Name: Nagrywanie wokalizacji ultradźwiękowych myszy w celu oceny komunikacji społecznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę nagrywania ultradźwiękowych wokalizacji myszy w celu oceny komunikacji społecznej i wpływu mutacji genetycznych na zachowania. Protokół umożliwia standaryzację badań nad zaburzeniami neurorozwojowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fondation de France; przez ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; przez ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; przez Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); przez Fondation Orange; przez Fondation FondaMentale; przez Fondation de France; przez Fondation Bettencourt-Schueller. Badania, które doprowadziły do powstania niniejszego artykułu, otrzymały również wsparcie Wspólnego Przedsięwzięcia Inicjatywy Innowacyjnej Medycyny na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 115300, której środki stanowią wkład finansowy z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) oraz wkład rzeczowy firm EFPIA. Dziękujemy Julie Lévi-Strauss za pomocne komentarze do manuskryptu oraz sześciorgu anonimowym recenzentom, których komentarze znacznie poprawiły rękopis.

<ol><li>American Psychiatric Association. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diagnostic+and+Statistical+Manual+of+Mental+Disorders%2C%0A++Fifth+Edition+%28DSM-V%29%22">Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,
 Fifth Edition (DSM-V)</a>. , (2013).</li>
<li>Ey, E., Leblond, C. S., Bourgeron, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Profiles+of+Mouse+Models+for+Autism+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral Profiles of Mouse Models for Autism Spectrum Disorders.</a> Autism Res. 4 (1), 5-16 (2011).</li>
<li>Bourgeron, T., Jamain, S., Granon, S. Animal Models of Autism - Proposed Behavioral Paradigms and Biological Studies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBourgeron%2C+T+%22Contemporary+Clinical+Neuroscience%3A+Transgenic+and+Knockout+Models+of+Neuropsychiatric+Disorders%22">Contemporary Clinical Neuroscience: Transgenic and Knockout Models of Neuropsychiatric Disorders</a>. , 151-174 (2006).</li>
<li>Scattoni, M. L., Crawley, J., Ricceri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+vocalizations%3A+A+tool+for+behavioural+phenotyping+of+mouse+models+of+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic vocalizations: A tool for behavioural phenotyping of mouse models of neurodevelopmental disorders.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 33 (4), 508-515 (2009).</li>
<li>Portfors, C. V., Perkel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ultrasonic+vocalizations+in+mouse+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cur.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication.</a> Cur. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).</li>
<li>Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+birds%2C+and+men%3A+the+mouse+ultrasonic+song+system+has+some+features+similar+to+humans+and+song-learning+birds%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds.</a> PLOS ONE. 7, e46610(2012).</li>
<li>Hammerschmidt, K., Schreiweis, C., Minge, C., Pääbo, S., Fischer, J., Enard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+humanized+version+of+Foxp2+does+not+affect+ultrasonic+vocalization+in+adult+mice%3A+Ultrasonic+vocalization+of+%26%2334%3Bhumanized%26%2334%3B+FoxP2+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">A humanized version of Foxp2 does not affect ultrasonic vocalization in adult mice: Ultrasonic vocalization of &#34;humanized&#34; FoxP2 mice.</a> Genes Brain Behav. , (2015).</li>
<li>Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+functions+of+ultrasonic+vocalizations+in+laboratory+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 28-34 (2007).</li>
<li>Panksepp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affiliative+Behavior%2C+Ultrasonic+Communication+and+Social+Reward+Are+Influenced+by+Genetic+Variation+in+Adolescent+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Affiliative Behavior, Ultrasonic Communication and Social Reward Are Influenced by Genetic Variation in Adolescent Mice.</a> PLOS ONE. 2, (2007).</li>
<li>Zippelius, H. -M., Schleidt, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraschall-Laute+bei+jungen+M%C3%A4usen%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Ultraschall-Laute bei jungen Mäusen.</a> Naturwissenschaften. 43, 502(1956).</li>
<li>Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+emissions%3A+do+they+facilitate+courtship+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic emissions: do they facilitate courtship of mice.</a> J. Comp. Physiol. Psychol. 84, 445-452 (1973).</li>
<li>Holy, T. E., Guo, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+songs+of+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic songs of male mice.</a> PLOS Biol. 3, 2177-2186 (2005).</li>
<li>Maggio, J. C., Whitney, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+vocalizing+by+adult+female+mice+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic vocalizing by adult female mice (Mus musculus).</a> J. Comp. Psychol. 99, 420-436 (1985).</li>
<li>Chabout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Male+Mice+Emit+Context-Specific+Ultrasonic+Vocalizations+That+Are+Modulated+by+Prior+Isolation+or+Group+Rearing+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adult Male Mice Emit Context-Specific Ultrasonic Vocalizations That Are Modulated by Prior Isolation or Group Rearing Environment.</a> PLOS ONE. 7 (1), e29401(2012).</li>
<li>Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+mice+respond+to+male+ultrasonic+%22songs%22+with+approach+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Female mice respond to male ultrasonic "songs" with approach behaviour.</a> Biol. Lett. 5, 589-592 (2009).</li>
<li>Wöhr, M., Moles, A., Schwarting, R. K. W., D'Amato, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+social+exploratory+activation+in+male+-opioid+receptor+KO+mice+in+response+to+playback+of+female+ultrasonic+vocalizations%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lack of social exploratory activation in male -opioid receptor KO mice in response to playback of female ultrasonic vocalizations.</a> Soc. Neurosci. 6, 76-87 (2011).</li>
<li>Granon, S., Faure, P., Changeux, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+and+social+behaviors+under+nicotinic+receptor+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Executive and social behaviors under nicotinic receptor regulation.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 100 (16), 9596-9601 (2003).</li>
<li>Schmeisser, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autistic-like+behaviours+and+hyperactivity+in+mice+lacking+ProSAP1%2FShank2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autistic-like behaviours and hyperactivity in mice lacking ProSAP1/Shank2.</a> Nature. 486 (7402), 256-260 (2012).</li>
<li>Ey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Deficits+in+Social+Behaviors+and+Ultrasonic+Vocalizations+in+Later+Generations+of+Mice+Lacking+Neuroligin4%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Absence of Deficits in Social Behaviors and Ultrasonic Vocalizations in Later Generations of Mice Lacking Neuroligin4.</a> Genes Brain Behav. 11, 928-941 (2012).</li>
<li>Chadman, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+Aberrant+Behavioral+Phenotypes+of+Neuroligin-3+R451C+Knockin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Res%22%5BJournal%5D)">Minimal Aberrant Behavioral Phenotypes of Neuroligin-3 R451C Knockin Mice.</a> Autism Res. 1, 147-158 (2008).</li>
<li>Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+Repertoire+of+Vocalizations+in+the+BTBR+T+plus+tf%2FJ+Mouse+Model+of+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Unusual Repertoire of Vocalizations in the BTBR T plus tf/J Mouse Model of Autism.</a> PLOS ONE. 3, (2008).</li>
<li>De Chaumont, F., Coura, R. D. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+video+analysis+of+social+interactions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Computerized video analysis of social interactions in mice.</a> Nat. Methods. 9, 410-417 (2012).</li>
<li>Leblond, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+Functional+Analyses+of+SHANK2+Mutations+Suggest+a+Multiple+Hit+Model+of+Autism+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic and Functional Analyses of SHANK2 Mutations Suggest a Multiple Hit Model of Autism Spectrum Disorders.</a> PLOS Genet. 8 (2), e1002521(2012).</li>
<li>Berkel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+SHANK2+synaptic+scaffolding+gene+in+autism+spectrum+disorder+and+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the SHANK2 synaptic scaffolding gene in autism spectrum disorder and mental retardation.</a> Nat. Genet. 42, 489-491 (2010).</li>
<li>Pinto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+global+rare+copy+number+variation+in+autism+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional impact of global rare copy number variation in autism spectrum disorders.</a> Nature. 466, 368-372 (2010).</li>
<li>Ey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autism+ProSAP1%2FShank2+mouse+model+displays+quantitative+and+structural+abnormalities+in+ultrasonic+vocalisations%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations.</a> Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).</li>
<li>Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+repertoire+of+vocalizations+in+adult+BTBR+T+plus+tf%2FJ+mice+during+three+types+of+social+encounters%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T plus tf/J mice during three types of social encounters.</a> Genes Brain Behav. 10, 44-56 (2010).</li>
<li>Zorrilla, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparous+species+present+problems+%28and+possibilities%29+to+developmentalists%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">Multiparous species present problems (and possibilities) to developmentalists.</a> Dev. Psychobiol. 30 (2), 141-150 (1997).</li>
<li>Lazic, S. E., Essioux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+basic+and+translational+science+by+accounting+for+litter-to-litter+variation+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 37(2013).</li>
<li>Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freezing+urine+reduces+its+efficacy+for+eliciting+ultrasonic+vocalizations+from+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice.</a> Physiol. Behav. 96, 602-605 (2009).</li>
<li>Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+mice+ultrasonically+interact+with+males+during+courtship+displays%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Burkett, Z. D., Day, N. F., Peñagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VoICE%3A+A+semi-automated+pipeline+for+standardizing+vocal+analysis+across+models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models.</a> Sci. Rep. 5, 10237(2015).</li>
<li>Weissgerber, T. L., Milic, N. M., Winham, S. J., Garovic, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Bar+and+Line+Graphs%3A+Time+for+a+New+Data+Presentation+Paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Beyond Bar and Line Graphs: Time for a New Data Presentation Paradigm.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002128(2015).</li>
<li>Jamain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+social+interaction+and+ultrasonic+communication+in+a+mouse+model+of+monogenic+heritable+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 105, 1710-1715 (2008).</li>
<li>Won, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autistic-like+social+behaviour+in+Shank2-mutant+mice+improved+by+restoring+NMDA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function.</a> Nature. 486, 261-265 (2012).</li>
<li>Ferhat, A. -T., Le Sourd, A. -M., de Chaumont, F., Olivo-Marin, J. -C., Bourgeron, T., Ey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+Communication+in+Mice+-+Are+There+Optimal+Cage+Conditions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Social Communication in Mice - Are There Optimal Cage Conditions?</a> PLOS ONE. 10 (3), e0121802(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół zapewnia ustandaryzowane i niezawodne sposoby zbierania wokalizacji ultradźwiękowych myszy w laboratorium. Te bardzo ograniczone sytuacje stanowią zaletę standaryzacji. Są one z powodzeniem wykorzystywane do porównywania szczepów lub genotypów w obrębie szczepów18,19,26,27. Jak przedstawiono w reprezentatywnych wynikach, metody te pozwalają na identyfikację nietypowej komunikacji społecznej u myszy zmutowanych na Shank2, gen związany z zaburzeniami ze spektrum autyzmu. Porównania między szczepami myszy, między różnymi kontekstami, a nawet między laboratoriami, będą wywołane dostępnością większych zbiorów danych w bazie danych mouseTube . To narzędzie powinno przyspieszyć badania nad ultradźwiękowymi wokalizacjami myszy, umożliwiając analizy wielowymiarowe.
Opisane tutaj protokoły są zoptymalizowane pod kątem testowania myszy o różnych genotypach w obrębie szczepu, tak jak ma to miejsce w większości badań modelujących genetyczny wkład w zaburzenia neuropsychiatryczne. Zaleca się eksperymentalne zaprojektowanie każdego badania w taki sposób, aby zapewnić jak najlepszą kontrolę. Rzeczywiście, efekty zaśmiecania mogą maskować lub sztucznie zawyżać skutki genetyczne28,29. W związku z tym zaleca się włączenie kontroli rodzeństwa z miotu dla każdego genotypu. Należy zatem faworyzować hodowlę heterozygotycznych rodziców, ponieważ pozwoli to na prawidłowe dopasowanie myszy zmutowanych i kontrolnych w miocie. Uzasadnia to oznaczanie tatuaży na łapach wszystkich szczeniąt (ślepych na genotyp) w celu śledzenia osobników w nagraniach co dwa dni. Genotypowanie przeprowadza się po odsadzeniu, pobierając próbki ogona. W przypadku nagrywania rozmów izolacyjnych szczeniąt od P2 nie zalecamy pobierania próbek ogona już u szczeniąt, ponieważ operacja ta obejmuje dodatkową manipulację i stres bardzo blisko sesji nagraniowej.
Sugerowane tutaj protokoły mające na celu wywołanie wokalizacji ultradźwiękowych u dorosłych nie pozwalają na wyraźną identyfikację emitera wokalizacji. To wyjaśnia, dlaczego manipulujemy motywacją zwierzęcia doświadczalnego. Rzeczywiście, myszy testowe są izolowane, a nie nowicjusze, a zwierzęta testowe przyzwyczajają się przez długi czas do klatki testowej podczas interakcji z osobami tej samej płci. W interakcjach męsko-żeńskich wprowadzona samica nie jest izolowana, a badany samiec przyzwyczaja się przez krótszy czas, ponieważ motywacja może być wyższa w tym kontekście seksualnym. Te manipulacje motywacją powinny maksymalizować prawdopodobieństwo, że mysz testowa emituje wokalizacje, a nie wprowadzona. Aby zarejestrować męskie wokalizacje ultradźwiękowe w kontekście seksualnym, do klatki można również wprowadzić prosty wacik ze świeżym (tj. nie zamrożonym) moczem samicy w rui30. Metoda ta pozwala na przypisanie wokalizacji ultradźwiękowych badanemu samcowi ze 100% pewnością, ale uniemożliwia zebranie jakichkolwiek konkretnych informacji na temat rzeczywistego kontekstu społecznego emisji tych wokalizacji. Dlatego faworyzujemy opisany tutaj protokół (ze swobodnie poruszającą się samicą rui). Zalecamy również, aby zawsze używać wprowadzonych myszy z tego samego szczepu podczas testowania myszy ze zmutowanego szczepu i analizować dane jako parę myszy wokalizujących. Jedno z ostatnich badań promuje zastosowanie triangulacji do lokalizacji emitera31. W tym badaniu stwierdzono, że samice emitują również wokalizacje ultradźwiękowe podczas spotkań z samcem. Można to wytłumaczyć tym, że byli izolowani przez co najmniej dwa tygodnie przed sesją nagraniową. Uogólnienie zastosowania triangulacji zaproponowane w tym badaniu powinno jednak pozwolić na identyfikację emitera wokalizacji w większości przypadków, jeśli nagrania wideo są prawidłowo zsynchronizowane.
Odgłosy izolacyjne szczeniąt nagrane podczas rozwoju nie są zakłócane przez hałas tła z ściółki. Zazwyczaj bardzo dobrze sprawdza się automatyczna analiza, która pozwala wyodrębnić główne zmienne. Natomiast wokalizacje nagrane przez dorosłe osobniki są zakłócane przez hałas tła zwierząt poruszających się po ściółce. Analiza automatyczna może zakończyć się niepowodzeniem i dlatego należy użyć analizy ręcznej. Niemniej jednak dodanie ściółki w klatce testowej powinno zapewnić warunki, które są mniej stresujące dla zwierząt niż goła gleba (której myszy nie lubią). Dalsze wysiłki społeczności koncentrują się na poprawie automatycznego wykrywania wokalizacji ultradźwiękowych w różnych warunkach, nawet tych, które sugerują dźwięki tła. Na przykład oprogramowanie VoICE pozwala analizować wokalizacje, które zostały ręcznie wybrane pod kątem braku szumu tła32. W tym oprogramowaniu ekstrakcja zmiennych akustycznych jest automatyczna, ale wymaga wstępnego wyboru ręcznego.
Należy zauważyć, że zmienność międzyosobnicza jest bardzo ważna w zachowaniu wokalnym myszy. Na przykład częstość nawoływania dorosłych samców w obecności samicy rui jest bardzo rozłożona (ryc. 1). Sugerujemy te ustandaryzowane protokoły, aby wywołać wokalizacje ultradźwiękowe już teraz, aby ograniczyć zmienność związaną z kontekstem eksperymentalnym. Niemniej jednak chcielibyśmy zwrócić uwagę na to, jak ważne jest przedstawienie nie tylko średniej i SEM dla danych, ale przede wszystkim poszczególnych punktów w próbkach o małej wielkości33. Bardzo istotne – jeśli nie konieczne – jest również rejestrowanie co najmniej 12 osobników z każdej grupy/genotypu w celu zebrania reprezentatywnych danych. W wielu przypadkach zmienność międzyosobnicza nie powinna być ukrywana (zwykle nie może być) i może mieć duże znaczenie dla identyfikacji osobników będących nosicielami badanej mutacji genetycznej, ale niewykazujących żadnego nietypowego fenotypu. Takie osoby mogą dostarczyć wskazówek na temat kompensacji, co może otworzyć nowe ścieżki terapii zaburzeń genetycznych.
W większości charakterystyk behawioralnych mysich modeli zaburzeń neuropsychiatrycznych zachowanie wokalne i kontakty społeczne są rozpatrywane oddzielnie (np. 19,27,34,35). Najnowsze metody analizy zapewniają obecnie półautomatyczną, szczegółową charakterystykę zdarzeń społecznych i sekwencji zdarzeń podczas interakcji (na przykład za pomocą MiceProfiler)36, a także możliwość łączenia tej analizy z danymi z nagrań dźwiękowych. Główną zaletą tej metody jest zapewnienie kompleksowego wglądu w komunikację społeczną w mysich modelach ASD, aby dokładniej określić, które aspekty komunikacji społecznej są dotknięte tym problemem. W obecnym protokole synchronizacja jest nadal ręczna, ale można to poprawić, uruchamiając nagrywanie wideo za pomocą oprogramowania do nagrywania dźwięku. Tego typu analizy powinny stać się standardem, aby zapewnić bardziej kompleksowe spojrzenie na deficyty komunikacji społecznej w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych. Ponadto do tej pory sygnały głosowe analizowane są głównie od strony emitera (tzn. testy są budowane tak, aby sprzyjać emisji sygnałów głosowych przez badaną mysz, tak jak w obecnych protokołach). Należy teraz skupić się również na odbiorniku tych sygnałów, aby lepiej zidentyfikować funkcje tych sygnałów akustycznych. Powinno się to odbywać poprzez ocenę zachowania nowo przybyłych myszy w obecnych protokołach u dorosłych (na przykład przy użyciu MiceProfiler)36, poprzez wykorzystanie eksperymentów z odtwarzaniem16 lub poprzez ustanowienie nowych protokołów. Rzeczywiście, obecne protokoły przewidują bardzo ograniczone sytuacje, które mogą nie odzwierciedlać dokładnych warunków etologicznych emisji wokalizacji u myszy. Spontaniczna emisja wokalizacji ultradźwiękowych będzie musiała być lepiej scharakteryzowana za pomocą ciągłych nagrań audio i wideo, aby rzucić więcej światła na spontaniczne zachowanie wokalne myszy.

Pacjenci z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi zazwyczaj wykazują deficyty w komunikacji społecznej (np. pacjenci z zaburzeniami ze spektrum autyzmu, schizofrenią lub chorobą Alzheimera)1. Genetycznie modyfikowane myszy są coraz częściej wykorzystywane do modelowania genetycznych przyczyn tych zaburzeń2. Badanie komunikacji społecznej w tych mysich modelach jest bardzo interesujące dla zrozumienia mechanizmów mutacji genetycznych prowadzących do nietypowych dysfunkcji społecznych oraz dla testowania nowych terapii. Ponieważ myszy są zwierzętami społecznymi i komunikują się ze sobą za pomocą sygnałów węchowych, dotykowych, wizualnych i akustycznych, są odpowiednimi modelami do oceny komunikacji społecznej.
Mysie ultradźwiękowe wokalizacje są obecnie używane jako proxy do modelowania genetycznych podstaw deficytów komunikacji głosowej3,4 (ale istnienie uczenia się głosu u tego gatunku jest nadal dyskutowane5,6, nawet jeśli najnowsze badania dowodzą braku uczenia się głosu7). Stwierdzono, że myszy laboratoryjne emitują ultradźwiękowe wokalizacje w relacjach matka-dziecko, w interakcjach społeczno-seksualnych mężczyzna-kobieta, w interakcjach społecznych osób tej samej płci (omówione w odnośniku8) oraz w interakcjach społecznych młodocianych i młodocianych9. Młode myszy emitują odgłosy izolacji w ciągu pierwszych dwóch tygodni życia, gdy są odizolowane od matki i rodzeństwa z miotu10. Samce emitują ultradźwiękowe wokalizacje, gdy znajdują się w obecności samicy rui (lub sygnałów moczowych od niej)11,12. Samce i samice emitują ultradźwiękową wokalizację podczas interakcji z nieznanym przedstawicielem tego samego gatunku13,14. Organizacja i funkcje tych wokalizacji nie są do końca jasne i wymagają dalszych badań. Obecna wiedza na temat aspektu funkcjonalnego ogranicza się do wywoływania zachowań związanych z aportem u matek słyszących odgłosy izolacji szczeniąt, ułatwiania bliskości dorosłych samic w stosunku do wokalizacji dorosłych samców15 oraz zwiększonych zachowań eksploracyjnych dorosłych samców słyszących wokalizacje dorosłych samic16.
Charakteryzacja nieprawidłowości w komunikacji głosowej w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych powinna być przeprowadzona w standardowych warunkach, aby wykluczyć główny wkład warunków eksperymentalnych. Takie charakterystyki, w połączeniu z oceną jednoczesnych interakcji społecznych i badaniami neurobiologicznymi, w różnych modelach genetycznych, powinny poszerzyć naszą wiedzę na temat wkładu genetycznego w różne aspekty komunikacji ultradźwiękowej myszy. W dłuższej perspektywie powinno to rzucić więcej światła na niektóre neurobiologiczne podstawy komunikacji społecznej u ludzi. Obecnie naszym celem jest zapewnienie prostych protokołów, aby niezawodnie wywoływać wokalizacje ultradźwiękowe podczas rozwoju i w wieku dorosłym zarówno dla samców, jak i samic myszy w laboratorium. Takie protokoły powinny ułatwić standaryzację nagrań, aby bardziej wiarygodnie porównywać emisje wokalizacji ultradźwiękowej między szczepami a laboratoriami. Powinno to również ułatwić tworzenie takich nagrań w laboratoriach, które nie mają wcześniejszego doświadczenia z nagraniami wokalizacji ultradźwiękowych myszy. Zwracamy również uwagę na obecną możliwość łączenia danych o wokalizacjach ultradźwiękowych ze szczegółowymi danymi behawioralnymi zbieranymi jednocześnie podczas interakcji społecznych u dorosłych myszy, w celu uzyskania kluczowych informacji na temat upośledzenia społecznego, a także na temat kontekstu emisji wokalizacji ultradźwiękowych. Takie analizy rzucą nowe światło na organizację i funkcje ultradźwiękowych wokalizacji myszy. Na koniec zamieszczamy również informację o możliwości udostępniania nagrań wokalizacji ultradźwiękowej całemu środowisku naukowemu w bazie danych mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Otwarty dostęp do danych dotyczących nagrań dźwiękowych powinien poszerzyć wiedzę na temat komunikacji ultradźwiękowej myszy, umożliwiając naukowcom porównywanie własnych danych z wokalizacjami ultradźwiękowymi zarejestrowanymi w innych laboratoriach (z podobnymi lub różnymi szczepami/protokołami) i/lub kwestionowanie ich metod analizy plików nagranych w innych warunkach.

<table><tbody><tr><td>igły 0,3mm x 13 mm [30&nbsp; G 1/2"]</td><td>BD Microlance</td><td>304000-zielona</td><td></td></tr> <tr><td>pasta do tatuażu</td><td>Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Kanada</td><td>329AA-termometr</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisherbrand, Waltham, USA</td><td>4126 (W255NA)</td><td>-</td></tr><tr><td>własnoręcznie wykonana komora dźwiękoszczelna (szczenięta)</td><td></td><td>Instytut Pasteura, Paryż-pianka</td> <td>akustyczna + plexi; wymiary wewnętrzne (szer. x wys. x gł.): 32 cm x 33 cm x 32 cm</td></tr><tr><td>termister o małej powierzchni + termopara z pojedynczą sondą</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>599814 +</td><td></td></tr> <tr><td>601956-bezwonny długopis</td><td>na przykład: Tusz Giotto</td><td></td> <td>wykonany z wody, zmywalny: te pisaki są przeznaczone dla niemowląt</td></tr><tr><td>Absolutny etanol (100%)</td><td>Sigma Aldrich,&nbsp; Saint-Quentin Fallavier, Francja</td><td>24103</td><td>rozcieńczony 1/10</td></tr><tr><td>Kondensacyjny mikrofon ultradźwiękowy Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlin, Niemcy</td><td>#40011</td><td>wyposażony w przedłużacze firmy Avisoft</td></tr><tr><td>Bramka ultradźwiękowa 416H</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlin, Niemcy</td><td>#34163</td><td>karta dźwiękowa</td></tr><tr><td>Avisoft Recorder USGH</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlin, Niemcy</td><td>#10301; #10302</td><td>oprogramowanie do nagrywania dla Windows Vista, 7 i 8</td></tr><tr><td>Avisoft SASLab Pro</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlin, Niemcy</td><td>#10101, 10111; #10102, 10112; &nbsp;</td><td>Windows 10, 8.1, 8, 7 lub Vista, w tym komputer Apple Macintosh z procesorem Intel z oprogramowaniem Boot Camp, Parallels lub podobnym oprogramowaniem do wirtualizacji.</td></tr><tr><td>Laptop lub komputer Apple Macintosh z systemem Boot Camp</td> <td>—</td><td></td> <td>z systemem Windows 10, 8.1, 8, 7 lub Vista; w przypadku komputerów Apple Macintosh Boot Camp jest preferowany zamiast oprogramowania do wirtualizacji, takiego jak Parallels, ze względu na ograniczenia pamięci</td></tr><tr><td>plastikowy odbiornik (nagrania pup)</td><td>Lock & Zamek, Chatswood, Stany Zjednoczone</td><td>HPL932D</td><td>Lock & Zamek Hermetyczny pojemnik do układania w stosy okrągły 700&nbsp; Ml; używać bez pokrowca; Wymiary: 9&nbsp; cm średnicy, 10 cm wysokości</td></tr><tr><td>PBS 1x (pH = 7,4)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10010-023-szkiełka</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Menzel-Gl&auml; ser, Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald roztwór 500 ml</td><td>RAL R&eacute; actifs, Martillac, Francja</td><td>320070-0500-Giemsa</td><td></td></tr> <tr><td>R 500 ml</td><td>RAL R&eacute; actifs, Martillac, Francja</td><td>720-1107</td><td>rozcieńczony 1/20 w roztworze buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>Fosforanowy roztwór buforowy (własnej roboty)</td><td>-</td><td>-</td><td>pH = 7, 0,1 M: 39 ml NaH2PO4 0,2 M + 61 ml Na2HPO4 0,2 M + 100&nbsp; ml H2O (objętość końcowa: 200&nbsp; ml)</td></tr><tr><td>klatka testowa</td><td>Institut Pasteur,</td><td></td> <td>Paryż-50&nbsp; x&nbsp; 25&nbsp; cm, 30&nbsp; cm wysokości; </td></tr><tr><td>Własnoręcznie wykonana komora dźwiękoszczelna z pleksiglasu (nagrania dla dorosłych)</td><td>Instytut Pasteura, Paryż</td> <td>-</td> <td>pianka akustyczna + PVC; wymiary wewnętrzne (szer. x wys. x gł.): 66 cm x 90 cm x 46 cm</td></tr><tr><td>kamera wideo</td><td>Z Noldus Information Technologies, Wageningen, Holandia</td> <td>-</td> <td>kamera wideo CamTech Super-Hi-Res o wysokiej rozdzielczości; 25 kl./s&nbsp;</td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus Information Technology, Wageningen, Holandia</td><td>http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt</td><td>oprogramowanie do akwizycji wideo</td></tr><tr><td>Wtyczka Mice Profiler Tracker z platformy ICY</td><td>Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paryż</td><td>http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker</td><td>oprogramowanie śledzące do analizy zdarzeń behawioralnych podczas interakcji społecznych</td></tr></tbody></table>

nagrywanie wokalizacji ultradźwiękowych myszy w celu oceny komunikacji społecznej

Recording Mouse Ultrasonic Vocalizations to Evaluate Social Communication

Myszy emitują ultradźwiękowe wokalizacje w różnych kontekstach podczas rozwoju i w wieku dorosłym. Te sygnały głosowe są obecnie wykorzystywane jako wskaźniki zastępcze do modelowania genetycznych podstaw deficytów komunikacji głosowej. Scharakteryzowanie zachowań wokalnych modeli myszy niosących mutacje w genach związanych z zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, takimi jak zaburzenia ze spektrum autyzmu, pomoże zrozumieć mechanizmy prowadzące do deficytów komunikacji społecznej. Udostępniamy tutaj protokoły niezawodnego wywoływania wokalizacji ultradźwiękowej u szczeniąt i dorosłych myszy. Ta standaryzacja pomoże zmniejszyć zmienność między badaniami wynikającą z warunków eksperymentalnych. Odgłosy izolacji szczeniąt są rejestrowane przez cały okres rozwoju od pojedynczych szczeniąt odizolowanych od matki i rodzeństwa z miotu. W wieku dorosłym wokalizacje są rejestrowane podczas interakcji osób tej samej płci (bez komponentu płciowego) poprzez wystawienie społecznie motywowanych mężczyzn lub kobiet na nieznanego przedstawiciela tego samego gatunku. Udostępniamy również protokół nagrywania wokalizacji dorosłych samców narażonych na samicę rui. W tym kontekście w interakcji pojawia się komponent seksualny. Protokoły te zostały ustanowione w celu wywołania dużej ilości wokalizacji ultradźwiękowych u myszy laboratoryjnych. Zwracamy jednak uwagę na istotną zmienność międzyosobniczą w zachowaniu wokalnym myszy, którą należy wziąć pod uwagę, rejestrując minimalną liczbę osobników (co najmniej 12 w każdym stanie). Te nagrania wokalizacji ultradźwiękowych są wykorzystywane do oceny częstotliwości połączeń, repertuaru wokalnego i struktury akustycznej rozmów. Dane są łączone z analizą synchronicznych nagrań wideo, aby zapewnić pełniejszy obraz komunikacji społecznej u myszy. Protokoły te są wykorzystywane do scharakteryzowania deficytów komunikacji głosowej u myszy pozbawionych genu ProSAP1 / Shank2 związanego z zaburzeniami ze spektrum autyzmu. Więcej nagrań wokalizacji ultradźwiękowych można również znaleźć w bazie danych mouseTube, opracowanej w celu sprzyjania wymianie takich danych.

W ramach niniejszych protokołów scharakteryzowaliśmy zachowanie wokalne myszy z brakiem ProSAP1/Shank2, genu powiązanego z zaburzeniami spektrum autyzmu (ASD)23-25. ASD charakteryzują się deficytami w komunikacji społecznej oraz stereotypowymi zachowaniami1. Nasze myszy Shank2-/- wykazywały nadaktywność, zwiększony lęk oraz atypową komunikację wokalną18,26. Rzeczywiście odnotowaliśmy, że myszy Shank2-/- wykazywały atypowy profil rozwojowy w częstotliwości emisji wołań izolacyjnych młodych w porównaniu z typową krzywą w kształcie odwróconej litery U u ich rodzeństwa typu dzikiego. Myszy Shank2-/- wykazywały zwiększoną częstotliwość wołań w P4 i zmniejszoną częstotliwość w P6 w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego (Rycina 2). Zaobserwowaliśmy również zmniejszoną częstotliwość wołań w interakcjach samic z udziałem samicy Shank2-/- w porównaniu z interakcjami z udziałem rodzeństwa typu dzikiego (Rycina 2). Zbadaliśmy repertuar 5 różnych kategorii wołań. Okazał się on różny pomiędzy młodymi (np. tutaj P2, P6 i P10) a osobnikami dorosłymi (Rycina 3). Różnice związane z genotypem były istotne głównie w wieku dorosłym. Podczas interakcji społecznych dorosłych samców lub samic Shank2-/- z samicą C57BL/6N zarejestrowano więcej krótkich wołań i wołań nieustrukturyzowanych w porównaniu z interakcjami z udziałem ich rodzeństwa typu dzikiego (Rycina 3D i E). Mniej złożonych wołań oraz wołań z przeskokami częstotliwości zarejestrowano również podczas interakcji dorosłych samic Shank2-/- z samicą C57BL/6N w porównaniu z interakcjami samic Shank2+/+ (Rycina 3E). Na koniec dokonaliśmy również ręcznego pomiaru zmiennych akustycznych. W trakcie rozwoju nie stwierdzono istotnych różnic związanych z genotypem. W przeciwieństwie do tego, czas trwania wołań zarejestrowanych podczas interakcji dorosłych samic Shank2-/- był krótszy niż tych zarejestrowanych podczas interakcji ich rodzeństwa typu dzikiego (Rycina 4A). Podkreśliliśmy również, że częstotliwość szczytowa wokalizacji ultradźwiękowych wzrastała podczas rozwoju młodych bez istotnych różnic związanych z genotypem26. Podczas interakcji samców lub samic Shank2-/- z samicą C57BL/6N wokalizacje ultradźwiękowe miały niższą częstotliwość szczytową w porównaniu z wołaniami zarejestrowanymi podczas interakcji ich rodzeństwa typu dzikiego (Rycina 4B).
Ponadto niniejszy protokół umożliwił badanie kontekstu emisji wokalizacji ultradźwiękowych poprzez połączenie danych z nagrań audio z danymi behawioralnymi uzyskanymi z programu MiceProfiler (oprogramowanie ICY, Institut Pasteur, Paryż). Na przykład w interakcjach samica-samica większość wokalizacji ultradźwiękowych była emitowana, gdy zwierzęta były w kontakcie, a konkretnie gdy osobnik przebywający w klatce wąchał obszar anogenitalny nowo wprowadzonego osobnika lub gdy przynajmniej znajdował się za nim. Myszy emitowały również wiele wokalizacji ultradźwiękowych, gdy osobnik przebywający w klatce zbliżał się do nowo wprowadzonego osobnika (Rysunek 5, panel górny). Odnotowano mniej wokalizacji, gdy myszy Shank2-/- przebywające w klatce były w kontakcie fizycznym z nowo wprowadzonym osobnikiem (np. wąchając obszar anogenitalny nowo wprowadzonego osobnika), niż gdy osobnik przebywający w klatce był myszą typu dzikiego. Mniej wokalizacji było wyzwalanych, gdy osobnik znajdujący się za nowo wprowadzonym zwierzęciem był myszą Shank2-/-, niż gdy była to mysz typu dzikiego. Więcej wokalizacji zarejestrowano również wtedy, gdy nowo wprowadzony osobnik znajdował się w polu widzenia myszy przebywającej w klatce, przy czym zjawisko to było wyraźniejsze u osobników typu dzikiego niż u mutantów (Rysunek 5, panel dolny).
<img alt="Wykres porównawczy częstości wokalizacji, typy dzikie vs Shank2 -/-, istotność statystyczna zaznaczona gwiazdkami." src="/files/ftp_upload/53871/53871fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Częstość emisji wokalizacji ultradźwiękowych podczas rozwoju oraz u dorosłych samców i samic myszy Shank2-/- oraz ich rodzeństwa typu dzikiego. Częstość wokalizacji szczeniąt (co dwa dni od P2 do P12, n = 18-19 Shank2+/+, n = 15-16 Shank2-/-) i osobników dorosłych podczas interakcji samca z samicą w rui (n = 15 Shank2+/+, n = 16 Shank2-/-) oraz interakcji samica-samica (n = 15 Shank2+/+, n = 13 Shank2-/-) u myszy typu dzikiego (panel lewy) i myszy Shank2-/- (panel prawy). Dane przedstawiono jako średnia+/-SEM oraz punkty indywidualne (nieparzysty test Wilcoxona: *p &lt;0.05, **p &lt;0.01, ***p &lt;0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proporcja sygnałów wokalnych u myszy typu dzikiego i Shank2-/-; wielokrotne wykresy słupkowe; analiza wokalizacji." src="/files/ftp_upload/53871/53871fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Repertuar wokalny myszy Shank2-/- i ich rodzeństwa typu dzikiego. Proporcje pięciu różnych typów sygnałów emitowanych przez szczenięta P2 (A; n = 20 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), szczenięta P6 (B; n = 19 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), szczenięta P10 (C; n = 20 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), dorosłych samców w obecności samicy w rutcie (D; n = 16 Shank2+/+, n=16 Shank2-/-) oraz dorosłych samic w obecności innej samicy (E; n = 15 Shank2+/+, n=13 Shank2-/-) u myszy typu dzikiego (panele lewe) i myszy Shank2-/- (panele prawe). Dane przedstawiono jako średnia+/-SEM oraz punkty indywidualne (testy chi-kwadrat: *p &lt;0.05, **p &lt;0.01, ***p &lt;0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie czasu trwania sygnału i maksymalnej częstotliwości szczytowej; typ dziki vs Shank2-/-. Wykres słupkowy; analiza statystyczna." src="/files/ftp_upload/53871/53871fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Zmienne akustyczne wyekstrahowane z wokalizacji ultradźwiękowych u myszy Shank2-/- oraz ich rodzeństwa typu dzikiego. (A) Czas trwania wszystkich połączonych typów sygnałów emitowanych przez młode w dniu P2 (n = 20 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), młode w dniu P6 (n = 19 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), młode w dniu P10 (n = 20 Shank2+/+, n = 18 Shank2-/-), dorosłe samce z samicą w rutcie (n = 16 Shank2+/+, n = 16 Shank2-/-) oraz dorosłe samice z inną samicą (n = 15 Shank2+/+, n = 13 Shank2-/-) u myszy typu dzikiego (panel lewy) i myszy Shank2-/- (panel prawy). (B) Maksymalna częstotliwość szczytowa zmierzona dla wszystkich połączonych typów sygnałów u młodych w dniu P2, P6, P10, dorosłych samców z samicą w rutcie oraz dorosłych samic z inną samicą (te same wartości N co powyżej). Dane przedstawiono jako średnia+/-SEM oraz punkty indywidualne (nieparametryczne testy Wilcoxona: *p &lt;0.05, **p &lt;0.01, ***p &lt;0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procenty wokalizacji ultradźwiękowych, genotypy Shank2, analiza wykresu słupkowego, porównanie statystyczne." src="/files/ftp_upload/53871/53871fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Konteksty emisji ultradźwiękowych wokalizacji myszy w dorosłych interakcjach społecznych samica-samica. Proporcja wokalizacji ultradźwiękowych emitowanych przez pary składające się z myszy Shank2+/+ i myszy C57BL/6N (n = 16, A) oraz pary składające się z myszy Shank2-/- i myszy C57BL/6N (n = 13, B) podczas następujących typów zdarzeń behawioralnych (czerwony: osobnik przebywający w klatce, zielony: osobnik nowy): kontakty społeczne, kontakt oro-oralny, węszenie anogenitalne przez osobnika przebywającego w klatce, węszenie anogenitalne przez osobnika nowego, osobnik przebywający w klatce za osobnikiem nowym, osobnik nowy za osobnikiem przebywającym w klatce, bezruch osobnika przebywającego w klatce, bezruch osobnika nowego, podejście osobnika przebywającego w klatce i ucieczka osobnika nowego, podejście osobnika nowego i ucieczka osobnika przebywającego w klatce, podejście i ucieczka osobnika przebywającego w klatce, podejście i ucieczka osobnika nowego, osobnik przebywający w klatce podążający za osobnikiem nowym, osobnik nowy w polu widzenia osobnika przebywającego w klatce, osobnik przebywający w klatce w polu widzenia osobnika nowego. Dane przedstawiono jako średnia+/-SEM i punkty indywidualne (nieparzyste testy Wilcoxona: *p <0,05, **p <0,01). Dane niepublikowane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typy połączeń</td>
			<td>Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>krótki</td>
			<td>czas trwania ≤5 ms i zakres częstotliwości ≤6,25 kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>prosty</td>
			<td>czas trwania &gt;5 ms i zakres częstotliwości ≤6,25 kHz (płaska charakterystyka), lub modulacja częstotliwości tylko w jednym kierunku (w górę lub w dół) z zakresem częstotliwości &gt;6,25 kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kompleks</td>
			<td>modulacje częstotliwości w więcej niż jednym kierunku i zakresie częstotliwości &gt;6,25 kHz (modulowane) lub włączenie jednej lub więcej dodatkowych składowych częstotliwości (harmonicznych lub zjawisk nieliniowych, ale bez nasycenia), przy czym nie ma ograniczeń co do zakresu częstotliwości (złożone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>skoki częstotliwości</td>
			<td>uwzględnienie jednego skoku (jednego skoku częstotliwości) lub większej liczby skoków (skoków częstotliwości, innych) w częstotliwości bez przerwy czasowej między kolejnymi składowymi częstotliwości, z (mieszaną) lub bez jakiejkolwiek części szumowej w obrębie czystego sygnału dźwiękowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>niestrukturalny</td>
			<td>brak identyfikowalnej składowej czystego tonu; sygnały „szumiące”</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Charakterystyka pięciu typów ultradźwiękowych wokalizacji myszy.Przykłady kryteriów czasu trwania, zakresu częstotliwości, modulacji częstotliwości oraz skoków częstotliwości wykorzystywanych do określenia 5 różnych typów wokalizacji w ramach ultradźwiękowych wokalizacji myszy.

Mysie ultradźwiękowe wokalizacje są używane jako proxy do modelowania genetycznych podstaw deficytów komunikacji głosowej w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych. Niniejszy protokół opisuje trzy konteksty eksperymentalne, które niezawodnie wywołują ultradźwiękowe wokalizacje od szczeniąt (w trakcie rozwoju) i dorosłych myszy (interakcje tej samej płci, interakcje samca-samicy w rui).

Nagrywanie wokalizacji ultradźwiękowych myszy w celu oceny komunikacji społecznej

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies ...

Ogólnym celem tego protokołu jest rejestrowanie i analizowanie wokalizacji ultradźwiękowych od szczeniąt myszy lub dorosłych osobników, a następnie publiczne udostępnienie danych w bazie danych mouseTube. Wcześniej zidentyfikowaliśmy mutacje w autyzmie, więc teraz chcemy zrozumieć rolę tych genów. Używamy modeli mysich, a w szczególności przyglądamy się ultradźwiękowej wokalizacji myszy.Model ten może pomóc w zrozumieniu kluczowych pytań w dziedzinie neuronauki. Na przykład, jak mutacje genetyczne wpływają na komunikację społeczną w mysim modelu zaburzeń neuropsychotycznych, takich jak autyzm. Główną zaletą tego protokołu jest to, że wokalizacja adresowana do myszy jest niezawodnie wywoływana.Powinno to sprzyjać standaryzacji informacji kontekstowych w celu poprawy porównań między badaniami. Metoda ta pozwoli również poszerzyć wiedzę na temat komunikacji wewnątrzdźwiękowej myszy z wykorzystaniem bazy danych mouseTube. Po przygotowaniu myszy i uzyskaniu nowonarodzonych szczeniąt ustaw klatkę, aby nagrywać ich rozmowy.Użyj dźwiękoszczelnego pudełka lub styropianowego pudełka. Najpierw ustaw termometr, aby monitorować temperaturę wewnętrzną. Następnie przez otwór w górnej części pudełka opuść pojemnościowy mikrofon ultradźwiękowy tak, aby membrana mikrofonu znajdowała się około 12 do 15 centymetrów nad podłogą.Teraz podłącz mikrofon do karty dźwiękowej komputera. Umieść nieeksperymentalne szczenię w czystym plastikowym uchwycie na szczenię w pudełku z nagraniami i zamknij je. Spraw, aby szczytowy dźwięk nagrania wykorzystywał pełną dostępną amplitudę bez zniekształceń.Nie zmieniaj tego ustawienia podczas eksperymentu. Teraz, w celu pomiarów eksperymentalnych, umieść szczeniaka tak delikatnie i szybko, jak to możliwe, w czystym plastikowym kubku. Następnie umieść szczeniaka pod mikrofonem i zamknij pudełko tak delikatnie i cicho, jak to możliwe.Następnie wykonaj 16-bitowe nagranie w rozdzielczości 300 kiloherców, aby uzyskać zestaw danych o wysokiej jakości. Po maksymalnie pięciu minutach nagrywania usuń pup. Zwróć uwagę na tatuaż łapy, a następnie zmierz temperaturę skóry za pomocą termometru cyfrowego.Teraz zrób mały znak na szczeniaku za pomocą atramentu na bazie wody i przywróć go do gniazda. Pomiędzy testami umyj kubek 10% etanolem i pozwól mu całkowicie wyschnąć. W przypadku klatki testowej dla dorosłych użyj klatki z pleksiglasu, która mieści się w dźwiękoszczelnym pudełku oświetlonym białym światłem o niskiej intensywności.Wyczyść klatkę wodą z mydłem, osusz ją i napełnij dwoma centymetrami świeżej ściółki. Zamocuj mikrofon w jednym rogu klatki i dostosuj kąt mikrofonu, aby przechwytywać dźwięki z całej klatki. Następnie umieść kamerę wideo nad dźwiękoszczelną komorą tak, aby patrzyła na powierzchnię klatki testowej bez zasłaniania rogu przez mikrofon.Używając nieeksperymentalnej pary zwierząt, ustaw wzmocnienie nagrania jak poprzednio. Na potrzeby eksperymentu należy najpierw wprowadzić do klatki jedno zwierzę, aby pełniło rolę lokatora. Pozwól mu się przyzwyczaić przez 20 minut.W tym czasie można dokonać zapisu linii bazowej. Następnie rozpocznij nagrania wideo i audio i wprowadź drugie zwierzę tej samej płci, aby wypełnić rolę nowicjusza. Zsynchronizuj nagrania, uruchamiając sygnał dźwiękowy, gdy sekunda dotknie klatki.Rejestruj interakcje zwierząt tak długo, jak to konieczne, na przykład przez cztery minuty. Aby przygotować się do tego testu, wcześnie rano w dniu badania należy pobrać wymazy z pochwy każdej samicy, aby określić jej status w cyklu rujowym. Chwyć samicę za ogon i pozwól jej chwycić siatkę klatki.Za pomocą pipety kilkakrotnie przepłucz jej pochwę, wstrzykując i zbierając 20 mikrolitrów PBS. Zwróć uwagę na PBS, gdy jest wypłukiwany z pochwy. Kiedy jest lekko mętny, zawiera wystarczającą ilość komórek.Rób to ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się śluzu. Rozprowadzić próbkę na szkiełku. Jednocześnie można zbadać do czterech urządzeń.Poczekaj, aż próbki wyschną przed kontynuowaniem. Pod wyciągiem inkubować szkiełka w kąpieli z 0,1 molowym roztworem Maya-Grunwalda w PBS przez trzy minuty. Następnie przenieś szkiełka do kąpieli PBS na minutę.Następnie przenieść szkiełka do kąpieli o zawartości 5% objętości Giemsa R w PBS. Po 10 minutach płucz szkiełka w świeżym PBS przez kolejną minutę. Następnie sprawdź poplamione szkiełka.Jeśli próbka pokazuje tylko duże, zrogowaciałe komórki nabłonka, które nie mają jąder i zabarwiają się na niebiesko, samica jest w pełnej rui. Tylko takie samice mogą być użyte do testu. Teraz ustaw klatkę testową z mężczyzną jako pasażerem.Pozwól mu przyzwyczaić się przez 10 minut i w razie potrzeby wykonaj podstawowe nagranie dźwiękowe. Następnie rozpocznij nagrania wideo i audio i wprowadź samicę w pełnej rui. Zsynchronizuj rekordy tak jak poprzednio, używając sygnału dźwiękowego.Następnie pozwól zwierzętom wchodzić w interakcje tak długo, jak to konieczne, na przykład przez cztery minuty. Po zakończeniu nagrywania przywróć myszy do odpowiednich klatek. Aby przesłać dane na stronę mouseTube w Instytucie Pasteura, najpierw zaloguj się.Sprawdź, czy nagrany szczep myszy istnieje w bazie danych mouseTube, klikając przycisk Szczepy. Jeśli nie, poproś administratorów o jego utworzenie. Następnie utwórz tematy zwierząt.Wprowadzić kody identyfikacyjne zarejestrowanych zwierząt. Zbierz je w grupy, aby ułatwić późniejsze pobieranie danych. Następnie podaj opis zastosowanego protokołu.Teraz utwórz eksperyment dla każdej sesji nagraniowej. Należy określić protokół, grupę osób, która została nagrana, używany sprzęt i oprogramowanie oraz ich specyfikę. Eksperyment zbiera wszystkie metadane odpowiadające plikom wokalizacji.Następnie utwórz link do plików wokalizacji. Najpierw wybierz eksperyment z listy. Następnie skopiuj i wklej adres URL pliku wokalizacji w odpowiednim polu kolumny Pliki do połączenia.Możliwe, że link, który umieszczasz do tej bazy danych, nie jest w rzeczywistości dobry. Upewnij się, że serwer, na którym znajdują się pliki wokalizacji, jest dostępny dla członków społeczności spoza Twojej instytucji. W obszarze Szczegóły, w sekcji Uwagi, aby podać w razie potrzeby.Na przykład określ, że wprowadzono łącze do pliku wideo, który towarzyszy plikowi audio. Na koniec, po dokonaniu wpisów, zweryfikuj je. Nie jest konieczne wypełnianie każdego pola dla każdego pliku.W razie potrzeby zmodyfikuj wprowadzone linki. Scharakteryzowano myszy pozbawione ekspresji Shank2, genu związanego z zaburzeniami ze spektrum autyzmu. Myszy te wykazywały nietypową komunikację głosową, którą po raz pierwszy można było zaobserwować jako zmniejszoną częstotliwość połączeń w interakcjach samic.Następnie oceniono standardowy repertuar pięciu zawołań, które zmieniają się z okresu szczenięcego na dorosłość. Pierwsze pomiary wykonano na szczeniętach P2. Repertuar wokalny nie zmienił się u szczeniąt P6.W P10 repertuar wokalny był wciąż ten sam. Do tego momentu nie było dużego deficytu wykazywanego przez myszy zerowe Shank2. Jednak w wieku dorosłym uwidoczniły się różnice związane z genotypem.Kiedy samce wchodziły w interakcje z samicami w rui, nastąpił znaczny wzrost odsetka krótkich i nieustrukturyzowanych odgłosów wykonywanych przez zmutowane samce. We wzorcach połączeń słyszanych między samicami, samice Shank2 null emitowały więcej krótkich i nieustrukturyzowanych połączeń, a także mniej złożonych połączeń i mniej połączeń skokowych częstotliwości w połączeniu z normalnymi samicami. Sparowane myszy bez Shank2, samce lub samice, wokalizowały z niższą częstotliwością szczytową w porównaniu z parami dzikich kolegów z miotu.Synchronizacja analizy zdarzeń behawioralnych i emisji wokalizacji pozwoliła na identyfikację upośledzeń w kontekście emisji wokalizacji ultradźwiękowych u zmutowanych myszy. Myszy puste Shank2 wokalizowały rzadziej w kontakcie fizycznym z nowicjuszami, a dokładniej podczas wąchania okolicy odbytu i narządów płciowych. Więcej wokalizacji było słychać, gdy nowicjusze znaleźli się w polu widzenia myszy zerowych Shank2.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak nagrywać ultradźwiękowe wokalizacje myszy i przesyłać dane do bazy danych mouseTube. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o nagraniu wystarczającej liczby osób wstępnie przygotowanych, biorąc pod uwagę wysokość i wewnętrzną żywotność bariery głosowej myszy.

recording-mouse-ultrasonic-vocalizations-to-evaluate-social

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ultradźwiękowe wokalizacje (USV) u myszy różnią się w zależności od wieku, płci, stanu i tła genetycznego. Wykorzystując dwa emitery ultradźwiękowe nadające jednocześnie w różnych lokalizacjach, ten test dwukrotnego wyboru może ocenić rozpoznawanie myszy i reakcje preferencji na różne cechy USV.

Określanie preferencji wokalizacji ultradźwiękowej u myszy za pomocą testu odtwarzania dwóch wyborów

Myszy wytwarzają złożony, wielosylabowy repertuar wokalizacji ultradźwiękowych (USV). Te USV są szeroko stosowane jako odczyty zaburzeń neuropsychiatrycznych. Protokół ten opisuje niektóre z praktyk, których nauczyliśmy się i opracowaliśmy, aby konsekwentnie indukować, zbierać i analizować cechy akustyczne i składnię piosenek myszy.

Wywoływanie i analizowanie piosenek z wokalizacji ultradźwiękowej (USV) samców myszy

Ultradźwiękowe wołania szczurów i myszy laboratoryjnych (USV) są przydatne do badania funkcji głosowych i nerwowych. Ten protokół opisuje paradygmat nagrody pokarmowej, który niezawodnie wywołuje wołania USV dotyczące pożądania bez zamieszań związanych z rozmnażaniem. Zawiera szczegóły dotyczące kondycjonowania zwierząt, prezentacji bodźców, nagrywania i analizy akustycznej, dostarczając metodę odtwarzalną do badania funkcji afektywno-motywacyjnych i czopowych czuciowo-ruchowych.

Elicytacja pokarmu przedwidziała wzmożenie apetytowych ultradźwiękowych wokalizacji u szczurów laboratoryjnych i myszy

Poprzednie badania nad społecznym wymiarem stresu koncentrowały się na dwóch ważnych zmiennych: tożsamości społecznej i wsparciu społecznym. Protokół ten wprowadza skuteczną eksperymentalną manipulację tymi dwoma zmiennymi społecznymi i opisuje ich implementację w standardowym paradygmacie indukcji stresu (Trier Social Stress Test).

Społeczny wymiar stresu: eksperymentalne manipulacje wsparciem społecznym i tożsamością społeczną w teście stresu społecznego w Trewirze

Pamięć robocza przewiduje znaczną ilość wariancji dla różnych zadań poznawczych, w tym mówienia, czytania i pisania. Dostępnych jest jednak niewiele narzędzi do oceny pamięci roboczej u dzieci. Prezentujemy innowacyjną, komputerową baterię, która kompleksowo ocenia różne składowe pamięci operacyjnej u dzieci w wieku szkolnym.

Ocena pamięci roboczej u dzieci: Kompleksowa bateria oceny dla dzieci – Pamięć robocza (CABC-WM)

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Tutaj prezentujemy protokół do administrowania odnośnikiem wideo wzajemnych zachowań społecznych (vrRSB) za pomocą wersji papierowej lub online. Badanie to określa ilościowo RSB, warunek wstępny kompetencji społecznej, u małych dzieci za pomocą elementów "wideoreferencyjnych", w których badany jest porównywany z dzieckiem referencyjnym pokazanym w trzyminutowym filmie.

Wykorzystanie kotwicy punktacji wideo do szybkiej seryjnej oceny komunikacji społecznej u małych dzieci

Ten artykuł opisuje zadanie ERP oparte na semantycznym torowaniu, wykorzystujące pary obrazów i słów w obrębie modalności do badania przetwarzania semantycznego u osób z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD).

Zadanie związane z potencjałem związanym ze zdarzeniami semantycznego torowania (ERP) do badania przetwarzania leksycyczno-semantycznego i wzrokowo-semantycznego w zaburzeniach ze spektrum autyzmu

Paradygmat świata wizualnego monitoruje ruchy gałek ocznych uczestników w przestrzeni wizualnej, gdy słuchają lub mówią w języku mówionym. Paradygmat ten może być wykorzystany do zbadania przetwarzania online szerokiego zakresu pytań psycholingwistycznych, w tym stwierdzeń semantycznie złożonych, takich jak zdania rozłączne.

Wykorzystanie ruchów gałek ocznych zarejestrowanych w paradygmacie świata wizualnego do zbadania przetwarzania języka mówionego online

Prezentujemy wizualny przewodnik po zachowaniach obronnych u mrówek tnących liście, z indywidualnymi klipami i towarzyszącymi im definicjami, zilustrowanymi eksperymentalnym scenariuszem infekcji. Naszym głównym celem jest pomoc innym badaczom w rozpoznawaniu kluczowych zachowań obronnych i zapewnienie wspólnego zrozumienia dla przyszłych badań w tej dziedzinie.

Wizualny przewodnik do badania obrony behawioralnej przed atakami patogenów u mrówek tnących liście

Poznaj metodę nagrywania ultradźwiękowych wokalizacji myszy w celu oceny komunikacji społecznej i wpływu mutacji genetycznych na zachowania. Protokół umożliwia standaryzację badań nad zaburzeniami neurorozwojowymi.

Nagrywanie wokalizacji ultradźwiękowych myszy w celu oceny komunikacji społecznej

Przeglądaj więcej filmów