Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek
10 maja 2016
Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.
Ogólnym celem niniejszego protokołu LAM jest izolacja specyficznych komórek roślinnych w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analiz transkrypcyjnych. Koncentracja skupia się na komórkach trudnodostępnych, takich jak komórki jajowe, u płciowych i apomiktycznych gatunków boechera. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu genetyki rozwojowej roślin, takie jak transkrypcyjne podstawy płciowej i bezpłciowej reprodukcji roślin poprzez nasiona.
Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykonania określonych specyficznych stylów. Pozwala to przezwyciężyć efekt maskowania transkrypcji rzadkich typów komórek w analizie tkanek aterogenezy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć stacji do blokowania i wypełnić uprzednio podgrzaną, świeżą plastikową kasetę balansującą roztopioną parafiną w temperaturze 56 °C.
Podnieś pokrywę kąpieli parafinowej i wyjmij kasety po jednej. Przenieś próbkę do ciekłej parafiny o temperaturze 56 stopni Celsjusza w tacy balansującej. Postępuj szybko, aby zapobiec twardnieniu wosku wokół próbki podczas manipulowania kasetą.
Następnie, za pomocą igły preparacyjnej, ustaw próbkę zgodnie z planem eksperymentalnym. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie próbki zostaną przeniesione. Aby przygotować cienkie skrawki do LAM, na stole świetlnym usuń parafinę z próbki znajdującej się w plastikowej kuwecie.
Wyciąć blok woskowy zawierający próbkę, np. pąk lub kwiat, używając wolnego od RNaz ostrza do golenia. Następnie roztopić niewielką kroplę parafiny na końcówce szpatułki. Za pomocą gorącego wosku przymocować blok z zatopioną próbką do podkładki.
Usuń nadmiar wosku otaczający próbkę za pomocą żyletki i upewnij się, że blok ma kwadratową powierzchnię z równoległymi krawędziami. Następnie ustaw płytę grzewczą na 42 °C. Bezpiecznie zamocuj próbkę w mikrotomie.
Przygotuj przekroje o grubości siedmiu mikrometrów dla komórek dojrzałego gametofitu boechera. Następnie przenieś parafiniowe taśmy o długości od 10 do 15 centymetrów do plastikowego pudełka z czarną tekturą na dnie, a następnie umieść je na szkiełkach LAM. Aby przygotować szkiełka do LAM, umieść od pięciu do dziesięciu szkiełek w metalowych ramkach na płycie grzewczej płaskimi powierzchniami do góry.
Nanieś pipetą od jednego do dwóch mililitrów wody wolnej od RNaz na plastikową część szkiełek. Za pomocą żyletki potnij wstążki parafiny na krótkie fragmenty o długości około czterech do pięciu centymetrów. Powinny być one wystarczająco długie, aby zakryć plastikowe okienka szkiełek.
Następnie, za pomocą pęsety i igły preparacyjnej, ułóż paski parafiny równolegle do siebie na plastikowym okienku szkiełek. Ostrożnie unieś szkiełka z jednego końca, aby usunąć wodę, a następnie odstaw je na miejsce. Przykryj płytkę grzewczą plastikową pokrywą, nie dotykając szkiełek, upewniając się, że pokrywa umożliwia wymianę powietrza.
Suszyć preparaty w temperaturze 42°C przez noc. W dygestorium odparafynować preparaty w ksylolu dwukrotnie, po 10 minut za każdym razem. Należy upewnić się, że zanurzona jest tylko plastikowa część szkiełek, a szerszy koniec metalowej ramki każdego preparatu pozostaje suchy, aby umożliwić ich wyjęcie.
Pozostaw preparaty do wyschnięcia na 10 minut w dygestorium przed wykonaniem LAM. W ramach tej procedury włącz komputer oraz mikroskop do LAM. Następnie uruchom program sterujący mikroskopem i laserem.
Włącz zasilacz kontrolny lasera i uruchom laser, naciskając odpowiedni przycisk na panelu sterowania. Następnie umieść nakrętkę w uchwycie na nakrętki. Połóż preparat LAM na szkiełku mikroskopowym, upewniając się, że płaska powierzchnia preparatu z przytwierdzonymi tkankami przylega do szkiełka.
Następnie umieść preparat w urządzeniu, kładąc pod nim szkiełko przedmiotowe. Na koniec umieść w urządzeniu uchwyt z nakrętką. Wybierz obiektyw 4x.
W programie przesuń obiektyw w górę. Następnie wykonaj skan preparatu. Przeszukaj preparat i zidentyfikuj interesujące struktury.
Dokładnie określ i zapisz ich pozycje na szkiełku, aby umożliwić powrót do tej samej lokalizacji podczas etapu wycinania. Następnie wybierz odpowiedni obiektyw. Zweryfikuj położenie lasera, naciskając raz przycisk wystrzału lasera.
Idealnie w części błony pozbawionej tkanki. Mając nakładkę w pozycji dolnej, należy użyć narzędzia pisaka ręcznego, aby zaznaczyć granice interesującego nas typu komórek lub tkanki. Na przykład komórki jajowej.
Wykonaj wycięcie laserowe, naciskając przycisk Cut. Aby wyizolować pojedyncze komórki, kluczowe jest ich wyraźne zidentyfikowanie w odpowiednich przekrojach. Ponadto komórki powinny mieć średnicę co najmniej 8 µm, aby umożliwić przeprowadzenie analizy transkrypcyjnej specyficznej dla danego typu komórek.
Należy pamiętać, że sekcjonowanie musi zostać powtórzone, jeśli obrzeże wokół komórki nie zostało całkowicie wycięte, co zazwyczaj można zaobserwować na ekranie. W takim przypadku zaleca się ustawienie oprogramowania tak, aby standardowo automatycznie wykonywało dwa powtórzenia sekcji. Następnie należy podnieść pokrywkę i przenieść się do następnej pozycji zapisu z interesującą strukturą oraz wycinać kolejne sekcje komórek, aż do momentu zebrania wszystkich interesujących komórek z jednego preparatu.
Upewnij się, że nakrętka jest ustawiona w taki sposób, aby nowa sekcja przylegała do pustego miejsca na nakrętce. Po wyizolowaniu interesujących typów komórek ze wszystkich slajdów, wyjmij slajd z urządzenia. Ustaw uchwyt nakrętki w pozycji dolnej i dokonaj inspekcji wizualnej powierzchni nakrętki.
Następnie należy użyć obiektywu 4x, aby wykluczyć nieswoiste zanieczyszczenia próbki. Po tym czasie należy zamknąć zakrętkę. Suche skrawki należy mrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
Oto schematyczny rysunek dojrzałego gametofitu żeńskiego. Przedstawione obrazy to cienkie przekroje przez zalążki zawierające gametofity żeńskie u boechera divaricarpa, w których komórki jajowe są wyraźnie identyfikowalne dzięki charakterystycznej morfologii gametofitu żeńskiego. Analiza wykazała, że RNA uzyskane z przekrojów komórek jajowych charakteryzowało się podobną jakością co RNA pozyskane z większych obszarów tkankowych pobranych z tych samych preparatów w ramach kontroli.
Osiągnięta jakość RNA była odpowiednia do sekwencjonowania RNA specyficznego dla typu komórek, co pozwoliło na zidentyfikowanie 236 genów ekspresjonowanych w apomiktycznej komórce jajowej, ale nie w apomiktycznej komórce centralnej, komórce synergidy ani apomiktycznej komórce inicjalnej. Nie stwierdzono ich również w komórkach dojrzałego płciowego gametofitu arabidopsis thaliana. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania z zakresu genetyki rozwoju można przeprowadzić profilowanie innych typów komórek i tkanek z różnych gatunków.
Taka jak molekularna podstawa imprintingów w endospermie i embrionach nasion roślin. Po opracowaniu, technika ta utoruje drogę badaczom z dziedziny genetyki rozwojowej i reprodukcji roślin do zbadania transkrypcyjnych podstaw rozmnażania apomiktycznego w rodzaju Boechera. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak uzyskać wysokiej jakości RNA do specyficznych dla typu komórek analiz transkrypcyjnych z wykorzystaniem mikrodysekcji wspomaganej laserem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę mikrodysekcji wspomaganej laserem (LAM) w celu izolacji specyficznych komórek roślinnych, ze szczególnym uwzględnieniem komórek linii zarodkowej żeńskiej u gatunków Boechera. Technika ta została opracowana w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do profilowania transkrypcyjnego, co wspomaga zrozumienie procesów reprodukcji roślin.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka rozwoju roślin
- Profilowanie transkrypcyjne
- Biologia rozrodu
Wprowadzenie
- Izolacja specyficznych komórek roślinnych jest kluczowa dla badania dynamiki transkrypcyjnej.
- Komórki trudno dostępne, takie jak komórki jajowe, są istotne dla zrozumienia rozmnażania płciowego i apomiktycznego.
- Metoda ta rozwiązuje problemy związane z analizą rzadkich typów komórek.
- Umożliwia ona uzyskanie wglądu w transkrypcyjne podstawy rozmnażania poprzez nasiona.
Cel badania
- Izolacja specyficznych komórek roślinnych w celu ekstrakcji wysokiej jakości RNA.
- Badanie mechanizmów transkrypcyjnych leżących u podstaw reprodukcji roślin.
- Pogłębienie wiedzy na temat reprodukcji płciowej i bezpłciowej roślin.
Zastosowane Metody
- Technika mikrodysekcji wspomaganej laserem (LAM).
- Wykorzystanie stacji blokującej i wosku parafinowego do izolacji komórek.
- Skupienie się na komórkach linii zarodkowej żeńskiej u gatunków Boechera.
- Analiza transkrypcyjna izolowanych komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja komórek jajowych z gatunków Boechera.
- Uzyskanie wysokiej jakości RNA do dalszych analiz.
- Wgląd w profile transkrypcyjne komórek rozrodczych.
- Metoda wykazuje potencjał do szerszych zastosowań w genetyce roślin.
Wnioski
- Protokół LAM jest skuteczny w izolowaniu specyficznych komórek roślinnych.
- Otwiera on nowe możliwości badań nad biologią rozrodczą roślin.
- Technika ta może pomóc w wyjaśnieniu podstaw genetycznych rozmnażania się roślin.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikrosekcja wspomagana laserem (LAM) umożliwia izolację wysokiej jakości RNA z rzadkich, trudno dostępnych typów komórek, takich jak komórki jajowe roślin, rozwiązując kluczowy problem w profilowaniu transkrypcyjnym w genetyce rozwojowej. Dostarczając specyficzne dla typu komórek dane transkrypcyjne, LAM wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów i zwiększa pewność predykcyjną w wczesnych etapach procesów odkrywania. Możliwość ta znajduje bezpośrednie zastosowanie w działaniach B+R w sektorze biofarmaceutycznym, skoncentrowanych na zrozumieniu złożonych systemów biologicznych poprzez precyzyjną dyssekcję molekularną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie aktywności transkrypcyjnej w konkretnych typach komórek w celu wyjaśnienia funkcji genów i udziału szlaków w procesach biologicznych.
- Wartość operacyjna: Redukuje sygnały zakłócające pochodzące z heterogenicznych tkanek, poprawiając specyficzność celu i zmniejszając ryzyko biologiczne.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację celów w oparciu o hipotezy poprzez powiązanie profili molekularnych z wynikami fenotypowymi w określonych kontekstach komórkowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie oczyszczonego RNA z mikrodissekowanych komórek, odpowiedniego do dalszych analiz transkrypcyjnych, w tym sekwencjonowania RNA i qPCR.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalny schemat przygotowania próbek, który zapewnia integralność RNA, umożliwiając spójne wyniki analiz.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych próbek biologicznych do wysokoprzepustowych kampanii przesiewowych ukierunkowanych na rzadkie populacje komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy profilowanie transkrypcyjne z fazy odkrywania z walidacją przedkliniczną, dostarczając istotnych dla choroby, specyficznych dla typu komórek informacji molekularnych.
- Korelacja z biomarkerami: Wspiera identyfikację sygnatur transkrypcyjnych, które mogą służyć jako biomarkery prognostyczne lub farmakodynamiczne w modelach przedklinicznych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), zmniejszając niepewność mechanistyczną w obrębie szlaków docelowych dzięki precyzyjnej rozdzielczości komórkowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
LAM wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, umożliwiając precyzyjną izolację komórek docelowych przed analizą transkrypcyjną, wspierając identyfikację wiodących związków dzięki jasności mechanistycznej oraz dostarczając danych zgodnych z biomarkerami na potrzeby prac przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie profilowania transkrypcyjnego wybranych typów komórek.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie standaryzowanych, wysokiej jakości ekstraktów RNA odpowiednich do ilościowych analiz transkrypcyjnych i profilowania odpowiedzi na związki chemiczne.
- Analityka: Dostarcza pomiarów ekspresji genów specyficznych dla danego typu komórek, co umożliwia dokładne porównanie warunków eksperymentalnych i efektów terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki molekularne uzyskane z izolowanych komórek z ciągłością przedkliniczną poprzez zachowane sygnatury transkrypcyjne i walidację funkcjonalną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi adaptacyjną funkcjonalność platformy, którą można zastosować w wielu projektach badających rzadkie lub niedostępne typy komórek w złożonych tkankach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki danym specyficznym dla typu komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację przygotowania próbek dla procesów transkrypcyjnych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka celów w oparciu o precyzyjny kontekst biologiczny.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów skorygowaną o ryzyko, dostarczając wyraźniejsze uzasadnienie mechanistyczne dla ich dalszego rozwoju.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu histologii, mikroskopii oraz technik mikrodysekcji laserowej.
- Konieczny jest dostęp do systemów laserowej mikrodysekcji, środowisk wolnych od RNaz oraz kompatybilnych zestawów do ekstrakcji RNA.
- Niezbędna jest standaryzacja przygotowania preparatów, krojenia oraz parametrów dysekcji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójności wyników.
- Należy uwzględnić zmienność wydajności i jakości RNA podczas pracy z małymi lub delikatnymi typami komórek, zgodnie z treścią materiałów źródłowych.
- Ograniczeniem jest konieczność optymalizacji protokołów krojenia i barwienia w celu zachowania morfologii tkanek oraz integralności RNA podczas obróbki.
