Name: Izolacja i kaniulacja tętniczek miąższowych mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Naucz się izolować i kaniulować tętniczki miąższowe mózgu myszy do badań funkcji naczyniowej metodą miografii ciśnieniowej. Technika umożliwia badanie odpowiedzi naczyń na zmiany ciśnienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ufundowane przez NHLBI R01HL091905 (SE), grant badawczy CADASIL (FD) United Leukodystrophy Foundation (FD) oraz AHA 15POST247200 (PWP). Autorzy pragną podziękować Samancie P. Ahchay za udostępnienie obrazu na rysunku 1 oraz dr Gerry'emu Herrerze, Ph.D., za dostarczenie krytycznych komentarzy do manuskryptu.

1. Przygotowanie kaniuli i komory
<ol>
	<li>Włożyć czyste kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna: 1,2 mm; średnica wewnętrzna: 0,69 mm; długość 10 mm) w rowki ściągacza do pipet z filamentem platynowym (średnica: 100 μm).</li>
	<li>Korzystając z odpowiednich ustawień, pociągnij kapilarę, aby wygenerować kaniulę z długą i cienką końcówką (Rysunek 2) za pomocą ściągacza do mikropipet. Używane ustawienia to: Ciepło - 700, Ciąg - 100, Prędkość - 50, Czas - 10.</li>
	<li>Włóż kaniulę do uchwytu komory miografu ciśnieniowego. Odpowiednio wyrównaj kaniule.</li>
	<li>Ostrożnie odłamać końcówki kaniul za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym do żądanej średnicy. Tutaj pokazujemy kaniulę z końcówką 10 μm (ryc. 2).</li>
	<li>Napełnij obie kaniule sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) zawierającym 1,8 mM Ca2+; napełnij komorę aCSF wolnym od Ca2+ uzupełnionym 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) + 10 μM Diltiazem (wszystkie roztwory powinny być przygotowane świeże przed rozpoczęciem eksperymentu). W zależności od wielkości komory należy zmieniać objętość płynu mózgowo-rdzeniowego w zakresie od 5 do 20 ml. Przechowywać komorę w temperaturze 4 oC do momentu przygotowania do rozpoczęcia kaniulacji. 
	UWAGA: Diltiazem jest odwracalnym inhibitorem wapnia bramkowanym napięciem typu L, który powoduje rozszerzenie tętniczek, co ułatwia kaniulację</li>
</ol>
2. Izolacja tętniczek miąższowych
<ol>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji bezpośrednio przed sekcją przy użyciu standardowych protokołów w laboratorium, które są zatwierdzone przez komitet ds. opieki nad zwierzętami instytucji. Preferowane jest stosowanie barbituranów lub dwutlenku węgla, ponieważ inne powszechnie stosowane środki znieczulające mogą mieć działanie rozszerzające naczynia krwionośne w krążeniu mózgowym 15. Wszystkie przedstawione tutaj procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt z University of Nevada School of Medicine i są zgodne z "Zasadami przewodnimi w opiece nad zwierzętami i ich wykorzystywaniu" przez National Institutes of Health.</li>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji za pomocą dwutlenku węgla. Przed dekapitacją upewnij się, że zwierzę przestało oddychać i nie reaguje na szczypanie łap.</li>
	<li>Odetnij głowę zwierzęciu za pomocą ostrych nożyczek (mysz) lub gilotyny (szczur). Usuń skórę z głowy zwierzęcia i przetnij wzdłuż szwu czaszkowego w linii środkowej za pomocą nożyczek z cienką końcówką. Za pomocą kleszczy (myszy) lub szczypiec do kości ostrożnie usuń kości czaszki i odsłoń mózg. Usuwaj mózg powoli i ostrożnie, aby nie uszkodzić tętnic powierzchniowych. Umieść mózg w pojemniku wypełnionym 20 ml aCSF wolnego odCa2+ uzupełnionego 1% BSA na lodzie.</li>
	<li>Napełnij naczynie preparacyjne zawierające podkładkę lodowatym aCSF wolnym od Ca2 + uzupełnionym 1% BSA i przenieś mózg z powierzchnią brzuszną skierowaną do góry do tej płytki (ryc. 2A). Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 3A). Przypnij mózg do podkładki za pomocą igieł o rozmiarze 27. Uważaj, aby nie umieszczać szpilek w pobliżu tętnicy środkowej mózgu (MCA).</li>
	<li>Zlokalizuj Krąg Willisa i odgałęziający się od niego MCA. Używając ostrych i wyrównanych nożyczek sprężynowych Vannas, wytnij mały prostokąt wokół MCA. Upewnij się, że prostokąt ma średnicę bliską 5 mm na całej długości MCA. Górna część prostokąta powinna znajdować się za punktem rozgałęzienia od Koła Willisa (proksymalnie do Koła Willisa, Rysunek 2B, strzałka).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas wykonaj podcięcie w głąb tkanki na około 2 - 3 mm. 
	UWAGA: Ta część ma kluczowe znaczenie dla dobrej izolacji tętniczek miąższowych i może wymagać kilku prób, aby uzyskać ją prawidłowo. Jeśli nacięcie zostanie wykonane wystarczająco głęboko, izolowane tętniczki miąższowe będą krótkie; Jeśli nacięcie jest zbyt głębokie, tętniczki pękną w miejscu rozgałęzienia po usunięciu wypreparowanej tkanki.</li>
	<li>Przygwoźdź najbardziej dystalny koniec mózgu do naczynia preparacyjnego z MCA skierowanym do góry (dystalnie od Kręgu Willisa) za pomocą szpilek do owadów. Wykonaj płytkie nacięcie, aby przeciąć pia w pobliżu szpilki, uważając, aby nie wciąć się zbyt głęboko w leżącą poniżej korę mózgową (w przeciwnym razie szpilki nie wytrzymają).</li>
	<li>Ostrożnie chwyć każdą stronę pia małymi kleszczami i zacznij obierać pia z kory. W razie potrzeby przytrzymaj MCA, upewniając się, że otaczająca membrana pial nie jest uszkodzona.</li>
	<li>Kontynuuj obieranie, aż pia zawierająca MCA zostanie wolna od kory. Zwróć uwagę, że odporność na łuszczenie się wzrośnie w pobliżu Circle the Willis. Zachowaj szczególną ostrożność w tym momencie, ponieważ dłuższe tętniczki miąższowe będą znajdować się w tym regionie.</li>
	<li>Gdy pia jest wolna, umieść ją ostrożnie na wierzchu podkładki na naczyniu preparacyjnym powierzchnią przeciwną do tętniczek miąższowych skierowanych w dół (ryc. 2B).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas wytnij wycięte tętniczki z MCA, upewniając się, że końce naczynia są tępo przycięte.</li>
	<li>Pobrane tętniczki można wykorzystać do miografii ciśnieniowej, analizy molekularnej lub izolacji natywnych komórek mięśni gładkich lub śródbłonka.</li>
</ol>
3. Miografia ciśnieniowa
<ol>
	<li>Przygotuj szew z wyprzedzeniem. Pokrój ciemnozieloną nylonową nić na kawałki o średnicy 5 mm i umieść po lepkiej stronie dwustronnej taśmy na szalce Petriego. Pod mikroskopem preparacyjnym rozdziel każdy kawałek na włókna za pomocą drobnych kleszczy i luźno przygotuj prosty węzeł półzaczepiający, przekładając jeden koniec włókna na drugi.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zerwij węzeł z taśmy dwustronnej, uważając, aby nie chwycić go ze zbyt dużym naciskiem. Przeciągnij szew do roztworu do kąpieli, wsuń węzeł na kaniulę i zaciśnij go w pewnej odległości od końcówki kaniuli. Powtórz ten proces, aby mieć 2 szwy na każdej kaniuli.</li>
	<li>Pokryj szklaną mikropipetę 10% roztworem BSA, a następnie spłucz nadmiar aCSF wolnym odCa2+ uzupełnionym 1% BSA.</li>
	<li>Pobrać 50 μl roztworu do szklanej mikropipety, wyciągnąć tętniczkę miąższową i przenieść do komory mięsnoskórnej ciśnieniowej. Wcisnąć tłok jednym ruchem płynu, aby dozować tętniczkę miąższową do komory, aby zapobiec jej przywieraniu do wewnętrznej komory szklanej mikropipety.</li>
	<li>Używając dwóch bardzo cienkich kleszczy, otwórz światło PA, uważając, aby dotknąć tylko samego końca naczynia.</li>
	<li>Używając kleszczyków do przytrzymania krawędzi tętniczki miąższowej, ostrożnie pociągnij naczynie na kaniulę. Pociągnij kaniulę na tyle głęboko, aby naczynie nie znajdowało się na bardzo zwężającym się końcu kaniuli (ryc. 3A).</li>
	<li>Poluzuj 2 szwy na kaniuli i zaciśnij je na naczyniu (ryc. 3B). Rozsuń nieco szwy na naczyniu i pociągnij w kierunku operatora, jednocześnie je zaciskając. Upewnij się, że wszystkie gałęzie są związane przed zamknięciem przeciwległego końca tętniczki miąższowej.</li>
	<li>Odwróć komorę i zamknij przeciwległy koniec tętniczki miąższowej jako ślepy worek. Aby to osiągnąć, otwórz opaski na przeciwległej kaniuli i przełóż ją do tętniczki. Powoli zamknij węzeł w taki sposób, aby tętniczka miąższowa była przywiązana do boku kaniuli. Unikaj podłużnego rozciągania tętniczki. (Rysunek 3C). 
	UWAGA: Jeśli celem badania jest perfuzja leków przez światło, należy kantonować przeciwległy koniec, zamiast wiązać tętniczkę miąższową z boku kaniuli. Upewnij się, że kaniule nie mają żadnych kryształów soli ani wewnętrznych nagromadzeń, które blokują przepływ wewnątrzświetlny. Odpowiednio wyreguluj natężenie przepływu, aby utrzymać naprężenia ścinające na poziomie fizjologicznym. Badanie przeprowadzone przez Shih i wsp. pokazuje natężenie przepływu wewnątrz przenikających tętniczek u szczurów 8 i może służyć jako wstępny przewodnik dla badań pilotażowych.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś komorę na stolik mikroskopu, który ma być używany do rejestrowania średnicy naczynia. Przymocuj komorę do stolika mikroskopu, łącząc sondę temperatury oraz wlot i wylot perfuzji z odpowiednimi probówkami. Zwiększyć ciśnienie w tętniczce do 40 mmHg ciśnienia śródświetlnego w przypadku tętniczek miąższowych myszy lub 50 mmHg w przypadku tętniczek szczurów, korzystając z systemu ciśnieniowego dostępnego w laboratorium (słup wody, pompa perystaltyczna sprzężona z przetwornikiem ciśnienia itp.). Rysunek 4D przedstawia przykład pompy perystaltycznej sprzężonej z przetwornikiem ciśnienia w celu zwiększenia ciśnienia w tętniczce kaniulowanej.</li>
	<li>Włącz system używany do wykrywania zmian średnicy (Rysunek 3E). Dostosuj ustawienia mikroskopu, takie jak oświetlenie i kontrast, aby uzyskać najlepszą możliwą detekcję. Idealnie, ściany tętniczki powinny być ciemne, a światło półprzezroczyste. Gdy wykrycie będzie odpowiednie, rozpocznij nagrywanie eksperymentu.</li>
	<li>Uruchomić system superfuzji. Płucz kaniulowaną tętniczkę miąższową pod ciśnieniem ciepłym (37 oC) aCSF zawierającym 1,8 mM Ca2+ przez 15 do 20 minut przy natężeniu przepływu między 3 - 5 ml/min. Niniejszy aCSF nie powinien zawierać leku Diltiazem ani BSA.</li>
	<li>Zastąp zwykły aCSF 60 mM KCl aCSF w celu oceny żywotności preparatu. W tym momencie PA powinny wykazywać 10 - 20% zwężenie do 60 mM KCl. Jeśli tętniczka nie zwęża się w tym stopniu, usuń i kaniuluj inną tętniczkę.</li>
	<li>Umyj 60 mM KCl zwykłym aCSF. Poczekaj na wytworzenie spontanicznego tonu miogennego, co może potrwać do jednej godziny. Jeśli do tego czasu tętniczka nie będzie miała tonu miogennego, zastąp ją inną tętniczką. 
	UWAGA: Ton miogenny obserwuje się jako stopniowe, a czasem powolne, zmniejszanie średnicy światła naczynia bez stymulacji przez agonistów kurczliwych lub roztwór o wysokiej zawartości KCl. Ton miogenny oblicza się według następującego wzoru: (1 - (aktywna średnica światła/pasywna średnica światła)) x 100 5. Odpowiednia ilość tonu miogennego może się różnić w zależności od zabiegów, szczepów, gatunków, transgeników itp. Ogólnie rzecz biorąc, fizjologiczny ton miogenny waha się od 15 do 30%5.</li>
</ol>
4. Przykładowe eksperymenty z miografią ciśnieniową: zwężenie wywołane przez agonistę i reaktywność miogenna
<ol>
	<li>Przygotować serię rozcieńczeń wybranego agonisty w aCSF, stosując odpowiednie stężenia. W niniejszym przykładzie zastosowano agonistę receptora tromboksanu A2 U46619. Przygotowano roztwór podstawowy 1 ml U46619 o stężeniu 1 mM. Przenieść 100 μl roztworu 1 mM do nowej probówki zawierającej 900 μl aCSF, aby wykonać 10-krotne rozcieńczenie leku, otrzymując roztwór zawierający 100 μM U46619. Powtórzyć ten proces dla 6 rozcieńczeń, w zakresie od 1 mM do 100 nM, aby przygotować krzywą zwężacza stężenie-odpowiedź.</li>
	<li>Dodać całą objętość roztworu zawierającego agonistę (1 ml dla pierwszej dawki, a następnie 900 μl wszystkich kolejnych dawek) do 100 ml superfuzji aCSF. Doprowadzi to do dodatkowego 100-krotnego rozcieńczenia agonisty. Tak więc końcowe stężenia agonisty w kąpieli wahają się od 10 pM do 10 μM. Pozwól tętniczkom inkubować przez ~10 minut w każdym stężeniu, aż średnica światła osiągnie stan ustalony.</li>
	<li>Wypłucz agonistę przez superfuzję PA z aCSF bez żadnych leków, aż średnica PA powróci do pierwotnej wartości. Inkubować tętniczkę miąższową w aCSF wolnym od Ca2+ (bez BSA) uzupełnionym 10 μM Diltiazem + 2 mM EGTA w celu wywołania maksymalnego poszerzenia i zarejestrowania biernej średnicy tętniczki.</li>
	<li>Wyjmij tętniczkę miąższową z kaniuli, ostrożnie ją wyciągając, trzymając za koniec opasek. Umyj komorę naczynia podwójnie dejonizowaną wodą, aby usunąć zanieczyszczenia i nadmiar agonisty. Wypełnij komorę wolnym od Ca2+ aCSF + BSA i kaniuluj kolejną tętniczkę. Nie zaleca się wykonywania więcej niż jednego eksperymentu na tętniczkę.</li>
	<li>Aby przeprowadzić eksperyment reaktywności miogennej, pozwól tętniczce miąższowej zrównoważyć się przy ciśnieniu śródświetlnym 40 mmHg, aż do wygenerowania spontanicznego tonu miogennego (opisanego powyżej). Zmniejsz ciśnienie śródświetlne do 5 mmHg i pozwól PA zrównoważyć się przez ~5 - 10 minut, aż średnica światła osiągnie stan ustalony. Ciśnienie śródświetlne zwiększaj stopniowo, korzystając z wybranego interwału (na przykład od 5 do 140 mmHg w krokach co 20 mmHg).</li>
	<li>Nie wystawiaj tętniczki na działanie ciśnienia śródświetlnego poniżej 5 mmHg, ponieważ może to spowodować zapadnięcie się i uszkodzenie śródbłonka, zmieniając w ten sposób wyniki eksperymentu.</li>
	<li>Na końcu krzywej ciśnienia przelej tętniczkę miąższową za pomocą Ca2+ wolnego od aCSF (bez BSA) uzupełnionego 10 μM Diltiazem + 2 mM EGTA i powtórz kroki ciśnienia, zaczynając od najniższego ciśnienia. 
	UWAGA: Spowoduje to uzyskanie średnic pasywnych PA, które są niezbędne do obliczenia % tonu miogenicznego, zdefiniowanego wzorem: % ton = (1 - (średnica czynna/średnica pasywna)) x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).</li>
<li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+regulation+in+the+normal+brain+and+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2%2C+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent%2C+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).</li>
<li>Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+myogenic+tone+and+structure+of+parenchymal+arterioles+by+hypertension+and+the+mineralocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).</li>
<li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K%2B+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).</li>
<li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries%3A+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).</li>
<li>Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+nerves+and+the+regulation+of+cerebrovascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone.</a> Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).</li>
<li>Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptors+regulate+myogenic+tone+in+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%2C+calcium+signaling%2C+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation. 20, 307-316 (2013).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circ Res. 110, 285-294 (2012).</li>
<li>You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+endothelial+P2+purinoceptors+in+the+cerebrovascular+tree+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat.</a> Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).</li>
<li>Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ketamine+on+isoflurane-+and+sevoflurane-induced+cerebral+vasodilation+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg+Anesthesiol%22%5BJournal%5D)">Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits.</a> J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).</li>
<li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arterial+lesions+underlying+lacunes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).</li>
<li>Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+changes+in+the+white+mater+in+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microvascular changes in the white mater in dementia.</a> J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).</li>
<li>Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+hypertension+on+the+cerebral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effects of hypertension on the cerebral circulation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).</li>
<li>Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+cortical+astrocytes+and+arterioles+during+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling.</a> Circ Res. 95, e73-e81 (2004).</li>
<li>Dacey, R. G. Jr, Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+rat+intracerebral+arterioles%3A+methods%2C+morphology%2C+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity.</a> Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).</li>
<li>Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+and+characterization+of+intracerebral+arterioles+in+the+C57%2FBL6+wild-type+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse.</a> J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).</li>
<li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+and+IKCa+Channels%2C+myogenic+tone%2C+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles%3A+effect+of+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40, 1451-1457 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tętniczki miąższowe mózgu to tętniczki o wysokim oporze z niewielką liczbą zespoleń i rozgałęzień, które przenikają różne populacje neuronów. Te wyspecjalizowane naczynia krwionośne odgrywają kluczową rolę w autoregulacji naczyń mózgowych i sprzężeniu nerwowo-naczyniowym poprzez rozszerzenie naczyń krwionośnych za pośrednictwem astrocytów 1. Znaczenie tych wyspecjalizowanych naczyń krwionośnych w chorobach naczyń mózgowych jest znane od około 50 lat, kiedy pionierska praca dr Millera Fishera opisała zmiany str...

Krążenie mózgowe jest wyjątkowo zorganizowane, aby wspierać zapotrzebowanie metaboliczne centralnych neuronów, komórek, które mają ograniczone zapasy energii i w związku z tym są bardzo wrażliwe na zmiany ciśnienia tlenu i dostarczania niezbędnych składników odżywczych. Ponieważ poszczególne subpopulacje neuronów stają się aktywne, gdy wykonywane są określone zadania, układ naczyniowy sprzyja wysoce zlokalizowanemu wzrostowi perfuzji, aby zapobiec miejscowemu niedotlenieniu i wyczerpaniu składników odżywczych 1. Jest to forma funkcjonalnej przekrwienia znana jako sprzężenie nerwowo-naczyniowe i zależy od prawidłowego działania jednostki nerwowo-naczyniowej, złożonej z aktywnych neuronów, astrocytów i tętnic mózgowych 2. Tętniczki miąższowe śródmózgowe, grupa naczyń krwionośnych obejmująca tętniczki miąższowe, penetrujące i przedkapilarne, mają kluczowe znaczenie dla tej odpowiedzi i dlatego bardzo ważne jest ich indywidualne badanie w celu zbadania sprzężenia nerwowo-naczyniowego 3.
Tętniczki miąższowe to małe (20 - 70 μm średnicy wewnętrznej) naczynia krwionośne o wysokim oporze, które łączą różne populacje neuronów w mózgu. Rozgałęziając się od tętnic pialnych na powierzchni, tętniczki miąższowe wnikają do miąższu mózgu pod kątem prawie 90o, aby zasilić mikrokrążenie podpowierzchniowe (ryc. 1). Tętniczki te odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu odpowiedniego ciśnienia perfuzji, ponieważ są najbardziej dystalnymi naczyniami zawierającymi mięśnie gładkie, chroniącymi naczynia włosowate. W przeciwieństwie do krążenia powierzchniowego, tętniczki miąższowe pozbawione są odgałęzień pobocznych i zespoleń, w związku z czym są "wąskimi gardłami" krążenia mózgowego 4. W rezultacie dysfunkcja tętniczek miąższowych przyczynia się do rozwoju chorób naczyń mózgowych, takich jak naczyniowe zaburzenia poznawcze i małe udary niedokrwienne (znane również jako udary ciche lub lakunarne). Badania wskazują, że dysfunkcja tętniczek miąższowych może być wywołana przez nadciśnienie samoistne5, przewlekły stres 6 i jest wczesnym zdarzeniem w genetycznym modelu myszy choroby małych naczyń 7. Co więcej, eksperymentalnie wywołana okluzja pojedynczych penetrujących tętniczek u szczurów jest wystarczająca, aby spowodować małe niedokrwienne udary o cylindrycznym kształcie, podobne do tych obserwowanych u starszych ludzi.
Oprócz tych anatomicznych rozróżnień, mechanizmy regulujące funkcję skurczu różnią się między tętniczkami pialnymi a miąższowymi. Miogenne zwężenie naczyń krwionośnych jest większe w tętniczkach miąższowych 9, prawdopodobnie z powodu braku unerwienia zewnętrznego 10, odrębnych trybów mechanotransdukcji 11 i różnic w wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2 + 12,13 w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Dowody sugerują, że zależne od śródbłonka mechanizmy rozszerzające naczynia krwionośne również różnią się między tymi segmentami naczyń, przy czym tętnice miąższowe wykazują większą zależność od mechanizmów obejmujących kanały K + aktywowane przez Ca2 + i komunikację elektrotoniczną w ścianie naczynia w porównaniu z czynnikami dyfuzyjnymi, takimi jak tlenek azotu i prostacykliny 14. W związku z tym dane zebrane w eksperymentach z wykorzystaniem tętnic mięśniowych niekoniecznie muszą dotyczyć tętniczek miąższowych, pozostawiając lukę w naszej wiedzy na temat miejscowej kontroli perfuzji mózgowej.
Pomimo ich znaczenia, tętniczki miąższowe są znacznie niedostatecznie zbadane, głównie ze względu na techniczne wyzwania związane z izolacją i montażem do badań ex vivo. W tym manuskrypcie opisujemy metodologię izolacji i kanniulacji tętniczek miąższowych mózgu, które można wykorzystać do miografii ciśnieniowej lub do izolacji tkanki do znakowania immunologicznego, elektrofizjologii, biologii molekularnej i analizy biochemicznej.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Izolacja/kaniulacja</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Super cienkie kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Narzędzia do nauki o szczegółach</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &mu; l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Sterylny filtr strzykawkowy VWR</td><td>Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Średnica zewnętrzna ze szkła borokrzemianowego: 1,2 mm, średnica wewnętrzna: 0,68 mm</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciemnozielone nylonowe systemy żywe z gwintem</td><td>Oprzyrządowanie</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Wyrównanie liniowe Systemy życia w pojedynczej komorze naczyniowej</td><td> Oprzyrządowanie</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Serwosterownik ciśnienia z pompą perystaltyczną</td><td>Oprzyrządowanie Living Systems</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Analizator wymiarów wideo</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Czterokanałowy rejestrator z oprogramowaniem do nagrywania i analizy LabScribe 3</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka grzewcza</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i kaniulacja tętniczek miąższowych mózgu

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Tętniczki miąższowe śródmózgowe (PA), które obejmują tętniczki miąższowe, tętniczki penetrujące i tętniczki przedkapilarne, są naczyniami krwionośnymi o wysokim stopniu oporu, rozgałęziającymi się od tętnic stawowych i tętniczek i zanurzających się w miąższu mózgu. Indywidualne PA perfundują dyskretne cylindryczne terytorium miąższu i zawartych w nim neuronów. Tętniczki te odgrywają kluczową rolę w regulacji przepływu krwi w mózgu, zarówno globalnie (autoregulacja naczyń mózgowych), jak i miejscowo (przekrwienie czynnościowe). PA są częścią jednostki nerwowo-naczyniowej, struktury, która dopasowuje regionalny przepływ krwi do aktywności metabolicznej w mózgu, a także obejmuje neurony, interneurony i astrocyty. Perfuzja przez PA jest bezpośrednio związana z aktywnością neuronów na tym konkretnym terytorium, a wzrost metabolizmu neuronalnego prowadzi do zwiększenia miejscowej perfuzji spowodowanej rozszerzeniem PA pokarmu. Regulacja PA różni się od regulacji lepiej scharakteryzowanych tętnic pialnych. Zwężenie naczyń krwionośnych wywołane ciśnieniem jest większe w PA, a mechanizmy rozszerzające naczynia krwionośne są różne. Ponadto PA nie otrzymują zewnętrznego unerwienia z nerwów okołonaczyniowych - unerwienie ma charakter wewnętrzny i pośredni poprzez kontakt z astrocytarnymi końcami. W związku z tym dane dotyczące regulacji skurczu zgromadzone w badaniach z wykorzystaniem tętnic palnych nie przekładają się bezpośrednio na zrozumienie funkcji PA. Ponadto nie wiadomo, w jaki sposób stany patologiczne, takie jak nadciśnienie i cukrzyca, wpływają na strukturę i reaktywność PA. Ta luka w wiedzy jest częściowo konsekwencją trudności technicznych związanych z izolacją i kaniulacją PA. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono protokół izolacji i kaniulacji PA gryzoni. Ponadto pokazujemy przykłady eksperymentów, które można przeprowadzić z tymi tętniczkami, w tym zwężenie wywołane przez agonistów i reaktywność miogenną. Chociaż ten manuskrypt koncentruje się na kaniulacji PA i miografii ciśnieniowej, izolowane PA mogą być również wykorzystywane do badań biochemicznych, biofizycznych, molekularnych i obrazowych.

Rysunek 5A przedstawia reprezentatywny skurcz mysich PA w odpowiedzi na 60 mM KCl aCSF w celu oceny integralności preparatu. PA powinny ulec skurczowi o 15 - 30% w obecności 60 mM KCl. Jeśli skurcz jest mniejszy niż 15%, należy odrzucić PA i kaniulować kolejną, ponieważ sugeruje to uszkodzenie tętniczki podczas procesu izolacji i kaniulacji.
Rysunek 5B przedstawia skurcz PA pod wpływem zwiększaj...

Ten manuskrypt opisuje prosty i powtarzalny protokół izolacji tętniczek śródmózgowych (grupa naczyń krwionośnych obejmujących tętniczki miąższowe, tętniczki penetrujące i tętniczki przedkapilarne) od myszy, do wykorzystania w miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badaniach molekularnych.

Izolacja i kaniulacja tętniczek miąższowych mózgu

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i montaż tętniczek mózgowych do badań nad funkcją i strukturą naczyniową z wykorzystaniem myografii ciśnieniowej. Metodę tę można zastosować w celu uzyskania odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań naczyniowych mózgu, takie jak sposób, w jaki mikrokrążenie mózgowe szybko adaptuje się do zmian ciśnienia w świetle naczynia lub zapotrzebowania na składniki odżywcze, a także w warunkach patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wywierania ciśnienia na tętniczkę poprzez zastosowanie ciśnienia wewnątrzświatłowego, które jest istotnym fizjologicznym determinantem funkcji naczyniowej.Aby rozpocząć, należy użyć wyciągacza do mikropipet z odpowiednimi ustawieniami, takimi jak te wymienione tutaj, w celu wyciągnięcia kapilar i utworzenia kaniul. Po włożeniu kaniuli do uchwytu komory miografu i jej wyrównaniu pod mikroskopem stereoskopowym, należy użyć pęsety, aby ostrożnie odłamać końcówkę do pożątej średnicy, np. 10 µm, jak pokazano tutaj. Obie kaniule należy napełnić płynem mózgowo-rdzeniowym lub aCSF zawierającym 1,8 mM wapnia, a komorę wypełnić od 5 do 20 mL aCSF wolnego od wapnia, uzupełnionego o 1% BSA i 10 µM dilti

isolation-and-cannulation-of-cerebral-parenchymal-arterioles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Rennert, R. C., et al. Kompleksowe wewnątrznaczyniowe i otwarte leczenie chirurgiczne malformacji tętniczo-żylnych mózgu.  J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje otwartą chirurgiczną resekcję malformacji tętniczo-żylnej mózgu (AVM) w ludzkim mózgu. Procedura polega na utworzeniu płata kostnego, uzyskaniu dostępu do przestrzeni podpajęczynówkowej, zidentyfikowaniu i zamknięciu tętnic zasilających i drenowaniu żył oraz ostrożnym usunięciu AVM. Angiografia śródoperacyjna potwierdza...

Otwarta resekcja chirurgiczna malformacji tętniczo-żylnych mózgu

Ten film demonstruje metodę izolowania przewodów śródbłonkowych od miąższu mózgu myszy. Dzięki połączeniu trawienia enzymatycznego i dysocjacji mechanicznej, proces ten daje nienaruszoną rurkę z komórkami śródbłonka.

Przygotowanie śródbłonka mózgowego z tętniczek miąższowych myszy

Źródło: Larpthaveesarp, A., et. al. Przemijający model niedrożności tętnicy środkowej mózgu udaru noworodka u szczurów P10. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje ustanowienie modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczeniaka szczura. Tętnica szyjna wewnętrzna (ICA) jest odsłonięta, a ligatura jest zabezpieczona, aby ograniczyć napływ krwi. Okluda jest wprowadzana przez ICA, aby dotrzeć do tętnicy środkowej mózgu. Szczenię może następnie dojść do siebie przed dalszą analizą.

Generowanie niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczeniaka szczura w celu wywołania lokalnego niedokrwienia mózgu

Opisujemy wysoce powtarzalną metodę trwałego zamknięcia głównego naczynia krwionośnego mózgu gryzoni.  Technikę tę można osiągnąć przy bardzo niewielkim uszkodzeniu obwodowym, minimalnej utracie krwi, wysokim wskaźniku długoterminowego przeżycia i stałej objętości zawału współmiernej do populacji klinicznej ludzi.

Stała niedrożność naczynia mózgowego poprzez podwójne podwiązanie i przecięcie

Chirurgia jest złotym standardem dla dostępnych malformacji tętniczo-żylnych (AVM), a przedoperacyjna embolizacja może uprościć tę procedurę. Opisujemy nasze podejście do etapowej embolizacji wewnątrznaczyniowej i otwartej resekcji AVM oraz przedstawiamy reprezentatywny przykład kliniczny podkreślający zalety kompleksowo wyszkolonego chirurga nerwowo-naczyniowego kierującego multidyscyplinarnym zespołem klinicznym.

Kompleksowe wewnątrznaczyniowe i otwarte leczenie chirurgiczne malformacji tętniczo-żylnych mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje, jak izolować tętniczki i naczynia włosowate hipokampa od mózgu myszy oraz jak zwiększać w nich ciśnienie do miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badań molekularnych.

Przygotowanie tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa pod ciśnieniem do badania funkcjonalnego

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Ten protokół przedstawia przewodnik krok po kroku dla badaczy, jak przeprowadzić procedurę zamknięcia tętnicy środkowej mózgu na myszach przy użyciu zmodyfikowanej metody Longa tętnicy szyjnej zewnętrznej. Modyfikacje przedstawione w artykule mają na celu zwiększenie dokładności niedrożności tętnicy środkowej mózgu i zapewnienie pełnej reperfuzji.

Optymalizacja metody zamykania tętnic środkowych Longa w celu uzyskania pełnej reperfuzji

Naucz się izolować i kaniulować tętniczki miąższowe mózgu myszy do badań funkcji naczyniowej metodą miografii ciśnieniowej. Technika umożliwia badanie odpowiedzi naczyń na zmiany ciśnienia.

Izolacja i kaniulacja tętniczek miąższowych mózgu

Przeglądaj więcej filmów