Name: Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Odkryj mechanizmy homeostazy i różnicowania adipocytów oraz wpływ hipoksji na apoptozę w tkance tłuszczowej myszy. Metoda umożliwia badanie biologii adipocytów w modelach metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy uprzejmie dziękują Dr. J. Lutherowi i K. Ubiecie za przygotowanie danych oraz Dr. B. Grötschowi za korektę manuskryptu. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811/1-1-Emmy Noether).

<ol><li>Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).</li>
<li>Gong, Z., Muzumdar, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+function%2C+type+2+diabetes%2C+and+metabolism+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging.</a> Int J Endocrinol. , 320482(2012).</li>
<li>Deng, Y., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+as+novel+biomarkers+and+regulators+of+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome.</a> Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).</li>
<li>Rezaee, F., Dashty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adipose+Tissue+in+Metabolic+System+Disorders+Adipose+Tissue+is+the+Initiator+of+Metabolic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases.</a> J Diabetes Metab. , 008(2013).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+fat+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of fat expansion.</a> J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).</li>
<li>Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+adipocyte+differentiation+in+different+fat+depots%3B+implications+for+pathophysiology+or+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1(2015).</li>
<li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+adipocyte+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metab. 4, 263-273 (2006).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Fra-1+expression+causes+severe+lipodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy.</a> J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fra-2%2FAP-1+controls+adipocyte+differentiation+and+survival+by+regulating+PPARgamma+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia.</a> Cell Death Differ. , (2014).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+O2+homeostasis+by+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).</li>
<li>Kim, W., Kaelin, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+protein%3A+new+insights+into+oxygen+sensing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).</li>
<li>Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensors+at+the+crossroad+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensors at the crossroad of metabolism.</a> Cell Metab. 9, 11-22 (2009).</li>
<li>Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+ameliorates+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction.</a> Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).</li>
<li>Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipogenesis+and+lipolysis+in+the+mouse+upon+selective+ablation+of+the+retinoid+X+receptor+alpha+mediated+by+a+tamoxifen-inducible+chimeric+Cre+recombinase+%28Cre-ERT2%29+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).</li>
<li>Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+hormones+determine+sensitivity+to+central+leptin+and+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin.</a> Diabetes. 55, 978-987 (2006).</li>
<li>Haluzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+%28C57BL%2F6J+versus+FVB%2FN%29+strongly+influences+the+severity+of+diabetes+and+insulin+resistance+in+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Planat-Benard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+human+adipose+lineage+cells+toward+endothelial+cells%3A+physiological+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives.</a> Circulation. 109, 656-663 (2004).</li>
<li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoNEET-driven+alterations+in+adipocyte+mitochondrial+activity+reveal+a+crucial+adaptive+process+that+preserves+insulin+sensitivity+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity.</a> Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).</li>
<li>Trajcevski, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+lipid+oxidation+and+maintenance+of+muscle+insulin+sensitivity+despite+glucose+intolerance+in+a+diet-induced+obesity+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model.</a> PLoS One. 8, 71747(2013).</li>
<li>Montgomery, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain-dependent+variation+in+obesity+and+glucose+homeostasis+in+response+to+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding.</a> Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).</li>
<li>de Queiroz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+driving+retroperitoneal+adipocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+response+to+a+high-sugar+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet.</a> Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+adipose+tissue+hypoxia+in+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance.</a> Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+corticotropin-releasing+hormone+receptor+2+signalling+pathway+partly+mediates+hypoxia-induced+increases+in+lipolysis+via+the+cAMP-protein+kinase+A+signalling+pathway+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue.</a> Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).</li>
<li>Bozec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+size+is+controlled+by+Fra-2+through+LIF%2FLIF-receptor+signalling+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia.</a> Nature. 454, 221-225 (2008).</li>
<li>Varia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimonidazole%3A+a+novel+hypoxia+marker+for+complementary+study+of+tumor+hypoxia+and+cell+proliferation+in+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).</li>
<li>Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D1+protein+coordinates+dynamic+assembly+of+HIF-1alpha-PHD-VHL+to+regulate+HIF-1alpha+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability.</a> Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).</li>
<li>Tennant, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivating+HIF+prolyl+hydroxylases+under+hypoxia+results+in+metabolic+catastrophe+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death.</a> Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).</li>
<li>Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1alpha+Upregulation+due+to+Depletion+of+the+Free+Ubiquitin+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+medical+science%22%5BJournal%5D)">HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool.</a> Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).</li>
<li>Amelio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+opposes+tumor+angiogenesis+by+promoting+hypoxia-inducible+factor+1alpha+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).</li>
<li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+remodeling+under+ischemia%3A+death+of+adipocytes+and+activation+of+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells.</a> Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> J Diabetes Res. 2015, 970375(2015).</li>
<li>Keuper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inflammatory+micro-environment+promotes+human+adipocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis.</a> Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).</li>
<li>Sera, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+origin+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+hematology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell origin of adipocytes.</a> Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
<li>Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+from+lipid+storage+compartment+to+endocrine+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ.</a> Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Adipocyty charakteryzują się fenotypowo ich wielkością, liczbą i powierzchnią, ujawniając przerost i przerost adipocytów, wywołany nadmiernym magazynowaniem energii z powodu nadmiernego odżywiania 5. Te zdarzenia prowadzące do rozregulowania kwasów tłuszczowych i późniejszych zespołów metabolicznych są również stanami zwiększonej masy tłuszczowej z zachowanym metabolizmem, co jest również określane jako "zdrowa" ekspansja tłuszczu. Na przykład Kusminski i wsp. 21 wykazało, że myszy z masywną ekspansją tłuszczu pozostają metabolicznie zdrowe, co sugeruje, że ekspansja tłuszczu niekoniecznie jest związana z zespołami metabolicznymi i musi być dokładnie określona, aby ocenić cechy adipocytów. Tkanka tłuszczowa (AT) odgrywa kluczową rolę w regulacji metabolizmu organizmu. AT jest największym narządem endokrynnym, który może wpływać na dyslipidemię, miażdżycę, hiperinsulinemię i hiperglikemię 3. Ocena homeostazy AT i mechanizmów molekularnych ją regulujących może pozwolić na lepsze zrozumienie zaburzeń układu metabolicznego. W związku z tym odkrycie mechanizmów regulujących różnicowanie adipocytów, wielkość adipocytów i masę poduszeczek tłuszczowych pomogłoby w opracowaniu nowej metody leczenia zaburzeń otyłości. Za pomocą metod in vivo i in vitro możliwe jest określenie roli wpływu żywności i ekspresji genów na różnicowanie i aktywność adipocytów. Aby określić homeostazę AT, określenie równowagi między różnicowaniem adipocytów, proliferacją i apoptozą, jak sugeruje nasz protokół, jest równie ważne, jak analiza odpowiedzi metabolicznej glukozy i insuliny 22-24.
Analizy profilowania ekspresji genów zaangażowanych w adipogenezę, lipogenezę, lipolizę, wychwyt kwasów tłuszczowych, niedotlenienie, apoptozę i proliferację w adipocytach pierwotnych i trzewnym AT jest wysokoprzepustową metodą uzyskiwania przeglądu homeostazy adipocytów i ich możliwej dysfunkcji. Interesujący kandydaci powinni być dalej analizowani na poziomie białka za pomocą western blot lub barwienia immunohistologicznego. Aby uzyskać optymalne wyniki za pomocą systemu real-time PCR przy użyciu niesymetrycznych barwników cyjaninowych, należy przetestować stężenia cDNA w zakresie od 1 do 10 ng oraz optymalne stężenia starterów w zakresie od 50 do 900 nM w celu zminimalizowania niespecyficznej amplifikacji. Krytycznymi składnikami są podkłady; Dla każdego przebiegu krzywe topnienia muszą być ściśle kontrolowane, aby zapewnić specyficzność i wykluczyć tworzenie się dimerów starterów. Dlatego zaleca się stosowanie kontroli ujemnej zH2Ozamiast cDNA. Ponadto dostępne na rynku niesymetryczne barwniki cyjaninowe są dostarczane jako mieszanki główne, które zawierają pasywny barwnik referencyjny (taki jak ROX) w celu zapewnienia wewnętrznego sygnału odniesienia. Sygnał cDNA jest normalizowany podczas analizy danych do sygnałów ROX w celu skorygowania wahań sygnału między studniami. Kolejną kwestią, którą należy wziąć pod uwagę w celu stworzenia dobrego systemu qPCR, jest wybór genu sprzątania. Dla każdego schorzenia stosuje się kilka genów porządkowych, np. HPRT, β-aktyna, GAPDH, β-2-MG lub HSP90.
Białka HIF stabilizowane w warunkach niedotlenienia są głównymi regulatorami warunkującymi nie tylko przeżycie adipocytów, ale także przemian metabolicznych, takich jak glukoza, tolerancja insuliny i metabolizm lipidów 11,25,26. Aby ustalić niedotlenione obszary w poduszce tłuszczowej, HIF-1α jest oznaczany w sekcjach AT za pomocą immunohistochemii. Ponieważ białka HIF ulegają szybkiej degradacji w ciągu 5 do 10 minut w warunkach normoksycznych, procedura i utrwalanie poduszeczki tłuszczowej do analizy histologicznej powinny być ściśle kontrolowane, aby uniknąć czasu utajenia. Dlatego, aby zapewnić niedotlenienie nie tylko poprzez barwienie HIF, pimonidazol stosuje się do określania obszarów niedotlenienia w AT. Pimonidazol jest zdolny do rozprowadzania się w tkankach, jak to już wykazano w kościach 27, i skutecznie zaznacza obszary niedotlenione poprzez wiązanie się z białkami zawierającymi tiol specyficznie w niedotlenionych komórkach, co jest dalej wykrywane w odcinkach histologicznych przez specyficzne wiązanie przeciwciał 28. Jednak do analizy szlaku niedotlenienia można zastosować inne markery i metody. Na przykład udział enzymu hydroksylazy prolilowej (PHD), który indukuje hydroksylację reszt proliny w normoksji, a także białka von Hippel-Lindau (VHL), które rozpoznaje hydroksylowane proliny i indukuje poliubikwitynację w celu pośredniczenia w proteasomalnej degradacji HIF, musi być analizowane w celu uzyskania pełnego przeglądu szlaku 29,30. Co więcej, wszechobecne wykrywanie HIF określiłoby również stabilność i degradację białek, które mogą być zmienione 31,32.
Ponadto proliferację przez Ki67 i apoptozę przez barwienie TUNEL określa się in vivo poprzez barwienie skrawków histologicznych AT. Przeprowadza się również kwantyfikację proliferacji przez Ki67 i apoptozę za pomocą barwienia TUNEL lub aneksyny V za pomocą analizy cytometrii przepływowej 33. Proliferację można oczywiście zmierzyć za pomocą innych technik, takich jak analiza cyklu komórkowego adipocytów, który nie jest uwzględniony w pomiarze komórek Ki67 dodatnich. Co więcej, badanie apoptozy za pomocą TUNEL może być uzupełnione analizami FACS Aneksyny V i TOP-PR-3, które określą poziomy martwicy w porównaniu z procesem apoptozy śmierci komórki. Apoptoza jest podstawowym procesem dla programu śmierci komórki, co jest ważne dla homeostazy AT. Rzeczywiście, rozregulowanie apoptozy adipocytów było wcześniej związane z procesami przyczyniającymi się do otyłości i lipodystrofii 34. Co więcej, w 2011 roku Keuper i wsp. powiązali zapalenie tkanki tłuszczowej z apoptozą adipocytów. Wykazali, że makrofagi indukują apoptozę w preadipocytach i adipocytach, które z kolei przyciągają makrofagi. Rekrutacja makrofagów przyspiesza stan zapalny, co przyczynia się do zespołów metabolicznych, takich jak tolerancja glukozy i insuliny 35. Jednak apoptoza adipocytów jest nadal słabo zbadanym zjawiskiem, pomimo hipotezy, że indukowana apoptoza adipocytów może prowadzić do zmniejszenia masy ciała.
Niniejszy protokół wykorzystuje podejścia immunohistochemiczne do badania różnych zjawisk, takich jak proliferacja, apoptoza i niedotlenienie in vivo. Dlatego tkanka została utrwalona za pomocą 4% formaldehydu, co jest krytycznym krokiem. Wydłużony czas wiązania tkanek prowadzi do zmiany epitopów, które stają się niedostępne dla przeciwciała. Natomiast krótki czas utrwalania zwiększa wrażliwość epitopów na odczynniki. Zalecany optymalny czas utrwalenia to 24 godziny. Co więcej, grubość skrawków wpływa również na przeciwciała wiążące się z ich epitopami; Optymalna grubość wynosi od 2 do 5 μm. Sekcje grubsze niż 5 μm dadzą fałszywie dodatnie wyniki ze względu na zwiększone miejsca wiązania. Natomiast odcinki cieńsze niż 2 μm zawierają mniej miejsc wiązania, a obszary dodatnie nie są dobrze zdefiniowane. Kolejnymi krytycznymi czynnikami są samo przeciwciało, czas inkubacji, stężenie, a nawet temperatura, które wpływają na jakość specyficznego wiązania z epitopami. Dlatego walidacja stężenia przeciwciał i czasu inkubacji jest konieczna dla każdego stanu.
Aby uzupełnić badanie, przedstawiamy protokół różnicowania adipocytów in vitro , który może być rozszerzony o różne zabiegi, stymulację lub kohodowle. Dzięki zastosowaniu hodowli adipocytów in vitro możliwe jest określenie defektów w różnicowaniu i funkcjach adipocytów. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, podobnie jak w przypadku wszystkich komórek pierwotnych, bardzo ważne jest zdrowe zachowanie i wygląd ADSC i adipocytów. Ziarnistość, wakuolacje cytoplazmatyczne i/lub oderwanie są oznakami pogorszenia, wskazującymi na nieodpowiednią pożywkę, zanieczyszczenie mikrobiologiczne lub starzenie się komórek pierwotnych. W protokole tym wykorzystuje się wyizolowane adipocyty z tkanki poduszeczki tłuszczowej, podczas gdy równie dobrze możliwe jest użycie mezenchymalnych komórek macierzystych wyizolowanych ze szpiku kostnego, jak opisano w innych protokołach 36. Najnowszy z nich obejmuje zrębowe komórki progenitorowe, które mogą odzwierciedlać dodatkowe problemy z różnicowaniem występujące na bardzo wczesnym etapie różnicowania adipocytów, co może zostać pominięte w naszym obecnym protokole. Co więcej, ADSC mogą być szybko rozrastane (ponad 10 razy w ciągu jednego tygodnia), a długotrwale hodowane ADSC po niektórych pasażach nadal zachowują swoją mezenchymalną pluripotencję 37,38. Kolejną zaletą stosowania ADSC jest to, że można łatwo przełączyć się na człowieka, ponieważ ADSC można pobrać od pacjentów za pomocą liposukcji, która jest prostą i mało inwazyjną metodą.
Ponieważ AT wpływa na kilka innych narządów w sposób endokrynologiczny, protokół powinien zostać rozszerzony na adipokiny. Wiadomo, że adipokiny, takie jak leptyna, adiponektyna, czynnik α martwicy nowotworu (TNF) i rezystyna, wydzielane przez adipocyty, wpływają na choroby metaboliczne poprzez kontrolowanie metabolizmu tłuszczów, homeostazy energetycznej i wrażliwości na insulinę 39. W związku z tym należy wykonać analizę sekretomu w surowicy i adipocytach. W przypadku dysfunkcji AT adipokiny i cytokiny prozapalne, takie jak IL-6, mogą prowadzić do rozregulowania narządów, takich jak wątroba i trzustka, oraz funkcji mięśni 4. Aby wykluczyć ogólnoustrojową dysfunkcję narządów, można przetestować modele zwierzęce lub hodowle komórkowe pod kątem ich reakcji na stymulację i wychwyt glukozy.
W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy podstawowego stanu AT i adipocytów in vivo i in vitro w celu ujawnienia molekularnych mechanizmów homeostazy i funkcjonalności adipocytów.

Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia z 2014 roku, 39% dorosłej populacji świata ma nadwagę, a 13% jest otyłych 1. W niedalekiej przyszłości osoby z nadwagą będą stanowiły znaczną część populacji osób starszych. Ważną cechą otyłości i starzenia się jest rozregulowanie tłuszczu w stosunku do zachorowalności i śmiertelności 2. Adipokiny, białka wydzielane przez tkankę tłuszczową (AT), mogą wywoływać zespoły metaboliczne, takie jak otyłość i cukrzyca typu 2 3. Choroby metaboliczne są najczęściej spowodowane nadmiernym magazynowaniem energii w kropelkach lipidów adipocytów, co skutkuje ekspansją AT 4. W związku z tym interesujące jest określenie przyczyn i mechanizmów molekularnych ekspansji AT w celu znalezienia możliwości jej kontrolowania.
Nadmierne odżywianie prowadzi do ekspansji AT, która jest regulowana przez dwa zdarzenia: nadmierne magazynowanie energii w kropelkach lipidów adipocytów, proces prowadzący do hipertrofii (wzrost wielkości adipocytów) oraz zwiększona adipogeneza, znana również jako hiperplazja adipocytów 5. Adipogeneza to proces różnicowania się multipotencjalnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w adipocyty. Po pierwsze, MSCs przekształcają się w preadipocyty w fazie zaangażowania. Po drugie, preadipocyty dalej różnicują się, aby nabyć cechy dojrzałych i funkcjonalnych adipocytów 6. Kilka czynników transkrypcyjnych zostało zidentyfikowanych jako główne regulatory do oznaczania preadipocytów, takich jak białko palca cynkowego 423 (Zfp423) i wczesny czynnik komórek B 1 (Ebf1). Podczas gdy Zfp423 indukuje wczesne zaangażowanie, Ebf1 jest niezbędny do wytwarzania komórek progenitorowych adipocytów 6. Różnicowanie końcowe jest ściśle kontrolowane przez kaskadę transkrypcyjną, w której γ receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPARγ) jest niezbędnym czynnikiem transkrypcyjnym 7. Innymi kluczowymi czynnikami transkrypcyjnymi są członkowie rodziny CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) (tj. C/EBPα, C/EBPβ i C/EBPδ), czynniki podobne do kruppela (KLF), białko wiążące elementy reagujące na cAMP (CREB) i wczesna odpowiedź wzrostu 20 (Krox20) 6.
Ostatnio wykazano, że rodzina białek aktywatora-1 (AP-1) bierze udział w procesie różnicowania adipocytów 8,9. Rodzina AP-1 jest utworzona przez dimeryczny kompleks białkowy, złożony z członków Fos, Jun i/lub aktywującego czynnika transkrypcyjnego (ATF). Antygen 1 i 2 związany z FOS (Fra-1 i Fra-2) jest w stanie regulować różnicowanie adipocytów. Fra-1 upośledza różnicowanie adipocytów poprzez hamowanie C/EBPα 8, podczas gdy Fra-2 kontroluje obrót adipocytów 9. W ten sposób Fra-2 nie tylko zmniejsza liczbę adipocytów poprzez tłumienie ekspresji PPARγ2 podczas różnicowania adipocytów, ale także zmniejsza apoptozę adipocytów poprzez bezpośrednie tłumienie ekspresji czynników indukowanych hipoksją (HIF). Rodzina HIF to heterodimeryczny kompleks czynników transkrypcyjnych, składający się z HIF-1α, HIF-2α i HIF-1β. Heterodimery składają się z wrażliwego na tlen białka HIF-α (HIF-1α lub HIF-2α) i niewrażliwej na tlen podjednostki HIF-1β 10. Podczas normoksji białka HIF-α są poliubikwitynylowane i ostatecznie degradowane przez proteasomy 11. W warunkach niedotlenienia, występujących w AT podczas ekspansji, białka HIF-α nie są już hydroksylowane. W związku z tym stabilizują się i tworzą dimery z konstytutywnie wyrażonym HIF-1β. Aktywacja transkrypcyjna genów kontrolowanych przez elementy odpowiedzi HIF bierze udział w regulacji angiogenezy, metabolizmu i stanu zapalnego 12. Rzeczywiście, HIF-1α sprzyja dysfunkcji AT poprzez indukowanie tolerancji glukozy, hamowanie wydatku energetycznego i obwodowego wykorzystania lipidów, a także poprzez zwiększanie poziomu leptyny i stłuszczenie wątroby wywołane HFD 13. Ponadto HIF-1α reguluje apoptozę adipocytów in vivo i in vitro9.
Obecny protokół opisuje metody badania statusu AT w celu rozwikłania molekularnych cech homeostazy adipocytów u dorosłych myszy. Pokazuje, w jaki sposób apoptoza, proliferacja i różnicowanie adipocytów in vivo i in vitro może być regulowane przez hipoksję. Aby to zrobić, używamy myszy z delecją Fra-2 specyficzną dla adipocytów wygenerowaną przez skrzyżowanie myszy przenoszących floksowane allele Fra-2 z myszami Fabp4-CreERT 9. Używając myszy Fabp4-Cre ERT, delecja jest specyficzna dla adipocytów i indukowana przez wstrzyknięcie tamoksyfenu 14. W przypadku modelu dorosłego wstrzyknięcia tamoksyfenu do otrzewnowej wykonuje się przez 5 kolejnych dni, począwszy od 6 tygodnia życia. W ten sposób myszy są poddawane normalnej diecie lub diecie wysokotłuszczowej przez 6 tygodni przed wykonaniem analizy. Myszy użyte w tym badaniu były samcami opartymi na tle C57Bl6, aby uniknąć żeńskich hormonów, takich jak estrogeny, które regulują dystrybucję tkanki tłuszczowej w organizmie 15. Użycie innego tła genetycznego może również zmienić fenotyp metaboliczny ze względu na związane ze szczepem różnice w gospodarce lipidowej 16.
Ten protokół pokazuje, jak analizować AT w warunkach niedotlenienia za pomocą histologii oraz jak ilościowo określać apoptozę, proliferację i różnicowanie adipocytów in vivo za pomocą analiz immunohistochemicznych i profilowania genów. Badanie zostało zakończone eksperymentami in vitro, pokazującymi, jak analizować pierwotne różnicowanie adipocytów i apoptozę zmienioną przez ekspozycję na niedotlenienie.

<table><tbody><tr><td>Roztwór RNAlater</td> Roztwór <td>stabilizujący RNA</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>4472908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony mysz Anty-ludzki Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>Klon B56 (RUO)</td></tr><tr><td>Oczyszczony mysz anty-ludzki klon Ki-67 B56 (RUO)</td><td>550609</td> Marker <td></td><td>proliferacji</td></tr><tr><td>FITC Aneksyna V</td><td>BioLegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Rozszczepiona kaspaza-3 MAb królika</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9664S</td><td>Klon 5A1E</td></tr><tr><td>Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175) (5A1E) MAb królika</td><td>9664</td><td>Marker</td><td></td>apoptozy</tr><tr><td>Lipofectamina2000 Odczynnik&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Jodek</td><td>T3605</td><td>Przeciwbarwienie jądrowe, Monomeryczne barwienie kwasem nukleinowym cyjaniny, Wzbudzenie i frasl; Emisja: 642&frasl; 661 nm</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s hemaluz,</td><td>Merck</td><td>109249</td><td>hematoksylin</td></tr><tr><td>pegGOLD TriFast</td><td>Peqlab</td><td>30-2030</td><td>TRIzol, jednofazowy roztwór izotiocyjanianu guanidyny i fenolu</td></tr><tr><td>Percellys Ceramic Kit 1.4&nbsp; mm</td><td>91-PCS-CK14</td><td>probówki zawierające kulki ceramiczne (1,4 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td></td> <td>Precellys 24</td><td>91-PCS24</td></tr><tr><td>Przeciwciało alfa HIF-1</td><td>Pierce</td><td>PA1-16601</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało alfa HIF-1, 16H4L13</td><td>700505</td><td>Marker</td><td></td> hipoksji</tr><tr><td> Zestaw do wykrywania śmierci komórkowej In Situ/em, Fluoresceina</td><td>Roche</td><td>11 684 795 001</td><td>Znakowanie końcówek dUTP-biotyna za pośrednictwem TdT (TUNEL)&nbsp;</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma</td><td>318906</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DNazy I (1&nbsp; jednostka/&mikro; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowany anty mysi IgG (H + L)</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowany anty mysz IgG (H + L)</td><td>BA-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>PK-4000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medium montażowe z DAPI</td><td>H-1200</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Biorąc pod uwagę, że tkanka tłuszczowa (AT) jest organem endokrynnym, może wpływać na metabolizm całego organizmu. Nadmierne magazynowanie energii prowadzi do rozregulowania adipocytów, co z kolei indukuje nieprawidłowe wydzielanie adipokin, wywołując zespoły metaboliczne, takie jak otyłość, dyslipidemia, hiperglikemia, hiperinsulinemia, insulinooporność i cukrzyca typu 2. W związku z tym badanie mechanizmów molekularnych stojących za dysregulacją adipocytów może pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych. Nasz protokół opisuje metody oceny mechanizmu molekularnego, na który wpływają warunki niedotlenienia AT, który koreluje z apoptozą adipocytów u dorosłych myszy. Protokół ten opisuje, jak analizować AT in vivo poprzez profilowanie ekspresji genów, a także analizę histologiczną różnicowania, proliferacji i apoptozy adipocytów podczas ekspozycji na niedotlenienie, stwierdzoną przez barwienie niedotlenionych komórek lub białka HIF-1α. Ponadto analiza in vitro różnicowania adipocytów i ich reakcji na różne bodźce uzupełnia charakterystykę szlaków molekularnych odpowiedzialnych za możliwą dysfunkcję adipocytów prowadzącą do zespołów metabolicznych.

Pokazujemy, jak określić homeostazę adipocytów in vivo i in vitro na przykładzie myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT w porównaniu do ich dzikiego typu. Nasz protokół określa, w jaki sposób zwiększona ekspresja HIF w warunkach hipoksji koreluje z dysfunkcją adipocytów, co wskazane jest przez zwiększoną apoptozę adipocytów.
Zwiększony rozmiar i powierzchnia adipocytów u myszy poddanych diecie bogatotłuszczowej (HFD)
Nadmierna podaży pokarmu, wśród innych czynników, prowadzi do hipertrofii adipocytów, spowodowanej nadmiernym magazynowaniem energii w kroplach tłuszczu. Wielkość i powierzchnia adipocytów są wskaźnikami hipertrofii. Przekroje tkanki tłuszczowej od myszy odżywianych dietą normalną (ND; Rycina 6a) i dietą bogatą w tłuszcze (HFD; Rycina 6b), a także ilościowe określenie wielkości i powierzchni adipocytów wyraźnie pokazują hipertrofię adipocytów po 6 tygodniach stosowania diety HFD, co objawia się zwiększoną wielkością adipocytów u myszy leczonych dietą HFD (Rycina 6c i d).
Zwiększona hipoksja w tkance tłuszczowej (AT) dorosłych myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT prowadzi do podwyższenia poziomu HIF-1α oraz apoptozy adipocytów
Aby określić stan hipoksji in vivo w TK, analizuje się myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 6 tygodni po usunięciu Fra-2 w wieku 12 tygodni i porównuje z osobnikami dzikiego typu z tej samej miotki. Pimonidazol podaje się myszom dootrzewnowo jako skuteczny wskaźnik hipoksji; jest nietoksyczny i może dyfundować do TK. Hipoksyjne adipocyty w TK in vivo identyfikuje się za pomocą immunohistochemicznego barwienia przeciwciałami (Rycina 7a). Ponadto zwiększony stan hipoksji w TK u myszy wiąże się ze wzrostem liczby adipocytów dodatnich dla HIF-1α, co wskazano na podstawie barwienia immunohistochemicznego (Rycina 7b), a potwierdzono przez ilościowe oznaczenie poziomu ekspresji HIF-1α oraz jego genów docelowych9. Dodatkowo barwienie TUNEL przekrojów TK od myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT oraz kontrolnych osobników z miotki (Rycina 7c) wykazuje, że zwiększona apoptoza adipocytów koreluje z obecnością hipoksji i ekspresją HIF-1α.
Zwiększona ekspresja HIF-1α w adipocytach pierwotnych poprzez indukowaną hipoksją apoptozę adipocytów
Aby przeanalizować apoptozę adipocytów in vitro, wykorzystujemy adipocyty wytworzone z podskórnych płytek tłuszczowych, jak opisano wcześniej20. Zgodnie z oczekiwaniami, ekspresja HIF-1α w adipocytach wzrasta po 24 godzinach hipoksji (Ryc. 8a). Aby dalej przeanalizować aktywność HIF-1α, poziomy RNA genów docelowych HIF, takich jak Inos (indukowalna syntaza tlenku azotu), są ilościowo oznaczane metodą qPCR. Ryc. 8b pokazuje, że zwiększone stężenie HIF-1α w warunkach hipoksji prowadzi do podwyższonego poziomu mRNA Inos. Ponieważ wcześniej wykazaliśmy in vivo (Ryc. 8), że zwiększona ekspresja HIF-1α w adipocytach koreluje ze zwiększoną apoptozą adipocytów, apoptozę ilościowo oznacza się również w kulturach in vitro za pomocą barwienia Annexiną V w warunkach hipoksji. Zgodnie z danymi in vivo (Ryc. 7), zwiększony poziom HIF-1α towarzyszy zwiększonej apoptozie adipocytów wywołanej warunkami hipoksjowymi (Ryc. 8b). Ponadto, aby udowodnić, że indukowana hipoksją apoptoza zależy od HIF, HIF-1α lub HIF-2α są wyciszane za pomocą interferencji RNA w adipocytach pochodzących od myszy typu dzikiego lub pozbawionych Fra-2. Zwiększona apoptoza adipocytów jest przywracana poprzez wyciszenie HIF-1α lub HIF-2α, co pokazano metodą barwienia Annexiną V na Ryc. 8b, co dowodzi, że czujnik hipoksji HIF-α reguluje apoptozę adipocytów.
<img alt="Histologia adipocytów i analiza ich wielkości; obrazy mikroskopowe z wykresami porównującymi wpływ dieety o standardowym zawartości tłuszczu (ND) i dieety bogatotłuszczowej (HFD)" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Zwiększony rozmiar i powierzchnia adipocytów u myszy odżywianych dietą bogatotłuszczową (HFD). (a, b) H&amp;Barwienie E przekrojów tkanki tłuszczowej otaczającej jądra u samców myszy typu dzikiego odżywianych dietą standardową (ND) (a) lub diecie bogatej w tłuszcze (HFD) (b) przez 6 tygodni. Słupki reprezentują 500 μm. (c, d) Pomiar wielkości adipocytów (c) oraz powierzchnia (d) z tkanki tłuszczowej otaczającej jajniki u myszy typu dzikiego odżywianych standardową dietą (ND)a) lub dieta o wysokiej zawartości tłuszczu (HFDb) przez 6 tygodni. n = 10. Dane przedstawiono jako średnie wartości ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t Studenta t-test. ***p &lt;0.0001.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy przedstawiające działanie niedotlenienia, HIF1α i testu TUNEL pokazujące efekty Fra-2 ΔAdip; mikroskopia w powiększeniach 20x, 40x." src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Zwiększony poziom HIF-1α oraz apoptoza w adipocytach dorosłych myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT. Barwienie na niedotlenienie (a) oraz HIF-1α (b) w TK samców myszy Fra-2fl/fl Fabp4-creERT i samców z grupy kontrolnej 6 tygodni po wstrzyknięciu tamoksyfenu. Powiększenie 20X, wstawka 40X. Czarne strzałki wskazują obszary niedotlenienia oraz komórki dodatnie dla HIF-1α. (c) Barwienie TUNEL w TK myszy Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT i ich kontrolnych towarzyszy 6 tygodni po wstrzyknięciu tamoksyfenu. Powiększenie 20X, wstawka 40X. Czarne strzałki wskazują komórki dodatnie w teście TUNEL. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Luther et al. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe ekspresji Hif1α i Inos; wyniki testu apoptozy Annexin V, zmienność stężenia tlenu." src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rycina 8: Zwiększona ekspresja HIF-1α i apoptoza adipocytów w pierwotnych adipocytach wywołana hipoksją. (a) Analiza metodą PCR w czasie rzeczywistym poziomów mRNA HIF-1α oraz mRNA INOS, genu docelowego HIF, w pierwotnych adipocytach umieszczonych w komorach hipoksyjnych, analizowanych w wskazanych punktach czasowych.b) Identyfikacja ilościowa apoptozy metodą barwienia Annexiną V z zastosowaniem cytometrii przepływowej w pierwotnych adipocytach wyizolowanych z Fra-2fl/fl Myszy Fabp4-CreERT lub kontrolnych typu dzikiego transfekowanych plazmidem kontrolnym sh lub plazmidem sh skierowanym przeciw HIF-1α lub HIF-2α umieszczono w warunkach hipoksji (1% O₂)2) przez 24 godz. Obraz zmodyfikowano w stosunku do Luther i inni 9. Dane przedstawiono jako wartości średnie ± odchylenie standardowe (SD). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t Studenta t-test. *P &lt;0,05 i **P &lt;0,01 uznano za istotne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tkanka tłuszczowa (AT) może wpływać na homeostazę całego organizmu, dlatego zrozumienie molekularnych mechanizmów różnicowania i funkcji adipocytów jest ważne. Udostępniamy protokół uzyskiwania nowych informacji na temat tych procesów poprzez analizę homeostazy, różnicowania i ekspozycji na niedotlenienie adipocytów jako modelu indukowanej apoptozy adipocytów.

Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Ogólnym celem tych eksperymentów jest analiza homeostazy i różnicowania adipocytów oraz zbadanie mechanizmów hipoksji i apoptozy adipocytów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie metaboliki, takie jak otyłość i cukrzyca typu II. Główną zaletą tych technik jest to, że są to podstawowe i niedrogie procedury służące do analizy biologii adipocytów w konkretnym modelu badań.Nicole Hannemann, doktorantka z mojego laboratorium, zaprezentuje opisane procedury. Aby ilościowo ocenić niedotlenienie in vivo, należy najpierw określić masę ciała myszy. Następnie należy wstrzyknąć dojamieniowo 60 mg na kg masy ciała pimonizolu w formie roztworu.Po 45 minutach unieruchom kończyny zwierzęcia i otwórz jamę otrzewną. Pobierz z jamy lewy i prawy tłuszcz okołojajowodowy/okołojądrowy, a następnie usuń z nich tkankę gonad. Następnie zważ tkankę, aby wyznaczyć stosunek masy tłuszczu okołogonadalnego do masy ciała w gramach.Aby przeprowadzić analizę histologiczną homeostazy adipocytów, najpierw odparafinizować przekroje tkanki tłuszczowej, płukając je trzykrotnie przez 5 minut w ksylenie, a następnie poddać dwukrotnej rehydratacji przez 2 minuty w 100% etanolu i dwukrotnej rehydratacji przez 2 minuty w 96% etanolu. Następnie płukać przekroje w wodzie destylowanej przez 5 minut i barwić hematoksyliną przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płukać przekroje w wodzie przez kolejne 5 minut, a następnie barwić roztworem eozyny przez 30 sekund.Umyj preparaty zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie odwodnij preparaty w 96% etanolu oraz 100% etanolu, po dwa razy przez dwie minuty w każdym roztworze. Następnie przeprowadź trzy pięciominutowe inkubacje w ksylenie.Następnie zamontuj skrawki za pomocą bezwodnego medium montażowego. W przypadku analizy immunohistochemicznej tkanek, odparafinuj skrawki w sposób przedstawiony powyżej, a następnie przeprowadź 30-minutową trawienie roztworem roboczym proteinazy K w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu trawienia wypłucz tkanki w PBS i zablokuj endogenną peroksydazę za pomocą 3% nadtlenku wodoru w PBS przez 10 minut.Po dwóch kolejnych pięciominutowych przemyciach w PBS należy zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał, stosując 10% serum w PBS. Następnie tkanki oraz odpowiednie przeciwciała należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przekroje należy przepłukać, wykonując trzy pięciominutowe przemycia w PBS.Następnie inkubuj tkanki z odpowiednimi biotyn glowanymi przeciwciałami wtórnymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. W ciągu ostatnich 30 minut okresu znakowania przeciwciałami wtórnymi doprowadź do równowagi 50 µL roztworu awidyny z 50 µL biotynlowanej peroksydazy H na każdy przekrój przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj przekroje dwukrotnie po pięć minut każdy w PBS i potraktuj tkanki 100 µL kompleksu ABC awidyna-biotyna w temperaturze pokojowej.Po 45 minutach przemyj przekroje dwukrotnie w PBS i inkubuj tkanki w roztworze substratu peroksydazy, aż barwienie osiągnie odpowiedni poziom intensywności. Następnie przemyj przekroje przez pięć minut wodą destylowaną i przeprowadź przeciwbarwienie komórek hematoksyliną przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po przeciwbarwieniu ponownie przemyj tkanki w wodzie.Następnie odwodnij przekroje i użyj bezwodnego medium montażowego do zamknięcia próbek pod szkiełkami przykrywnymi. Przekroje można następnie ocenić pod mikroskopem w świetle przechodzącym. Rozpocznij od oddzielenia skóry dorosłego samca myszy z górnej części nogi, lędźwi i boku, przypinając skórę w miarę jej usuwania.Następnie pobierz tylną podskórną tkankę tłuszczową otaczającą węzły chłonne pachwinowe, zlokalizowane u podstawy tylnych kończyn, w celu hodowli adipocytów. Aby przeanalizować różnicowanie adipogenne, umieść hodowlę zróżnicowanych komórek tłuszczowych pod dygestorium i delikatnie przemyj komórki PBS. Następnie utrwal komórki w 2 mL 10% formaliny przez 60 minut.Po zakończeniu fiksacji przemyć komórki wodą, a następnie potraktować kulturę dwoma mililitrami 60% izopropanolu przez pięć minut, a następnie dwoma mililitrami roztworu roboczego Oil Red O. Po pięciu minutach płukać komórki wodą z kranu, aż woda stanie się czysta. Następnie przeprowadzić przeciwbarwienie komórek hematoksyliną, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Komórki można następnie ocenić pod mikroskopem fazowo-kontrastowym przy 100-krotnym powiększeniu. Lipidy adipocytów będą miały kolor czerwony, a jądra komórkowe kolor niebieski. Tutaj przedstawiono przekroje tkanki tłuszczowej myszy karmionych normalną oraz wysokotłuszczową dietą.Kwantyfikacja rozmiaru i powierzchni adipocytów wyraźnie wykazuje hipertrofię adipocytów po sześciu tygodniach diety wysokotłuszczowej, co potwierdza zwiększony rozmiar adipocytów u zwierząt poddanych działaniu diety wysokotłuszczowej. U myszy traktowanych markerem hipoksji pimonidzolem zwiększony stan hipoksji tkanki tłuszczowej towarzyszy wzrostowi liczby adipocytów wykazujących pozytywny wynik dla HIF1 alpha. Ponadto barwienie metodą TUNEL przekrojów tkanki tłuszczowej od myszy z knock-outem oraz kontrolnych rodzeństwa wykazuje, że wzrost apoptozy adipocytów koreluje z obecnością hipoksji oraz ekspresją czynnika indukowanego hipoksją 1 alpha.Zgodnie z oczekiwaniami ekspresja Hif1a w adipocytach wzrasta po 24 godzinach hipoksji. Co więcej, ilościowe oznaczenie genów docelowych Hif metodą QPCR wskazuje, że zwiększona ekspresja Hif1a w warunkach hipoksji prowadzi do wzrostu ekspresji mRNA Inos. Jednak wyciszenie Hif1 lub 2 alpha za pomocą interferencji RNA chroni adipocyty przed apoptozą w warunkach hipoksji, co potwierdza regulacyjną rolę Hif alpha jako sensora hipoksji w procesie apoptozy adipocytów.Po przeprowadzeniu tych procedur można wykonać wszelkie analizy, takie jak pomiar poziomu glukozy i insulinooporności, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian metabolicznych i dysfunkcji adipocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić analizę histologiczną apoptozy adipocytów oraz badania hipoksji.

mechanism-regulation-adipocyte-numbers-adult-organisms-through

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Pierwotne białe preadipocyty wyizolowane z białych tkanek tłuszczowych u myszy mogą być różnicowane na komórki beżowe/brite. Przedstawiono niezawodny system modelu komórkowego do badania molekularnej regulacji "brązowienia" białego tłuszczu.

Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Hodowla agregatów dojrzałych adipocytów błonowych (MAAC) to nowa metoda hodowli dojrzałych ludzkich adipocytów. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wyizolować adipocyty z ludzkiej tkanki tłuszczowej i jak skonfigurować MAAC.

Izolacja i hodowla dojrzałych adipocytów ludzkich przy użyciu błonowych dojrzałych kultur zagregowanych adipocytów (MAAC)

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

Protokół pozwala na generowanie czystej populacji adipocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Kwas retinowy służy do różnicowania iPSC w mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), które są wykorzystywane do produkcji adipocytów. Następnie stosuje się podejście sortowania oparte na barwieniu czerwienią nilową w celu uzyskania czystych adipocytów.

Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

Ten protokół opisuje izolację preadipocytów myszy z podskórnego tłuszczu, ich różnicowanie na dojrzałe adipocyty oraz indukcję insulinooporności. Działanie insuliny ocenia się na podstawie fosforylacji/aktywacji członków szlaku sygnałowego insuliny przez western blot. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie insulinooporności/wrażliwości w adipocytach pierwotnych.

Zróżnicowane adipocyty myszy w hodowli pierwotnej: model insulinooporności

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Odkryj mechanizmy homeostazy i różnicowania adipocytów oraz wpływ hipoksji na apoptozę w tkance tłuszczowej myszy. Metoda umożliwia badanie biologii adipocytów w modelach metabolicznych.

Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Przeglądaj więcej filmów