Name: Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę łączącą optogenetykę z immunoznakowaniem replik zamrażalniczo-łamliwych do analizy gęstości receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. Technika ta umożliwia ilościowe badanie organizacji synaptycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez grant FWF Austriackiego Funduszu Naukowego nr P-22969-B11 dla F. Ferraguti, a także przez Charitable Hertie Foundation i Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience oraz przez DFG (CIN-Exc. 307) dla I. Ehrlicha.

<ol><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes%3A+practical+procedure%2C+interpretation+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li>
<li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li>
<li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver%2C+brain%2C+and+spinal+cord%3A+factors+limiting+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li>
<li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li>
<li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li>
<li>Rollenhagen, A., Lübke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+excitatory+central+synapses%3A+from+structure+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li>
<li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li>
<li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li>
<li>Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li>
<li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure%2C+size%2C+ionotropic+receptor+expression%2C+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li>
<li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li>
<li>Jüngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction%3A+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628(2016).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li>
<li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li>
<li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li>
<li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li>
<li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li>
<li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFukazawa%2C+Y+%22Handbook+of+Cryo-Preparation+Methods+for+Electron+Microscopy%22">Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy</a>. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).</li>
<li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li>
<li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mikroskopia elektronowa z zamrażaniem i pękaniem jest główną techniką w badaniach ultrastrukturalnych od ponad 40 lat. Jednak brak skutecznych środków do badania składu molekularnego membran spowodował znaczny spadek jego stosowania. Ostatnio nastąpiło znaczne ożywienie w mikroskopii elektronowej z zamrażaniem i pękaniem ze względu na opracowanie skutecznych sposobów ujawniania integralnych białek błonowych poprzez znakowanie immunozłotem 1, 2, a mianowicie technikę FRIL.
Technika FRIL ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami ultrastrukturalnymi immunogold. Po pierwsze, białka są łatwo dostępne dla przeciwciał, co zwiększa ich czułość. Po drugie, naświetlenie dużej części specjalizacji błony plazmatycznej, takich jak błona postsynaptyczna, na dwuwymiarowej powierzchni repliki pozwala na kontrolę rozkładu przestrzennego i fizycznej styczności cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania bez pracochłonnej i czasochłonnej rekonstrukcji seryjnych ultracienkich odcinków. Po trzecie, dostępność obu połówek błony plazmatycznej zwiększa liczbę białek, które można znakować dla każdej pojedynczej struktury, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie przeciwciała. Po pęknięciu hydrofobowa powierzchnia rozszczepionej błony jest pokryta węglem i platyną, która okopuje domeny białkowe pozostające na pękniętej powierzchni. Zapobiega to dostępowi przeciwciał do antygenów w tych domenach. Na przykład na powierzchni P repliki tylko epitopy skierowane w przestrzeń protoplazmatyczną mogą być wykryte przez przeciwciała, podczas gdy na powierzchni E tylko epitopy skierowane w przestrzeń egzoplazmatyczną mogą być wiązane przez przeciwciała (patrz ryc. 2).
Z drugiej strony, technika FRIL również cierpi z powodu pewnych ograniczeń 2. Ponieważ złamania występują losowo, może być trudno celować w określone komórki lub struktury. Może to również prowadzić do błędu systematycznego próbkowania, np. w zbieraniu synaps, biorąc pod uwagę różne prawdopodobieństwo pęknięcia wzdłuż błony struktur o różnej krzywiźnie (np. kolce kontra trzony). Co więcej, alokacja białek błonowych do jednej z dwóch ścian jest nieprzewidywalna. Dlatego dystrybucja białka do powierzchni P lub E, szczególnie w przypadku badań ilościowych, powinna być dokładnie zbadana przy użyciu przeciwciał reagujących na domeny wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. Wreszcie, identyfikacja w replice niektórych struktur, takich jak presynaptyczne zakończenia aksonów, może być trudna, gdy opiera się tylko na cechach morfologicznych. Jednak zastosowanie specyficznych przeciwciał dla białek markerowych lub transdukcja znakowanych integralnych białek lub kanałów błonowych za pomocą wektorów wirusowych oferuje dodatkowe narzędzia ułatwiające identyfikację pękniętych błon. Na przykład w badaniu tym wykorzystano transdukcję ChR2-YFP w neuronach wzgórzowych w celu zidentyfikowania ich aksonalnych eferentów w ciele migdałowatym lub znakowania receptorów μ-opioidowych w celu odsłonięcia błon postsynaptycznych neuronów ITC.
Aby skutecznie wykonać technikę FRIL, należy zwrócić szczególną uwagę na utrwalenie tkanek. Silne utrwalenie tkanek (> 2% paraformaldehydu) może skutkować wysokim wskaźnikiem złamań krzyżowych i zmniejszeniem czułości znakowania. Z drugiej strony, słabe fiksacje utrudniają obchodzenie się z tkankami i ich przygotowanie (np . wycinanie skrawków). Ważne jest również, aby kontrolować, czy grubość przyciętych klocków odpowiada grubości taśmy dwustronnej. Jeśli grubość próbki jest mniejsza niż grubość taśmy, powierzchnie tkanki mogą nie przylegać do powierzchni dwóch metalowych nośników, w związku z czym zamrożona próbka nie zostanie pęknięta. Jeśli tkanka jest grubsza, zostanie ściśnięta z nieuniknionymi zniekształceniami strukturalnymi, gdy zostanie wykonana kanapka dwóch miedzianych nośników. Temperatura, w jakiej dochodzi do złamania egzemplarza (w tym protokole -115 °C) odgrywa również ważną rolę w budowie repliki. Wyższe temperatury mogą powodować większą szybkość artefaktów, takich jak kondensacja pary wodnej na powierzchni tkanki przed lub podczas parowania. Niższe temperatury (< -125 °C) mogą zwiększać ryzyko oderwania się materiału podczas szczelinowania. Materiał ten może spaść na powierzchnię próbki lub pozostać z nią połączony. Te płatki materiału są również powlekane i kontrastowane, tworząc ciemne plamy na obrazie. Pękanie w niższych temperaturach może również wpływać na częstotliwość pęknięć krzyżowych, szczególnie w przypadku małych drobnych struktur, takich jak kolce dendrytyczne. Kolejnym krytycznym krokiem w przygotowaniu replik jest trawienie detergentem. Jeśli trawienie jest niekompletne, niestrawiona tkanka pojawia się jako ciemne plamy na replice, co zakłóca analizę struktury w TEM. Co więcej, niestrawiona tkanka może niespecyficznie wychwytywać lub wiązać przeciwciała, zwiększając znakowanie tła. Z drugiej strony, stosowanie detergentów do trawienia tkanek może denaturować cząsteczki związane z repliką, zmieniając ich drugorzędowe i trzeciorzędowe struktury. Dlatego w przypadku niektórych antygenów może być konieczne stopniowe rozcieńczanie stężenia SDS za pomocą dodatkowych etapów mycia.
W przypadku znakowania immunologicznego dostępność różnych rozmiarów cząsteczek złota sprzężonych z przeciwciałami drugorzędowymi pozwala na wykrycie w tym samym czasie, ale tylko jakościowo, wielu białek, nawet w określonych mikrodomenach błony komórkowej, takich jak specjalizacja postsynaptyczna. Jednak ze względu na przeszkodę steryczną, badania ilościowe są na ogół ograniczone do wykrycia tylko jednej cząsteczki. Wielkość cząsteczki złota może również wpływać na skuteczność etykietowania.
W celu interpretacji znakowania w FRIL należy pamiętać, że cząstka immunozłota może znajdować się w dowolnym miejscu na półkuli o promieniu 20-25 nm od antygenu ze względu na elastyczny kompleks utworzony przez przeciwciało pierwszorzędowe i wtórne 26. W celu uzyskania dalszych informacji na temat teorii i praktyki FRIL i technik pokrewnych odsyłamy czytelnika również do innych artykułów metodologicznych 27, 28.
Technika FRIL została ostatnio wykorzystana do wysokorozdzielczych analiz ilościowych lokalizacji receptora glutaminianu w różnych populacjach synaps 29, 30. Co więcej, czułość wykrywania techniki FRIL dla AMPA-R oszacowano na poziomie jednej cząsteczki immunozłota na jeden funkcjonalny kanał AMPA-R 29. Tak więc podejście to jest ogólnie bardzo przydatne do ilościowego określania i analizowania wzorca postsynaptycznej ekspresji AMPA-R i NMDA-R w centralnych synapsach. Tutaj wykazaliśmy jego zastosowanie w synapsach PIN/MGn-ITC, miejscu najprawdopodobniej ważnym dla przekazywania informacji amerykańskich podczas warunkowania strachu. Używając przeciwciała podniesionego przeciwko wysoce konserwatywnym zewnątrzkomórkowym resztom aminokwasowym podjednostek receptora AMPA GluA1-GluA4, znaleźliśmy równomierny rozkład cząstek złota w klastrach IMP odpowiadających specjalizacji błony postsynaptycznej. Gęstość AMPA-R w kolcach ITC była istotnie wyższa w porównaniu z synapsami trzonu, do których kierowane są aferenty wzgórzowe PIN/MGn. Zarówno w synapsach kręgosłupa, jak i trzonu wykryto dodatnią korelację między znakowaniem AMPA-Rs a obszarem postsynaptycznym, co jest cechą wspólną dla innych synaps glutaminergiczne25. Niska wariancja gęstości AMPA-R w synapsach PIN/MGn-ITC wskazuje na jednorodną dystrybucję podobną do innych synaps utworzonych przez eferenty wzgórzowe 7, ale różną od synaps korowych 25. I odwrotnie, gęstość NMDA-Rs była bardziej zmienna i nie różniła się między synapsami kręgosłupa i trzonu, co sugeruje inną regulację niż AMPA-R. W przyszłości wysoka odtwarzalność techniki FRIL nie tylko pozwoli na ocenę podstawowego składu molekularnego centralnych synaps, ale może również ułatwić wykrywanie zmian w liczbie jonotropowych receptorów glutaminianu i dystrybucji subsynaptycznej po uczeniu się strachu, uzupełniając zapisy ex-vivo pre- i postsynaptycznych właściwości tych danych wejściowych.
Podsumowując, podejście to może być wykorzystane przez innych badaczy w celu uzyskania wglądu w relacje struktura-funkcja synaps pobudzających specyficznych dla danych wejściowych w wielu innych obwodach neuronalnych, w których rozwikłanie pochodzenia danych wejściowych oraz natury i składu elementów postsynaptycznych jest kluczowe, ale problematyczne.

Definicja funkcjonalnej architektury biomembran w skali nanometrowej została w ostatnich latach zakwestionowana przez rozwój szeregu technik immunoznakowania odpowiednich dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Jednak techniki te, np. przed i po zatopieniu immunogold, mają szereg istotnych ograniczeń, do których należą słaba wykrywalność antygenów i/lub ograniczona ocena ilościowa białek związanych z błoną. Ograniczenia te stają się szczególnie istotne w badaniu subtelnej struktury układu nerwowego, który charakteryzuje się wysokim stopniem różnorodności komórek i niejednorodnością synaps. Ta niejednorodność wynika zarówno z różnorodności strukturalnej, jak i funkcjonalnej dyktowanej przez elementy pre- i postsynaptyczne oraz przez zróżnicowaną ekspresję, wzbogacenie lub interakcję białek sygnałowych, takich jak receptory, transportery i cząsteczki efektorowe.
Nowe podejście do bezpośredniego znakowania immunologicznego integralnych lub usieciowanych białek błonowych w replikach zamrażalniczo-łamanych (FRIL) zostało pierwotnie wprowadzone przez Fujimoto dwie dekady temu. Ta oryginalna metoda miała jednak kilka ograniczeń, tj. poważną fragmentację replik, która utrudniała znaczące korelacje znakowanych cząsteczek z indywidualnie zmapowanymi komórkami w złożonych tkankach, takich jak mózg. Około 10 lat temu Shigemoto i Fukazawa stopniowo ulepszali technikę 2. Równolegle z wysiłkami innej grupy naukowców z laboratoriów Boulder Uniwersytetu Stanowego Kolorado, którzy również znacznie udoskonalili tę technikę, w szczególności w zakresie badania połączeń szczelinowych 3.
Ulepszenie protokołów i maszyn do szczelinowania zamrażalniczego, a także wprowadzenie szybkiego zamrażania (pod wysokim ciśnieniem), pozwala teraz badaczom na tworzenie nieprzerwanych replik próbek o stosunkowo dużych rozmiarach i wysokiej jakości obrazach większości składników komórkowych bez ograniczeń i artefaktów wytwarzanych przez silne chemiczne utrwalenia.
Technika FRIL oferuje wielką zaletę wysoce ilościowej identyfikacji in situ jednego lub więcej białek (równocześnie) w histologicznie zmapowanych i cytologicznie zidentyfikowanych komórkach w złożonych tkankach, takich jak mózg, z dodatkową zaletą płaskiego widoku elementów pre- i postsynaptycznych w pojedynczej replice. W związku z tym, technika FRIL, pomimo wielu przeszkód technicznych, daje nadzieję na szereg bardzo istotnych przełomów naukowych, w szczególności w zakresie korelacji właściwości strukturalnych i funkcjonalnych poszczególnych synaps. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat uzyskano wiele informacji na temat struktury, składu molekularnego i funkcji fizjologicznych synaps; Jednak synapsy są morfologicznie i molekularnie bardzo zróżnicowane w zależności od pre i postsynaptycznych neuronów macierzystych 4. Do tej pory przeprowadzono badania struktury i funkcji tylko dla garstki typów synaps (5-7). Wynikało to głównie z ograniczeń technicznych, które uniemożliwiały precyzyjną identyfikację natury elementów pre- i postsynaptycznych.
Analiza ultrastrukturalna dostarczyła krytycznych informacji na temat zmienności specjalizacji błon postsynaptycznych w różnych kontaktach synaptycznych zarówno pod względem wielkości synaptycznej, jak i zawartości w receptorach neuroprzekaźników 6, co ma duży wpływ na siłę i plastyczność transmisji synaptycznej. Co więcej, wiele badań wskazuje, że liczba jonotropowych receptorów glutaminianu ulegających ekspresji w różnych typach synaps jest regulowana w sposób zależny od aferentności i celu.
Tutaj przedstawiono metodę, która pozwala na analizę struktury i składu receptorów specjalizacji błon postsynaptycznych ze zdefiniowanymi elementami i funkcją presynaptyczną. Podejście to wykorzystuje presynaptyczną ekspresję niedawno opracowanych wrażliwych na światło białek glonów, takich jak rodopsyna kanałowa2 (ChR2), oraz technikę FRIL do analizy wzorca postsynaptycznej ekspresji receptorów glutaminianu kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego (AMPA-Rs) i N-metylo-D-asparaginianu (NMDA-Rs). Widać to w synapsach utworzonych przez aksony pochodzące z tylnych jąder kolankowatych wzgórzowo-przyśrodkowych (PIN/MGn) na neuronach interkalowanych mas komórkowych ciała migdałowatego (ITC). Neurony ITC to małe kolczaste komórki GABA-ergiczne zorganizowane w klastry otaczające podstawno-boczny kompleks migdałowaty (BLA) 11, 12. Wiadomo, że neurony ITC odbierają bodźce pobudzające z głównych neuronów BLA i celują w jądro centralne (CeA), działając w ten sposób jako brama hamująca przepływ informacji między BLA a CeA 12-15.
Ostatnio wykazaliśmy, że neurony ITC zlokalizowane w środkowo-grzbietowym klastrze pomiędzy BLA i CeA otrzymują również bezpośrednie i zbieżne bodźce pobudzające z czuciowych obszarów wzgórza i kory skroniowej, które są modyfikowane podczas uczenia się strachu podczas warunkowania słuchowego Pawłowa 16. Warunkowanie strachu jest jedną z najlepiej poznanych form uczenia się asocjacyjnego pod względem mechanizmów mózgowych. W warunkowaniu strachu początkowo neutralny bodziec warunkowy (CS, np. ton) jest sparowany z awersyjnym bodźcem bezwarunkowym (US, np. łagodny wstrząs stopą), co skutkuje skojarzeniem CS-US i warunkową reakcją strachu 17, 18. Wiadomo, że bodźce pobudzające zarówno z obszaru wzgórza, jak i kory nowej, które przenoszą informacje reprezentujące odpowiednio CS i US, zbiegają się w neuronach piramidowych bocznego jądra ciała migdałowatego (LA) i ulegają plastyczności 19. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że informacje sensoryczne są również równolegle przekazywane do neuronów ITC 16.
Jako pierwszy krok w kierunku mechanistycznej analizy molekularnej poszczególnych synaps sensorycznych na neuronach ITC, użyliśmy wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do ekspresji ChR2 oznaczonego żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP). AAV został wstrzyknięty do PIN / MGn, a zakończenia aksonów zostały zidentyfikowane na podstawie ich ekspresji ChR2-YFP. Wykorzystaliśmy obie twarze wygenerowane techniką FRIL do oceny gęstości postsynaptycznych AMPA-R i NMDA-Rs w synapsach utworzonych z neuronami ITC przez zakończenia aksonów PIN / MGn.

<table><tbody><tr><td>Ramka Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczna</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>może być zastąpiona inną ramką stereotaktyczną dla myszy</td></tr><tr><td>Adapter myszy stereotaktycznej</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Maska do znieczulenia gazowego dla myszy</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>już niedostępna, zastąpiona przez nr artykułu 51609M</td></tr><tr><td>Urządzenie do wstrzykiwania ciśnienia, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>można stosować inne urządzenia do wtrysku ciśnieniowego (np. Picospritzer)</td></tr><tr><td>Kapilary szklane Kwik Fill</td><td>World Precision Instruments, Niemcy</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Aparat anestezjologiczny, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Niemcy</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury DC i poduszka grzewcza</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Poziomy ściągacz do mikropipet model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator narzędzi chirurgicznych, Sterylizator 75</td><td>Melag, Niemcy</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotyp 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Niemcy</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran znieczulający, Isofuran CP (1 ml/ml)</td> <td>CP Pharma, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antyseptyczny, Betadine (prowidon-jod)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>można zastąpić innymi środkami dezynfekującymi</td></tr><tr><td>Przeciwbólowe, Metacam Roztwór (5 mg/ml meloksykamu)</td> <td>Boehringer Ingelheim, Niemcy</td><td></td> można <td>zastąpić innymi środkami przeciwbólowymi</td></tr><tr><td>Maść do oczu Bepanthen</td><td>Bayer, Niemcy</td><td>0191</td><td>można zastąpić innymi maściami do oczu</td></tr><tr><td>Wiertło NM3000 (SNKG1341 i SNIH1681)</td> <td>Nouvag, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Igła do szwów</td><td>Fine Science Tools, Niemcy</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Pleciony jedwabny szew</td><td>Fine Science Tools, Niemcy</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Przygotowanie tkanki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde EM grade</td><td>Agar Scientific Ltd., Wielka Brytania</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Nasycony roztwór kwasu pikrynowego</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H20</td><td>Merck Millipore, Niemcy</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-2H2O&nbsp;</td><td>Merck Millipore, Niemcy</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Niemcy</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>System ultraczystej wody GenPure</td><td>Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td>50131235</tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>ISMATEC, Niemcy</td> Bibuła filtracyjna <td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MACHEREY-NAGEL, Niemcy</td> Krajalnica wibracyjna <td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpel okulistyczny</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>można zastąpić innymi skalpelami okulistycznymi</td></tr><tr><td>Kaniula perfuzyjna</td><td>Vieweg, Niemcy</td><td>F560088-1</td><td>mogą być zastąpione podobnymi przedmiotami innych firm</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>High-pressure&nbsp; Nośniki miedzi < / mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Miedziane</td><td>Biuro Konstrukcyjne M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polski</td><td>Henkel, Niemcy</td><td></td><td>można zastąpić tym samym produktem innych firm</td></tr><tr><td>Skóra irchowa</td><td>Sklep</td><td></td><td></td>z artykułami gospodarstwa domowego</tr><tr><td>Dziurkacz, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>można zastąpić tym samym artykułem innych firm</td></tr><tr><td>Denaturowany etanol</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>można zastąpić tym samym artykułem innych firm</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Roth, Niemcy</td><td>9372.5</td><td>UWAGA!</td></tr><tr><td>Wysokociśnieniowa zamrażarka HPM 010</td><td>BalTec, CH; teraz Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>nie jest już produkowany, zastąpiona przez LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-mikroskop</td><td>Olympus, Japonia</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td>UWAGA!</td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Roth, Niemcy</td><td>E309.1</td><td>można zastąpić tym samym artykułem innych firm</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International, USA</td><td>5015-0001</td><td>można zastąpić tym samym produktem innych firm</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International, USA</td><td>5016-0001</td><td>można zastąpić tym samym produktem innych firm</td></tr><tr><td>Zbiornik do przechowywania ciekłego azotu</td><td>Cryopal, Francja</td><td>GT38</td><td>można zastąpić tym samym produktem innych firm</td></tr><tr><td>Detergent niejonowy (Lavocid)</td><td>Werner & Mertz Professional, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Freeze-fracture and Replication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten & Kettenbaum, Niemcy</td><td>SANDURET 2-K</td><td>można zastąpić tym samym artykułem innych firm</td></tr><tr><td>Węglik krzemu SIC 360, wielkość ziarna 25 - 21 i mikro;</td><td>ŻART Joisten & Kettenbaum, Niemcy</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>System do pękania zamrażalniczego BAF 060</td><td>BalTec, CH; teraz Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczna płytka 12-dołkowa</td><td>Gr&ouml; pel, Austria</td><td>14511</td><td>może być zastąpiony przez ten sam artykuł od innych firm</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>może być zastąpiony przez ten sam produkt od innych firm</td></tr><tr><td>Chlorowodorek Trizma</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>może być zastąpiony przez ten sam artykuł innych firm</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck, Niemcy</td><td>1 064 041 000</td><td>można zastąpić tym samym artykułem innych firm</td></tr><tr><td>SDS, Laurylosiarczan sodu</td><td>Roth, Niemcy</td><td>5136.1</td><td>UWAGA! ; &nbsp; może być zastąpiony tym samym artykułem z innych firm</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck, Niemcy</td><td>1,076,871,000</td><td>może być zastąpiony tym samym artykułem z innych firm</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Niemcy</td><td>5429.3</td><td>może być zastąpiony tym samym artykułem z innych firm</td></tr><tr><td>Uniwersalne spoiwo</td><td>do pieców hybrydyzacyjnych</td>, Niemcy <td>7001-0050</td><td>można zastąpić tym samym artykułem innych firm</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>można zastąpić tym samym artykułem innych firm</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>przeciwciała anty-GFP</td>, USA <td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-pan-AMPAR</td><td>Frontier Institute, Japonia</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-NMDAR1, klon 54.1</td><td>Merck Millipore, Niemcy</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko receptorowi opioidowemu Mu (MOR)</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM kozia świnka morska, 5 nm; przeciwciało drugorzędowe</td><td>BBInternational, Wielka Brytania</td><td>EM. GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM kozioł anty-królik, 15 nm; przeciwciało drugorzędowe</td><td>BBInternational, Wielka Brytania</td><td>EM. GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik, 10nm, przeciwciało wtórne</td><td>AURION, Holandia</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Siatki miedziane, 100 Parallel Bar</td><td>&nbsp; Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>można zastąpić tym samym produktem innych firm</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&nbsp; Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth, Niemcy</td><td>3313.1</td><td>UWAGA! ; &nbsp; można zastąpić tym samym przedmiotem z innych firm</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>EM analiza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Kamera CCD Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada</td><td>Miękkie systemy obrazowania, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, oprogramowanie do obrazowania</td><td>Soft Imaging Systems, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Mikroskopia elektronowa z zamrażaniem i pękaniem jest główną techniką w badaniach ultrastrukturalnych od ponad 40 lat. Jednak brak skutecznych środków do badania składu molekularnego membran spowodował znaczny spadek jego stosowania. Ostatnio nastąpiło znaczne ożywienie w mikroskopii elektronowej zamrażania i pękania dzięki opracowaniu skutecznych sposobów ujawniania integralnych białek błonowych poprzez znakowanie immunozłotem. Jedna z tych metod jest znana jako rozpuszczalne w detergentach immunoznakowanie repliki zamrażalniczo-łamliwej (FRIL).
Połączenie techniki FRIL z optogenetyką pozwala na skorelowaną analizę strukturalnych i funkcjonalnych właściwości synaps centralnych. Dzięki temu podejściu możliwe jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie zarówno neuronów pre-, jak i postsynaptycznych na podstawie ich odpowiedniej ekspresji znakowanej rodopsyny kanałowej i specyficznych markerów molekularnych. Charakterystyczny wygląd specjalizacji błony postsynaptycznej synaps glutaminergiczny pozwala ponadto, po znakowaniu jonotropowych receptorów glutaminianu, na ilościowe określenie i analizę wewnątrzsynaptycznej dystrybucji tych receptorów. W tym miejscu podajemy krok po kroku opis procedur wymaganych do przygotowania sparowanych replik i sposobu ich znakowania immunologicznego. Omówimy również zastrzeżenia i ograniczenia techniki FRIL, w szczególności te związane z potencjalnymi błędami systematycznymi w próbkowaniu. Wysoka powtarzalność i wszechstronność techniki FRIL, w połączeniu z optogenetyką, oferuje bardzo skuteczne podejście do charakteryzowania różnych aspektów transmisji synaptycznej w zidentyfikowanych mikroobwodach neuronalnych w mózgu.
Tutaj podajemy przykład, jak to podejście zostało wykorzystane do uzyskania wglądu w relacje struktura-funkcja synaps pobudzających w neuronach interkalowanych mas komórkowych ciała migdałowatego myszy. W szczególności zbadaliśmy ekspresję jonotropowych receptorów glutaminianu na zidentyfikowanych wejściach pochodzących z tylnych wewnątrzwarstwowych i przyśrodkowych jąder kolankowatych wzgórza. Wykazano, że synapsy te przekazują informacje sensoryczne istotne dla uczenia się strachu i ulegają zmianom plastycznym po warunkowaniu strachu.

Technika FRIL w połączeniu z ekspresją optogenetycznych aktuatorów pochodzenia mikrobiologicznego 21, t.j. kanałów zintegrowanych z błoną plazmatyczną i efektywnie transportowanych anterogradnie wzdłuż aksonów, pozwala na ilościowe badanie postsynaptycznej ekspresji AMPA-Rs i NMDA-Rs w określonej podgrupie synaps. Zostało to tutaj zaprezentowane dla aksonów pochodzących z różnych jąder wzgórza (np. PIN/MGn) do neuronów ITC w ciele migdałowatym. Podejście to umożliwia analizę molekularną pojedynczych synaps wejścia sensorycznego do neuronów ITC – grupy komórek, które do tej pory pozostawały oporne na szczegółową charakterystykę anatomiczną i molekularną.
Cztery tygodnie po stereotaktycznym wstrzyknięciu rAAV-ChR2-YFP do PIN/MGn, aksony dodatnie pod kątem ChR2-YFP gęsto unerwiły LA, obszar przejścia ciała migdałowatego do prążkowia (Astria) oraz przyśrodkowy paracapsularny klaster ITC w ciele migdałowatym, co jest wzorcem w pełni zgodnym z poprzednimi badaniami tracingowymi 16, 22. Wykryliśmy również intensywne złote znakowanie immunologiczne ChR2-YFP na powierzchni P aksonów i zakończeń w replikach mrożenia-trawienia od myszy, którym wstrzyknięto rAAV-ChR2-YFP (Rysunek 5A), czego nie zaobserwowano w replikach od myszy niewstrzykniętych. Specjalizację błony postsynaptycznej synaps glutaminergicznych w replice można zaobserwować jako skupisko cząsteczek wewnątrzmembranowych (IMPs) na powierzchni E błony plazmatycznej 2, 23, czemu często towarzyszy powierzchnia P jej presynaptycznej błony plazmatycznej 7 (Rysunek 5B-C). Cechy te pozwoliły na identyfikację specjalizacji postsynaptycznej synaps glutaminergicznych utworzonych przez zakończenia aksonalne PIN/MGn (Rysunek 5 i 6). Znakowaliśmy AMPA-Rs przeciwciałem rozpoznającym wszystkie cztery podjednostki (GluA1-4), natomiast NMDA-Rs wykrywano przy użyciu przeciwciała przeciwko niezbędnej podjednostce NR1.
Ze względu na brak narzędzi pozwalających na wykrycie w obrębie tej samej repliki, czy synapsy te powstały na kolcach dendrytycznych czy na trzonach neuronów ITC, wybarwiliśmy odpowiadającą im powierzchnię repliki pod kątem receptorów µ-opioidowych, ponieważ neurony ITC wykazują postsynaptyscznie wysoki poziom tych receptorów 24. Wymagało to identyfikacji tych samych profili postsynaptycznych w dwóch replikach (Rycina 5C-F oraz Rycina 6A-D) przy użyciu strategii wykorzystującej punkty orientacyjne (Rycina 4E).
<img alt="EM mrożenia i frakturowania, fuzja pęcherzyków synaptycznych, PSD, powierzchnia E, powierzchnia P, wyniki mikroskopii elektronowej." src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Detekcja ChR2-YFP i jonotropowych receptorów glutaminianowych na replice za pomocą cząsteczek immunozłota. (A) Poprzecznie sfrakturowany terminal aksonalny (jasnoniebieski) i niewielkie fragmenty jego powierzchni P znakowane 15 nm cząsteczkami złota wykrywającymi ChR2-YFP. Wewnątrz terminala widoczne są błony licznych pęcherzyków synaptycznych (sv). Zwróć uwagę na specyficzność immunoznakowania, ograniczone w dużej mierze do błony plazmatycznej. Znakowanie ChR2 identyfikuje terminal jako pochodzący z PIN/MGn. Terminal tworzy asymetryczną synapsę z kolcem dendrytycznym. Specjalizacja błony postsynaptycznej (PSD) na powierzchni E wykazuje charakterystyczny skupisk cząsteczek wewnątrz błonowych i jest znakowana 5 nm cząsteczkami złota ujawniającymi AMPA-Rs. (B) Powierzchnia P aksonu wykazującego ekspresję ChR2 (znakowana 15 nm cząsteczkami złota) sąsiaduje z dwoma dendrytami, z których jeden posiada dwa PSD znakowane 5 nm cząsteczkami złota ujawniającymi NMDA-Rs. (C-D) Przeciwległe powierzchnie błon przed- i postsynaptycznych synapsy PIN/MGn-ITC. (C) Powierzchnia P terminala wykazuje ekspresję ChR2 (znakowana 15 nm cząsteczkami złota) i rozciąga się nad powierzchnią E dwóch trzonów dendrytycznych, z których jeden zawiera dwa PSD znakowane pod kątem AMPA-Rs (5 nm cząsteczki złota). (D) Odpowiadająca im powierzchnia P dwóch dendrytów jest znakowana pod kątem receptorów µ-opioidowych (10 nm cząsteczki złota). (E-F) Powiększenia obszarów ograniczonych przerywanymi liniami. Paski skali: 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Immunocząsteczki dla AMPA-Rs w synapsach PIN/MGn-ITC znaleziono w całym klastrze IMP, co sugeruje jednorodny rozkład w obrębie specjalizacji postsynaptycznej (Rycyna 5E). Znacznie wyższą (test t nieparzysty p&lt;0,018) gęstość znakowania AMPA-R zaobserwowano w synapsach PIN/MGn na kolcach ITC (715±38 cząsteczek złota/µm2, n = 32) w porównaniu do synaps na dendrytach ITC (590±44 cząsteczek złota/µm2, n = 32). Ogólnie gęstość AMPA-Rs w synapsach PIN/MGn-ITC wykazała stosunkowo niską wariancję (współczynnik zmienności, CV = 0,37), co jest zgodne z jednorodnym rozkładem.
Cząstki immunozłota dla NMDA-Rs w synapsach PIN/MGn-ITC często wykazywały nierównomierny rozkład w obrębie postsynaptycznych klastrów IMP (Ryc. 5B). Gęstość znakowania NMDA-R była podobna (nieparzysty test t p=0,39) pomiędzy synapsami PIN/MGn na kolcach ITC (1070±153 cząstek złota/µm2, n=8) a dendrytami ITC (812±183 cząstek złota/µm2, n=9). W przeciwieństwie do obserwacji dla AMPA-Rs, gęstość NMDA-Rs w synapsach PIN/MGn-ITC była wysoce zmienna (CV = 0,54).
<img alt="Mikroskopia elektronowa pokazująca struktury synaptyczne z cząsteczkami złota, schematy wykresów analizy danych." src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Immunoznakowanie AMPA-Rs i NMDA-Rs w zidentyfikowanych synapsach PIN/MGn-ITC. 
(A-B) Przeciwległe strony membran presynaptycznej i postsynaptycznej synapsy PIN/MGn-ITC utworzonej na kolcu dendrytycznym, w której strona P terminala wykazuje ekspresję ChR2 (znakowana 15 nm cząsteczkami złota), a PSD na kolcu dendrytycznym jest znakowana pod kątem AMPA-Rs (5 nm cząsteczki złota). (C-D) Powiększone widoki obszarów zaznaczonych linią przerywaną. Obszary te zostały obrócone o około 45° przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby umożliwić lepszą obserwację PSD. (E) Wykresy rozrzutu liczby cząsteczek AMPA-R w zależności od powierzchni synaptycznej w kolcach i dendrytach ITC. W obu strukturach zaobserwowano korelację dodatnią. (F) Wykresy rozrzutu liczby cząsteczek NMDA-R w zależności od powierzchni synaptycznej w kolcach i dendrytach ITC. Istotna korelacja dodatnia została wykryta tylko w kolcach dendrytycznych. Paski skali: 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ponieważ powierzchnia P presynaptycznej błony plazmatycznej często częściowo nakładała się na postsynaptyczny klaster IMP, byliśmy w stanie oszacować powierzchnię synaptyczną jedynie w 30% synaps (kolce: średnia powierzchnia 0,032 µm2, zakres: od 0,007 do 0,063 µm2, n = 8; dendryty: 0,047 µm2, zakres: od 0,024 do 0,166 µm2, n = 11). Wartości te mieściły się w podobnym zakresie co wcześniej analizowane glutaminergiczne synapsy telencefaliczne 25.
Zarówno w kolcach, jak i w dendrytach, liczba złotych immunocząsteczek dla receptorów AMPA (AMPA-Rs) w poszczególnych synapsach była dodatnio skorelowana z powierzchnią synaptyczną (Spearman, kolce: r = 0.88, dendryty: r = 0.60, p&lt;0.0001) (Rysunek 6E). W przeciwieństwie do tego, stwierdzono, że liczba złotych immunocząsteczek dla receptorów NMDA (NMDA-Rs) korelowała z powierzchnią synaptyczną w kolcach (Spearman, kolce: r = 0.90, p&lt;0.002), ale nie w dendrytach (r = 0.21, p = 0.29) (Rysunek 6F).

Ten artykuł ilustruje, jak można określić ilościowo ekspresję receptorów neuroprzekaźników i przeanalizować wzór w synapsach z zidentyfikowanymi elementami pre i postsynaptycznymi, wykorzystując kombinację transdukcji wirusa za pomocą narzędzi optogenetycznych i techniki immunoznakowania repliki zamrażania i złamania.

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Celem niniejszej procedury, która łączy optogenetykę z techniką immunoznakowania replik mrożonych przełomów, jest analiza gęstości jonotropowych receptorów glutaminianu w synapsach ciała migdałowatego myszy z zidentyfikowanymi elementami presynaptycznymi i postsynaptycznymi. Wysoka powtarzalność i wszechstronność techniki immunoznakowania replik mrożonych przełomów, w połączeniu z optogenetyką, stanowi bardzo potężne podejście do skorelowanej analizy właściwości strukturalnych i funkcjonalnych synaps. Głównymi zaletami tej procedury są: płaski widok elementów presynaptycznych i postsynaptycznych oraz ilościowa analiza białek w tych wyspecjalizowanych mikrodomenach.Różne techniki można dostosować do wielu różnych tkanek w celu zbadania rozkładu i organizacji integralnych białek błonowych. Zazwyczaj to połączone podejście optogenetycznego FRIL jest trudne dla osób początkujących ze względu na szeroki zakres wymaganej aparatury i urządzeń. Rozpoczęcie modulacji za pomocą innej metody jest kluczowe, ponieważ niektóre pozostałe etapy są trudne do opanowania.Np. frakcjonowanie i powielanie mrożonych preparatów. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przykleić blok koronalny mózgu myszy do uchwytu wibrosieka (vibro-slicer). Zorientuj blok tkanki tak, aby nowokora skierowana była w stronę wibrującego ostrza. Następnie wykonaj przekroje koronalne zawierające ciało migdałowate o grubości 140 micrometers w lodowatym roztworze PB o stężeniu zero point one molar. Zbierz je do płytki 6-dołkowej zawierającej ten sam bufor.Pod stereomikroskopem wyciąć obszar zainteresowania z plastrów, w szalce Petri powlekonej elastomerem silikonowym i wypełnionej 0,1 M PB. Następnie przenieść wycięty blok do roztworu krioprotekcyjnego i przechowywać przez noc w temperaturze 6°C. Na tym etapie przygotować nośniki miedziane do użycia w kolejnych etapach procedury FRIL, polerując je kawałkiem skóry jagnięcej w celu usunięcia nalotu. Pod mikroskopem przymocować pierścień dwustronnej taśmy do nośnika miedzianego, który będzie służył jako uchwyt dla wyciętego bloku.Następnie, za pomocą pętli z drutu platynowego, umieść przyciętny blok w otworze dwustronnej taśmy. Usuń nadmiar roztworu krioprotekcyjnego za pomocą papieru filtracyjnego lub pędzelka. Następnie przykryj nośnik utrzymujący drugim nośnikiem.Tak, aby blok tkanki znajdował się pomiędzy dwoma nośnikami. W celu zamrożenia preparatu należy umieścić tak przygotowany zestaw nośników w uchwycie na preparaty. Następnie włóż uchwyt z preparatem do urządzenia do mrożenia wysokociśnieniowego.Rozpocznij cykl zamrażania, naciskając przycisk jet-auto, natychmiast wyjmij uchwyt do próbek i zanurz końcówkę w izolowanym pojemniku z ciekłym azotem. Następnie ostrożnie wyjmij kanapkę nośnikową z uchwytu do próbek i umieść ją w schłodzonej wcześniej krioprobtce. Przechowuj krioprobtki z nośnikami w kriozakładzie do czasu replikacji.Przed włożeniem działa wiązki elektronowej należy zdjąć osłonę z płytką odchylającą. Wprowadzić wzornik do centrowania włókna do uchwytu trzpieniowego przez dolną osłonę katody. Następnie nasunąć nowe włókno na wzornik, aż blaszki dociskowe zaciśną końce włókna.Następnie należy wyjąć wzornik i włożyć pręt węglowy. Należy go zamocować, dokręcając uchwyt tulejowy uchwytu pręta odparowywacza. Należy upewnić się, że koniec pręta znajduje się na wysokości środka drugiej cewki od dołu.Następnie należy zamontować płytkę odchylającą i wprowadzić działo elektronowe do jednostki do mrożenia i trawienia. W tej procedurze należy dostosować natężenie prądu i napięcie dla procesu odparowania. Następnie wprowadź zamrożoną kanapkę nośnika do stołu do podwójnej replikacji w ciekłym azocie.Następnie przenieś stół z podwójną repliką do naczynia Dewara i przymocuj go do uchwytu etapu preparatu pod kątem 45 stopni. Podnieś stół z podwójną repliką za pomocą manipulatora stołu. Wsuń go do jednostki mroźnego trawienia na chłodny stopień i odczekaj około 20 minut, aby temperatura stołu z podwójną repliką ustabilizowała się na poziomie -115 °C.Następnie należy złamać tkankę, ręcznie obracając koło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, które jest połączone z osłoną nad stołem do podwójnego odlewu. Obrót osłony wymusza otwarcie stołu do podwójnego odlewu, co prowadzi do złamania tkanki. Na przełamane powierzchnie nakłada się warstwę węgla pod kątem 90 stopni.Następnie należy zdjąć powielone preparaty z powierzchni do tworzenia dubletów i przenieść je do ceramicznej płytki 12-dołkowej wypełnionej TBS. Za pomocą platynowej igły z pętelką należy oddzielić powieloną tkankę od nośnika preparatu. W celu przeprowadzenia trawienia w SDS, należy przenieść powielinę do szklanej fiolki o pojemności 4 ml wypełnionej 1 ml buforu do trawienia w SDS.Pozostawić do trawienia na 18 godzin w temperaturze 80°C przy ciągłym mieszaniu. W celu immunoznakowania przemyć replikę przez 10 minut w świeżym buforze do trawienia SDS. Następnie inkubować ją z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, rozcieńczonymi w 2%BSA-TBS, w komorze wilgotnościowej w temperaturze 15°C przez okres od 24 do 72 godzin.Następnie przenieś replikę na siatkę z równoległymi prętami o gęstości 100 linii, pokrytą formvar-em. Wykonaj obrazowanie repliki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego przy napięciu 80 lub 100 kV. Następnie zarejestruj obrazy cyfrowe przy użyciu kamery CCD.W przypadku braku dostępności trybu online, należy zlokalizować odpowiadające regiony na obrazie z repliki, wykorzystując różne punkty orientacyjne. Cztery tygodnie po iniekcji AAV, w celu ekspresji kanałorodopsyny-2 w grupie jąder tylnych wzgórza, kanałorodopsyna-2 jest skutecznie transportowana anterogradnie wzdłuż aksonów wzgórza, aby dotrzeć do mas komórek przerywających ciała migdałowatego. Specjalizacja postsynaptyczna synaps glutaminergicznych może być rozpoznana w replice jako skupisko cząsteczek wewnątrzbłonowych na powierzchni E błony plazmatycznej i często towarzyszy jej powierzchnia P elementu presynaptycznego.W niniejszym badaniu wizualizację kanałorodopsyny-2 oraz receptorów glutaminianu przeprowadzono z wykorzystaniem cząsteczek złota o różnych rozmiarach sprzężonych z przeciwciałami wtórnymi. Ze względu na brak narzędzi strukturalnych lub molekularnych pozwalających na wykrycie na tej samej replice, czy błona postsynaptyczna należała do neuronów interkalowanych, odpowiednią replikę znakowano pod kątem receptorów opioidowych mu, które są markerem tych neuronów.Jako przykład ilościowej analizy gęstości receptorów glutaminianu w tych synapsach przedstawiono wykresy rozrzutu liczby cząsteczek złota dla receptorów AMPA w zależności od powierzchni synaptycznej na kolcach i dendrytach. Wykazują one dodatnią korelację w obu strukturach. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że poszczególne etapy są od siebie silnie zależne.W związku z tym błąd na jednym z etapów może zagrozić całej procedurze. Obserwacja dużych fragmentów specjalizacji błony plazmatycznej na dwuwymiarowej powierzchni repliki pozwala na zbadanie rozmieszczenia przestrzennego i ciągłości fizycznej interesujących cząsteczek bez żmudnej i czasochłonnej rekonstrukcji seryjnych przekrojów artrofinowych. Podejście to może być wykorzystywane przez innych badaczy w celu uzyskania wiedzy na temat zależności między strukturą a funkcją specyficznych synaps w obwodach neuronalnych.Kwestia rozplątania pochodzenia sygnałów wejściowych oraz natury elementów postsynaptycznych jest kluczowa, lecz problematyczna.

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje procedurę analizy połączeń synaptycznych między przyśrodkową korą przedczołową (mPFC) a neuronami ciała migdałowatego za pomocą ostrych wycinków mózgu ciała migdałowatego od myszy. Neurony mPFC u tych myszy wyrażają rodopsynę kanałową połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Rodopsyny kanałowe ułatwiają napływ jonów i generowanie potencjału czynnościowego w neuronach mPFC po aktywacji światłem. W konsekwencji neurony mPFC uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z...

Wizualizacja i mapowanie ścieżek neuronalnych w wycinku mózgu ciała migdałowatego

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Podejścia optogenetyczne są powszechnie używane do manipulowania aktywnością neuronalną i oceny konsekwencji dla funkcjonowania mózgu. W tym miejscu przedstawiono technikę, która po ekspresji in vivo aktywatora optycznego rodopsyny kanałowej pozwala na analizę ex vivo właściwości synaptycznych określonych połączeń neuronalnych dalekiego zasięgu i lokalnych połączeń nerwowych w obwodach związanych ze strachem.

Ex vivo Optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu

Ten protokół dostarcza przepływ pracy, jak połączyć sztuczną interferencję RNA za pośrednictwem mikroRNA z optogenetyką, aby stymulować specyficznie presynaptyczne butony ze zmniejszoną ekspresją selektywnych genów w nienaruszonych obwodach neuronalnych.

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

Ta praca wprowadza metodę niezawodnego wykonywania optogenetycznego zapisu pojedynczej jednostki z obudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody.

Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia in vivo jest nieocenionym narzędziem, które umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się zwierząt. Jednak zastosowanie tej techniki do ciała migdałowatego było trudne. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do skutecznego celowania w komórki ciała migdałowatego za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu u myszy.

Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Poznaj metodę łączącą optogenetykę z immunoznakowaniem replik zamrażalniczo-łamliwych do analizy gęstości receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. Technika ta umożliwia ilościowe badanie organizacji synaptycznej.

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy (Wideo) | JoVE Journal

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Przeglądaj więcej filmów