktywności retrotranspozycyjnej gorącej linii-1 za pomocą długodystansowego odwrotnego PCR

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Poznaj metodę FISH do analizy retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra w liniach komórkowych HepG2. Technika ta umożliwia dokładne określenie wskaźników i wzorców retrotranspozycji.

Analiza retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra

Przeglądaj więcej filmów