Name: Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo do transferu genów do narządu słuchowego kurczaka od czwartego dnia embriogenezy. Technika umożliwia badanie proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Doris K. Wu za plazmidy ekspresyjne i sondy in situ, Centrum Biologii Sensorycznej Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa oraz Centrum Słuchu i Równowagi. Prace te były wspierane przez NIDCD Grant T32 DC000023 dla L.E.

Jaja i niewyklute embriony są pielęgnowane i traktowane etycznie i humanitarnie. Wszystkie protokoły dotyczące wykorzystania niewyklutych zarodków zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania w Johns Hopkins School of Medicine w Baltimore w stanie Maryland.
1. Jaja i przygotowanie konstrukcji wyrażeń
<ol>
	<li>Jaja:
	<ol>
		<li>Wysiadywać 3 - 4 tuziny zapłodnionych jaj kurzych (Gallus gallus) leżących płasko na boku w temperaturze 37 °C.
		<ol>
			<li>Po 24 godzinach inkubacji wyciągnąć strzykawką 3 cm3 cm3 białka z okrągłego tylnego końca jaja i uszczelnić otwór przezroczystą taśmą. Tworzy to komorę powietrzną między zarodkiem a skorupką jaja, umożliwiając łatwy dostęp do zarodka bez przyklejania się zarodka do skorupki podczas przecinania okienka w celu uzyskania dostępu na wierzchu jaja 19.</li>
			<li>Po 117 godzinach inkubacji zarodki należy zasadzić w stadium zgodnie z 20 etapami rozwoju Hamburgera i Hamiltona w E4 (HH24-25) (patrz ryc. 1D).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstrukcje wyrażeń:
	<ol>
		<li>Przygotować plazmidowe DNA przy użyciu odczynników i protokołu dostarczonego przez producenta dostępnego na rynku zestawu do przygotowania. Na ostatnim etapie przygotowania należy eluować DNA do 500 μl buforu TE (Tris-EDTA) dostarczonego w zestawie do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Etanol wytrąca DNA w celu jego zagęszczenia, dodając do probówki 50 μl 3 M octanu sodu i 1 ml 100% etanolu. Umieścić probówkę w temperaturze -20 °C O/N.</li>
		<li>Odwirować probówkę przez 30 minut przy 14 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i suszyć osad na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Rozpuść osad w 15 μl buforze TE, który powinien dać stężenie ~4 μg/μl. 
		UWAGA: Użyte tutaj konstrukcje wyrażeń kontrolnych to pMES-IRES-GFP10, który jest sterowany przez promotor β-aktyny z kurczaka, lub pCI-H2B-IRES-RFP10, który jest sterowany przez promotor CMV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test mikroelektroporacji kurczaka in ovo i proliferacji komórek in ovo
<ol>
	<li>In Ovo Mikroiniekcja konstruktu ekspresji i mikroelektroporacja:
	<ol>
		<li>Przeciągnij szklane rurki kapilarne do cienkich igieł za pomocą ściągacza do mikropipet o następujących zoptymalizowanych parametrach dla platynowego filamentu grzewczego o wymiarach 2,5 x 2,5 mm: ciśnienie = 500, ciepło = 600 °C, ciągnięcie = 64, prędkość = 105 i czas = 150 ms (patrz tabela 1).</li>
		<li>Ustaw lewo- i praworęczny stopień mikromanipulatora po bokach mikroskopu (patrz rysunek 1A). Praworęczny mikromanipulator trzyma szklaną igłę kapilarną, a leworęczny mikromanipulator trzyma elektrody (rysunek 1A).</li>
		<li>Przygotować drobno wyciągniętą szklaną igłę kapilarną do mikroiniekcji, przecinając końcówkę igły kleszczami podczas pracy pod mikroskopem.</li>
		<li>Napełnij igłę ręcznie, ręcznie za pomocą mikromanipulatora 2,5 μl plazmidowego DNA zabarwionego 0,1% Fast Green podczas pracy pod mikroskopem.</li>
		<li>Umieść jajko leżące na boku w urządzeniu do przechowywania formy/jaj (patrz rysunek 1A). Wytnij okrągłe okienko na wierzchu jajka za pomocą nożyczek 19 (Rysunek 1A).</li>
		<li>Podczas pracy pod mikroskopem ostrożnie otwórz dwie błony pokrywające zarodek za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Podczas pracy pod mikroskopem dostarczyć około ~0,5 μl plazmidowego DNA do prawego światła pęcherzyka moczowego poprzez mikroiniekcję ręczną za pomocą prawej ręki za pomocą mikromanipulatora oraz za pomocą mikroelektroporacji.
		<ol>
			<li>Aby to zrobić, należy wykonać mikro-wstrzyknięcie DNA do prawego światła pęcherzyka usznego za pomocą mikromanipulatora prawej ręki (ryc. 1B-D), jednocześnie używając lewej ręki trzymającej kleszcz, aby ustabilizować głowę zarodka, ponieważ głowa zarodka zanurza się w stadium E4. Nie należy wstrzykiwać mikroiniekcji poza światło pęcherzyka usznego, ponieważ spowoduje to uszkodzenie pęcherzyka usznego.</li>
			<li>Bezpośrednio po mikroiniekcji, podczas pracy pod mikroskopem, za pomocą mikromanipulatora lewoskrętnego umieścić dodatnią (anodową) 2 mm platynową elektrodę przednią i brzuszną dodatnią (anodową) 2 mm do prawego pęcherzyka usznego, a ujemną elektrodę 2 mm (katodę) równolegle w odległości 1 mm od siebie (patrz rysunek 1 C). Dostarcz 4 impulsy przy napięciu 12 V o czasie trwania 100 ms i odstępie 200 ms. Lewy pęcherzyk uszny służy jako wewnętrzna nieleczona kontrola. 
			UWAGA: Wyczyść elektrody między elektroporacjami wacikiem z bawełnianą końcówką zamoczonym w 1x PBS.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test proliferacji komórek in ovo:
	<ol>
		<li>Bezpośrednio po elektroporacji dodać 50 μl 0,25 mg/ml EdU do 1x PBS, ręcznie upuszczając 50 μl roztworu EdU na cały zarodek in ovo za pomocą pipety. Zaklej jaja taśmą i wróć do inkubatora na 18 - 96 godzin.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć taśmę i sprawdzić, czy w pęcherzyku żółtym nie ma sygnału fluorescencyjnego GFP lub RFP po 18 - 24 godzinach za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego (patrz rysunek 1 E-E'). Jeśli obecny jest sygnał fluorescencyjny, w tym momencie należy pobrać zarodki do analiz lub ponownie zakleić taśmą i zwrócić do inkubatora w celu pobrania i analiz na późniejszych etapach (patrz rysunek 1 F-P''). 
		UWAGA: Ekspresja sygnału GFP za pomocą konstruktu pMES-IRES-GFP jest widoczna 6 - 7 godzin po elektroporacji 10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pobieranie zarodków i przetwarzanie tkanek pod kątem RNA Hybrydyzacja in situ i immunohistochemia
<ol>
	<li>Zbierz zarodki za pomocą kleszczy. Opłucz zarodek na zimno 1x PBS. Usunąć głowy zarodków, przecinając głowę za szyję za pomocą kleszczy, i umieścić głowy w 4% paraformaldehydzie O/N w temperaturze 4 °C. Nakłuć mózg za pomocą kleszcza, aby umożliwić przenikanie 4% paraformaldehydu do wnętrza głowy.</li>
	<li>Odwodnić głowy w 30% sacharozie (w 1x PBS) O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zamontuj głowice w pożywce krioprotekcyjnej poprzez szybkie zamrożenie w zawiesinie suchego lodu i metylobutanu (2-metylobutanu). Alternatywnie, szybko zamroź głowy w pożywce krioprotekcyjnej z ciekłym azotem. Zamontowane głowice należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Kriosekcja głów na skrawki tkanek o grubości 12 μm i zebranie wszystkich skrawków tkanek zawierających ucho wewnętrzne na przeszkiełkione szkiełka mikroskopowe.</li>
	<li>Wykonaj standardową hybrydyzację RNA in situ i immunohistochemię, jak opisano wcześniej 4,21, i przeanalizuj pod kątem proliferacji komórek EdU zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta zestawu. 
	UWAGA: Komórki rzęsate można zidentyfikować za pomocą poliklonalnego przeciwciała królika α-MyosinVIIa (Myo7a) (1:1,000, Proteus Biosciences) i znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowego (1:250, kozia anty-królicza AlexaFluor 488; Invitrogen).</li>
</ol>
4. Przechwytywanie i przetwarzanie obrazów
<ol>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą cyfrowego sprzętu do przetwarzania obrazu. Wyniki immunohistochemii obrazu za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego oraz wyniki badania in situ przy użyciu standardowego mikroskopu szerokokątnego (w powiększeniu od 5x do 40x).</li>
	<li>Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li>
<li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).</li>
<li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li>
<li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+production+in+the+chicken+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li>
<li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li>
<li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050(2008).</li>
<li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li>
<li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode%3A+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li>
<li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear%3A+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li>
<li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li>
<li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871(2012).</li>
<li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li>
<li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li>
<li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306(2007).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li>
<li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tu metoda mikroelektroporacji in ovo jest zoptymalizowana pod kątem transferu genów do rozwijającego się narządu słuchu. Jest kompatybilny z wektorami ekspresyjnymi opartymi na plazmidowym DNA, zwykle używanymi do manipulowania funkcją/ekspresją genów. Czas elektroporacji w E4 jest optymalny dla badań, które koncentrują się na rozwoju HC w narządzie słuchowym. Najbardziej krytycznymi etapami są mikroiniekcja DNA do światła pęcherzyka usznego bez wchodzenia zbyt głęboko w igłę i uszkadzania pęcherzyka usz...

Pomimo różnic w morfologii i wzorcu komórkowym między narządem słuchowym ssaków i ptaków, uważa się, że czynniki molekularne i szlaki odpowiedzialne za rozwój sensorycznego HC są ewolucyjnie zachowane 1-3. Brodawka podstawna, w której znajdują się słuchowe HC i otaczające je SC, rozwija się jako zewnętrzna otochetysta ucha wewnętrznego. Na wczesnym etapie pula komórek progenitorowych HC i SC jest określana w domenie kompetencji nerwowo-sensorycznej (NSD) w obrębie plakodu otycznego/miseczki usznej. Dane z mapowania losu dostarczają dowodów na to, że linie neuronalne i czuciowe są połączone i powstają z NSD zlokalizowanego w przednio-brzusznym obszarze miseczki usznej lub otocysty u myszy i kurczaków 4,5. Po pierwsze, neuroblasty rozwarstwiają się z NSD, dając początek neuronom zwoju słuchowo-przedsionkowego, które ostatecznie dzielą się na zwoje słuchowe i przedsionkowe. Neurony te unerwiają czuciowe HC ucha wewnętrznego i jądra w pniu mózgu. Uważa się, że komórki, które pozostają w NSD, powodują powstawanie różnych plam czuciowych, w tym narządu zmysłu słuchowego, składającego się z mechano transdukujących czuciowych HC i powiązanych z nimi SC.
Zarówno u piskląt, jak i u myszy, wyjście z cyklu komórkowego progenitorów czuciowych narządu słuchu i różnicowanie HC występują w przeciwstawnych gradientach. U piskląt wyjście z cyklu komórkowego słuchowego progenitora rozpoczyna się około ~E5 i postępuje od podstawy do wierzchołka i od środka do peryferii 6. Dzień później różnicowanie HC zaczyna się w wierzchołku i przechodzi do podstawy 7. Badanie rozwoju ucha wewnętrznego u kurcząt zapewnia wiele korzyści technicznych, ponieważ mechanizmy funkcjonalne można badać ze względną łatwością in ovo, w przeciwieństwie do manipulowania zarodkami w macicy w innych systemach modelowych, co wymaga skomplikowanych operacji. Opisana tutaj metoda wykorzystuje mikroelektroporację in ovo do celowania w geny będące przedmiotem zainteresowania w przypuszczalnym obszarze brodawki podstawnej przednio-brzusznie w pęcherzyku usznym, szczególnie w E4.
Elektroporacja in ovo to technika, która jest dobrze znana i powszechnie stosowana 8-14. Zasada działania techniki elektroporacji opiera się na fakcie, że nukleotydy (np. plazmidowe DNA, syntetyczne DNA lub oligonukleotydy RNA) są naładowane ujemnie. DNA jest wstrzykiwane do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Kiedy prąd elektryczny jest umieszczany w tkance, prąd otwiera przejściowe pory w ścianach komórkowych i pozwala na wychwyt DNA, ponieważ ujemnie naładowane DNA przepływa w kierunku elektrody dodatniej (anody). W eksperymentach ze wzmocnieniem funkcji, geny będące przedmiotem zainteresowania są zwykle subklonowane do plazmidów ekspresyjnych, które zawierają odpowiednie kasety ekspresyjne dla białka zielonej fluorescencji (GFP) lub białka czerwonej fluorescencji (RFP). W eksperymentach z utratą funkcji powszechnie stosuje się dominujące ujemne konstrukty represorowe oparte na plazmidzie lub RNAi lub konstrukty morpholino 15,16. Do hamowania funkcji mikroRNA (miRNA) można użyć konstruktów gąbczastych, które są zwykle oparte na plazmidzie 17. Opisana metoda pozwala na badanie mechanizmów molekularnych kontrolujących proliferację i różnicowanie w narządzie słuchu, ponieważ metodę mikroelektroporacji in ovo można łatwo połączyć z testem proliferacji komórek in ovo poprzez dodanie EdU do całego zarodka.
Elektroporacja i dodanie EdU odbywa się w E4 w pęcherzyku słuchowym, co następuje dzień przed rozpoczęciem wyjścia cyklu komórkowego w narządzie słuchowym. Analiza narządu słuchu jest zwykle wykonywana 18 - 96 godzin po elektroporacji w E5 (początek wyjścia z cyklu komórkowego progenitora czuciowego), E6 (początek różnicowania HC) i E7 (podczas różnicowania HC); a później aż do ~E9 (koniec różnicowania HC). Ta metoda elektroporacji transferu genów jest przejściowa trwająca około ~ 4 dni, ponieważ geny będące przedmiotem zainteresowania nie integrują się z genomem, ale metoda ma zastosowanie do stosowania z odpowiednimi wektorami ekspresyjnymi opartymi na plazmidowym DNA, które mają zdolność integracji z genomem, takimi jak transfer genów za pośrednictwem Tol2 11. Dzięki tej metodzie silna ekspresja GFP lub RFP trwa ~ 4 dni w ślimaku, po czym sygnały zanikają, ale zapewniają wystarczające okno czasowe do zbadania skomplikowanego rozwoju narządu słuchowego. Ta metoda transferu genów in ovo jest nowatorska i pozwala na specyficzne ukierunkowanie na przypuszczalny narząd słuchu w E4, co jest optymalne dla badań koncentrujących się na rozwoju HC w narządzie słuchowym. Jest to dobry dodatek do metod alternatywnych, które elektroporują w znacznie młodszych stadiach rozwojowych 11,12 lub w porównaniu z zastosowaniem kultur eksplantatów brodawek podstawnych in vitro 18.

<table><tbody><tr><td>Sterylny 1x PBS pH 7,4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Powder</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Powder</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Zestaw do obrazowania</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&nbsp;</td>Aparat <td></td><td></td><td>BTX Harvard</td></tr><tr><td>Zestaw bananowych do mikrochwytaków Aparat</td><td>BTX Harvard 45-0216</td><td></td><td></td></tr><tr><td>praworęczny i Mikromanipulatory leworęczne</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M3301R & M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Dwa 12-milimetrowe magnetyczne stoliki mocujące z 7-calowymi pionowymi słupkami</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td>Metalowa stalowa płyta podstawy <td>M10</td><td></td></tr><tr><td>12x24 cale</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do jaj o długości 12 cm zakrzywione, 12 mm bardzo drobne ostrza; Nożyczki sprężynowe</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet do igieł</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2,5x2,5 mm Pudełko Platynowy żarnik grzewczy</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane rurki kapilarne/igły/bez włókna/borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka Hamilton 100 &mu; l</td><td>Hamilton</td><td>80601 Model 710LT</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny (ciężki) do szklanej strzykawki Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa do łączenia szklanej strzykawki i szklanych igieł kapilarnych / nietoksyczna</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td> <td>427420 Jednorazowe strzykawki Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe igły o rozmiarze 21</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Jedna para 2 mm elektrod platynowych</td><td>Bulldog Bio. / Uchwyt elektrody Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>Jedna para cienkich kleszczy Dumont nr 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niewidoczna taśma o matowym wykończeniu do uszczelniania jaj</td><td>Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>Waciki z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki</td><td></td><td></td><td></td> filtrujące</tr></tbody></table>

transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Embriony kurczaków są idealnymi systemami modelowymi do badania rozwoju embrionalnego, ponieważ manipulacje funkcją genów mogą być przeprowadzane stosunkowo łatwo w ovo. Narząd słuchu słuchowego ucha wewnętrznego ma kluczowe znaczenie dla naszej zdolności słyszenia. Znajduje się w nim wysoce wyspecjalizowany nabłonek czuciowy, który składa się z mechano transdukujących komórek rzęsatych (HC) i otaczających komórek podporowych przypominających glej (SC). Pomimo różnic strukturalnych w narządach słuchu, mechanizmy molekularne regulujące rozwój narządu słuchu są ewolucyjnie zachowane między ssakami a narządami słuchowymi. Elektroporacja in ovo jest w dużej mierze ograniczona do wczesnych stadiów w E1 - E3. Ze względu na stosunkowo późny rozwój narządu słuchu w E5, manipulacje narządu słuchu za pomocą elektroporacji in ovo po E3 są trudne ze względu na zaawansowany rozwój zarodka kurzego w późniejszych stadiach. Przedstawiona tutaj metoda jest przejściową metodą transferu genów do celowania w geny będące przedmiotem zainteresowania w stadium E4 - E4.5 w rozwijającym się narządzie czuciowym słuchu kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo. Metoda ta ma zastosowanie do wzmacniania i utraty funkcji z konwencjonalnymi wektorami ekspresyjnymi opartymi na plazmidowym DNA i może być połączona z testem proliferacji komórek in ovo przez dodanie EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyny) do całego zarodka w czasie elektroporacji. Zastosowanie plazmidów ekspresyjnych białka zielonej lub czerwonej fluorescencji (GFP lub RFP) pozwala eksperymentatorowi szybko określić, czy elektroporacja skutecznie celowała w część słuchową rozwijającego się ucha wewnętrznego. W niniejszej pracy metodologicznej zilustrowano reprezentatywne przykłady próbek elektroporowanych GFP; zarodki pobrano w ciągu 18 - 96 godzin po elektroporacji, a skierowanie GFP na obszar prosensoryczny narządu słuchowego zostało potwierdzone przez hybrydyzację RNA in situ. W artykule dotyczącym metody przedstawiono również zoptymalizowany protokół stosowania analogu tymidyny EdU do analizy proliferacji komórek; podano przykład testu proliferacji komórek opartego na EdU, który łączy znakowanie immunologiczne i chemię EdU click.

W niniejszej pracy metodycznej plazmidowe DNA zawierające kasety ekspresyjne białka GFP (zielone białko fluorescencyjne) wprowadzano do rozwijającej się papillae basilaris (BP) kurczaka przy użyciu zoptymalizowanych parametrów: 12 V oraz 4 impulsów o czasie trwania 10 msec i odstępach 20 msec, co pozwoliło uzyskać około 50% przeżywalności embrionów oraz efektywność targetowania plazmidowego DNA do BP. Obrazowanie fluorescencyjne natywnej ekspresji GFP w rozwijających się embrionach wykaza...

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Ogólnym celem tej metody jest przeprowadzenie manipulacji genetycznych w rozwijającym się narządzie słuchu kurczaka od czwartego dnia embrionalnego wzwyż. Jest to istotne ze względu na trudności związane z pracą na zaawansowanym etapie rozwoju zarodka kurczaka. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na celowane oddziaływanie na rozwijający się narząd słuchu in ovo z relatywną łatwością w porównaniu do innych metod, które wymagają skomplikowanych operacji in utero.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju sensorycznego słuchu, w tym w jaki sposób koordynowane są przestrzenny i czasowy wzorzec proliferacji progenitorowych komórek sensorycznych oraz ich różnicowanie dziedziczne. Aby rozpocząć tę procedurę, podłącz szklaną igłę kapilarną za pomocą rurki połączonej ze szklaną strzykawką, która jest umieszczona na prawym mikromanipulatorze, a elektrody umieść na lewym mikromanipulatorze.Pod mikroskopem odciąć końcówkę igły za pomocą pęsety. Następnie nanieść 2,5 µL DNA z plazmy zabarwionego 0,1% fast green do naczynka. Napełnić igłę DNA z plazmy, używając tłoka strzykawki przymocowanej do prawego mikromanipulatora.Umieść jajko na boku w uchwycie. Następnie, za pomocą nożyczek, wytnij okrągłe okienko na górnej części jajka. Po tym etapie umieść jajko w uchwycie pod mikroskopem.Za pomocą pęsety ostrożnie rozchyl dwie błony przykrywające embrion, aby odsłonić prawy pęcherzyk słuchowy. Stabilizując głowę embrionu pęsetą w lewej ręce, podaj około 0,5 µL plazmidowego DNA za pomocą mikromanipulatora w prawej ręce. Należy uważać, aby nie wstrzyknąć preparatu poza światło pęcherzyka słuchowego, ponieważ spowoduje to jego uszkodzenie.Mikroiniekcja DNA do światła pęcherzyka słuchowego bez uszkodzenia pęcherzyka jest kluczowa i wymaga użycia obu rąk. Bezpośrednio po mikroiniekcji należy użyć lewego mikromanipulatora, aby umieścić zestaw dwóch milimetrowych platynowych elektrod dodatniej i ujemnej przednio-brzusznie w stosunku do prawego pęcherzyka słuchowego, a następnie przy użyciu elektroporatora podać cztery impulsy o napięciu 12 V. Precyzyjne umieszczenie elektrod w obszarze przednio-brzusznym przyszłego narządu słuchu jest istotne i gwarantuje ukierunkowanie na rozwijający się narząd słuchu.Bezpośrednio po elektroporacji należy dodać 50 µl EdU na cały embrion in ovo. Następnie jajko należy zabezpieczyć taśmą. Wszystkie manipulowane i zabezpieczone jajka należy przenieść z powrotem do inkubatora na okres od 18 do 96 godzin.Po 18 do 24 godzin ostrożnie usuń taśmę. Sprawdź obecność fluorescencyjnego sygnału GFP lub RFP w pęcherzyku słuchowym zarodków, używając standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Jeśli sygnał fluorescencyjny jest obecny, pobierz zarodki do analiz lub ponownie zabezpiecz je taśmą i umieść w inkubatorze w celu pobrania i analizy na późniejszych etapach.Hybrydyzacja in situ RNA została wykorzystana do określenia, czy elektroporacja skutecznie objęła słuchową część rozwijającego się ucha wewnętrznego. W obrębie rozwijającej się BP progenitorów sensorycznych zidentyfikowano na podstawie ekspresji Sox2 oraz Lunatic Fringe. Obrazy te wykazują, że progenitorzy sensoryczni w całej rozwijającej się BP, zarówno u podstawy, jak i w wierzchołku, zostali skutecznie objęci procedurą i wykazywali ekspresję GFP po 68 godzinach od elektroporacji.Dodatkowo GFP była ekspresowana poza domeną sensoryczną w nie-sensorycznych komórkach nabłonkowych oraz w zwoju słuchowym oznaczonym ekspresją Neurod1. Aby określić zachowanie proliferacyjne progenitorów sensorycznych, w czasie elektroporacji w dniu E4 dodano EdU, analog tymidyny, a cztery dni później przeanalizowano wbudowanie EdU w rozwijającej się BP w przekrojach tkankowych. Do identyfikacji różnicujących się komórek rzęskowych w rozwijającej się BP wykorzystano immunoznakowanie specyficznego dla komórek rzęskowych białka Myosin7a. W części szczytowej BP komórki rzęskowe wykazujące ekspresję Myo7a często były dodatnie pod kątem wbudowania EdU.Podczas gdy w podstawie jedynie niewielka liczba komórek rzęsnych wykazujących ekspresję Myo7a włączyła EdU, co sugeruje, że w momencie dodania EdU w dniu E4, progenitorzy sensoryczni w podstawie są już w przeważającej mierze pomitotyczni. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w czasie od pięciu do ośmiu minut na jedno jajo. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest stosowanie świeżo przygotowanych i sterylnych odczynników, aby zapewnić przeżywalność embrionów.Po zastosowaniu tej procedury parametry metody można zmodyfikować w celu zbadania innych zjawisk w rozwijającym się uchu wewnętrznym, takich jak rozwój organów przedsionkowych oraz neurogeneza ucha wewnętrznego. Technika ta otwiera badaczom zajmującym się uchem wewnętrznym drogę do specyficznego badania stosunkowo późno rozwijającego się narządu słuchu kurczaka, począwszy od czwartego dnia embrionalnego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat właściwego obchodzenia się z embrionem kurczaka, przeprowadzania mikroiniekcji i elektroporacji oraz wykonywania testu proliferacji komórek in ovo.

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

Wewnętrzne ucho myszy jest organem zmysłowym pochodzącym z placody, którego program rozwojowy realizowany jest podczas ciąży. Opisujemy technikę transferu genu in utero, składającą się z trzech etapów: brzusznej laparotomii myszy, mikrowstrzyknięcia do macicy oraz elektroporacji in vivo. Wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Opisano metodę transferu genów do embrionów kurcz uklutych na późniejszych etapach inkubacji (starszych niż stadium Hamburgera i Hamiltona (HH) 22). Metoda ta eliminuje wady elektroporacji in ovo stosowanej u starszych embrionów kurczych i stanowi przydatną technikę badania funkcji i regulacji genów na późniejszych etapach rozwoju.

Transfer genów do starszych zarodków kur w metodzie elektroporacji ex ovo

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Poznaj zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo do transferu genów do narządu słuchowego kurczaka od czwartego dnia embriogenezy. Technika umożliwia badanie proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Przeglądaj więcej filmów