Połączony model tkankowy 3D guza płuca wykonany in vitro/in silico do przewidywania skuteczności leków w określonych tłach mutacyjnych
6 kwietnia 2016
Prezentujemy trójwymiarowy (3D) model raka płuc oparty na biologicznym rusztowaniu kolagenowym do badania wrażliwości na terapie ukierunkowane na niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Pokazujemy różne techniki odczytu w celu określenia wskaźnika proliferacji, apoptozy i stanu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT). Zebrane dane są integrowane z modelem in silico w celu przewidywania wrażliwości leków.
Ogólnym celem tego połączonego modelu raka płuca in vitro i in silico jest zbadanie wrażliwości terapii celowanych w niedrobnokomórkowym raku płuca oraz przewidzenie skuteczności nowych substancji. Ten system modeli 3D umożliwia monitorowanie specyficznych odpowiedzi komórek na ukierunkowane leczenie lub bezpośrednie kombinacje. Główną zaletą tej techniki jest to, że przewidywania pokryte in silico mogą ułatwić przedkliniczne testowanie leków w bardziej odpowiednim fizjologicznie środowisku.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii różnych jednostek nowotworowych, ponieważ można ją wykorzystać do optymalizacji przewidywań odpowiedzi na leki w oparciu o określone tła mutacyjne. Procedurę zademonstruje Franziska Schmitt, asystentka naukowa z naszego laboratorium. Aby skonfigurować dynamiczną hodowlę, zacznij od hodowli modelu guza w warunkach hodowli statycznej, w koronie komórkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, w konwencjonalnym inkubatorze.
Po trzech dniach zmontuj autoklawizowany bioreaktor i włóż do systemu wysiewane, biologiczne submucoso jelita cienkiego wraz z rusztowaniem błony śluzowej. Następnie dodać 45 mililitrów RPMI, uzupełnionych odpowiednią ilością FCS do kolby i podłączyć bezigłowe urządzenie do pobierania próbek do systemu rurek między bioreaktorem a kolbą z podłożem. Umieść bioreaktor w inkubatorze i podłącz go do pompy, aby hodować model guza przez dodatkowe 14 dni, ze stałym przepływem medium wynoszącym trzy mililitry na minutę.
Aby leczyć statyczny model nowotworu, Gefitynib, w 11 dniu hodowli w konwencjonalnym inkubatorze, najpierw użyj pipety Pasteura, aby usunąć stare podłoże z dołków. Następnie dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego RPMI, uzupełnionego FCS i Gefitinibem, do wnętrza każdej korony komórkowej i 1,5 mililitra do dna każdej studzienki. Aby pobrać próbki Elisy z dynamicznej hodowli, w dniach od 11 do 14 hodowli należy podłączyć strzykawkę do urządzenia do pobierania próbek i usunąć jeden mililitr pożywki z systemu bioreaktora.
Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż do wykonania testu Elisa. Aby określić liczbę jąder dodatnich Ki67, najpierw użyj mikroskopu odwróconego, aby uzyskać pięć obrazów fluorescencyjnych barwienia DAPI i pięciu Ki67 kultur 2D przy 20-krotnym powiększeniu każdego warunku, z nienakładających się na siebie odcinków próbki. Aby ręcznie policzyć dodatnie jądra Ki67, otwórz wyłoniony obraz na Fidżi i wybierz Wtyczki i Licznik komórek, a następnie kliknij inicjalizację, wybierz typ licznika i kliknij każde dodatnie jądro Ki67.
Liczba klikniętych komórek pojawi się obok wybranego typu licznika. Aby automatycznie zliczać komórki całkowitej liczby jąder na obrazach 2D, uruchom rejestrator makr, otwórz obraz DAPI i kliknij obraz, wpisz i 8-bitowy, a następnie kliknij zwiększ kontrast i ustaw nasycony parametr na jeden i znormalizuj. Aby wyostrzyć obraz, ustaw maskę wyostrzającą, używając promienia 1 i maski 60.
Aby zbindować obraz, kliknij przycisk Automatyczny próg i wybierz metodę Reny/Entropia z białymi obiektami na czarnym tle. Następnie kliknij Wtyczki, a następnie BioVoxxel i nieregularny element zlewni, o promieniu erozji równym pięć, aby oddzielić komórki. Kliknij przycisk Analizuj i analizuj cząstki, a następnie ustaw rozmiar na 02 nieskończoność i zaznacz opcję podsumowania.
Liczba komórek zostanie wyświetlona w tabeli podsumowania jako liczby. Następnie kliknij przycisk Utwórz, aby zapisać makro umożliwiające automatyczne zliczanie jąder w kolejnych obrazach hodowli komórkowych 2D. Po użyciu znanych baz danych do wygenerowania sieci nowotworów, otwórz odpowiednie oprogramowanie do analizy sieci, kliknij plik i nowy, a następnie wprowadź modele guza jowisza.
Kliknij ok, aby wygenerować nową sieć, a następnie kliknij, kwadrat do północy i ok, aby zwizualizować receptor w podwójnej błonie. Aby wyświetlić węzły jako prostokąty, kliknij białko ogólne, następnie EGFR, a następnie Ok.To oznacz węzły w sieci, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmienić kolor i kształt, a następnie ustaw kody kolorów węzłów zgodnie ze wskazaniami. Aby zobrazować parametry odczytu w postaci sześciokątów, wybierz fenotyp, wprowadź proliferację i kliknij przycisk OK.
Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i ponownie wybierz zmień kolor i kształt, aby ustawić kod koloru na 255, 204, 204. Aby zwizualizować krawędzie interakcji węzłów, kliknij przycisk Przejście stanu dla strzałek aktywacji i przycisk Blokada dla stępionych strzałek hamowania. Następnie kliknij plik i zapisz jako, a następnie zapisz wygenerowaną sieć sygnalizacyjną, tak jak models.xml guz jove.
Aby przeprowadzić analizę równowagi systemu w stanie ustalonym, otwórz oprogramowanie SQUAD, kliknij przycisk załaduj sieć i prześlij plik models. xml guza jowisza. Kliknij, uruchom analizę.
Aby napisać protokół symulacji, kliknij przycisk Zaawansowane i Pertubator, a następnie kliknij przycisk Edytuj protokół, aby zasymulować opór anit-EGFR. Następnie kliknij, pertubacja i wybierz standardowy stan początkowy równy cztery. Kliknij przycisk dodaj, aby dodać nowy stały impuls, a następnie wybierz parametr stanu i ustaw cel na FLIP, czas na zero, a wartość na 4.
Kliknij przycisk OK i ustaw stany dla c-MET i Gefitynibu w ten sam sposób. Aby ustawić wartość stanu dla aktywnego węzła EGFR, kliknij przycisk Aktywny węzeł, a następnie kliknij przycisk Edytuj. Ustaw stan na 8 i kliknij przycisk OK.
Kliknij przycisk OK, aby zapisać protokół. Aby wyświetlić określone krzywe, w panelu opcji wybierz EGF-EGFR, gwiazda EGF-EGFR, gwiazda Mek, kaspazy, PI3K, gegitynib, apoptoza, proliferacja, inhibitor MEk i inhibitor PI3K. Następnie kliknij przycisk Zainicjuj i Uruchom, aby rozpocząć pełną symulację odpowiedzi systemu.
Aby zasymulować skojarzone leczenie inhibitorem PI3K i Mek, kliknij przycisk edytuj protokół. Następnie, używając tego samego parametru węzła, jak właśnie pokazano, kliknij pertubację, a następnie dodaj, aby dodać nowy stały impuls. Następnie wybierz parametr stanu i ustaw cel na inhibitor PI3K, czas na zero, a wartość na jeden, a następnie kliknij ok.
Kliknij ponownie dodaj, aby dodać kolejny nowy stały impuls i pod parametrem state ustaw cel na Mek inhibitor, ustaw czas na zero, a wartość na jeden, a następnie kliknij ok, a następnie ponownie ok, aby zapisać protokół. W panelu opcji, używając tych samych węzłów do reprezentacji graficznej, jak pokazano powyżej, kliknij przycisk inicjuj i uruchom, aby rozpocząć pełną symulację odpowiedzi systemu. Następnie, aby zakończyć symulację, kliknij przycisk resetuj.
Ten system testowania nowotworów 3D ułatwia określenie wskaźnika proliferacji. I kwantyfikacja apoptozy za pomocą M30 Elisa. Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie tylko komórki nowotworowe HCC827 z mutacją EGFR, inkubowane w warunkach hodowli statycznej, zareagowały na hamowanie naskórkowego czynnika wzrostu.
Przez inhibitor kinazy tyrozyny, Gefitynib, o czym świadczy wzrost apoptozy obserwowany w systemie modelu guza HCC827. Tutaj pokazano reprezentatywne obrazy statycznych modeli 3D guzów, z lub bez, induktorem przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego, symulacją TGF-beta-1. Zwróć uwagę na wzrost ekspresji wimentyny w leczonych kulturach komórek nowotworowych.
W warunkach dynamicznych gefitynib wywiera silny wpływ na komórki HCC827 z mutacją EGFR, o czym świadczy zmniejszenie struktur tkankopodobnych w obecności inhibitora kinazy tyrozynowej w porównaniu z niekontrolowaną hodowlą nieleczoną. Na tym wykresie zaobserwowano symulację znanego napędu mutacji, koaktywacji EGFR i c-MET oraz zwiększonego tempa proliferacji i zmniejszonego wskaźnika apoptozy w komórkach HCC827 w czasie, co odzwierciedla oporność indukowaną przez gefitynib, która koreluje z aktywacją MEK i PI3K. Rzeczywiście, modelowanie połączonych inhibitorów PI3K i MEK prowadzi do odwrócenia efektu oporności na anty-EGFR, zmniejszenia proliferacji i indukcji apoptozy.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak Western Blot lub w celu zbadania dalszych szlaków sygnałowych. Co więcej, systemy kohodowli z różnymi typami komórek mogą być również wykorzystywane do analizy wzajemnych oddziaływań między różnymi komórkami w mikrośrodowisku guza. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się opracowywaniem leków do badania skuteczności leków w Silico.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przewidywać skuteczność leku w stratyfikowanych grupach pacjentów, symulując zmiany sygnalizacyjne i analizując wynikowe odpowiedzi systemu w różnych mutacjach i tłach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia trójwymiarowy (3D) model raka płuc z wykorzystaniem biologicznego rusztowania kolagenowego w celu zbadania wrażliwości terapii nieznajdzącego drobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Model integruje podejścia in vitro oraz in silico, aby usprawnić przewidywania odpowiedzi na leki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Farmakologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Niedrobnokomórkowy rak płuca jest powszechną postacią raka płuca.
- Terapie celowane są kluczowe dla skutecznego leczenia.
- Modele 3D zapewniają środowisko bardziej istotne fizjologicznie do testowania leków.
- Modele in silico mogą przewidywać skuteczność leku na podstawie charakterystyki guza.
Cel badania
- Ocena wrażliwości NSCLC na terapie celowane.
- Przewidywanie skuteczności nowych substancji terapeutycznych.
- Optymalizacja prognoz odpowiedzi na leki w oparciu o tło mutacyjne.
Zastosowane metody
- Opracowanie trójwymiarowego modelu raka płuca z wykorzystaniem rusztowania kolagenowego.
- Monitorowanie specyficznych dla komórek odpowiedzi na zastosowane leczenie.
- Integracja przewidywań in silico z danymi eksperymentalnymi.
- Statyczne warunki hodowli w celu przygotowania modelu guza.
Główne wyniki
- Wykazano zróżnicowane reakcje NSCLC na terapie celowane.
- Ustanowiono korelację między wynikami in vitro a przewidywaniami in silico.
- Przedstawiono spostrzeżenia dotyczące optymalizacji protokołów testowania leków.
- Podkreślono możliwość zastosowania modelu w przypadku innych typów nowotworów.
Wnioski
- Trójwymiarowy model raka płuca jest skuteczny w badaniu wrażliwości na leki.
- Przewidywania in silico zwiększają istotność badań przedklinicznych.
- Podejście to można zaadaptować dla różnych typów nowotworów w celu poprawy wyników leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten połączony model 3D in vitro/in silico guza płuca odpowiada na potrzebę stworzenia fizjologicznie istotnych systemów przedklinicznych, które oddają odpowiedzi na leki specyficzne dla tła mutacyjnego. Poprzez integrację architektury macierzy zewnątrzkomórkowej z komputerowymi symulacjami sieci sygnałowych, podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz identyfikacji wiodących cząsteczek dla NSCLC z mutacją EGFR. Model ten wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka, łącząc wyniki fenotypowe (proliferację, apoptozę, EMT) z symulacjami in silico mechanizmów oporności, co umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji go/no-go na wczesnym etapie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych w kontekście NSCLC z mutacją EGFR w porównaniu z NSCLC z mutacją KRAS przy użyciu izogenicznych par linii komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany 14-dniowy protokół generowania sztucznej tkanki nowotworowej na odkomórkowanych rusztowaniach o zdefiniowanym składzie ECM.
- Wartość prognostyczna: Koreluje fenotypy hodowli 3D z klinicznymi wskaźnikami proliferacji, zwiększając istotność translacyjną w porównaniu z modelami 2D.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Umożliwia ilościowe odczyty, w tym indeks proliferacji Ki67, detekcję apoptozy metodą M30-ELISA oraz ocenę EMT poprzez barwienie na wimentynę/pan-cytokeratynę.
- Powtarzalność: Wykorzystuje perfuzję w bioreaktorze przepływowym z prędkością 3 mL/min w celu utrzymania warunków fizjologicznych i poprawy spójności generowania tkanek.
- Użyteczność w badaniach przesiewowych: Pozwala na ocenę wrażliwości na inhibitory kinazy tyrozynowej (np. gefitynib) z rozwarstwieniem ze względu na tło mutacyjne (linia HCC827 z mutacją EGFR vs linia A549 z mutacją KRAS).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Odzwierciedla tkankowo specyficzną architekturę ECM oraz cechy błony podstawnej na rusztowaniu z błony podśluzowej jelita cienkiego świni.
- Ciągłość translacyjna: Integruje dynamiczne dane o odpowiedzi na leki (apoptoza, proliferacja, EMT) w booleowskim modelu in silico w celu symulacji oporności i interwencji kombinowanych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wykazuje odwrócenie oporności na gefitynib poprzez symulowaną ko-inhibicję PI3K i MEK, łącząc fenotypy in vitro z adaptacjami na poziomie sieciowym.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten stanowi pomost pomiędzy biologią odkrywczą a walidacją przedkliniczną, zapewniając platformę z podziałem na mutacje do oceny skuteczności terapii celowanej przed optymalizacją wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zależności od EGFR oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych w modelach NSCLC o określonym tle mutacyjnym.
- Przesiewanie: Dostarcza gotową do analizy, powtarzalną tkankę 3D z ilościowymi wskaźnikami proliferacji, apoptozy i przejścia fenotypowego.
- Analityka: Generuje wieloparametryczne dane o odpowiedzi na lek, odpowiednie jako dane wejściowe dla modeli obliczeniowych symulujących dynamikę sieci sygnałowych i ewolucję oporności.
- Badania translacyjne: Łączy indukcję EMT in vitro i odpowiedź na lek z symulacjami in silico adaptacyjnej aktywacji szlaków (np. MET, PI3K, MEK) obserwowanych w oporności nabytej.
- Zastosowania systemowe: Ustanawia reużywalne ramy dla przewidywania skuteczności leków w konkretnych kontekstach genetycznych, możliwych do dostosowania do innych typów nowotworów i czynników celowanych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez korelację fenotypowych odpowiedzi na leki z przewidywaniami in silico dotyczącymi zmian stanu sieci.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje generowanie modeli guzów z wykorzystaniem rusztowań odkomórkowionych i kultury perfuzyjnej, zwiększając powtarzalność między ośrodkami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez przewidywanie mechanizmów oporności i wczesną identyfikację racjonalnych strategii łączenia leków w fazie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o przewidywaną skuteczność w subpopulacjach zdefiniowanych przez biomarkery.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie trójwymiarowych hodowli tkankowych, obchodzenia się z odcellularyzowanymi rusztowaniami oraz obsługi bioreaktorów perfuzyjnych.
- Wymaga aparatury do hodowli statycznych i dynamicznych, mikroskopii fluorescencyjnej do barwienia Ki67/wimentyn oraz platform ELISA do ilościowego oznaczania apoptozy.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej pomiędzy grupami zajmującymi się hodowlą komórek, obrazowaniem i biologią obliczeniową w celu zintegrowanej interpretacji danych.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy rozszerzaniu modelu na inne typy nowotworów lub źródła ECM poza rusztowaniami wieprzowymi.
- Ograniczony przez 14-dniowy czas trwania hodowli oraz zależność od określonych tła mutacyjnego dla predykcyjnego modelowania in silico.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Dynamic Culture Conditions and Static Tumor Model Gefitinib Treatment
2:35
ELISA Samples Collection and Proliferation Index Determination
5:21
In Silico Tumor Model Generation and Anti-EGFR Therapy Simulation in HCC827 Cells
7:13
In Silico Simulation Using SQUAD
10:32
Results: The Effects of Gefitinib Treatment on Cell Growth in Static and Dynamic Tumor Model Systems
12:42
Conclusion
