Name: Selektywne pobieranie leukocytów płucnych z marginesem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Naucz się selektywnego pobierania leukocytów płucnych z marginesu szczurów i myszy metodą perfuzji wymuszonej. Technika ta umożliwia izolację komórek z kapilar płucnych w celu badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy i ta praca byli wspierani przez grant NIH/NCI # R01CA172138 (dla SBE).

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC) na Uniwersytecie w Tel Awiwie.
1. Protokół dla szczurów
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Ułóż 2 igły motylkowe 21 G. Opcjonalnie przygotuj 2 igły motylkowe o krawędziach 21 G, piłując ostrą krawędź igły.</li>
		<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne: 2 pary nożyczek, kleszcze o stępionych krawędziach, hemostat, kleszczyki do tkanek zębów sterylizowane w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w stanie grawitacyjnym (na sucho).</li>
		<li>Przygotować heparynizowany PBS (30 jednostek/ml), dodając 30 jednostek heparyny na ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS). Stosować w temperaturze RT. 35 ml to minimalna objętość potrzebna na zwierzę.</li>
		<li>Przesyłaj heparynizowany PBS do przewodów pompy perystaltycznej i igieł motylkowych, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja płuc i pobieranie leukocytów MP
	<ol>
		<li>Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Potwierdź eutanazję, monitorując ustanie oddychania.</li>
		<li>Po ustaniu oddychania należy natychmiast otworzyć jamę otrzewnej i klatkę piersiową za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy do tkanek zęba. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej wzdłuż brzucha aż do wyrostka mieczykowatego.</li>
		<li>Podnieś mostek za pomocą kleszczy, ostrożnie przecinając klatkę piersiową po obu stronach, nie nakłuwając żadnych narządów wewnętrznych ani dużych naczyń krwionośnych. Zaciśnij hemostat na mostku i rostralnie złóż klatkę piersiową, aby odsłonić kompleks krążeniowo-oddechowy.</li>
		<li>Wbić igłę motylkową do prawej komory serca i w ciągu około minuty zebrać maksymalną objętość krwi do strzykawki (~6 ml od zwierzęcia o wadze 250 g).</li>
		<li>Zacisnąć żyłę główną za pomocą hemostatu, aby uniknąć wstecznej perfuzji wątroby (patrz Dyskusja).</li>
		<li>Trzymać igłę motylkową w prawej komorze, jednocześnie zastępując strzykawkę zawierającą krew rurą odpływową pompy perystaltycznej.</li>
		<li>Wprowadzić drugą igłę motylkową połączoną ze strzykawką o pojemności 5 ml do pobierania do lewej komory, unikając penetracji przegrody międzykomorowej.</li>
		<li>Włączyć pompę perystaltyczną z prędkością około 5 ml/min i delikatnie zebrać do strzykawki pierwsze mililitry perfuzatu, które są zanieczyszczone krwią. Kontynuuj, aż kolor perfuzyjny zmieni się z ciemnego na bladoczerwony. (Wyrzuć zanieczyszczony krwią perfuzt).</li>
		<li>Nie przerywając pracy pompy perystaltycznej, należy szybko wymienić strzykawkę o pojemności 5 ml na strzykawkę do pobierania o pojemności 20 ml i pobrać 20 ml perfuzatu płucnego, stosując większą prędkość perfuzji (do 7 ml/min). Należy stale monitorować przepływ perfuzatu do strzykawki zbierającej, unikając przy tym powstawania podciśnienia.</li>
		<li>Zatrzymaj przepływ pompy perystaltycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja leukocytów
	<ol>
		<li>Odwirować perfuzat przez 10 minut przy 400 × g.</li>
		<li>Odessać płyn.</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS lub pożywki, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać płyn. Powtórz ten krok dwukrotnie. Użycie PBS lub pożywki zależy od późniejszego wykorzystania próbki.</li>
		<li>Dodać 20 ml PBS lub pożywki, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać płyn.</li>
		<li>Rozpuść komórki do pożądanego stężenia, w oparciu o użycie próbki (FACS, PCR itp.).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół myszy
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Ułóż 2 igły motylkowe 25 G. Opcjonalnie przygotuj 2 igły motylkowe o krawędziach 25 G, piłując ostrą krawędź igły.</li>
		<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne: 2 pary nożyczek, kleszcze o stępionych krawędziach, hemostat, kleszczyki do tkanek zębów sterylizowane w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w stanie grawitacyjnym (na sucho).</li>
		<li>Przygotować heparynizowany PBS (30 jednostek/ml), dodając 30 jednostek heparyny na ml 1x PBS roztworu. Stosować w temperaturze RT. 25 ml to minimalna objętość potrzebna na zwierzę.</li>
		<li>Przesyłaj heparynizowany PBS do przewodów pompy perystaltycznej i igieł motylkowych, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja płuc i pobieranie leukocytów MP
	<ol>
		<li>Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Potwierdź eutanazję, monitorując ustanie oddychania.</li>
		<li>Po ustaniu oddychania należy natychmiast otworzyć jamę otrzewnej i klatkę piersiową za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy do tkanek zęba. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej wzdłuż brzucha aż do wyrostka mieczykowatego.</li>
		<li>Podnieś mostek za pomocą kleszczy, ostrożnie przecinając klatkę piersiową po obu stronach, nie nakłuwając żadnych narządów wewnętrznych ani dużych naczyń krwionośnych. Zaciśnij hemostat na mostku i rostralnie złóż klatkę piersiową, aby odsłonić kompleks krążeniowo-oddechowy.</li>
		<li>Zacisnąć żyłę główną za pomocą hemostatu, aby uniknąć wstecznej perfuzji wątroby (patrz Dyskusja).</li>
		<li>Do prawej komory serca wprowadzić igłę motylkową podłączoną do rury odpływowej pompy perystaltycznej, a drugą igłę motylkową połączoną ze strzykawką o pojemności 2 ml do lewej komory serca, unikając penetracji przegrody międzykomorowej.</li>
		<li>Włączyć pompę do prędkości około 2 ml/min i zebrać pierwsze mililitry zanieczyszczonego krwią perfuzatu do strzykawki do pobierania do momentu, aż perfulat zmieni kolor z ciemnego na bladoczerwony (wyrzucić zanieczyszczony krwią perfut).</li>
		<li>Nie przerywając pracy pompy perystaltycznej, należy szybko zastąpić strzykawkę o pojemności 2 ml strzykawką do pobierania próbek o pojemności 10 ml i pobrać 10 ml perfuzatu płucnego, stosując większą prędkość perfuzji (do 4 ml/min). Należy stale monitorować przepływ perfuzatu do strzykawki zbierającej, unikając przy tym powstawania podciśnienia.</li>
		<li>Zatrzymaj przepływ pompy perystaltycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja leukocytów
	<ol>
		<li>Odwirować perfuzat przez 10 minut przy 400 × g.</li>
		<li>Odessać płyn.</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS lub pożywki, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać płyn. Powtórz ten krok trzy razy. Użycie PBS lub pożywki zależy od późniejszego wykorzystania próbki.</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS lub pożywki, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać płyn.</li>
		<li>Rozpuść komórki do pożądanego stężenia, w oparciu o użycie próbki (FACS, PCR itp.).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginated+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li>
<li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC%3A+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li>
<li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li>
<li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li>
<li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis%3A+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li>
<li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona w artykule metoda umożliwia selektywne zbieranie i badanie unikalnej populacji leukocytów MP. W porównaniu z leukocytami krążącymi lub śledzionowymi, populacja MP charakteryzuje się odrębnym składem subpopulacji leukocytów, wyższymi poziomami aktywacji, wyższym uwalnianiem różnych cytokin oraz wyższymi poziomami mRNA cytokin pro- i przeciwzapalnych2,3. W szczególności wykazaliśmy, że komórki MP-NK są bardziej cytotoksyczne niż krążące komórki NK w stosunku do różnych komórek docelowych3,4</s...

Leukocyty przylegające do naczyń włosowatych płuc (tj. leukocyty z marginesem płucnym (MP))1 wykazały wyraźny skład leukocytów i unikalną aktywność w porównaniu do leukocytów z innych kompartmentów immunologicznych (np. krążenia, śledziony, szpiku kostnego)2-4. Na przykład leukocyty MP wykazują wyższą cytotoksyczność komórek NK (Natural Killer) wobec różnych komórek nowotworowych w porównaniu z krążącymi i śledzionowymi komórkami NK, a także zróżnicowane poziomy informacyjnego RNA (mRNA) i zwiększone wydzielanie cytokin pro- i przeciwzapalnych. Skład komórek różni się również od leukocytów krążących, ponieważ leukocyty MP mają wyższy stosunek odporności wrodzonej/nabytej w porównaniu z leukocytami krążącymi (odpowiednio 50% i 30%). Celem przedstawionej w niniejszym dokumencie metody jest umożliwienie selektywnego zbierania leukocytów MP w celu zbadania tego ważnego i unikalnego przedziału immunologicznego (populacji komórek) oraz wyjaśnienia wpływu różnych manipulacji (np. aktywacji immunologicznej) na te specyficzne komórki.
Aby zrozumieć znaczenie tej unikalnej populacji, ważne jest, aby zauważyć, że układ odpornościowy może kontrolować krążące komórki nowotworowe, mikroprzerzuty i choroby resztkowe poprzez funkcje in vivo odporności komórkowej (CMI). Zdolność ta jest oczywista pomimo wcześniejszej porażki układu odpornościowego w kontrolowaniu guza pierwotnego i poparta licznymi dowodami in vivo u pacjentów z rakiem i modelach zwierzęcych5. Co ważne, wyniki te są często niespójne z badaniami in vitro i ex vivo, które donoszą, że większość autologicznych komórek nowotworowych jest odporna na cytotoksyczność poprzez krążenie leukocytów w próbkach krwi od ludzi i zwierząt (mierzonych za pomocą testów cytotoksyczności) 6,7. Rozbieżność ta może być przypisana istnieniu in vivo odrębnych populacji leukocytów, takich jak wspomniana wcześniej populacja leukocytów MP, a konkretnie jej subpopulacja aktywowanych komórek NK3. Rzeczywiście, wykazano, że syngeniczne komórki nowotworowe (MADB106), które okazały się oporne na krążące i śledzioniczne leukocyty, są lizowane przez komórki MP-NK3,8. Tak więc rzekomo "odporne na NK" komórki MADB106, które dają przerzuty do płuc szczurów fischera344 (F344), są kontrolowane przez komórki MP-NK, ale nie przez krążące lub śledzionowe komórki NK, które są powszechnie badane ze względu na ich łatwość dostępu.
Oczyszczone i aktywne leukocyty MP są niedostępne za pomocą standardowych metod pozyskiwania leukocytów z płuc, które opierają się na mieleniu tkanki płucnej lub biologicznej degradacji9. Nasze podejście ma dwie główne zalety w porównaniu z metodami przetwarzania tkanek. Po pierwsze, podejście perfuzyjne selektywnie zbiera leukocyty MP, oddzielając je od innych komórek pochodzących z przedziałów miąższowych płuc, śródmiąższowych i oskrzelowo-pęcherzykowych. Po drugie, technika perfuzji lepiej zachowuje integralność i środowisko fizjologiczne leukocytów MP, w przeciwieństwie do metod mielenia i przetwarzania biologicznego, które uszkadzają komórki, zmieniają ich morfologię oraz indukują produkcję i uwalnianie różnych czynników, które modulują aktywność immunologiczną i specyficznie hamują cytotoksyczność NK10.
Płuca są głównym celem przerzutów nowotworowych i różnych chorób zakaźnych. Wszystkie krążące komórki nowotworowe i zakażone komórki przechodzą przez naczynia włosowate płuc, gdzie muszą się odkształcać i wchodzić w interakcje z komórkami śródbłonka naczyń włosowatych i leukocytami rezydentnymi. W tych warunkach krążące komórki mogą być łatwo atakowane przez rezydentne leukocyty MP. Wydaje się zatem, że biologicznie korzystne jest posiadanie aktywowanych leukocytów w tym przedziale immunologicznym i ważne jest, aby badać tę unikalną populację MP w różnych warunkach biologicznych, eksperymentalnych i klinicznych. Warto zauważyć, że wykazano, że ogólnoustrojowa aktywacja immunologiczna przez różne modyfikatory odpowiedzi biologicznej (np. kwas poliinozyno-policytydylowy (poli I:C) lub oligodeoksynukleotydy typu C CpG (CpG-C ODN)) aktywują leukocyty MP bardziej niż krążące leukocyty3,8,11.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Pompa</td><td></td><td></td><td></td>perystaltyczna</tr><tr><td>Igła motylkowa</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>Igła motylkowa</td><td>OMG</td><td></td><td>21G*3/4"</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>roztwór</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>roztwór</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>roztwór</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Roztwór</td><td></td> <td>10 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Roztwór</td><td></td> <td>25 ml</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>o krawędziach</tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>do tkanek</tr><tr><td>Heparyna sodowa błona śluzowa świni (bez konserwantów)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selektywne pobieranie leukocytów płucnych z marginesem

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Leukocyty płucno-z marginesem (MP) to leukocyty, które przylegają do wewnętrznego śródbłonka naczyń włosowatych płuc. Wykazano, że leukocyty MP wykazują unikalny skład i cechy w porównaniu z leukocytami innych kompartmentów immunologicznych. Dowody wskazują na wyższą cytotoksyczność komórek NK oraz wyraźny profil pro- i przeciwzapalny populacji leukocytów MP w porównaniu z immunocytami krążącymi lub śledzionowymi. Przedstawiona w niniejszym artykule metoda umożliwia selektywne pobieranie leukocytów MP poprzez wymuszoną perfuzję płuc u myszy lub szczurów. W przeciwieństwie do innych metod stosowanych do ekstrakcji leukocytów płucnych, takich jak rozdrabnianie tkanek i degradacja biologiczna, ta metoda daje wyłącznie leukocyty z naczyń włosowatych płuc, niezanieczyszczone komórkami miąższowymi, śródmiąższowymi i oskrzelowo-pęcherzykowymi. Ponadto technika perfuzji lepiej zachowuje integralność i środowisko fizjologiczne leukocytów MP, bez wywoływania reakcji fizjologicznych spowodowanych przetwarzaniem tkankowym. Ta unikalna populacja leukocytów MP jest strategicznie zlokalizowana, aby identyfikować i reagować na nieprawidłowe krążące komórki, ponieważ wszystkie krążące komórki nowotworowe i zakażone komórki są zatrzymywane podczas przechodzenia przez naczynia włosowate płuc, fizycznie oddziałując z komórkami śródbłonka i leukocytami rezydentnymi. Tak więc selektywne zbieranie leukocytów MP i ich badanie w różnych warunkach może pogłębić naszą wiedzę na temat ich znaczenia biologicznego i klinicznego, szczególnie w odniesieniu do kontrolowania krążących nieprawidłowych komórek i chorób związanych z płucami.

Przedział MP wykazuje inny skład podzbiorów leukocytów w porównaniu do leukocytów krążących. Za pomocą analizy cytometrii przepływowej zidentyfikowano i zmierzono subpopulacje leukocytów, aby scharakteryzować skład leukocytów zarówno krążących, jak i znajdujących się w MP. Granulocyty i limfocyty zidentyfikowano na podstawie rozproszenia światła przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter). Wśród limfocytów komórki NKRP-1bright zidentyfikowano jako komórki NK, CD3<sup...

Marginating-pulmonary leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy selektywne zbieranie tej subpopulacji leukocytów płucnych poprzez wymuszoną perfuzję płuc u szczurów i myszy. Leukocyty płucne z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby krwiopochodne i płucne.

Selektywne pobieranie leukocytów płucnych z marginesem

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Ogólnym celem tej procedury jest wymuszenie perfuzji płuc myszy lub szczura w celu selektywnego pozyskania marginujących leukocytów płucnych, które przylegają do wewnętrznego endotelium kapilar płucnych. Metoda ta umożliwia badanie tej specyficznej populacji leukocytów, która wykazuje unikalne cechy i odrębne funkcje hematologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na uzyskanie leukocytów pochodzących wyłącznie z kapilar płucnych, z wyłączeniem komórek z miąższu, przestrzeni śródmiąższowej oraz przedziałów oskrzelowo-pęcherzykowych.Procedurę tę zaprezentują Liat Sorski i Lee Shaashua, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury przepuść heparynowany PBS przez linie pompy perystaltycznej i igły motylkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie, natychmiast po ustaniu oddechu, użyj sterylnych nożyczek i pęsety tkankowej do otwarcia jamy otrzewnej i klatki piersiowej ueutanazowanego szczura, wykonując cięcie wzdłuż linii środkowej brzucha aż do wyrostka mieczykowatego.Następnie za pomocą pincety unieś mostek i ostrożnie przetnij klatkę piersiową po obu stronach. Zaciśnij zacisk hemostatyczny na mostku i odchyl klatkę piersiową w kierunku rostralnym, aby odsłonić kompleks sercowo-płucny. Następnie wprowadź igłę motylkową do prawej komory serca i pobierz maksymalną ilość krwi.Po pobraniu całej krwi, zacisnąć żyłę główną za pomocą kleszczyków hemostatycznych, aby zapobiec wstecznej perfuzji wątroby. Następnie, utrzymując igłę motylkową w prawej komorze, zastąpić strzykawkę z krwią rurą odpływową pompy perystaltycznej i wprowadzić drugą igłę motylkową, podłączoną do pięciomililitrowej strzykawki do pobierania, do lewej komory. Włączyć pompę perystaltyczną, ustawiając prędkość na około 5 ml/min, i delikatnie pobrać pierwsze mililitry zanieczyszczonego perfuzatem krwi do strzykawki do pobierania, aż perfuzat zmieni kolor z ciemnoczerwonego na jasnoczerwony.Następnie, bez zatrzymywania pompy, szybko zastąp strzykawkę do pobierania o pojemności pięciu mililitrów strzykawką do pobierania o pojemności 20 ml i zbierz 20 ml perfuzatu płucnego w celu wyizolowania margynujących leukocytów płucnych szczura z szybkością siedmiu mililitrów na minutę. Zauważ stopniową zmianę koloru płuc z bladoczerwonego na czysto biały, co świadczy o prawidłowej perfuzji. Po zebraniu całej objętości perfuzatu zatrzymaj pracę pompy perystaltycznej i przelej zebrany perfuzat do probówki.Następnie odwiruj perfuzat i odessaj nadsącz. Przepuść PBS z heparyną przez przewody pompy perystaltycznej i igły motylkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Aby pobrać margynujące leukocyty płucne myszy, natychmiast po ustaniu oddychania użyj sterylnych nożyczek i pęsety tkankowej do otwarcia jamy otrzewnej i klatki piersiowej, wykonując cięcie wzdłuż linii środkowej brzucha aż do wyrostka mieczowatego.Następnie za pomocą pincety unieś mostek i przetnij klatkę piersiową po obu stronach. Zaciśnij kleszczyki hemostatyczne na mostku i odchyl klatkę piersiową w kierunku rostralnym, aby odsłonić kompleks sercowo-płucny. Zaciśnij żyłę główną kleszczykami hemostatycznymi, aby zapobiec wstecznej perfuzji wątroby, a następnie wprowadź igłę motylkową do prawej komory serca.Następnie, utrzymując igłę motylkową w prawej komorze, podłącz ją do rurki wylotowej pompy perystaltycznej i wprowadź drugą igłę motylkową, połączoną z 2 mL strzykawką do pobierania, do lewej komory. Włącz pompę, ustawiając prędkość na około 2 mL/min. Delikatnie pobierz do strzykawki pierwszy 1 mL zanieczyszczonego perfuzatem krwi, aż perfuzat zmieni kolor z ciemnoczerwonego na jasnoczerwony.Następnie, bez zatrzymywania pompy perystaltycznej, szybko zastąp strzykawkę do pobierania o pojemności 2 ml strzykawką o pojemności 10 ml i pobierz 10 ml perfuzatu płucnego przy szybkości perfuzji 4 ml/min. Zwróć uwagę na stopniową zmianę barwy płuc z bladoróżowej na wyraźnie białą, co wskazuje na prawidłowy przebieg perfuzji. Po pobraniu całego perfuzatu płucnego zatrzymaj pracę pompy perystaltycznej i przelej zebrany perfuzat do probówki.Następnie odwiruj perfuzat i odciągnij nadsącz. Kompartment płucny marginalny wykazuje inny skład podzbiorów leukocytów niż ten obserwowany dla leukocytów krążących. W rzeczywistości immunocyty wrodzone, w tym granulocyty, monocyty i komórki natural killer, stanowią ponad 50% populacji leukocytów w kompartmencie płucnym marginalnym.W porównaniu do mniej niż 30% krążącej puli komórek. Z kolei populacje limfocytów T i komórek dendrytycznych występują w niższych odsetkach w margynującym przedziale płucnym w porównaniu do komórek krążących. W margynującym przedziale płucnym obecny jest trzykrotnie wyższy odsetek dużych komórek natural killer niż w krążącej puli komórek, mimo że całkowita liczba komórek natural killer jest w obu przypadkach podobna.Co więcej, zdolność komórek natural killer z przedziału margynującego płuc do lizy komórek nowotworowych jest większa niż w przypadku krążących komórek natural killer, co wykazano w standardowym teście uwalniania chromu z wykorzystaniem co najmniej dwóch różnych linii komórek nowotworowych. Ponadto stymulacja immunologiczna poprzez podanie Poly I:C in vivo wywiera silniejszy wpływ na cytotoksyczność komórek natural killer w przedziale margynującym płuc niż na krążące komórki natural killer przy zastosowaniu celów MADB106. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu kilku minut, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia.Techniki te umożliwiają selektywne pozyskiwanie leukocytów MP. Badanie tych leukocytów pozwoli poszerzyć naszą wiedzę na temat ich znaczenia biologicznego i klinicznego, w szczególności w odniesieniu do kontroli krążących komórek aberrantnych oraz chorób płuc. Po przeprowadzeniu tej procedury komórki można scharakteryzować i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej, PCR lub dowolnego innego wybranego testu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat sposobu izolacji margynujących leukocytów płucnych.

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

W tym filmie pokazujemy izolację leukocytów wątrobowych z wątroby myszy za pomocą wymuszonej perfuzji.

Izolacja marginesujących leukocytów wątrobowych z wątroby myszy

Ten protokół opisuje technikę izolacji w celu uzyskania pierwotnych mezenchymalnych komórek zrębu rezydujących w płucach od szczurów, poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego, separacji gradientu gęstości, przylegania plastiku i selekcji kulek magnetycznych CD146+.

Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc rezydentnych CD146 + z płuc szczura

Margining-hepatic leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy metodę selektywnego pobierania tej specyficznej populacji komórek wątroby poprzez wymuszoną perfuzję wątroby szczurów lub myszy. Leukocyty wątroby z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby wątrobowe i przerzuty.

Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Ten protokół opisuje usuwanie i oczyszczanie komórek śródbłonka tętnicy płucnej (PAEC), które przylegają do końcówek balonów cewników Swan-Ganz, podczas gdy są zaklinowane w tętnicy płucnej podczas cewnikowania prawego serca i pozostają przylegające do opróżnionego balonu po usunięciu z ciała pacjenta.

Pobieranie komórek śródbłonka z końcówek balonów cewników Swan-Ganz po cewnikowaniu prawego serca

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Komórki śródbłonka limfatycznego (LLEC), niedawno zidentyfikowany typ komórek wewnątrzczaszkowych, mają słabo poznane funkcje. W badaniu przedstawiono powtarzalny protokół zbierania LLEC od myszy i tworzenia kultur pierwotnych in vitro. Protokół ten ma na celu umożliwienie naukowcom zagłębienia się w funkcje komórkowe i potencjalne implikacje kliniczne LLEC.

Zbiór i pierwotna hodowla komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.

Izolacja leukocytów naciekających mózg

Naucz się selektywnego pobierania leukocytów płucnych z marginesu szczurów i myszy metodą perfuzji wymuszonej. Technika ta umożliwia izolację komórek z kapilar płucnych w celu badań immunologicznych.

Selektywne pobieranie leukocytów płucnych z marginesem

Przeglądaj więcej filmów