Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Ogólnym celem tych eksperymentów jest analiza homeostazy i różnicowania adipocytów oraz zbadanie mechanizmów niedotlenienia i apoptozy adipocytów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metaboliki, takie jak otyłość i cukrzyca typu II. Główną zaletą tej techniki jest to, że są to podstawowe i niedrogie procedury, jest analiza biologii adipocytów w konkretnym modelu badań.

Nicole Hannemann, doktorantka z mojego laboratorium, będzie demonstrować procedury. Aby określić ilościowo hipoksję in vivo, najpierw określ masę ciała myszy. Następnie wstrzyknąć dootrzewnowo 60 mg na kg masy ciała stałego hirochlorku pimonidazolu.

Po 45 minutach przygwoźdź kończyny zwierzęcia i otwórz jamę otrzewnej. Zbierz z jamy lewe i prawe okołogodopalne poduszeczki tłuszczowe i usuń tkanki gonadalne z poduszeczek. Następnie zważ tkankę, aby określić stosunek poduszeczki tłuszczowej do masy ciała w gramach.

Aby przeprowadzić analizę histologiczną homeostazy adipocytów, najpierw należy odparafinować skrawki tkanki tłuszczowej za pomocą trzech pięciominutowych płukań ksylenem, a następnie dwóch dwuminutowych rehydratacji w 100% etanolu i dwóch dwuminutowych rehydratacji w 96% etanolu. Następnie umyj skrawki w wodzie destylowanej przez pięć minut i zabarwij je hematoksyliną przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki w wodzie przez kolejne pięć minut, a następnie zabarwić roztworem eozyny przez 30 sekund.

Umyj sekcje, jak właśnie pokazano. Następnie odwodnić sekcje w 96% etanolu i 100% etanolu dwa razy przez dwie minuty. Następnie następuje trzy pięciominutowe inkubacje ksylenu.

Następnie zamontuj sekcje za pomocą bezwodnego środka montażowego. Do analizy immunohistochemicznej tkanek należy odparafinować skrawki, jak pokazano powyżej, a następnie 30-minutowe trawienie roztworem roboczym proteinazy K w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec trawienia wypłucz tkanki w PBS i zablokuj endogenną peroksydazę 3% nadtlenkiem wodoru w PBS na 10 minut.

Po dwóch kolejnych pięciominutowych płukaniach w PBS blokuj wszelkie nieswoiste wiązania przeciwciał z 10% surowicą w PBS. Następnie inkubuj tkanki i przeciwciała w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka spłucz skrawki trzema pięciominutowymi płukaniami w PBS.

Następnie inkubować tkanki z odpowiednimi biotynylowanymi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. W ciągu ostatnich 30 minut okresu znakowania przeciwciał wtórnych należy zrównoważyć 50 mikrolitrów roztworu awidyny z 50 mikrolitrami biotynylowanej peroksydazy H na sekcję przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj skrawki dwa razy przez pięć minut każdy w PBS i potraktuj tkanki 100 mikrolitrami kompleksu awidyny biotyny ABC w temperaturze pokojowej.

Po 45 minutach przemyć skrawki dwukrotnie w PBS i inkubować tkanki w roztworze substratu peroksydazy, aż barwienie osiągnie odpowiedni poziom intensywności. Teraz myj skrawki przez pięć minut wodą destylowaną i przeciwbarwij komórki hematoksyliną przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po przeciwdziałaniu barwieniu ponownie umyj chusteczki w wodzie.

Następnie odwodnić skrawki i użyć bezwodnego środka montażowego do zamontowania próbek za pomocą szkiełek nakrywkowych. Skrawki można następnie ocenić pod mikroskopem jasnego pola. Zacznij od oderwania skóry dorosłego samca myszy od górnej części nogi, schabu i boku, przypinając skórę podczas jej usuwania.

Następnie należy pobrać tylną podskórną tkankę tłuszczową otaczającą pachwinowe węzły chłonne znajdujące się u podstawy tylnych nóg w celu wyhodowania adipocytów. Aby przeanalizować różnicowanie adipogenne, umieść zróżnicowaną kulturę komórek tłuszczowych pod wyciągiem i delikatnie umyj komórki PBS. Następnie utrwal komórki w dwóch ml 10% formalyny przez 60 minut.

Pod koniec utrwalania umyj komórki w wodzie i potraktuj kulturę dwoma mililitrami 60% izopropanolu przez pięć minut, a następnie dwoma mililitrami roztworu roboczego O o barwie olejowej. Po pięciu minutach przepłucz komórki wodą z kranu, aż woda będzie czysta. I przeciwbarwić komórki hematoksyliną, jak właśnie pokazano.

Komórki można następnie ocenić pod mikroskopem z kontrastem fazowym przy 100-krotnym powiększeniu. Lipidy adipocytów będą czerwone, a jądra niebieskie. Tutaj pokazane są fragmenty poduszeczki tłuszczowej myszy z normalną i wysokotłuszczową dietą.

Kwantyfikacja wielkości i powierzchni adipocytów wyraźnie wskazuje na przerost adipocytów po sześciu tygodniach diety wysokotłuszczowej, o czym świadczy zwiększona wielkość adipocytów u zwierząt leczonych dietą wysokotłuszczową. U myszy, które były leczone markerem hipoksyjnym pimonidazolem, zwiększonemu statusowi niedotlenienia tkanki tłuszczowej towarzyszy wzrost liczby alfa-dodatnich adipocytów HIF1. Co więcej, barwienie tunelowe skrawków tłuszczu z nokautujących i kontrolnych kolegów z miotu pokazuje, że wzrost apoptozy adipocytów koreluje z obecnością hipoksji i ekspresją czynnika alfa indukowanego hipoksyjnością 1

Zgodnie z oczekiwaniami ekspresja Hif1a w adipocytach wzrasta po 24 godzinach niedotlenienia. Co więcej, kwantyfikacja docelowych genów Hif za pomocą QPCR wskazuje, że zwiększona ekspresja Hif1a w warunkach niedotlenienia prowadzi do wzrostu ekspresji mRNA Inos. Wyciszenie Hif1 lub 2 alfa przez interferencję RNA ratuje jednak adipocyty przed apoptozą w warunkach niedotlenienia, potwierdzając niedotlenienie sensorycznej roli regulacyjnej Hif alfa w apoptozie adipocytów.

Po tych procedurach można wykonać wszystkie testy, takie jak określenie glukozy i insulinooporności, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian metabolicznych i dysfunkcji adipocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić analizę histologiczną badań apoptozy adipocytów i hipoksji.