Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Celem tej procedury, która łączy optogenetykę z techniką znakowania immunologicznego repliki zamrażania-złamania, jest analiza gęstości jonotropowych receptorów glutaminianu w synapsach w ciele migdałowatym myszy ze zidentyfikowanymi elementami synaptycznymi przed i po. Wysoka powtarzalność i wszechstronność tej techniki znakowania immunologicznego repliki zamrażania i złamania, w połączeniu z optogenetyką, oferuje bardzo skuteczne podejście do skorelowanej analizy właściwości strukturalnych i funkcjonalnych synaps. Głównymi zaletami tej procedury są: płaski widok elementów pre i post synaptycznych oraz analiza ilościowa białek w tych wyspecjalizowanych mikrodomenach.

Różne techniki można dostosować do wielu różnych tkanek w celu zbadania dystrybucji i organizacji integralnych białek błonowych. Ogólnie rzecz biorąc, to połączone podejście optogenetyczne FRIL jest wyzwaniem dla początkujących ze względu na szeroki zakres wymaganych różnych aparatów i maszyn. Rozpoczęcie modulacji inną metodą ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre inne kroki są trudne do nauczenia.

Takich jak pękanie i powielanie zamrożonych próbek: Aby rozpocząć tę procedurę, przyklej koronalny blok mózgu myszy do uchwytu wibrokrajalnicy. Ustaw blok tkankowy tak, aby kora nowa była skierowana w stronę wibrującego ostrza. Następnie pokrój odcinki koronalne zawierające ciało migdałowate o grubości 140 mikrometrów w punkcie zerowym jednego zęba trzonowego, lodowato zimnego PB. I zbierz je w sześciodołkowym naczyniu w tym samym buforze.

Pod mikroskopem stereoskopowym wytnij obszar zainteresowania z plastrów na szalce Petriego pokrytej elastomerem silikonowym i wypełnionej punktem zerowym jednego molowca PB. Następnie przenieś przycięty blok do roztworu krioochronnego i trzymaj przez noc w temperaturze sześciu stopni Celsjusza. Na tym etapie należy przygotować miedziane nośniki do użycia w kolejnych etapach procedury FRIL, polerując je arkuszem skóry zamszowej jako środkiem do usuwania nalotu. Pod mikroskopem przymocuj pierścień taśmy dwustronnej do miedzianego nośnika, który posłuży jako studnia mocująca przycięty blok.

Następnie umieść przycięty blok w otworze taśmy dwustronnej za pomocą pętli z drutu platynowego. Usuń nadmiar roztworu krioprotektantu za pomocą bibuły filtracyjnej lub szczotki. Następnie przykryj nośnik innym nośnikiem.

Tak aby blok tkankowy był umieszczony między dwoma nośnikami. Aby zamrozić próbkę, włóż kanapkę nośną do uchwytu na próbkę. Następnie włóż uchwyt próbki do zamrażarki wysokociśnieniowej.

Rozpocznij cykl zamrażania, naciskając przycisk jet-auto, natychmiast wyjmij uchwyt próbki i zanurz końcówkę w izolowanym pudełku z ciekłym azotem. Następnie ostrożnie wyjmij kanapkę z nośnikiem z uchwytu na próbkę i umieść ją we wstępnie schłodzonym kriowiale. Przechowywać kriowiale zawierające nośniki w kriozbiorniku do czasu replikacji.

Przed włożeniem pistoletu na wiązkę elektronów zdejmij osłonę z płytką deflektora. Umieść miernik nastawczy, aby wycentrować żarnik, w uchwycie tulei zaciskowej przez dolną osłonę katody. Następnie nasuń nowy żarnik na manometr, aż blaszki ciśnieniowe zacisną końce żarnika.

Następnie wyjmij miernik nastawczy i włóż pręt węglowy. Napraw to, dokręcając uchwyt tulei zaciskowej uchwytu pręta parownika. Upewnij się, że wysokość końca pręta znajduje się w środku drugiego zwoju od dołu.

Następnie wymień płytę deflektora i włóż pistolet elektronowy do jednostki zamrażania i pękania. W tej procedurze dostosuj prąd i napięcie do parowania. Następnie włóż zamrożoną kanapkę z nośnikiem do stołu z podwójną repliką w ciekłym azocie.

Następnie przenieś stół z podwójną repliką do naczynia Dewara i przymocuj go do odbiornika stopnia próbki pod kątem 45 stopni. Podnieś stół z podwójną repliką za pomocą manipulatora stołu. Włóż go do jednostki zamrażania i łamania na zimny stopień i odczekaj około 20 minut, aby temperatura stołu z podwójną repliką dostosowała się do minus 115 stopni Celsjusza.

Następnie należy złamać tkankę, ręcznie obracając koło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, które jest połączone z osłoną nad stołem z podwójną repliką. Kiedy całun się obraca, wymusza otwarcie stołu z podwójną repliką, co skutkuje pęknięciem tkanki. Warstwa węgla pod kątem 90 stopni jest nakładana na pęknięte powierzchnie.

Następnie wyjmij zreplikowane próbki ze stołu z podwójną repliką i przenieś je na ceramiczną 12-dołkową płytkę wypełnioną TBS. Za pomocą platynowej walcówki pętelkowej usuń zreplikowaną tkankę z nośnika próbki. W celu roztwarzania SDS przenieść replikę do czteromililitrowej szklanej fiolki wypełnionej jednym mililitrem buforu do wytrawiania SDS.

Pozostaw do strawienia na 18 godzin w temperaturze 80 stopni Celsjusza, wstrząsając. W celu znakowania immunologicznego myć replikę przez 10 minut w świeżym buforze do trawienia SDS. Następnie inkubuj go z przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi, rozcieńczonymi w 2% BSA-TBS, w wilgotnej komorze o temperaturze 15 stopni Celsjusza przez 24 do 72 godzin.

Następnie zamontuj replikę na pokrytej farbą, 100-liniowej siatce prętów równoległych. Zobrazuj replikę za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego o napięciu 80 lub 100 kilowoltów. Następnie uzyskaj obrazy cyfrowe za pomocą kamery CCD.

Gdy jest w trybie offline, znajdź odpowiednie regiony na obrazie z repliki, używając różnych punktów orientacyjnych. Cztery tygodnie po wstrzyknięciu AAV, w celu ekspresji rodopsyny kanałowej-2 w tylnej grupie jądrowej wzgórza, rodopsyna kanałowa-2 jest skutecznie transportowana do przodu wzdłuż aksonów wzgórza, aby dotrzeć do interkalowanych mas komórek ciała migdałowatego. Postsynaptyczna specjalizacja synaps glutaminergicznych może być rozpoznana w replice jako skupisko cząstek wewnątrzbłonowych na powierzchni E błony plazmatycznej i często towarzyszy jej twarz P jej elementu presynaptycznego.

W tym przypadku receptory rodopsyny kanałowej-2 i glutaminianu uwidoczniono za pomocą cząsteczek złota o różnych rozmiarach sprzężonych z przeciwciałami drugorzędowymi. Ze względu na brak narzędzi strukturalnych lub molekularnych do wykrycia na tej samej replice, czy błona postsynaptyczna należała do interkalowanych neuronów. Odpowiednia replika została oznaczona dla receptorów opioidowych mu, markera dla tych neuronów.

Jako przykład analizy ilościowej gęstości receptorów glutaminianu w tych synapsach, oto wykresy rozrzutu liczby cząstek złota dla receptorów ampa w funkcji obszaru synaptycznego na kolcach i dendrytach. Co ujawnia dodatnią korelację w obu strukturach. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że poszczególne kroki są wysoce współzależne.

Dlatego błąd w jednym z kroków może zagrozić całej procedurze. Oglądanie dużej części specjalizacji błony plazmatycznej na dwuwymiarowej powierzchni repliki, pozwala na badanie rozkładu przestrzennego i ciągłości fizycznej interesujących nas cząsteczek bez pracochłonnej i czasochłonnej rekonstrukcji seryjnych odcinków artrofiny. Podejście to może być wykorzystane przez innych badaczy w celu uzyskania wglądu w relacje struktura-funkcja określonych synaps w obwodach neuronalnych.

Gdzie jest to rozplątywanie pochodzenia danych wejściowych i charakteru elementów postsynaptycznych. Jest to kluczowe, ale problematyczne.