Name: Leczenie myszy SCA1 związkami rozpuszczalnymi w wodzie w celu niespecyficznego wzmocnienia funkcji mitochondriów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Poznaj metodę leczenia ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 u myszy za pomocą kwasu bursztynowego, związku rozpuszczalnego w wodzie wspierającego funkcję mitochondriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować doktorowi Harry'emu Orrowi z University of Minnesota za jego hojny dar w postaci transgenicznych myszy. Chcielibyśmy również podziękować następującym absolwentom Skidmore College za ich pracę podczas wykonywania poprzednich eksperymentów: Monice Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson i Cheyanne Slocum. Ponadto chcielibyśmy podziękować Skidmore College za sfinansowanie rozwoju tych metod.

<ol><li>Stucki, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairments+contribute+to+Spinocerebellar+ataxia+type+1+progression+and+can+be+ameliorated+by+the+mitochondria-targeted+antioxidant+MitoQ%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ.</a> Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).</li>
<li>Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mitochondrial+dysfunctions+in+the+brain%2C+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men.</a> J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).</li>
<li>Breuer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+OXPHOS+dysfunction+in+the+development+of+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases.</a> Neurobiol Dis. , (2012).</li>
<li>Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunctions+in+neurodegenerative+diseases%2C+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease.</a> Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).</li>
<li>Burright, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA1+transgenic+mice%2C+a+model+for+neurodegeneration+caused+by+an+expanded+CAG+trinucleotide+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat.</a> Cell. 82 (6), 937-948 (1995).</li>
<li>Clark, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+expression+of+a+mutant+allele+of+SCA1+in+transgenic+mice+leads+to+disparate+effects+on+motor+behaviors%2C+followed+by+a+progressive+cerebellar+dysfunction+and+histological+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations.</a> J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+tempol%2C+a+catalytic+scavenger+of+peroxynitrite-derived+free+radicals%2C+in+a+mouse+traumatic+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).</li>
<li>Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation-derived+reactive+aldehydes+directly+and+differentially+impair+spinal+cord+and+brain+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function.</a> J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).</li>
<li>Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+administration+increases+brain+mitochondrial+concentrations+and+exerts+neuroprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+creatine+in+a+transgenic+mouse+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+coenzyme+Q10+and+remacemide+in+transgenic+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).</li>
<li>Hersch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+in+Huntington+disease+is+safe%2C+tolerable%2C+bioavailable+in+brain+and+reduces+serum+8OH2%27dG%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG.</a> Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+coenzyme+Q10+and+creatine+produces+additive+neuroprotective+effects+in+models+of+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases.</a> J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).</li>
<li>Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+reduces+beta-amyloid+plaque+in+an+APP%2FPS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Sandhir, R., Mehrotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+supplementation+is+effective+in+improving+mitochondrial+dysfunctions+induced+by+3-nitropropionic+acid%2C+implications+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).</li>
<li>Ergonul, P. G., Nergiz, C. <a target="_blank" href="http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/31627.pdf">Determination of organic acids in olive fruit by HPLC.</a> 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantiative+measurement+of+motor+inco-ordination+in+naive+mice+using+an+acelerating+rotarod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod.</a> J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).</li>
<li>Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ataxin-1+protein+in+tissues+from+normal+and+spinocerebellar+ataxia+type+1+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals.</a> Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).</li>
<li>Klement, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+nuclear+localization+and+aggregation%2C+role+in+polyglutamine-induced+disease+in+SCA1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice.</a> Cell. 95 (1), 41-53 (1998).</li>
<li>Serra, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+links+SCA1+pathophysiology+to+glutamate+signaling+in+Purkinje+cells+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).</li>
<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+progressive+motor+deficits+in+mice+transgenic+for+the+human+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation.</a> J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).</li>
<li>Anjomani Virmouni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GAA-repeat-expansion-based+mouse+model+of+Friedreich%27s+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jeśli metody te zostaną zastosowane zgodnie z opisem, są w stanie wykryć i złagodzić dysfunkcję mitochondriów za pośrednictwem fosforylacji oksydacyjnej w modelach myszy z chorobą neurodegeneracyjną móżdżku. Połączone testy biochemiczne i behawioralne są wieloaspektowymi metodami określania zakresu udziału mitochondriów w patologii choroby neurodegeneracyjnej móżdżku. Lecząc myszy kwasem bursztynowym w celu pobudzenia metabolizmu i poprawy funkcji mitochondriów, jesteśmy w stanie pokazać ratunek w deficytach behawioralny...

Mitochondria są kluczowymi producentami trifosforanu adenozyny (ATP), niezbędnego koenzymu dla energii komórkowej, przy czym większość mitochondrialnego ATP wytwarzana jest w procesie fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) przy użyciu łańcucha transportu elektronów. Mózg, ze względu na wysokie wymagania metaboliczne i zależność od fosforylacji oksydacyjnej w celu zasilania aktywności neuronalnej, jest bardzo podatny na dysfunkcję mitochondriów. W rezultacie, dysfunkcja mitochondriów jest wywoływana podczas procesu starzenia 1 i jest zaangażowana w patogenezę wielu chorób neurodegeneracyjnych 2,3,4. Wynika z tego, że mitochondria są atrakcyjnymi celami terapeutycznymi dla neurodegeneracji.
W tym protokole przyjęliśmy użycie ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 (SCA1) jako modelowej choroby neurodegeneracyjnej do badania dysfunkcji mitochondriów i rozwoju terapii ukierunkowanych na mitochondria. SCA1 jest spowodowany mutacją powtórzeń poliglutaminy (polyQ) w produkcie genu ataksyny-1, która powoduje postępującą degenerację neuronów Purkinjego móżdżku i neuronów innych obszarów mózgu. Zastosowana tutaj transgeniczna linia myszy (oznaczona jako mysz SCA1), która wykazuje ekspresję transgenu ataksyny-1 z mutacją polyQ pod kontrolą promotora specyficznego dla komórek Purkinjego, pozwala na ukierunkowaną analizę składnika komórki Purkinjego SCA1 5. Myszy SCA1 przechodzą stopniową degenerację komórek Purkinjego i rozwijają ataksyjny chód 6.
Dysfunkcja kompleksu mitochondrialnego i skuteczność leczenia ukierunkowanego na mitochondria mogą być oceniane za pomocą zestawu testów molekularnych i behawioralnych. Dysfunkcja kompleksu mitochondrialnego jest mierzona ex vivo za pomocą testów oddychania, które wykrywają zmienione zużycie tlenu w tkance móżdżku w obecności substratów i inhibitorów łańcucha transportu elektronów 7. Testy oddychania były wcześniej stosowane z przepuszczalną tkanką, izolatami mitochondrialnymi i całymi tkankami 7,8,9. Pozwalają one na bezpośrednią ocenę funkcji mitochondriów, w przeciwieństwie do metod zbierania danych morfologicznych, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa czy barwienie immunofluorescencyjne. Użycie całej tkanki, a nie izolowanych mitochondriów, zapobiega tendencyjnej selekcji zdrowych mitochondriów, która może wystąpić podczas procesu izolacji 7. Po dostosowaniu do protokołu, jak pokazano, test oddychania jest cenną metodą wykrywania dysfunkcji mitochondriów w stanach choroby neurodegeneracyjnej móżdżku.
Niespecyficzne aktywatory metabolizmu mogą być używane do wnioskowania o dysfunkcji mitochondriów u transgenicznych myszy modeli chorób neurodegeneracyjnych i pomocy w opracowywaniu nowych terapii. Wykazano, że kwercetyna, koenzym q10 i kreatyna łagodzą patologię chorób neurodegeneracyjnych u pacjentów i w zwierzęcych modelach chorób neurodegeneracyjnych 10,11,12,13,14,15,16. Przedstawiamy nowy aktywator metaboliczny, kwas bursztynowy, który stymuluje metabolizm i poprawia funkcję mitochondriów w chorobach neurodegeneracyjnych. Aby upewnić się, że aktywator przekracza barierę krew-mózg, HPLC zastosowano do wykrywania dostarczania do tkanki nerwowej u leczonych myszy 17.
Aby ocenić efekty terapeutyczne metabolicznie ukierunkowanych związków rozpuszczalnych w wodzie, takich jak kwas bursztynowy, można użyć zestawu paradygmatów behawioralnych i badań immunopatologicznych. Ze względu na deficyty koordynacji ruchowej występujące w chorobie neurodegeneracyjnej móżdżku, test pasa startowego odcisku stopy, test wiązki i test przyspieszającego pręta obrotowego są używane do wykrywania ratowania patologii behawioralnej 6, 18, 19. Pomiary te są uzupełnione immunopatologiczną oceną cytoarchitektury móżdżku poprzez ocenę grubości warstwy molekularnej (zdefiniowanej jako długość dendrytycznego trzpienia komórek Purkinjego) i liczby somy komórek Purkinjego w określonym zraziku tkanki móżdżku 6, 20, 21. W tym artykule przedstawiamy wiele neuropatologicznych i behawioralnych metod wykrywania i leczenia dysfunkcji mitochondriów za pomocą metabolicznie ukierunkowanych związków rozpuszczalnych w wodzie.
Używamy analizy ex vivo oddychania mitochondrialnego do analizy dysfunkcji mitochondriów u transgenicznej myszy SCA1. Ponadto wykazaliśmy, że objawy choroby i patologia są poprawiane przez rozpuszczalny w wodzie mitochondrialny kwas bursztynowy, co dodatkowo implikuje dysfunkcję mitochondriów w progresji choroby SCA1.

<table><tbody><tr><td>Difosforan adenozyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>Askorbinian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>BSA</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenyloindol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1446600</td><td></td></tr><tr><td>Jabłczan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6994</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Laktobionian potasu</td><td>Bio-Cukry</td><td>69313-67-3</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; -tetrametylo-p-fenylenodiamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0631</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield podłoże montażowe</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11NQ (anty-ataksyna-1 )</td><td></td><td></td><td>Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-mysie przeciwciało wtórne</td><td>Life Technologies</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Calbindin (koza)</td><td>Santa Cruz</td><td>C-20</td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontroluj transgeniczne myszy</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>A02</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>myszy SCA1</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>B05</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>Myszy typu dzikiego</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESM-100L mikrotom</td><td>ERMA</td><td></td><td>Sanki mikrotom</td></tr><tr><td>Fluoview FV1200 Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka glicerolowo-żelatynowe</td><td>FD Neuro Technologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>VCAT 80465</td><td></td></tr><tr><td>OXYT1 Jednostka sterująca elektrodą Oxytherm</td><td>Hansatech Instruments Papier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P.T.F.E.</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08277-15</td><td></td></tr><tr><td>Rotallion Rotarod</td><td>PPP& G</td><td></td><td>skontaktuj się z autorem korespondencyjnym w celu uzyskania informacji</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Wtyczka licznika komórek (dla ImageJ)</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a></td></tr><tr><td>3P& G Rota-Rod v3.3.3 (oprogramowanie rotarod)</td><td>PPP& G</td><td></td><td>skontaktuj się z autorem korespondencyjnym w celu uzyskania</td></tr><tr><td>informacji Phidget21.dll (wymagane dla oprogramowania rotarod)</td><td>DLL-Files.com</td><td></td><td><a href="https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html">https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html</a></td></tr></tbody></table>

leczenie myszy sca1 związkami rozpuszczalnymi w wodzie w celu niespecyficznego wzmocnienia funkcji mitochondriów

Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function

Dysfunkcja mitochondriów odgrywa znaczącą rolę w procesie starzenia się oraz w chorobach neurodegeneracyjnych, w tym kilku dziedzicznych ataksjach rdzeniowo-móżdżkowych i innych zaburzeniach ruchowych charakteryzujących się postępującą degeneracją móżdżku. Celem tego protokołu jest ocena dysfunkcji mitochondriów w ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 (SCA1) i ocena skuteczności farmakologicznego ukierunkowania oddychania metabolicznego za pomocą rozpuszczalnego w wodzie związku kwasu bursztynowego w celu spowolnienia postępu choroby. Podejście to ma zastosowanie w przypadku innych chorób móżdżku i może być dostosowane do wielu terapii rozpuszczalnych w wodzie.
Analiza ex vivo oddychania mitochondrialnego służy do wykrywania i ilościowego określania zmian w funkcjonowaniu mitochondriów związanych z chorobą. Na podstawie dowodów genetycznych (dane niepublikowane) i proteomicznych dowodów dysfunkcji mitochondriów w mysim modelu SCA1, oceniamy skuteczność leczenia rozpuszczalnym w wodzie wzmacniaczem metabolizmu kwasem bursztynowym poprzez rozpuszczenie tego związku bezpośrednio w wodzie pitnej w klatce domowej. Zdolność leku do przenikania przez barierę krew-mózg można wywnioskować za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Skuteczność tych związków można następnie przetestować przy użyciu wielu paradygmatów behawioralnych, w tym przyspieszającego rotarodu, testu równoważnicy i analizy śladu węglowego. Integralność cytoarchitektoniczną móżdżku można ocenić za pomocą testów immunofluorescencyjnych, które wykrywają jądra komórek Purkiniego i dendryty komórek Purkiniego oraz somę. Metody te są solidnymi technikami określania dysfunkcji mitochondriów i skuteczności leczenia związkami rozpuszczalnymi w wodzie w chorobie neurodegeneracyjnej móżdżku.

Poprzez farmakologiczne celowanie w mitochondria móżdżku za pomocą kwasu bursztynowego jesteśmy w stanie zapobiec dysfunkcji mitochondrialnej w mysim modelu cerebellarnej choroby neurodegeneracyjnej SCA1. Kanoniczny donor elektronów dla dehydrogenazy bursztynianowej, kwas bursztynowy, rozpuszczono w wodzie pitnej w klatkach myszy SCA1 na okres jednego miesiąca; ocenę behawioralną rozpoczęto w drugim tygodniu leczenia, natomiast ocenę neuropatologiczną przeprowadzono po zakończeniu terapii...

Przedstawiamy protokół biochemiczny i behawioralny do oceny skuteczności związków rozpuszczalnych w wodzie ukierunkowanych na mitochondria w leczeniu ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 (SCA1) i innych chorób neurodegeneracyjnych móżdżku.

Leczenie myszy SCA1 związkami rozpuszczalnymi w wodzie w celu niespecyficznego wzmocnienia funkcji mitochondriów

Mitochondrial dysfunction plays a significant role in the aging process and in neurodegenerative diseases including several hereditary spinocerebellar ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja i ilościowe określenie efektów terapeutycznych rozpuszczalnych w wodzie aktywatorów mitochondrialnych na zachowanie móżdżku i tkanki u myszy z ataksją rdzeniową móżdżku typu pierwszego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ataksji rdzeniowej móżdżku, takie jak to, czy deficyty mitochondrialne przyczyniają się do patologii choroby i czy choroba może być hamowana przez rozpuszczalny w wodzie aktywator mitochondriów. Główną zaletą tej techniki jest to, że kwas bursztynowy jest zatwierdzonym przez FDA niedrogim związkiem rozpuszczalnym w wodzie, który może być dostarczany bezpośrednio do mózgu za pośrednictwem wody pitnej.Implikacje tej techniki mogą rozciągać się na terapię innych chorób neurodegeneracyjnych, ponieważ deficyty mitochondrialnych kompleksów fosforylacji oksydacyjnej występują w wielu chorobach neurodegeneracyjnych, w tym w chorobie Alzheimera i Huntingtona. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z początkową konfiguracją paradygmatów behawioralnych, które mogą wymagać dostosowania w celu osiągnięcia spójnych wyników. Wizualna demonstracja tej metody jest korzystna, ponieważ kroki behawioralne mogą być trudne do odtworzenia z pisemnej sekcji metody, ale są łatwe do odtworzenia za pomocą nagrania wizualnego.Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw pas startowy pod lekkim kątem do góry w kierunku pudełka głównego, wyłożonego pościelą i jedzeniem z nagrodami. Następnie wyłóż arkusz białego papieru na pasie startowym. Pozwól myszy zaaklimatyzować się w pudełku domowym przez pięć minut.Następnie podnieś pojedynczy temat i pomaluj lewe i prawe tylne łapy odpowiednio niebieską i czerwoną nietoksyczną farbą na bazie wody. Następnie umieść obiekt na początku pasa startowego i pozwól mu przejść do pola głównego. Gdy tester dotrze do skrzynki domowej, zamknij klapę i pozwól mu pozostać w skrzynce domowej przez minutę, zanim wróci do odpowiedniej klatki domowej.Następnie wyczyść wybieg i pudełko domowe 30% etanolem i wymień pościel, karmę z nagrodami i papier na wybieg do następnej próby. W tym samym czasie zbierz papier startowy po eksperymencie i sprawdź próbę. Udana próba odcisku stopy jest definiowana jako minimum pięć kolejnych śladów, w których badany idzie w kierunku złotego pudełka, nie odwracając się ani nie zatrzymując.Teraz ustaw aparat belkowy zgodnie ze specyfikacją krzyża prętów z sześcioma różnymi belkami. Na jednym końcu belki ustaw zaciemnione pudełko domowe z jedzeniem z nagrodami. Aby trenować obiekty na belce, zmontuj aparaturę z belką trzecią.Delikatnie umieść obiekt na końcu belki naprzeciwko pudełka głównego. I pozwól mu przejść przez belkę. Pozwól każdemu badanemu na maksymalnie trzy dwuminutowe próby, aby osiągnąć udany bieg.Co definiuje się jako przekroczenie belki i wejście do pola startowego w ciągu dwóch minut. W czwartym dniu treningu z belką zmontuj aparat z belką pierwszą. I skonfiguruj skrzynkę domową.Umieść kamerę wideo przed aparatem i sprawdź, czy aparat z pełną wiązką światła może być wyraźnie uchwycony na wideo. Pozwól myszy przejść przez wiązkę, nagrywając każdą próbę i rejestrując liczbę udanych prób na osobę na wiązkę. Na tym etapie zaaklimatyzuj badanych do zbiornika na 10 minut przed rozpoczęciem próby.Podczas tego okresu aklimatyzacji należy przygotować aparat rotarod, czyszcząc każdą linię aparatu 30% etanolem. Następnie otwórz oprogramowanie rotarod. Ustaw ustawienia początkowe na cztery prędkości na minutę, ustawienia przyspieszenia na pięć minut i ustawienia prędkości końcowej na 40 obr./min, aby zapewnić stałe przyspieszenie od czterech do 40 obr./min przez okres pięciu minut.Po okresie aklimatyzacji umieść obiekty na rotarodzie w odpowiednich pasach, podczas gdy pręt obraca się z prędkością czterech obrotów na minutę. Gdy wszyscy badani znajdą się na swoich pasach, rozpocznij pierwszą próbę. Zapisz opóźnienie do upadku za pomocą oprogramowania instrumentu.Dodatkowy zegar może być użyty jako kopia zapasowa. Po zakończeniu próby, pozwól każdemu badanemu odpocząć w odpowiednich zbiornikach pasa przez 10 minut przed następną próbą, aby zapobiec zmęczeniu. W tej procedurze przymocuj rurkę skrzynki kontroli temperatury mikrotomu sań ze sceny do kranu zlewozmywakowego.Użyj skrzynki kontrolnej temperatury, aby schłodzić stopień mikrotomu do 28 stopni Celsjusza. Następnie ustaw pokrętło grubości przekroju na 50 mikrometrów. Następnie wlej na scenę porcję roztworu OTC wielkości dziesięciocentówki.Zanim OTC zamarznie, użyj kleszczy, aby ustawić półkulę tak, aby środkowa strzałkowa powierzchnia cięcia była skierowana w dół na warstwie OTC. Szybko i delikatnie ustaw tkankę tak, aby boczny koniec półkuli był skierowany w stronę ostrza. Lepszy od sceny.Pracując warstwami, dodaj dodatkowe OTC wokół tkanki i pozwól OTC całkowicie zamarznąć przed dodaniem następnej warstwy. Następnie dodaj cienką warstwę OTC na wierzch tkanki i zamroź ją. Następnie pokrój tkankę z równym ciężarem ciała rozłożonym na ostrzu tnącym.Zbierz sekcje za pomocą pędzla artystycznego. I umieść je w odpowiednio oznakowanej płytce studzienkowej zawierającej jeden XPBS. Między sekcjami zresetuj grubość cięcia do 50 mikrometrów, jeśli to konieczne.Po podzieleniu na sekcje zastąp PBS w każdym dołku płytki roztworem mocznika. I połóż talerz na lodzie. Gdy będzie gotowa, przenieś płytkę do bloku grzewczego ustawionego na temperaturę wrzenia, aby zagotować skrawki w roztworze mocznika w celu zdemaskowania epitopów do znakowania immunologicznego.Pomiędzy każdym etapem gotowania schłodzić płytkę zawierającą skrawki tkanki na lodzie. Po ugotowaniu umyj sekcje trzy razy, zastępując obecny roztwór jednym XPBS i mieszając sekcje przez 10 minut. Następnie zablokuj skrawki roztworem surowicy osła, inkubując je w surowicy przez godzinę z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.Sekcje można teraz barwić. Po oznaczeniu zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną o stężeniu 2% z podłożem montażowym, aby zmniejszyć fotowybielanie. Szkiełko nakrywkowe i schnąć przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego zlokalizuj pierwotną szczelinę móżdżku w jasnym świetle pola. Najważniejszym etapem testu aminowego jest dokładne zlokalizowanie tkanki móżdżku w modułach piątym i szóstym A, które flankują pierwotną szczelinę.Analiza wzorów barwienia i niespójnych zrazików zapewni zmienność wyniku. Dzięki obiektywowi 10X skanuj i sekwencyjnie wzbudzaj kanały DAPI, Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 594. Za pomocą lasera diodowego o długości fali 405 nanometrów, argonowego lasera gazowego o długości 488 nanometrów i lasera diodowego o długości fali 559 nanometrów, w połączeniu z rozdzielaczem wiązki dichroicznej DM 488559 nanometra.Następnie oddziel i zbierz emitowane światło za pomocą rozdzielaczy wiązki SDM 490 i SDM 560 oraz filtra pasmowoprzepustowego BA 575675. Kwas bursztynowy rozpuszczano w wodzie pitnej myszy SCA1 w klatce domowej przez cztery tygodnie, począwszy od 17 tygodnia życia. Myszy SCA1 zaczynają wykazywać fenotyp ataksji w wieku pięciu tygodni.Oceny behawioralne przeprowadzono w okresie leczenia w następujący sposób. Test odcisku stopy w 17. tygodniu. Test wiązki w 18. tygodniu i przyspieszający rotarod w 19. tygodniu.W wieku 20 tygodni myszy uśmiercano, a tkankę móżdżku pobierano do testów patologii aminowej, testów HPLC i testów oddychania. Oto reprezentatywne dane z testu śladu wskazującego na bramę typu dzikiego traktowaną pojazdem, bramkę SCA1 traktowaną pojazdem i bramkę SCA1 traktowaną kwasem bursztynowym. W tym przypadku dane z analizy wiązki pokazują poprawę wydajności wiązki myszy SCA1 po leczeniu kwasem bursztynowym.Leczenie kwasem bursztynowym znacznie poprawia przyspieszenie działania rotarodu myszy SCA1, o czym świadczy zwiększona latencja do upadku. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o konsekwentnym stosowaniu tej techniki do każdego pacjenta w wielu próbach. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak oddychanie mitochondrialne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak poprawa oddychania przez poszczególne kompleksy fosforylacji oksydacyjnej po dostarczeniu kwasu bursztynowego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać testy behawioralne i neuropatologiczne. Które oceniają poprawę zachowania móżdżku i cytoarchitektury.

treating-sca1-mice-with-water-soluble-compounds-to-non-specifically

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie przeprowadzamy test przyspieszającego pręta obrotowego lub rotarod, aby ocenić koordynację ruchową i uczenie się u myszy.

Test przyspieszającego pręta obrotowego lub test rotarod: metoda testowania koordynacji ruchowej i uczenia się u myszy

Dysfunkcja mitochondriów jest cechą charakterystyczną starzenia się komórek. W tym artykule zastosowano nieinwazyjne leczenie w bliskiej podczerwieni (NIr) w celu poprawy funkcji mitochondriów w starzejącym się nabłonku czuciowym przedsionkowym myszy.

Światło bliskiej podczerwieni (NIr) zwiększa ekspresję markera funkcji mitochondriów w przedsionkowym nabłonku czuciowym myszy

Mysie badania na modelach zapalenia jelita grubego wykazały, że niewielki procent (1 - 5%) mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wstrzykniętych dożylnie lub dootrzewnowo do miejsca zapalnego jelita grubego1,2. Badanie to pokazuje, że dosercowe wstrzyknięcia MSC pod kontrolą USG powodują zwiększoną lokalizację w jelicie.

Wstrzyknięcie dosercowe pod kontrolą ultradźwięków ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zwiększenia naprowadzania do jelita do stosowania w mysich modelach eksperymentalnych chorób zapalnych jelit

Zrozumienie wpływu środowiskowych pestycydów chloroorganicznych (OCP) na funkcję mitochondriów w hepatocytach jest ważne dla zbadania mechanizmu OCP powodującego zaburzenia metaboliczne. W pracy przedstawiono szczegółowe metody wykrywania funkcji mitochondriów wątroby.

Eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Tutaj opisujemy podawanie leków za pomocą mikropipet (MDA) jako alternatywną metodę do doustnego podawania leków, która zachęca zwierzę badawcze do łatwego przyjmowania leków przy minimalnym stresie i dyskomforcie.

Stosowanie podawania leków pod kontrolą mikropipet jako metody alternatywnej dla doustnego podawania przez zgłębnik w modelach gryzoni

Organoidy mózgowe stanowią cenny model dla badań nad encefalomiopatią mitochondrialną, kwasicą mlekową oraz epizodami podobnymi do udaru (MELAS), oferując wgląd w ich podstawową patofizjologię i stanowiąc platformę do badań przesiewowych leków. Organoidy pochodzące z linii komórkowych o różnym poziomie heteroplazmy genów wywołujących chorobę wykazują istotne różnice fenotypowe.

Modelowanie chorób mitochondrialnych za pomocą organoidów mózgowych: Skupienie się na encefalomiopatii mitochondrialnej, kwasicy mlekowej oraz epizodach podobnych do udaru

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Zaprezentowano nieinwazyjną procedurę oceny funkcji śródbłonka z wykorzystaniem urządzenia Endo-PAT 2000.

Ocena funkcji rozszerzania naczyń śródbłonka za pomocą urządzenia Endo-PAT 2000

Poznaj metodę leczenia ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1 u myszy za pomocą kwasu bursztynowego, związku rozpuszczalnego w wodzie wspierającego funkcję mitochondriów.

Leczenie myszy SCA1 związkami rozpuszczalnymi w wodzie w celu niespecyficznego wzmocnienia funkcji mitochondriów

Przeglądaj więcej filmów