Name: Analiza retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj metodę FISH do analizy retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra w liniach komórkowych HepG2. Technika ta umożliwia dokładne określenie wskaźników i wzorców retrotranspozycji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 i ES017274) oraz AstraZeneca dla KSR.

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej. Zapoznaj się z sekcją Odczynniki, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania poszczególnych odczynników.
1. Etykietowanie sond L1
UWAGA: Sondy mogą być oznaczone za pomocą etykietowania chemicznego lub PCR.
<ol>
	<li>Etykietowanie substancji chemicznych
	<ol>
		<li>Przygotować 0,7-1% żelu agarozowego w buforze Tris-acetate-EDTA (TAE), podgrzać w kuchence mikrofalowej do stopienia, pozostawić żel do ostygnięcia, a następnie dodać bromek etydyny (0,5 μg/ml). Wlej do tacki na żel, dodaj grzebienie i pozwól żelowi zastygnąć w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Oznacz sondę SNeo (1-2 μg) CY3 lub FITC w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę zgodnie z protokołem producenta. 
		UWAGA: SNeo oznacza gen Neomycyny z wiązaniem Sulegający ekspresji po pełnym cyklu retrotranspozycji. Sonda ma rozmiar ~1,000 pz. SNeo może być amplifikowany metodą PCR z dowolnego wektora lub z genomowego DNA. Patrz Tabela materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat odczynników do znakowania Streptavidin-CY3/FITC.</li>
		<li>Wymieszaj znakowany roztwór sondy SNeo z 1x buforem ładującym DNA, załaduj do każdej studzienki i pracuj pod napięciem 75-100 woltów przez 15-20 minut.</li>
		<li>Wizualizacja pasma sondy za pomocą oświetlacza ultrafioletowego (UV). Należy pamiętać, że rozmiar sondy SNeo można regulować, a także dodawać kwas jądrowy Lock (LNA) (rysunek 2).</li>
		<li>Wytnij oznaczoną sondę SNeo z żelu za pomocą czystego ostrza, rozpuścij i oczyść sondę SNeo z żelu za pomocą zestawu PCR Clean-Up zgodnie z protokołem producenta. 
		UWAGA: Przykryj każdą odsłoniętą część ciała osłonami ochronnymi (tj. fartuchami laboratoryjnymi i przezroczystą maską na twarz UV) podczas oglądania i krojenia żelu. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat żelowego oczyszczania produktów PCR.</li>
		<li>Ponownie przeprowadź 5 μl sondy znakowanej SNeo z nieznakowaną sondą SNeo na 0,7% żelu agarozowym (patrz 1.1.1), aby potwierdzić zwiększenie rozmiaru i utratę intensywności sygnału (rysunek 2).</li>
		<li>Określić ilościowo ilość znakowanej sondy SNeo, mierząc absorbancję przy 260 nm i rozcieńczyć sondę SNeo do 10 podwielokrotności ng/μl w H2O. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowanie PCR (alternatywna metoda etykietowania sondy)
	<ol>
		<li>Połącz startery specyficzne dla SNeo (5'-ggatagcattgggagatatacct-3' i 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') z odczynnikami PCR w jednej probówce: 13,6 μl H2O wolne od nukleazy; 0,1 μl dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 μl dTTP (10 nM); 0,05 μl dUTP-biotyna/dUTP-FITC/CY3 (10 nM); 4 μl bufor Go Tag 5x; 0,4 μl polimerazy Go Tag; 1 μl matrycy SNeo (10 ng). Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat odczynników PCR.</li>
		<li>Dostosuj ilość każdego odczynnika, mnożąc przez całkowitą liczbę próbek.</li>
		<li>Użyj następujących parametrów cyklicznych PCR, aby wzmocnić i oznaczyć sondy SNeo: 95 °C przez 2 min; 35 cykli po 95 °C przez 30 sekund, 62 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 60 sekund; 72 °C przez 2 min; Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony. 
		UWAGA: Temperaturę wyżarzania można dostosować lub wykonać gradientowy PCR w celu określenia optymalnych temperatur wyżarzania dla innych sond.</li>
		<li>Zrobić 0,7-1% żelu, jak w sekcji 1.1.1, załadować i zwizualizować opaskę sondy jak w sekcji 1.1.4.</li>
		<li>Wyciąć i oczyścić oznaczoną sondę SNeo, jak w rozdziale 1.1.5.</li>
		<li>Ponownie uruchom 5 μl sondy znakowanej SNeo z nieznakowaną sondą SNeo, aby potwierdzić wzrost rozmiaru i utratę intensywności sygnału (patrz rysunek 2).</li>
		<li>Określić ilościowo ilość znakowanej sondy SNeo, mierząc absorbancję przy 260 nm i rozcieńczyć sondę SNeo do 10 podwielokrotności ng/μl w wolnym od nukleazH2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozkładów chromosomowych
<ol>
	<li>Generowanie stabilnych klonów wykazujących ekspresję szkieletu wektorowego (kontrola) lub kompetentnej retrotranspozycji L1 przy użyciu standardowych metodologii selekcji. 12,16 Podczas gdy reporterzy nieepizodyczni zostali użyci do skorelowania wyników z badaniami transkrypcji, można również użyć wektorów epizodycznych. Hoduj komórki stabilnie wyrażające wektor kontrolny lub wektor L1 (1 x 106 komórek na 10 cm płytkę, z dostosowaniem rozmiaru płytki w razie potrzeby) w kompletnej pożywce wzrostowej. W przypadku komórek HepG2 należy użyć RPMI-1600, 10% FBS i 200 μg/ml higromycyny. Uprawiaj kultury do 70% konfluencji w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Wybór pożywki wzrostowej zależy od typu komórki. Biorąc pod uwagę, że użyte tutaj plazmidy przenoszą kasety selekcyjne zarówno dla higromycyny, jak i neomycyny, stabilną selekcję klonów można również przeprowadzić za pomocą neomycyny po selekcji na higromycynie, ale ilość neomycyny musi zostać zoptymalizowana, aby ustalić poziomy tolerancji dla każdego typu komórek.</li>
	<li>Dodać colcemid (0,4 μg/ml) do pożywki hodowlanej i inkubować przez 90 minut w celu zatrzymania komórek w metafazie. W przypadku stosowania różnych typów komórek należy empirycznie określić optymalne stężenie colcemidu i czas ekspozycji (60, 90 i 120 min) w celu optymalnego zatrzymania metafazy.</li>
	<li>Umyj komórki 2x 10 ml 1x PBS Dulbecco (DPBS), trypsynizuj dodając 3-5 ml 0,25% roztworu trypsyny do komórek i inkubuj przez 5 minut w celu odłączenia komórek. Dezaktywuj trypsynę równą ilością pożywki zawierającej 10% FBS.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 2 minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C, odessać pożywkę z osadu komórkowego i przemyć komórki DPBS. Odessać wszystkie DPBS, pozostawiając 200 μl DPBS do ponownego zawieszenia komórek. Upewnij się, że komórki są dobrze wymieszane i że wszystkie grudki są rozproszone. Używaj migotania lub delikatnego pipetowania, aby wymieszać i rozproszyć grudki i uniknąć wirowania.</li>
	<li>Dodać kroplami 5 ml roztworu hipotonicznego (tj. 75 mM KCl), który jest wstępnie ogrzany do temperatury 37 °C, obracając probówkę o pojemności 15 ml w poziomie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje o tym, jak uzyskać i przygotować roztwór hipotoniczny.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 120 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i powtórzyć kroki 2,4 - 2,5 3x, pozostawiając około 200 μl roztworu hipotonicznego do ponownego zawieszenia komórek po każdym myciu. Upewnij się, że pod koniec 3 prań granulka jest widocznie biała i spuchnięta.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 200 μl roztworu utrwalającego Carnoya i rozcieńczyć 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 w roztworze utrwalającym Carnoy. Upuść 10 μl każdego rozcieńczenia na suche, czyste szkiełko podstawowe z wysokości około 1 cm i natychmiast wystawij stronę wolną od rozprowadzania na działanie gorącej pary z wrzącej wody przez 30 sekund. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat przygotowania roztworu utrwalającego Carnoya.</li>
	<li>Wysuszyć pasty w temperaturze pokojowej, zabarwić 0,1 μg/ml Hoechst-33342 zanurzając na 15-20 min w słoiku Coplin i umyć 3x DPBS. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje na temat przygotowania roztworu Hoechst-33342.</li>
	<li>Widok rozkładów na mikroskopie fluorescencyjnym/kontrastowym fazowym przy 40-krotnym powiększeniu. Po zoptymalizowaniu przygotowania do rozprowadzania, smarowidła nie muszą być barwione Hoechst-33342. Wyświetl rozrzuty na mikroskopie z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu, aby określić jakość rozrzutu i separację, jak opisano w sekcji Wyniki (patrz rysunek 3).</li>
	<li>Wybierz i zakreśl dobre rozkłady za pomocą znacznika Diamond Point po przeciwnej stronie szkiełka (tj. po stronie bez spreadu).</li>
	<li>Przechowywać pasty do smarowania w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca. Unikaj narażenia na wilgoć.</li>
</ol>
3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
<ol>
	<li>Smary stabilizujące i odwadniające 
	UWAGA: Chromosom metafazy równowagi rozprzestrzenia się do temperatury pokojowej, jeśli jest przechowywany w temperaturze -20 °C. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje o tym, jak uzyskać i wykonać odczynniki.
	<ol>
		<li>Inkubować chromosom metafazy rozprzestrzenia się z 200 μl RNazy A przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przemyć szkiełka w buforze 2x-SSC dwa razy przez 5 minut każde, a następnie przepłukać 10 mM roztworem HCl.</li>
		<li>Inkubować rozsiewy z 1% pepsyną przez 10 minut w temperaturze 37 °C, płukać dejonizowanymH2Oi przemywać dwukrotnie buforem 2x-SSC przez 5 minut każdy.</li>
		<li>Inkubować rozsiewy z 4% paraformaldehydem przez 10 minut i przemywać w 2x buforze SSC dwa razy po 5 minut każdy.</li>
		<li>Odwodnić rozprzestrzenianie się przez inkubację przez 2 minuty w seriach etanolu: 70%, 80% i 95% etanolu.</li>
		<li>Zjeżdżalnie suche na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja rozprzestrzenia się za pomocą sond retrotranspozycyjnych znakowanych L1 (tj. SNeo) 
	UWAGA: W przypadku sond z etykietą bezpośrednią należy zawsze trzymać z dala od światła. Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje o tym, jak uzyskać i wykonać odczynniki.
	<ol>
		<li>Dodać 30 ng SNeo do buforu hybrydyzacyjnego, ogrzewać w temperaturze 72 °C przez 10 minut i schłodzić przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Do każdego smarowania dodać 30 μl roztworu sondy SNeo, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić krawędzie cementem gumowym. Upewnij się, że nie tworzy się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Podgrzewać szkiełko w temperaturze 72 °C przez 5 minut na bloku grzewczym, stopniowo obniżać temperaturę do 37 °C i inkubować przez noc w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie i oglądanie (lub dodanie przeciwciała drugorzędowego) 
	UWAGA: W przypadku sond z bezpośrednim znacznikiem należy zawsze trzymać z dala od światła. 
	UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów i odczynników, aby uzyskać informacje o tym, jak się przygotować. Zaleca się stosowanie wystarczającej objętości, aby pokryć całe rozprzestrzenianie się chromosomów. Pamiętaj, że nadmiar objętości zostanie utracony po dodaniu szkiełka nakrywkowego.
	<ol>
		<li>Zanurz szkiełka w buforze 2x SSC, aby usunąć szkiełka nakrywkowe.</li>
		<li>Szkiełka myć przez zanurzenie w buforze 2x-SSC w temperaturze 45 °C na 5 min.</li>
		<li>Myć szkiełka przez zanurzenie w buforze do płukania w temperaturze 45 °C na 5 min, 2x.</li>
		<li>Szkiełka myć przez zanurzenie w 0,1x buforze SSC w temperaturze 45 °C na 10 min.</li>
		<li>Szkiełka myć przez zanurzenie w 2x buforze SSC w temperaturze 45 °C przez 10 min. 
		UWAGA: Umieść słoik Coplin zawierający zalecany bufor w łaźni wodnej, ustaw temperaturę do 45 °C.</li>
		<li>Schłodzić szkiełka do temperatury pokojowej i zrównoważyć szkiełka w buforze detekcji.</li>
		<li>W przypadku sond z etykietą bezpośrednią przejdź do kroku 3.4.10.</li>
		<li>W przypadku sond znakowanych pośrednio należy zablokować bufor blokujący na 20-30 min i przemyć 3x w DPBS.</li>
		<li>Inkubować z 50 μl przeciwciała drugorzędowego (np. 5 μg/ml streptawidyny-FITC lub αCY3 w buforze blokującym) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj szkiełka w 2x SSC przez 5 minut dwa razy.</li>
		<li>Barwienie przeciwdziałające roztworem Hoechst-33342 (0,1 μg/ml) przez 10 min. 
		UWAGA: to barwienie ma na celu barwienie chromosomów w celu kolokalizacji za pomocą sondy.</li>
		<li>Umyj w DPBS 3x, dodaj kroplę podłoża montażowego, umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelnij brzegi lakierem do paznokci.</li>
		<li>Analizuj retrotranspozycję L1 za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 40-krotnym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254, 1808-1810 (1991).</li>
<li>Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+retrotransposon+encodes+a+conserved+endonuclease+required+for+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition.</a> Cell. 87, 905-916 (1996).</li>
<li>Clements, A. P., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+LINE-1+reverse+transcriptase%3Aeffect+of+deletions+outside+the+common+reverse+transcriptase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain.</a> Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).</li>
<li>Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+for+an+essential+protein+in+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).</li>
<li>Khazina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+and+flexibility+of+the+L1ORF1+protein+in+human+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).</li>
<li>Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+defines+distinct+functional+domains+for+protein-protein+and+nucleic+acid+interactions+in+the+ORF1+protein+of+mouse+LINE-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1.</a> J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).</li>
<li>Martin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+particles+with+LINE-1+RNA+in+mouse+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).</li>
<li>Hohjoh, H., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+ribonucleoprotein+complexes+containing+human+LINE-1+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA.</a> EMBO J. 15, 630-639 (1996).</li>
<li>Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+element+target-primed+reverse+transcription+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro.</a> EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).</li>
<li>Szak, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+archeology+of+L1+insertions+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular archeology of L1 insertions in the human genome.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li>
<li>Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease-independent+insertion+provides+an+alternative+pathway+for+L1+retrotransposition+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome.</a> Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+HepG2+genome+by+long+interspersed+nuclear+element-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1.</a> Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).</li>
<li>Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ty+elements+transpose+through+an+RNA+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ty elements transpose through an RNA intermediate.</a> Cell. 40, 491-500 (1985).</li>
<li>Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indicator+gene+to+demonstrate+intracellular+transposition+of+defective+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses.</a> PNAS. 85, 2219-2223 (1988).</li>
<li>Moran, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+retrotransposition+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells.</a> Cell. 87, 917-927 (1996).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+LINE-1+retrotransposition+in+HepG2+cells+preferentially+targets+gene+poor+regions+of+chromosome+13%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13.</a> Genomics. 104, 96-104 (2014).</li>
<li>Rozen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+gene+conversion+between+arms+of+palindromes+in+human+and+ape+Y+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes.</a> Nature. 423, 873-876 (2003).</li>
<li>Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+gene+content+of+human+sex+chromosomes+evolved%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Gen+Develop%22%5BJournal%5D)">How the gene content of human sex chromosomes evolved.</a> Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).</li>
<li>Leem, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+Tf1+is+targeted+to+Pol+II+promoters+by+transcription+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators.</a> Mol Cell. 30, 98-107 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Levin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+retrotransposon+integration+provides+a+saturated+profile+of+target+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genome Res. 20, 239-248 (2010).</li>
<li>Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+regulates+integration+of+the+yeast+Ty5+retrotransposon+into+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin.</a> Mol Cell. 27, 289-299 (2007).</li>
<li>McClintock, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+behavior+of+mutable+loci+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The origin and behavior of mutable loci in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).</li>
<li>Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-induced+gene+activation+as+a+mechanism+generating+cluster+shape+somatic+variation+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine.</a> Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).</li>
<li>Garcia-Perez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+engineered+L1+retrotransposition+events+in+human+embryonic+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells.</a> Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).</li>
<li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductual+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma.</a> Nat Med. 21 (9), (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak potencjalnych konkurencyjnych interesów.

Do badania retrotranspozycji L1 zastosowano takie metodologie, jak sekwencjonowanie całego genomu, odwrócony PCR i southern blot. Chociaż metodologie te są niezwykle cenne w lokalizowaniu miejsc insercji L1 w genomach, wyzwaniem dla wszystkich z nich jest potrzeba programowania in-silico w celu ponownego złożenia sekwencji. Opisana tu metodologia FISH ma na celu uzupełnienie tych metod, szczególnie w przypadku badań wymagających analizy ektopowej retrotranspozycji L1 w hodowanych komór...

Długo przeplatany Ludzki Pierwiastek Jądrowy-1 (Linia-1 lub L1) jest autonomicznym ruchomym pierwiastkiem, który rozprzestrzenia się w obrębie genomu poprzez mechanizm retrotranspozycji "kopiuj i wklej". Typowy ludzki L1 ma ~6 kb długości i składa się z 5'UTR (Nieprzetłumaczony Region), który służy jako promotor, dwóch otwartych ramek odczytu (ORF): L1-ORF1 i L1-ORF2 oraz 3'UTR z ogonem polyA. Białko L1-ORF1 ma trzy odrębne domeny: domenę cewka-cewka, motyw rozpoznawania RNA i domenę C-końcową, podczas gdy białko L1-ORF2 ma endonukleazę, odwrotną transkryptazę i domeny bogate w cysteinę1,2,3,4,5. L1-ORF1 wykazuje aktywność opiekuńczą kwasu nukleinowego, podczas gdy L1-ORF2 zapewnia aktywność enzymatyczną, przy czym oba białka są niezbędne do retrotranspozycji1,2,6.
Cykl retrotranspozycji L1 rozpoczyna się od transkrypcji z 5'UTR mRNA bicystronicznego L1 przez polimerazę RNA II, translokacji do cytoplazmy i translacji. W cytoplazmie L1-ORF1 wykazuje albo wiązanie cis, w którym pakuje własne RNA, albo wiązanie trans, w którym pakuje inne RNA (tj. SINE / SVA / pseudogeny), tworząc cząstkę rybonukleoproteiny (RNP) z L1-ORF2p7,8. RNP przemieszczają się do jądra, gdzie aktywność endonukleazy L1-ORF2p nacina genomowe DNA (gDNA), aby odsłonić grupę OH- 9, która z kolei jest wykorzystywana przez odwrotną transkryptazę do wstępnej i odwrotnej syntezy RNA do DNA z końca 3'. Podczas syntezy odwrotnej druga nić DNA jest nacinana 7-20 pz od pierwotnego miejsca nacięcia, aby utworzyć rozłożone w czasie przerwy, które są wypełniane, tworząc charakterystyczne sekwencje insercji L1 (np. TTTTAA) zwane duplikacjami miejsca docelowego (TSD)9,10. Proces ten jest znany jako docelowa pierwotna odwrotna transkrypcja (TPRT) i prowadzi do wstawienia pełnych lub skróconych kopii L1 / innych DNA z TSD na obu końcach wstawionej sekwencji. Wykazano również, że retrotranspozycja L1 odbywa się za pośrednictwem niehomologicznego łączenia końców podobnych do TPRT w niektórych typach komórek11.
Wektor retrotranspozycji L1 zastosowany w naszych badaniach jest nieepisomalny i składa się z oznaczonych L1-ORF1&2p napędzanych przez połączone promotory CMV-L1-5'UTR (Rysunek 1)12. Wcześniejsze wersje tego konstruktu zostały opisane w badaniach z użyciem drożdży i kultur komórek ludzkich13,14,15. Dwa odrębne promotory CMV znajdujące się na końcach 5' i 3' wektora, przy czym koniec 3' umieszczony jest w odwrotnej orientacji, aby sterować ekspresją neomycyny po splicingu i integracji. Kaseta wskaźnika retrotranspozycji na końcu 3' składa się z genu neomycyny wprowadzonego antysensownie do L1-ORF i unieaktywnionego przez rozdzielenie na dwie połówki przez intron globiny z lokacjami spliced donor (SD) i spliced acceptor (SA) (Figura 1). Po integracji z chromosomem L1 jest transkrybowany ze wspólnego promotora w celu wytworzenia mRNA, które składa się z mRNA bicystronicznego i nieaktywnego mRNA neomycyny. Podczas przetwarzania RNA intron globiny jest wycinkany z genu neomycyny w celu przywrócenia w pełni funkcjonalnego genu neomycyny. Hybrydowe mRNA jest pakowane w RNP w cis i translokowane do jądra, gdzie jest integrowane z genomem jako insercja o pełnej długości lub skrócone za pomocą TPRT.
Tutaj opisujemy metodologię, która wykorzystuje fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) z sondami skierowanymi specjalnie na splicing genu neomycyny (SNeo) do śledzenia wzorców retrotranspozycji L1 i szybkości insercji na poziomie pojedynczego jądra. Skuteczność i swoistość detekcji potwierdzono przy użyciu kompetentnych i niekompetentnych konstruktów i sond do retrotranspozycji do wykrywania SNeo lub złącza intronowego16 neomycyny i globiny. Metodologia ta wyjaśnia niektóre niedociągnięcia testów retrotranspozycji opartych na hodowlach komórkowych, takie jak wielokrotne insercje, oporność kolonii i korzystna ekspansja klonu.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Sondy do znakowania</td></tr><tr><td>Go Tag DNA polimeraza Promega</td><td></td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x bezbarwny bufor</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Indywidualny dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Dostosuj stężenie dATP, dGTP, dCTP do 2&nbsp; mM i dTTP do 1,5&nbsp; mM w wodzie wolnej od nukleaz.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotyna (0,5&nbsp; mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0,5&nbsp; mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0,5&nbsp; mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td> Zestaw do etykietowania MIRUS FISH Zestaw do etykietowania MIRUS MIR3625 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH</td> Zestaw do czyszczenia <td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>Zamiast zestawu do czyszczenia PCR NucleoSpin PCR Clean Up Kit można użyć dowolnego odczynnika</td></tr> do <tr><td>PCR Do</td><td></td><td></td><td>wzmocnienia produktu etykietowego można użyć dowolnego termocyklera.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przygotowanie spreadów chromosomowych</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Dodać Colcemid bezpośrednio do pożywki wzrostowej do końcowego stężenia 0,4&nbsp; &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp; M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Rozcieńczony 1&nbsp; M KCl rozwiązanie do 75&nbsp; Roztwór mM do przygotowania roztworu hipotonicznego</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>utrwalający Carnoya</td><td>Wymieszaj 3 objętości metanolu i 1 objętość kwasu octowego, aby uzyskać roztwór utrwalający Carnoya. Zrób świeżość za każdym razem.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Rozpuścić Hoechst-33342 w PBS do końcowego stężenia 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Marker Diamond Point</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Matowe slajdy</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Technologie życia&nbsp;</td><td>R001100</td><td>Aby zdetechizować komórki, inkubuj komórkę w trypsynie przez 5 minut i nieaktywną z równą objętością kompletnego podłoża.</td></tr><tr><td>Prowadnice pokrywy</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td> grzewczy <td>Do tego celu można użyć dowolnego bloku grzewczego, chociaż zalecane są bloki montowane do prowadnic grzewczych.</td></tr><tr><td>Zlewka (600&nbsp; ml)</td> <td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Napełnij zlewkę wodą, podgrzej do wrzenia, użyj gorącej pary, aby rozerwać chromosomy.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Nikon</td><td>125690</td><td>Do sprawdzenia jakości rozprowadzania można użyć dowolnego mikroskopu.</td></tr><tr><td colspan="4">Odczynniki i materiały dla RYB</td></tr><tr><td>cytrynian trisodowy</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chroride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran Sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr>Technologie<td>życia DNA plemników łososia</td><td>&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma 322415</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Rozpuścić Hoechst-33342 w PBS do końcowego stężenia 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Uszczelniacz z cementu gumowego/Cytobond&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Siedem słoików z kopliną</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Ciemna komora nawilżana</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka osłonowe</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Suchy cyfrowy blok grzewczy</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>fluorescencyjny</tr><tr><td>20x sól fizjologiczno-cytrynian sodu (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Połącz 175 g NaCl i 88,2&nbsp; g cytrynianu trisodowego z 800 ml klasy cząsteczkowej H2O. Mieszać, dostosowując do pH 7. Gdy wszystkie sole się rozpuszczą, dostosuj objętość do 1 l i przefiltruj przez 0,22 &mikro; m Bibuła filtracyjna. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>1&nbsp; mg/ml Rnazy A</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczyć 20x bufor SSC do 2x bufor SSC. Rozpuścić RNazę A w 2x buforze SSC do końcowego stężenia 1&nbsp; mg/ml. Za każdym razem przygotuj świeże rozwiązanie.</td></tr><tr><td>1% pepsyna</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić pepsynę (W/V) w 10 mM HCl do końcowego stężenia 1% roztworu. Zrób świeże za każdym razem.</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>Odważyć 4,0 g PFA w dygestorium, dodać 50 ml 1xPBS, podgrzać do 60&nbsp; &deg; C mieszając i dostosuj pH kroplami NaOH, aż cały PFA się rozpuści, a roztwór stanie się klarowny. Dostosuj głośność do 100&nbsp; ml, przefiltrować przez 0,22 i mikro; m Filtruj bibułę i przechowuj 5 ml porcji w temperaturze -20&nbsp; &deg;C. Rozmrozić podwielokrotność PFA w 37 &deg; C przez 10-15 minut do kolejnych zastosowań. Dostosuj rozmiar filtra w zależności od ilości paraformaldehydu.</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> płuczący <td>Połącz 100 ml formamidu (20%) z 2,5 ml 20x SSC, dostosuj do pH 7 za pomocą 1,0 M HCl i doprowadź objętość do 500 ml za pomocą klasy cząsteczkowej H2O.</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>hybrydyzacyjny</td><td>Połącz 50% formamidu, 10% siarczanu dekstranu, 0,1% SDS i 300 ng / ml DNA plemników łososia w 2x buforze SSC. Ilość formamidu określa stopień skupienia chromatyd; Miareczkować ilość.</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> detekcji <td>Rozcieńczyć 20x bufor SSC do 4x i dodać 0,2% Tween-20, aby utworzyć bufor detekcji.</td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td></td><td></td><td>Połącz 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z 0,2% Tween-20 w buforze 4x SSC.</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>odwadniający</td><td>Wykonaj 70%, 80% i 95% roztworów etanolu.</td></tr></tbody></table>

analiza retrotranspozycji line-1 na poziomie pojedynczego jądra

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Długi przeplatany pierwiastek jądrowy-1 (Linia-1 lub L1) stanowi około 17% DNA obecnego w ludzkim genomie. Podczas gdy większość L1s jest nieaktywna z powodu obcięć 5', ~ 80-100 tych elementów pozostaje kompetentnych do retrotranspozycji i rozprzestrzenia się do różnych miejsc w całym genomie za pośrednictwem produktów pośrednich RNA. Podczas gdy uważa się, że starsze L1 celują w bogate w AT regiony genomu, cele chromosomalne nowszych, bardziej aktywnych L1 pozostają słabo zdefiniowane. Tutaj opisujemy metodologię hybrydyzacji fluorescencji in situ (FISH), którą można wykorzystać do śledzenia wzorców insercji L1 i szybkości inkorporacji ektopowego L1 na poziomie pojedynczego jądra. W tych eksperymentach sondy neomycyny znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny/cyjaniną-3 (FITC/CY3) zastosowano do śledzenia retrotranspozycji L1 in vitro w komórkach HepG2 stabilnie eksprymujących ektopowy L1. Metodyka ta zapobiega błędom w szacowaniu wskaźników retrotranspozycji spowodowanych toksycznością i uwzględnia występowanie wielokrotnych insercji do pojedynczego jądra.

Schematyczny rysunek wektora retrotranspozycji L1 przedstawiono na Rysunku 1. Wektor składa się z genu neomycyny w orientacji antysensownej względem ORF-ów L1, który jest przerwany intronem globiny w orientacji sensownej i otoczony miejscami SD oraz SA. Po stabilnej integracji z chromosomem, mRNA L1 jest transkrybowane z połączonego promotora CMV i L1-5'UTR (Rysunek 1). Podczas procesu przetwarzania RNA, intron globiny jest wyci...

Tutaj stosujemy metodologię FISH do śledzenia retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczych jąder w rozsiewach chromosomów linii komórkowych HepG2 stabilnie wyrażających syntetyczną LINE-1.

Analiza retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i analiza tempa oraz wzorców retrotranspozycji L-1 na poziomie pojedynczych jąder komórkowych przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, czyli FISH. Główną zaletą tej metodologii jest fakt, że pozwala ona badaczowi uniknąć nadmiernego lub niedoszacowania tempa i wzorców retrotranspozycji, a w połączeniu z innymi metodami umożliwia badanie retrotranspozycji L-1 na poziomie pojedynczych jąder. Procedurę tę przeprowadza dr Pasano Bojang, starszy pracownik naukowy w laboratorium.W pierwszej kolejności, po przygotowaniu żelu agarozy o stężeniu od 0,7% do 1% w buforze TAE zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć CY3 lub FITC do znakowania sondy SNeo i inkubować w temperaturze 37°C przez jedną godzinę zgodnie z protokołem producenta. Roztwór znakowanej sondy SNeo należy zmieszać z 1X buforem do ładowania DNA i nanieść do studzienek żelu agarozy. Następnie należy prowadzić elektroforezę w napięciu od 75 do 100 V przez 15 do 20 minut.Używając iluminatora UV, zwizualizuj prążek sondy. Następnie za pomocą czystego skalpela wytnij oznakowaną sondę SNeo z żelu. Po tym użyj zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta, aby r

analysis-of-line-1-retrotransposition-at-the-single-nucleus-level

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Tutaj prezentujemy protokół techniki etykietowania mozaiki, który pozwala na wizualizację neuronów pochodzących ze wspólnej komórki progenitorowej w dwóch różnych kolorach. Ułatwia to analizę linii neuronalnej z możliwością datowania pojedynczych neuronów na narodziny i badania funkcji genów w tych samych neuronach różnych osób.

Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy podejście bioinformatyczne i analizy mające na celu zidentyfikowanie ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus.

Sekwencjonowanie RNA nowej generacji i proces bioinformatyczny w celu identyfikacji ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus

Ten artykuł przedstawia prosty test oparty na PCR do monitorowania aktywności aktywnej retrotranspozonu LINE-1 i mapowania retrotranspozycji de novo w danym genomie. Korzystając z linii komórkowej MCF7, pokazujemy tutaj, w jaki sposób można zastosować tę metodę do wykrywania aktywności LINE-1 zlokalizowanej w 22q12.1.

Wykrywanie aktywności retrotranspozycyjnej gorącej linii-1 za pomocą długodystansowego odwrotnego PCR

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Poznaj metodę FISH do analizy retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra w liniach komórkowych HepG2. Technika ta umożliwia dokładne określenie wskaźników i wzorców retrotranspozycji.

Analiza retrotranspozycji LINE-1 na poziomie pojedynczego jądra

Przeglądaj więcej filmów