Name: Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych nowotworowych z ludzkiego kostniakomięsaka przy użyciu testu formowania sarkosfer. Technika ta umożliwia badanie biologii CSC i poszukiwanie nowych terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.

<ol><li>Reddick, R. L., Michelitch, H. J., Levine, A. M., Triche, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+sarcoma%3A+a+study+of+the+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteogenic sarcoma: a study of the ultrastructure.</a> Cancer. 45 (1), 64-71 (1980).</li>
<li>Gatta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+cancer+survival+trends+in+Europe%3A+a+EUROCARE+Working+Group+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood cancer survival trends in Europe: a EUROCARE Working Group study.</a> J. Clin. Oncol. 23 (16), 3742-3751 (2005).</li>
<li>Olstad, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+heterogeneity+in+human+osteosarcoma+demonstrated+by+enriched+mRNAs+isolated+by+directional+tag+PCR+subtraction+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular heterogeneity in human osteosarcoma demonstrated by enriched mRNAs isolated by directional tag PCR subtraction cloning.</a> Anticancer. Res. 23 (3B), 2201-2216 (2003).</li>
<li>Geller, D. S., Gorlick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+a+review+of+diagnosis%2C+management%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Adv+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: a review of diagnosis, management, and treatment strategies.</a> Clin Adv Hematol Oncol. 8 (10), 705-718 (2010).</li>
<li>Tang, N., Song, W. X., Luo, J., Haydon, R. C., He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+development+and+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma development and stem cell differentiation.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 466 (9), 2114-2130 (2008).</li>
<li>Kempf-Bielack, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+relapse+after+combined+modality+therapy%3A+an+analysis+of+unselected+patients+in+the+Cooperative+Osteosarcoma+Study+Group+%28COSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma relapse after combined modality therapy: an analysis of unselected patients in the Cooperative Osteosarcoma Study Group (COSS).</a> J. Clin. Oncol. 23 (3), 559-568 (2005).</li>
<li>Meyers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+a+randomized%2C+prospective+trial+of+the+addition+of+ifosfamide+and%2For+muramyl+tripeptide+to+cisplatin%2C+doxorubicin%2C+and+high-dose+methotrexate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: a randomized, prospective trial of the addition of ifosfamide and/or muramyl tripeptide to cisplatin, doxorubicin, and high-dose methotrexate.</a> J. Clin. Oncol. 23 (9), 2004-2011 (2005).</li>
<li>Gorlick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+childhood+osteogenic+sarcoma+and+potential+targets+for+therapeutic+development%3A+meeting+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biology of childhood osteogenic sarcoma and potential targets for therapeutic development: meeting summary.</a> Clin. Cancer Res. 9 (15), 5442-5453 (2003).</li>
<li>Hayden, J. B., Hoang, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma%3A+basic+science+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma: basic science and clinical implications.</a> Orthop. Clin. North Am. 37 (1), 1-7 (2006).</li>
<li>Thomas, D., Kansara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+in+osteogenic+differentiation+and+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications in osteogenic differentiation and transformation.</a> J. Cell. Biochem. 98 (4), 757-769 (2006).</li>
<li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+retinoblastoma+gene+in+primary+osteosarcomas+and+other+bone+and+soft-tissue+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of the retinoblastoma gene in primary osteosarcomas and other bone and soft-tissue tumors.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 270 (270), 271-277 (1991).</li>
<li>Chou, A. J., Gorlick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+resistance+in+osteosarcoma%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy resistance in osteosarcoma: current challenges and future directions.</a> Expert. Rev. Anticancer Ther. 6 (7), 1075-1085 (2006).</li>
<li>Arndt, C. A. S., Crist, W. M. Common musculoskeletal tumorsof childhood and adolescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArndt%2C+CAS+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 341 (5), 342-352 (1999).</li>
<li>Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bone+osteosarcoma+in+the+pediatric+age%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Treat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: state of the art.</a> Cancer. Treat. Rev. 32 (6), 423-436 (2006).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcome+for+patients+with+nonmetastatic+osteosarcoma+of+the+extremity+treated+at+the+istituto+ortopedico+rizzoli+according+to+the+istituto+ortopedico+rizzoli%2Fosteosarcoma-2+protocol%3A+an+updated+report%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcome for patients with nonmetastatic osteosarcoma of the extremity treated at the istituto ortopedico rizzoli according to the istituto ortopedico rizzoli/osteosarcoma-2 protocol: an updated report.</a> J. Clin. Oncol. 18 (24), 4016-4027 (2000).</li>
<li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells-perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions: AACR workshop on cancer stem cells.</a> Cancer. Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat. Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+accumulating+evidence+and+unresolved+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: accumulating evidence and unresolved questions.</a> Nat. Rev. Cancer. 8 (10), 755-768 (2008).</li>
<li>Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of cancer stem cells.</a> Semin. Cancer Biol. 17 (3), 204-213 (2007).</li>
<li>Rubio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+human+adult+stem+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Spontaneous human adult stem cell transformation.</a> Cancer. Res. 65 (8), 3035-3039 (2005).</li>
<li>Burns, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenic+heterogeneity+in+cancer+stem+cells+evolved+from+long-term+cultures+of+telomerase-immortalized+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumorigenic heterogeneity in cancer stem cells evolved from long-term cultures of telomerase-immortalized human mesenchymal stem cells.</a> Cancer. Res. 65 (8), 3126-3135 (2005).</li>
<li>Zhang, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+etiology+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the etiology and treatment of cancer.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16 (1), 60-64 (2006).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+transgenes+encoding+components+of+the+Wnt+signaling+pathway+preferentially+induce+mammary+cancers+from+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence that transgenes encoding components of the Wnt signaling pathway preferentially induce mammary cancers from progenitor cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 100 (26), 15853-15858 (2003).</li>
<li>Sell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+cancer%3A+dedifferentiation+or+stem+cell+maturation+arrest%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of cancer: dedifferentiation or stem cell maturation arrest?</a> Environ Health Perspect. 101 (Suppl 5), 15-26 (1993).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24 (4), 372-376 (2000).</li>
<li>Hochedlinger, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+reprogramming+and+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear reprogramming and pluripotency.</a> Nature. 441 (7097), 1061-1067 (2006).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells and drug resistance.</a> Nat. Rev. Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Ma, S., Lee, T. K., Zheng, B. J., Chan, K. W., Guan, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+HCC+cancer+stem+cells+confer+chemoresistance+by+preferential+expression+of+the+Akt%2FPKB+survival+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">CD133+ HCC cancer stem cells confer chemoresistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway.</a> Oncogene. 27 (12), 1749-1758 (2008).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+isolated+from+mesenchymal+neoplasms+have+tumor+initiating+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Side population cells isolated from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential.</a> Cancer. Res. 67 (17), 8216-8222 (2007).</li>
<li>Ma, I., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+human+aldehyde+dehydrogenase+in+normal+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem.+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells.</a> Stem. Cell. Rev. 7 (2), 292-306 (2011).</li>
<li>Awad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+ALDH+activity+identifies+chemotherapy-resistant+Ewing%27s+sarcoma+stem+cells+that+retain+sensitivity+to+EWS-FLI1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High ALDH activity identifies chemotherapy-resistant Ewing's sarcoma stem cells that retain sensitivity to EWS-FLI1 inhibition.</a> PLoS One. 5 (11), e13943(2010).</li>
<li>Fujii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+stem-like+cell+populations+with+drug+resistance+in+human+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming stem-like cell populations with drug resistance in human sarcoma cell lines.</a> Int. J. Oncol. 34 (5), 1381-1386 (2009).</li>
<li>Di Fiore, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+molecular+characterization+of+the+human+osteosarcoma+3AB-OS+cancer+stem+cell+line%3A+a+possible+model+for+studying+osteosarcoma+origin+and+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic and molecular characterization of the human osteosarcoma 3AB-OS cancer stem cell line: a possible model for studying osteosarcoma origin and stemness.</a> J. Cell. Physiol. 228 (6), 1189-1201 (2013).</li>
<li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonicprogenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A multipotent EGF-responsive striatal embryonicprogenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gibbs, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+cells+in+bone+sarcomas%3A+implications+for+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Stem-like cells in bone sarcomas: implications for tumorigenesis.</a> Neoplasia. 7 (11), 967-976 (2005).</li>
<li>Beccari, N., Mazzi, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeccari%2C+N+%22Manuale+di+tecnica+microscopic.+Casa+Editrice+Dr.+Francesco+Vallardi+Societ%C3%A0+Editrice+Libraria%22">Manuale di tecnica microscopic. Casa Editrice Dr. Francesco Vallardi Società Editrice Libraria</a>. , 99-100 (1966).</li>
<li>Majumdar, M. K., Thiede, M. A., Mosca, J. D., Moorman, M., Gerson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+comparison+of+cultures+of+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28MSCs%29+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.</a> J. Cell. Physiol. 176 (1), 57-66 (1998).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+bone+sarcomas+contain+CD133%2B+cancer+stem+cells+displaying+high+tumorigenicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Human primary bone sarcomas contain CD133+ cancer stem cells displaying high tumorigenicity in vivo.</a> FASEB J. 25 (6), 2022-2030 (2011).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Martins-Neves, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+implications+of+an+enriched+cancer+stem-like+cell+population+in+a+human+osteosarcoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Therapeutic implications of an enriched cancer stem-like cell population in a human osteosarcoma cell line.</a> BMC Cancer. 12 (1), 139(2012).</li>
<li>Tang, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+osteosarcoma+stem+cells+by+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Enrichment of osteosarcoma stem cells by chemotherapy.</a> Chin. J. Cancer. 30 (6), 426-432 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

CSC mają kilka właściwości, które pozwalają na identyfikację tego konkretnego podzbioru komórkowego w masie guza. Na podstawie tych cech, takich jak nabyta oporność na cytotoksyczne środki chemioterapeutyczne na nadekspresję wielolekowych transporterów wypływu kasety wiążącej ATP28, 32, 33 lub na zwiększenie ekspresji enzymów detoksykacyjnych, takich jak ALDH32, na ekspresję określonego markera powierzchniowego, takiego jak CD133, CD44, CD34, CD90 i inne30, 34, 35, 41, opracowano kilka różnych metod izolacji CSC42-44. Jedną z tych technik jest test tworzenia kuli, który opiera się na zdolności CSC do wzrostu w warunkach nieprzylegających.
Zdolność tkankowych komórek macierzystych i CSC do tworzenia kul została po raz pierwszy opisana w badaniach nad identyfikacją nerwowych komórek macierzystych przez Reynoldsa i wsp.37. Następnie Gibbs i wsp.38 wykorzystali te badania, aby rozpocząć izolację CSC od guzów litych, w szczególności od mięsaków kostnych. Zdecydowaliśmy się na zastosowanie metody tworzenia kul zilustrowanej przez Gibbsa i wsp. do izolowania CSC z linii komórkowych OBS uzyskanych z konwencjonalnych biopsji OS. Dostosowaliśmy oryginalną metodę, aby poprawić wyniki tego testu i ułatwić jego odtwarzalność dla innych linii komórek nowotworowych. W odniesieniu do ustanowienia testu tworzenia kuli, sprawdziliśmy, że posiew 40 000 komórek/studzienkę jest dobrą praktyką utrzymywania komórek w izolacji na początku testu. Ta sztuczka jest bardzo ważna, aby uniknąć możliwości, że kuliste kolonie pochodzą z agregacji komórek, a nie ze szczególnej i wyłącznej zdolności pojedynczego CSC do wzrostu w warunkach nieprzylegających i tworzenia kulistej kolonii. Ta zdolność jest szczególnie krytycznym punktem tego testu.
Certyfikat wykazał również, że aby uzyskać dobre tempo tworzenia się sfery, wystarczy odświeżać porcje czynników wzrostu co 3 dni, a nie codziennie, jak opisano w oryginalnej metodzie. W tym badaniu ustaliliśmy również i obszernie opisaliśmy dobrą metodę izolowania kulistych kolonii, które utworzyły się podczas hodowli w warunkach nieprzylegających. Ten krok ma kluczowe znaczenie w tym teście, ponieważ bardzo ważne jest, aby spróbować wyizolować jak najwięcej kulek, które tworzą się w każdej studzience, nie uszkadzając ich. Ważne jest również, aby wyizolować tylko kulki, a nie pojedyncze komórki, które mogą pozostać w zawieszeniu przez czas trwania testu. Aby przezwyciężyć te krytyczne punkty, opracowaliśmy specjalną metodę izolacji, która, jak pokazano powyżej, dała dobre wyniki w izolacji CSC. Oczywiście istnieje możliwość, że nie wszystkie uformowane kule da się odzyskać, ale procent strat jest bardzo niski. Rzeczywiście, mamy również możliwość zastosowania filtra z porami 40 μm do izolowania kul po tym, jak staną się duże (utworzą około 100 - 200 komórek).
Ta izolacja zatrzymuje tworzenie się kulek, ale pozwala na filtrowanie pojedynczych komórek, części reszty metylocelulozy i najmniejszych kulek. Eliminacja ta odbywa się poprzez dokładną filtrację, jak opisano w protokole.
Co więcej, selekcja największych kulistych kolonii przez siatkę 40 μm z wynikającą z tego utratą najmniejszych kulistych kolonii pozwala na wyselekcjonowanie CSC o największej zdolności do tworzenia kulistych kolonii i o większej macierzystości. Wszystkie te modyfikacje zostały przeprowadzone, aby ulepszyć test i pomóc naukowcom badającym CSC w zrozumieniu i odtworzeniu najbardziej krytycznego kroku oryginalnej metody testu formowania kul.
Wśród badań dotyczących metod in vitro do izolowania CSC, niniejsze badanie miało na celu pokazanie, w jaki sposób ten dostosowany test tworzenia kulek może być dobrą metodą izolowania CSC z linii komórkowych OBS. Adaptacje do oryginalnej metody i szczegółowo opisana technika izolacji poprawiają jej skuteczność. W krótkim czasie można uzyskać dużą liczbę CSC i wykorzystać je do kilku eksperymentów. W związku z tym możliwe jest szybkie potwierdzenie fenotypów podobnych do łodyg, a w szczególności zbadanie fenotypu podobnego do podwójnej łodygi, który charakteryzuje OS-CSC. Dlatego ten zmodyfikowany test może być dobrą techniką izolowania CSC i badania ich biologii. W przyszłości metoda ta, z dodatkowymi adaptacjami, może być również stosowana do izolowania CSC z innych skończonych linii komórek nowotworowych uzyskanych za pomocą biopsji rzadkich guzów litych.
Możliwość izolowania CSC z rzadkich guzów litych, takich jak OS, nie tylko pozwala na ulepszenie badań nad tym konkretnym nowotworem, ale także rozszerza się na badania różnych typów nowotworów w celu opracowania lepszych metod ich izolacji oraz na przyszłe badania biologii tego ważnego podzbioru komórkowego. Dlatego, jak to zrobiliśmy w tym badaniu, ważne jest, aby ulepszyć metody izolacji CSC poprzez badanie biologii CSC, z ostatecznym celem znalezienia celów molekularnych i opracowania bardzo specyficznej terapii przeciwnowotworowej skierowanej przeciwko tej konkretnej podgrupie komórkowej, która jest prawdopodobnie odpowiedzialna za utrzymanie guza pierwotnego, rozwój jego nawrotu i pochodzenie przerzutów w kilku narządach. Badanie biologii CSC jest również ważne dla znalezienia terapii, które mogłyby być skuteczne w leczeniu nowotworów, takich jak OS, w przypadku których wskaźnik przeżycia po leczeniu neoadjuwantowym pozostaje bardzo niski.

mięsaki to niejednorodna grupa rzadkich złośliwych nowotworów tkanki łącznej pochodzących głównie z zarodkowej mezodermy1. Różne typy obejmują mięsaki kości i mięsaki tkanek miękkich. Mięsaki kostne, grupa stosunkowo rzadkich nowotworów pierwotnych, składają się z kilku podtypów, w tym kostniakomięsaka (OS). OS, jeden z najczęstszych pierwotnych nowotworów kości, jest mezenchymalnym nowotworem złośliwym, który wykazuje rozległe niejednorodności kliniczne, histologiczne i molekularne2, 3. Niestety, OS występuje głównie u dzieci i młodych dorosłych4, 5 i stanowi 60% powszechnych podtypów histologicznych mięsaka kości w dzieciństwie6, 7. OS zwykle dotyczy obszarów szkieletowych, które charakteryzują się szybkim wzrostem kości (np. przynasada kości długich). Wśród histologicznie różnych podtypów OS, konwencjonalny OS, zwany również rdzeniastym lub centralnym OS, ma wysoki stopień złośliwości i udział kwotowy wynoszący 80%8. Te 80% składa się w 60% z konwencjonalnego osteoblastycznego systemu operacyjnego, 10% chondroblastycznego systemu operacyjnego i 10% fibroblastycznego systemu operacyjnego6, 8-10. Inne podtypy OS obejmują system operacyjny anaplastyczny, teleangiektatyczny, bogaty w olbrzymie komórki i system operacyjny małych komórek. Pomimo postępów w chirurgii skojarzonej i chemioterapii w leczeniu OS, wyniki pozostają słabe, z długoterminowym wskaźnikiem przeżycia wynoszącym 65-70% u pacjentów bez przerzutów11, 12. Nawroty odległe często występują jako przerzuty do płuc lub rzadziej jako przerzuty do odległych kości i nawroty miejscowe13. Przerzuty są często oporne na konwencjonalne leczenie. Ta oporność jest powodem, dla którego 10-letnie przeżycie wolne od choroby wynosi około 30% u pacjentów z chorobą przerzutową w momencie rozpoznania14, 15.
Podobnie jak w przypadku normalnej tkanki, tkanka nowotworowa składa się z niejednorodnego zbioru typów komórek. Komórki w guzie wydają się odpowiadać różnym etapom rozwoju. W każdej normalnej tkance znajduje się subpopulacja komórek ze zdolnością do samoodnawiania, zapewniając w ten sposób komórki progenitorowe i dojrzałe do homeostazy tkanek. Podobnie rak składa się z podobnej niejednorodnej populacji komórek na różnych etapach rozwoju, o różnym stopniu proliferacji i potencjale rakotwórczym. Podzbiór tych komórek rakowych, określany jako rakowe komórki macierzyste (CSC), stanowi rezerwuar samowystarczalnych komórek z wyłączną zdolnością do samoodnawiania i utrzymywania złośliwego potencjału nowotworów, generując w ten sposób różne linie komórkowe, które stanowią masę guza16. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku badania nad ostrą białaczką szpikową dostarczyły pierwszych przekonujących dowodów na istnienie subpopulacji CSC17, 18. Od tego czasu CSC zostały wyizolowane z dużej liczby guzów litych19, stając się tym samym jednym z najczęściej badanych tematów w badaniach nad rakiem. CSC mogą rzeczywiście powstawać z normalnych komórek macierzystych w wyniku mutacji w genach, które sprawiają, że normalne komórki macierzyste są rakowe20-23. Wielokrotne mutacje transformacyjne i interakcje z mikrośrodowiskiem mogą również przyczynić się do tego, że zdrowi przodkowie i dojrzałe komórki nabywają zdolność do samoodnawiania się i nieśmiertelność, które są typowe dla CSC. Istnieje kilka hipotez na temat tej transformacji. Zdrowi przodkowie, zdrowe dojrzałe komórki i komórki rakowe mogą odróżnić się do komórek macierzystych, uzyskując fenotyp podobny do macierzystego poprzez aktywację genów związanych z samoodnową24-28. Pomimo kilku ostatnich badań, pochodzenie CSC nie zostało jeszcze odkryte.
Szczególną cechą CSC jest ich zdolność do opierania się podejściu wieloterapeutycznemu, które składa się z połączonej chirurgii i chemioterapii różnymi lekami. Ostatnie badania wykazały, że CSC mogą również nabyć oporność na cytotoksyczne środki chemioterapeutyczne. Możliwe wyjaśnienia tej oporności obejmują nadekspresję wielolekowego transportera kasety wiążącej ATP (ABC) (tj. MDR1 i BCRP1), nadekspresję enzymów metabolizujących chemioterapię, takich jak dehydrogenaza aldehydowa 1 (ALDH1) i / lub zmiany w kinetyce cyklu komórkowego30-33. Bezpośrednią konsekwencją wszystkich tych koncepcji, które zostały opisane do tej pory, jest to, że terapia przeciwnowotworowa byłaby skuteczna tylko wtedy, gdyby subpopulacja CSC została całkowicie wyeliminowana, podczas gdy miejscowy nawrót lub odległe przerzuty mogłyby wystąpić, gdyby przeżył nawet jeden CSC.
Odkrycie CSC w ludzkich mięsakach34, szczególnie OS35, lub w jakimkolwiek innym nowotworze kości i tkanek miękkich, ma duże znaczenie kliniczne, ponieważ oferuje możliwe wyjaśnienie, dlaczego wiele metod leczenia wydaje się być początkowo skutecznych, ale później u pacjentów dochodzi do nawrotu. Dlatego nadzieją na przyszłą walkę z konwencjonalnym OS jest znalezienie nowych i specyficznych terapii celowanych opartych na rozwoju innowacyjnych leków skierowanych na OS-CSC dzięki charakterystyce molekularnej tej subpopulacji i badaniom biologii CSC.
W 1992 roku Reynolds i współpracownicy, którzy badali, czy w mózgu dorosłego ssaka występuje podzbiór komórek macierzystych, opracowali metodę izolowania komórek podejrzanych o bycie komórkami macierzystymi36, 37. Metoda ta opiera się na szczególnej zdolności tych komórek do tworzenia kulistych kolonii, gdy są hodowane w nieprzylegających warunkach. Podobne techniki zostały zastosowane przez Gibbsa i współpracowników w 2005 roku do zbadania subpopulacji komórek macierzystych w mięsakach kości38. Aby wyizolować i scharakteryzować OS-CSC z pierwotnych kultur komórkowych różnych typów konwencjonalnego OS, zdecydowaliśmy się dostosować tę technikę do linii komórkowych OS.
Tutaj opisujemy tę zaadaptowaną metodę badania formowania sfery, zwaną "testem sarkosfery", która może być użyta do izolacji OS-CSC od skończonych pierwotnych linii komórkowych pochodzących z ludzkich biopsji konwencjonalnego systemu operacyjnego. Opisujemy również wszystkie techniki stosowane do walidacji podobnego do łodygi fenotypu CSC linii komórkowych wyizolowanych za pomocą tego testu: 1) ocena ekspresji genów charakteryzujących pluripotencjalne embrionalne komórki macierzyste (ESC) i genu CD133, który jest markerem CSC; 2) test jednostki tworzącej kolonię (CFU); 3) ocena zdolności tych komórek do różnicowania się w osteoblasty i adipocyty w odpowiednich warunkach różnicowania; 4) badanie markerów powierzchniowych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) (tj. CD44, CD105 i Stro-1) metodą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy metodą cytometrii przepływowej; 5) ocena aktywności ALDH tych komórek.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco z Ca2+ i Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-513F</td><td>_</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco&nbsp; bez Ca2+ i Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-512F</td><td>_</td></tr><tr><td>Trypsyna wieprzowa 1:250</td><td>BD Difco</td><td>215310</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie magazynowe: Proszek</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie podstawowe: Kolagenaza w proszku</td></tr><tr><td>z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td>Rozpuszczalnik: roztwór buforowy, pH 7,4. Stężenie zapasów: Proszek</td></tr><tr><td>Dimetylosulftlenek (DMSO)</td><td>BDH Chemicals-VWR</td><td>10323</td><td>_</td></tr><tr><td>Mieszanina składników odżywczych F-12 Ham</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6636</td><td>Rozpuszczalnik: Ultraczysty dH2O. Stężenie w magazynie:</td></tr><tr><td>Sól trisodowa kwasu 2-fosfo-L-askorbinowego</td><td>w proszku Sigma-Aldrich</td><td>49752</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie podstawowe: 5 mg/ml</td></tr> <tr><td>i beta;-Fosforan glicerolu sól disodowa pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie podstawowe: 1 M</td></tr><tr><td>insuliny. Ludzki rekombinowany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077</td><td>Rozpuszczalnik: NaOH 0,1 M. Stężenie podstawowe: 10 mM</td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>Rozpuszczalnik: DMSO. Stężenie magazynowe: 500 mM</td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>Rozpuszczalnik: DMSO. Stężenie magazynowe: 200 mM</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>Rozpuszczalnik: DMSO. Koncentracja zapasów:&nbsp; 1 mM / 100 &mikro;M. Przechowywać w ciekłym azocie w celu utrzymania aktywności biologicznej</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Ameryka Południowa&nbsp;</td><td>EUROCLONE</td><td>ECS0180L</td><td>_</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (PEN-STREP) 10 000 U/ml</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td>_</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274429</td><td>Rozpuszczalnik: Ultraczysty dH2O. Stężenie podstawowe: 2%</td></tr> <tr><td>dichlorowodorek putresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>Rozpuszczalnik: Ultraczysty dH2O. Stężenie zapasów: Proszek</td></tr><tr><td>apo-Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1147</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie podstawowe: 25 mg / ml</td></tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EFGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5036</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS pH 7,4. Stężenie w magazynie: 10 i mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów-Zasadowy ludzki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS + 0,2% BSA. Stężenie w magazynie: 25 i mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Kwas selenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211176</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie magazynowe: 30 mM</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Rozpuszczalnik: ETOH. Stężenie magazynowe: 10 mM</td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>Rozpuszczalnik: Ultraczysty dH2O. Stężenie w magazynie: Olej w proszku</td></tr><tr><td>Red O</td><td>ICN Biochemicals</td><td>155984</td><td>Rozpuszczalnik: 2-propanol. Stężenie magazynowe: Proszek</td></tr><tr><td>Naftol AS-MX Fosforan Sól disodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5000</td><td>Rozpuszczalnik: DMSO. Stężenie w magazynie:</td></tr><tr><td>Powder Fast Blue BB Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3378</td><td>Rozpuszczalnik: Tris HCL, pH 9,0. Stężenie w magazynie:</td></tr><tr><td>Powder Fast Red Violet LB Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td>Rozpuszczalnik: Tris HCL, pH 9,1. Stężenie magazynowe:</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej w proszku, frakcja V (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: 2%</td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>ICN Biochemicals</td><td>100375</td><td>Rozpuszczalnik: Ultrapure dH2O. Stężenie w magazynie:</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>w proszku Sigma-Aldrich</td><td>533998</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton-100X</td><td>MERCK</td><td>11869</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: 0,2%. Niebezpieczeństwo - Stosować tylko pod kapturem chemicznym</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>MERCK</td><td>2315</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS . Stężenie w magazynie: 200 i mikro; g/ml</td></tr><tr><td>2-propanolu</td><td>MERCK</td><td>109634</td><td>Niebezpieczeństwo - Stosować tylko pod kapturem chemicznym</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Mysz monoklonalna [SN6] do CD105 (FITC)</td><td>Abcam</td><td>ab11415</td><td>Ciecz. Podanie:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Cytometria przepływowa (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Mysz monoklonalna&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; [F10-44-2] na CD44 (PE/Cy7&reg;) )</td><td>Abcam</td><td>ab46793</td><td>Płyn. Podanie:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Cytometria przepływowa (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD45&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Mysz monoklonalna&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; [MEM-28] do CD45 (PerCP))&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab65952</td><td>Płyn. Podanie:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Cytometria przepływowa (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Oczyszczone przeciwciało ludzkie CD105)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD10500</td><td>rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Zastosowanie: Barwienie immunofluorescencyjne (IF)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Przeciwciało anty-CD44)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>EPR1013Y(ab51037)</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Zastosowanie: Barwienie immunofluorescencyjne (IF)</td></tr><tr><td>Ab-Stro-1&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Mysz anty-STRO-1)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>398401</td><td>rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Podanie:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Cytometria przepływowa (Flow Cyt)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Barwienie immunofluorescencyjne (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (IgG przeciw królikom (Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L))</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Zastosowanie: Barwienie immunofluorescencyjne (IF)</td></tr><tr><td>FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L))</td><td>)Invitrogen</td><td>61-6511</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Podanie:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Cytometria przepływowa (Flow Cyt)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Barwienie immunofluorescencyjne (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 635 Falloidyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A34054</td><td>Rozpuszczalnik: DPBS. Stężenie zapasów: Liofilizowane. Zastosowanie: Barwienie immunofluorescencyjne (IF)</td></tr><tr><td>AutoMACS&trade; Uruchomiony bufor separacji MACS Bufor</td><td>Miltenyi</td><td>130,091,221</td><td>Ciecz. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>QIAzol&reg; Odczynnik do lizy</td><td>QIAGEN</td><td>79306</td><td>Niebezpieczeństwo - Stosować tylko pod kapturem chemicznym</td></tr><tr><td>QUANTITECT&reg; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Zestaw do odwrotnej transkrypcji</td><td>QIAGEN</td><td>205314</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Płyn Chlorophorm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>. Niebezpieczeństwo - Stosować tylko pod kapturem chemicznym</td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>GELAIRE</td><td>BSB6A</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaptur chemiczny</td><td>ARREDI TECNICI&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Willa</td><td>Modello&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; DYNAMIKA_</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>EPPENDORF</td><td>5415R</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna LSM 5109 Meta&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermalcykler iCycler PCR&nbsp;</td><td>BIORAD_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>CyFlow&reg; PRZESTRZEŃ&nbsp;</td><td>(PARTEC)</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Odwrócony Micrposkop Aksjowert 200M&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania ,</td><td>Nalgene</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Oryginalny Pipet-Aid</td><td>pbiBrand</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>EPPENDORF_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>SIGMA_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>VICTOR3&handel; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>PERKIN ELMER_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Rury stożkowe&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (15 i 50 ml)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>352096 (na 15 ml)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 352070 (na 50 ml)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>24-dołkowa, przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowych z płaskim dnem poddanym TC</td><td>BD FALCON</td><td>353047</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>6-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe z płaskim dnem i bardzo niskim mocowaniem</td><td>CORNING</td><td>3471</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (5 i 10 ml)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>357543 (na 5 ml)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 357551 (na 10 ml)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka (5mL)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>B|BRAUN</td><td>4617053V</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>szalka Petriego 100X20 mm&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD SOKÓŁ</td><td>353003</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>R&ouml; hren Rury&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (3,5 mL, 55x12mm, PS)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>55,484</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>szalka Petriego 60X15 mm&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD SOKÓŁ</td><td>353004</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Kriowiale 1,5 mL&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>NALGENE</td><td>5000-1020</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych 25 cm&sup2; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD SOKÓŁ</td><td>353014</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtr siatkowy nylonowy, hydrofilowy</td><td>MERCK</td><td>NY4104700</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Uchwyt filtra Swinnex</td><td>MERCK</td><td>SX0002500</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Pęseta Perry&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Lancet</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Odbicie</td><td>_</td><td>_</td><td>_</td></tr></tbody></table>

ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Obecne postępy w terapii kostniakomięsaka (OS) przedłużyły życie pacjentów z rakiem, ale wskaźnik przeżycia wynoszący pięć lat pozostaje niski, gdy wystąpiły przerzuty. Teoria rakowych komórek macierzystych (CSC) utrzymuje, że w guzie znajduje się podzbiór komórek nowotworowych, które mają cechy podobne do łodygi, w tym zdolność do utrzymania guza i odporności na chemioterapię wielolekową. W związku z tym konieczne jest lepsze zrozumienie biologii i patogenezy OS, aby przyspieszyć rozwój terapii celowanych w celu wyeliminowania tej konkretnej podgrupy oraz zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności wśród pacjentów. Izolowanie CSC, tworzenie kultur komórkowych CSC i badanie ich biologii to ważne kroki w kierunku lepszego zrozumienia biologii i patogenezy OS. Ustalenie OS-CSC pochodzenia ludzkiego z biopsji OS było możliwe dzięki kilku metodom, w tym zdolności do tworzenia trójwymiarowych kultur komórek macierzystych w warunkach nieprzylegających. W tych warunkach CSC są w stanie tworzyć kuliste pływające kolonie utworzone przez potomne komórki macierzyste; Kolonie te nazywane są "sferami komórkowymi". W tym miejscu opisano metodę ustanawiania kultur CSC z pierwotnych kultur komórkowych konwencjonalnego OS uzyskanych z biopsji OS. Jasno opisujemy kilka fragmentów wymaganych do wyizolowania i scharakteryzowania CSC.

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Ogólnym celem niniejszego opracowania jest wyizolowanie komórek macierzystych nowotworu z ograniczonej linii komórkowej pochodzącej z ludzkich kostniakomięsaków. Główną zaletą tej pracy jest jasne zaprezentowanie badaczom w dziedzinie onkologii sposobu izolacji komórek macierzystych nowotworu in vitro. Komórki te mogą następnie zostać wykorzystane do badania terapii przeciwkostniakomięsakowych oraz terapii innych guzów litych.Zazwyczaj osoby po raz pierwszy zajmujące się tym zagadnieniem będą miały trudności, jeśli nie będą wiedziały, jak izolować kolonie mięsaka. Wizualna demonstracja tego procesu jest kluczowa, ponieważ etap izolacji jest trudny do przeprowadzenia i zrozumienia. Pomysł na tę technikę pojawił się u nas po zapoznaniu się z testem tworzenia sfer.Opisano przez Gypsuma i współpracowników. Procedurę zaprezentują dr Gaia Palmini, doktorantka, oraz dr Roberto Zonefrati, technik z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować wszystkie niezbędne pożywki hodowlane.Bufory do trawienia oraz inne roztwory niezbędne do przeprowadzenia procedury. Następnie należy stworzyć linię komórkową osteosarcomy, izolując osteosarcomę z potwierdzonej biopsji igłowej lub chirurgicznej oraz podkupując uzyskane komórki zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule tekstowym.Po ustanowieniu hodowli komórek osteosarcoma i osiągnięciu przez płytkę stanu bliskiego konfluencji, usuń medium poprzez aspirację, a następnie poddaj komórki trypsynizacji, aby odłączyć je od płytki. Przenieś komórki do nowej probówki i delikatnie pipetuj zawiesinę komórkową w górę i w dół, aby rozbić wszelkie skupiska komórek.Następnie pobierz 10 µL zawiesiny komórkowej i przenieś ją do komory hemocytometru. Umieść komorę hemocytometru pod mikroskopem fazokontrastowym i oblicz stężenie komórek w zawiesinie. Następnie dodaj 280 000 komórek do 35 ml pożywki do hodowli sarkosfer zawierającej metocelulozę i delikatnie wymieszaj roztwór za pomocą pipety, aby rozbić ewentualne skupiska komórek.Przenieś pięć mililitrów mieszaniny komórek do każdej studni płytek 6-dołkowych o ultra niskiej adhezji (ultra low attachment). Po wysianiu użyj mikroskopu odwróconego, aby zaobserwować wygląd komórek oraz sprawdzić, czy są one odpowiednio odizolowane. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy pięciu procentach dwutlenku węgla.Co trzy dni do każdej studzienki należy dodać świeże alkohole beta FGF i EGF, aby odnowić stężenie czynników wzrostu. Postępy w analizie sarkosfer należy monitorować, obserwując komórki pod mikroskopem w 7, 14, 20, 21 i 28 dniu. Po zaobserwowaniu obecności dużych, czarnych sarkosfer skupionych w centrum studzienki, należy przerwać hodowlę i rozpocząć proces izolacji.W momencie izolacji sarkosfer należy użyć sterylnej pipety o objętości 1 000 µL, aby przenieść medium zawierające sarkosfery do strzykawki z jałowym uchwytem filtra membranowego. Po całkowitym usunięciu medium z sarkosferami, do dołka należy dodać pięć mililitrów medium wzrostowego i wypłukać go, aby upewnić się, że zebrano wszystkie pozostałe sfery.Następnie, za pomocą mikroskopu potwierdź, czy wszystkie sarkosfery zostały odzyskane. Jeśli nie, ponownie przemyj dołek, aż do całkowitego zebrania sfer. Następnie przefiltruj zawiesinę przez uchwyt filtra membranowego metodą grawitacyjną, aby nie uszkodzić sfer i upewnić się, że żadne sarkosfery nie przeniknęły przez filtr.W trakcie tego procesu należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, delikatnie używając sterylnej szklanej pipety Pasteura. Po przefiltrowaniu wszystkich sarkosfer należy przemyć jednostkę filtracyjną, dodając dziesięć mililitrów pożywki bezpośrednio do strzykawki i pozwalając jej przefiltrować bez wywierania nacisku, aby upewnić się, że usunięto pojedyncze komórki. Po przefiltrowaniu zawiesiny sarkosfer należy usunąć filtr z cieczą i zwrócić szczególną uwagę na odzyskanie sarkosfer, które zaplątały się w siatce filtra.W tym momencie odłącz jednostkę filtrującą, zdejmując ją ze strzykawki, a następnie umieść ją w 100 milimetrowej szalce Petriego. Wyjmij filtr siatkowy z uchwytu filtra membranowego za pomocą sterylnej pęsety.Następnie przenieś filtr do nowej szalki Petriego o średnicy 60 mm. Potem wypłucz filtr siatkowy, delikatnie nim potrząsając, dodając 5 mL pożywki wzrostowej, aby uwolnić sarkosfery z splotów membrany.Następnie umieść membranę w dołku i potwierdź pod mikroskopem, czy w membranie nie pozostały już żadne sfery. Ponownie przemyj membranę, a następnie ponownie sprawdź ją pod mikroskopem, jeśli w membranie wciąż znajdują się sfery. Gdy w membranie nie pozostaną już żadne sfery, inkubuj je w pożywce wzrostowej, aby sarkosfery wyrosły w monowarstwę.Monitoruj wzrost komórek macierzystych raka osteosarcoma, które uzyskano z sarkosfer. Proces ten trwa do momentu, aż komórki osiągną około 90% konfluencji w 60 milimetrowej szalce Petriego. Oprócz licznych protokołów opisanych w niniejszym artykule, w towarzyszącym tekście protokołu szczegółowo omówiono metody oceny zdolności do różnicowania, aktywności ALDH, cytometrii przepływowej, immunofluorescencji oraz analizy RTPCR.Próbki osteosarcoma pozyskuje się za pomocą aspiracji cienką igłą lub wycinka chirurgicznego. Przy odpowiednim prowadzeniu hodowli pierwotnych, osiągają one konfluencję w 100 milimetrowej szalce Petriego po około jednym miesiącu. Po ekspansji komórki wysiewa się na płytki sześciodołkowe o ultraniskiej adhezji, aby rozpocząć test sarkosfer.Płytka ta utrzymuje komórki w stanie zawiesiny i zapobiega ich przywieraniu do podłoża. Po siedmiu dniach obserwuje się kilka małych sferycznych kolonii otoczonych pojedynczymi komórkami. Po 28 dniach obserwuje się kilka dużych sarkosfer.Po wyizolowaniu sferycznych kolonii, nowotworowe komórki macierzyste mogą być namnażane z pojedynczych sferkosaczkowych poprzez umieszczenie ich na standardowych płytkach adhezyjnych. Barwienia immunofluorescencyjne wykazały fenotyp podobny do mezenchymalnych komórek macierzystych, ponieważ namnożone komórki były pozytywne pod kątem CD44 i CD105 oraz umiarkowanie pozytywne dla Stro-1. Analiza RTPCR potwierdziła również fenotyp embrionalnych komórek macierzystych poprzez ekspresję trzech genów markerowych dla embrionalnych komórek macierzystych.Nanog, Oct 3/4 i Sox2. Oraz gen CD133, będący markerem komórek macierzystych raka kostniaka. Szczegółowa technika izolacji przedstawiona w tym filmie utoruje drogę innym badaczom do studiowania komórek macierzystych nowotworów, pokazując, jak zrozumieć i powtórzyć krytyczne etapy testu tworzenia sfer.Ta zmodyfikowana metoda analizy stanowi skuteczną technikę izolowania komórek macierzystych nowotworu oraz badania ich biologii. Metoda ta, po wprowadzeniu dodatkowych adaptacji, może być również wykorzystana do izolowania komórek macierzystych nowotworu z innych ograniczonych linii komórkowych raka, uzyskanych z biopsji guzów litych.Podsumowując, izolacja komórek macierzystych nowotworu z kilku typów guzów umożliwi badanie ich biologii. Ostatecznym celem jest zidentyfikowanie celów molekularnych oraz opracowanie bardzo specyficznych terapii przeciwnowotworowych skierowanych przeciwko konkretnym podgrupom komórkowym.

establishment-cancer-stem-cell-cultures-from-human-conventional

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych (CSC) bezpośrednio z tkanek ludzkich jest niezbędna do ich biologicznej charakterystyki. Niniejszy manuskrypt opisuje metodologię izolacji CSC prostaty od tkanek ludzkich, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych etapów.

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych z próbek ludzkiego raka prostaty

Rakowe komórki macierzyste (CSC) są zaangażowane w nawroty nowotworu z powodu chemooporności. Zoptymalizowaliśmy protokół selekcji i namnażania CSC z linii komórkowych raka jajnika. Poprzez traktowanie komórek chemoterapeutykiem cisplatyną i hodowlę w pożywce promującej komórki macierzyste, wzbogacamy je o nieprzylegające hodowle CSC.

Wzbogacanie w chemooporne komórki macierzyste raka jajnika z ludzkich linii komórkowych

Testy sferyczne in vitro są powszechnie używane do identyfikacji komórek macierzystych raka. Tutaj porównujemy testy sferyczne pojedyncze i wielokomórkowe. Bardziej pracochłonne testy jednokomórkowe lub suplementacja metylocelulozą dają dokładniejsze wyniki, podczas gdy testy wielokomórkowe wykonywane w płynnym podłożu mogą mieć duży wpływ na gęstość komórek.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Poniższy protokół skupia się na ustanowieniu pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich (STS) pochodzącego od pacjenta. Model ten może pomóc nam lepiej zrozumieć podłoże molekularne i profil farmakologiczny tych rzadkich nowotworów złośliwych i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu poprawę leczenia STS.

Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Opisujemy szczegółowy protokół izolacji komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim mięsakiem poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytów-1 (HLA-1) jako markera ujemnego, oraz dla dalszej walidacji i charakterystyki tych komórek inicjujących HLA-1-ujemny nowotwór.

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Uśpione i aktywne fenotypy komórek nowotworowych zostały scharakteryzowane za pomocą ilościowego obrazowania fazowego. Testy proliferacji, migracji i morfologii komórek zostały zintegrowane i przeanalizowane w jednej prostej metodzie.

Poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z fibroblastów pochodzących od pacjentów z zespołem Li-Fraumeni (LFS), różnicowania iPSC poprzez mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) do osteoblastów oraz modelowania nowotworzenia in vivo przy użyciu osteoblastów pochodzących od pacjentów z LFS.

Modelowanie kostniakomięsaka za pomocą zespołu Li-Fraumeni Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Obecny protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) przy użyciu ludzkiej tkanki kostniakomięsaka.

Opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z tkankami ludzkiego kostniakomięsaka

Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych nowotworowych z ludzkiego kostniakomięsaka przy użyciu testu formowania sarkosfer. Technika ta umożliwia badanie biologii CSC i poszukiwanie nowych terapii przeciwnowotworowych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Przeglądaj więcej filmów