Name: Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj mikrodysekcję wspomaganą laserowo do izolacji komórek roślinnych w celu profilowania transkrypcyjnego. Technika ta umożliwia uzyskanie RNA o wysokiej jakości z komórek jajowych Boechera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Timothy'emu F. Sharbelowi (IPK Gatersleben) za dostarczenie nasion Boechera divaricarpa oraz Sharon Kessler (University of Oklahoma) za krytyczną lekturę i korektę. Prace nad analizami transkryptomu specyficznego dla typu komórki w celu zbadania rozwoju gametofitów i apomiksy w laboratorium UG są wspierane przez Uniwersytet w Zurychu, stypendium "Deutsche Forschungsgemeinschaft" i projekt Marie Curie IDEAGENA to AS, przez granty ze "Staatssekretariat für Bildung und Forschung" w ramach działania COST FA0903 (dla UG i AS) oraz Szwajcarskiej Fundacji Narodowej (dla UG).

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+Introduction+to+the+Embryology+of+Angiosperms%22">An Introduction to the Embryology of Angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillemse%2C+MTM+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).</li>
<li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis%3A+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li>
<li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis+-+the+asexual+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li>
<li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+future+for+apomixis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li>
<li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+germline+formation%3A+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle%2C+transcriptional%2C+hormonal+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+GENET%22%5BJournal%5D)">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476(2014).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li>
<li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li>
<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li>
<li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+BIOL%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).</li>
<li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685(2012).</li>
<li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li>
<li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li>
<li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li>
<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół jest odpowiedni dla różnych typów komórek i tkanek
LAM w połączeniu z analizami transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub RNA-Seq jest cennym narzędziem do uzyskania wglądu w specyficzne wzorce aktywności genów regulujących procesy rozwojowe lub fizjologiczne 7-11,13,14. Jednak przydatność tej metody dla danego typu ogniwa jest krytycznie zależna od kwestii strukturalnych. Komórka musi być wyraźnie widoczna i jednoznacznie rozpoznawalna w suchych sekcjach w...

W badaniach transkrypcyjnych przeprowadzanych na poziomie tkankowym, transkryptomy wysoce wyspecjalizowanych, ale rzadkich typów komórek są często maskowane przez liczniejsze otaczające komórki. Przykładem takich wysoce wyspecjalizowanych typów komórek są komórki żeńskiej linii rozrodczej (linii zarodkowej) roślin. Żeńska linia zarodkowa jest określona w rozwijających się zalążkach, prekursorach nasion wewnątrz gynoecium kwiatu 1,2. Komórka macierzysta megaspor (MMC) jest pierwszą komórką żeńskiej linii rozrodczej. Przechodzi mejozę, tworząc tetradę zredukowanych megaspor. Zazwyczaj tylko jedna z tych megaspor przeżywa i dzieli się mitotycznie bez cytokinezy, tj. w syncytium. Po tych mitozach następuje celularyzacja w celu utworzenia dojrzałego gametofitu, który zazwyczaj składa się z czterech typów komórek: trzech antypodali, dwóch komórek synergicznych, komórki jajowej i komórki centralnej. Komórka jajowa i komórki centralne to gamety żeńskie, które są zapładniane przez dwa plemniki podczas podwójnego zapłodnienia, aby dać początek zarodkowi i bielmu rozwijającego się nasienia 1,2. W systemie modelu płciowego Arabidopsis thaliana rozwija się tylko ~ 50 nasion na kwiat, podczas gdy około 50 - 80 nasion rozwija się na kwiat w blisko spokrewnionym rodzaju Boechera. Tak więc żeńska linia zarodkowa składa się tylko z kilku wysoce wyspecjalizowanych typów komórek, co czyni ją doskonałym modelem do badania procesów rozwojowych, takich jak specyfikacja i różnicowanie komórek.
Ponadto, wgląd w procesy regulacji genów rządzący rozmnażaniem roślin może być użyteczny. U roślin może wystąpić zarówno rozmnażanie płciowe, jak i bezpłciowe przez nasiona (apomixis). Podczas gdy rozmnażanie płciowe generuje różnorodność genetyczną w populacji, apomiksa prowadzi do powstania potomstwa klonów, które jest genetycznie identyczne z rośliną mateczną. Dlatego apomixis ma ogromny potencjał do zastosowań w rolnictwie i produkcji nasion, ponieważ nawet złożone genotypy matczyne mogą być utrzymywane w niezmienionym stanie przez kilka pokoleń 3,4,5. Ponieważ apomiksis nie występuje naturalnie w żadnym z głównych gatunków roślin uprawnych, inżynieria apomiksy w uprawach jest bardzo interesująca 3,4,5. Ten długoterminowy cel jest jednak trudny do osiągnięcia, ponieważ genetyczne i molekularne podstawy apomiksy nie są wystarczająco szczegółowo poznane 6.
Aby uzyskać wgląd w podstawy transkrypcji rządzącej rozmnażaniem apomiktycznym, profilowanie transkrypcyjne specyficzne dla typu komórki za pomocą laserowo wspomaganej mikrodysekcji (LAM) i sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stanowi bardzo skuteczne podejście 7,8. LAM został po raz pierwszy opracowany na potrzeby badań na zwierzętach i badań biomedycznych. W ciągu ostatnich kilku lat lam znalazł również zastosowanie w biologii roślin 6,9,10. W przeciwieństwie do innych metod pozwalających na profilowanie poszczególnych typów komórek i tkanek, LAM nie wymaga generowania linii markerowych 6,9,10. Dlatego może być stosowany do dowolnego typu komórki lub tkanki bez wcześniejszej wiedzy molekularnej. Kolejną zaletą LAM jest to, że można go zastosować do dowolnego typu ogniwa, o ile ogniwo można rozpoznać w suchych sekcjach na podstawie położenia i/lub cech strukturalnych. LAM ma dodatkową zaletę, że stosuje się utrwalone tkanki, co zapobiega zmianom profilu transkrypcyjnego podczas przetwarzania.
Tkanka będąca przedmiotem zainteresowania, np. tkanka kwiatowa, jest utrwalana w utrwalaczu bez sieciowania przed zatopieniem w wosku parafinowym. Zatapianie w wosku parafinowym można wykonać ręcznie, zgodnie z ustalonymi protokołami 9,11. Jednak zastosowanie automatycznego procesora tkanek do odwodnienia i infiltracji woskiem na ogół skutkuje wyższą odtwarzalnością pod względem zachowania jakości RNA i morfologii tkanki. Alternatywna strategia zatapiania tkanek w żywicy została również z powodzeniem wykorzystana do analiz specyficznych dla typu komórek za pomocą LAM 8. Jednak użycie automatycznego procesora tkanek do zatapiania w wosku jest bardzo efektywne czasowo, ponieważ wiele próbek może być przetwarzanych jednocześnie, co wymaga minimum czasu pracy. Podczas gdy zazwyczaj nie dochodzi do znaczącej utraty jakości RNA podczas utrwalania i zatapiania, przygotowanie cienkich skrawków za pomocą mikrotomu, a w szczególności montaż na szkiełkach ramowych stosowanych w LAM pozostaje kluczowym krokiem dla zachowania jakości RNA. Zostało to już wcześniej zauważone i opisano użycie systemu transferu taśmowego w celu uzyskania lepszej jakości RNA na tym etapie 12. Jest to jednak dodatkowy czasochłonny etap podczas przygotowywania preparatów, a także wymaga specjalnego sprzętu. Zoptymalizowany protokół opisany poniżej w sposób powtarzalny wytwarza RNA o jakości wystarczającej do profilowania transkrypcji za pomocą GeneCHIPs i metod sekwencjonowania nowej generacji (NGS) 7,11,13,14. Ponadto, przy użyciu mikroskopu laserowego do mikrodysekcji, rutynowo uzyskuje się wysoką czystość izolowanych typów komórek 7,11,13,14.
Rodzaj Boechera jest doskonałym modelowym systemem do badania kluczowych etapów rozmnażania apomiktycznego. U Boechera zidentyfikowano wiele różnych akcesji płciowych i apomiktycznych, które mogą być wykorzystane do analiz porównawczych 15,16,17. Porównując transkryptomy specyficzne dla typu komórki komórek z żeńskiej linii zarodkowej od płciowego rzodkiewnika pospolitego i apomiktycznego Boechera, zidentyfikowaliśmy geny i szlaki, które są różnie wyrażane, identyfikując w ten sposób nowe aspekty procesów regulacyjnych rządzących apomixis 7. Ponadto w badaniu tym zweryfikowano przydatność LAM do analiz transkrypcyjnych małych i rzadkich typów komórek specyficznych dla danego typu komórek. Używaliśmy już tego protokołu do analizy różnych typów komórek u różnych gatunków roślin, ale w niektórych przypadkach mogą być wymagane modyfikacje protokołu specyficzne dla danego gatunku i tkanki.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>1 009 861 000</td><td>absolutny EMPROVE Ph Eur, BP, USP</td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe falcon</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Ambion Technologie życia wodnego wolne od nukleaz</td><td></td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S S</td><td>14048043624</td> procesor tkanek <td>Leica</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>karton</td><td></td><td></td><td>można kupić w specjalnych sklepach papierniczych</td></tr><tr><td>Wolne od DNA i RNAse Frame Slides</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 i micro; m Membrana PET; można również kupić w Leica</td></tr><tr><td>Dumond Kleszcze</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>eksycykator</td><td>do</td> lamp <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>etanolowych</td></tr> Sigma-Aldrich Z354074-1EA Nalgene Vaccuum Ekssykator lub podobny sprzęt <tr><td>końcówki filtrujące 10&nbsp; &mikro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>można zastąpić podobnymi końcówkami</td></tr><tr><td>filtrującymi 1 000&nbsp; &mikro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>można zastąpić podobnymi końcówkami</td></tr><tr><td>filtrującymi 20&nbsp; &mikro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>można zastąpić podobnymi końcówkami</td></tr><tr><td>filtrującymi 200&nbsp; &mikro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>można zastąpić podobnymi końcówkami</td></tr><tr><td>kleszcze precyzyjne</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>uchwyt do szkiełek do szkieł</td><td>Huber & Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&auml; rbek&auml; sten nach Szklana</td></tr><tr><td>witraża</td> Hellendahl <td>Huber & Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&auml; rbekasten</td></tr><tr><td>Podgrzewany moduł do zatapiania parafiny Stacja blokująca Leica</td><td>Leica Leica</td><td>EG 1150 H</td><td>, odpowiednie są podobne urządzenia</td></tr><tr><td>Stół grzewczy i suszący</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>inne modele i/lub dostawcy są odpowiednie</td></tr><tr><td>Wiadro na</td><td>lód VWR z pokrywką&nbsp;</td><td>10146-184</td><td>podobne wiadra równie odpowiedni</td></tr><tr><td>stół oświetleniowy</td><td>UVP An Analytical Jena Company</td><td>TW-26&nbsp;</td><td>transluminator światła białego</td></tr><tr><td>szkiełko mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>krawędzie tnące</td></tr><tr><td>ostrze mikrotomu</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 jednorazowe ostrze mikrotomu</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus MMI</td><td>(Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nieprzywierające, wolne od RNA probówki do mikrofuge, technologie 2 ml</td><td>Life</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>do histologii</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure Technologie</td><td>życia</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus Zestaw do izolacji RNA PicoPure</td></tr><tr><td>plastikowe tace do równoważenia</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe pudełko</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS plastikowa</td></tr><tr><td>pokrywka do płyty</td><td></td><td></td> grzewczej <td>domowa</td></tr><tr><td>igła do przygotowania</td><td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Zestaw Pico</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrofug bez RNA</td><td>technologie życia</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Technologie dekontaminacji RNAz ZAP Technologie żywotności roztworu</td><td></td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Półautomatyczny mikrotom obrotowy&nbsp;</td><td>Podobne urządzenia Leica</td><td>RM2245</td><td>są równie odpowiednie</td></tr><tr><td>Kasety ekranowe Tissue Loc Histo</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>odpowiednie są podobne kasety innych dostawców</td></tr><tr><td>Probówki z samoprzylepną pokrywą, bez dyfuzora 500 i mikro; l&nbsp;</td><td>MMI (Maszyny i Przemysł Molekularny)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Ksylol (Isomere) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>min. 99%, p.a., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>proces zatapiania Kasety</td><td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Kaseta Leica Jet I bez pokrywy</td></tr><tr><td>Piekarnik uniwersalny</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>inne modele i/lub dostawcy są odpowiednie</td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja wspomagana laserowo (lam) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Zrozumienie procesów rozwojowych na poziomie molekularnym wymaga wglądu w regulację transkrypcji, a tym samym transkryptom, na poziomie poszczególnych typów komórek. Chociaż opisane tutaj metody mają ogólne zastosowanie do szerokiego zakresu gatunków i typów komórek, nasze badania koncentrują się na rozmnażaniu roślin. Uprawa roślin i produkcja nasienna ma kluczowe znaczenie w żywieniu ludzi i zwierząt. Szczegółowe zrozumienie sieci regulacyjnych, które regulują tworzenie się linii rozrodczej (linii rozrodczej) i ostatecznie nasion, jest warunkiem wstępnym ukierunkowanej manipulacji reprodukcją roślin. W szczególności inżynieria apomiksy (rozmnażania bezpłciowego przez nasiona) w roślinach uprawnych obiecuje ogromną poprawę, ponieważ prowadzi do powstania nasion klonalnych, które są genetycznie identyczne z rośliną mateczną. W związku z tym typy komórek żeńskiej linii zarodkowej mają ogromne znaczenie dla zrozumienia i inżynierii apomiksy. Ponieważ jednak odpowiadające im komórki są głęboko osadzone w tkankach kwiatowych, bardzo trudno jest uzyskać do nich dostęp do analiz eksperymentalnych, w tym transkryptomiki specyficznej dla typu komórki. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, skrawki pojedynczych komórek można wyizolować za pomocą mikrodysekcji wspomaganej laserem (LAM). Podczas gdy LAM w połączeniu z profilowaniem transkrypcyjnym umożliwia identyfikację genów i szlaków aktywnych w każdym typie komórki o wysokiej swoistości, ustalenie odpowiedniego protokołu może być trudne. W szczególności jakość RNA uzyskanego po LAM może być zagrożona, zwłaszcza gdy celem są małe, pojedyncze komórki. Aby obejść ten problem, ustaliliśmy przepływ pracy dla LAM, który w sposób powtarzalny zapewnia wysoką jakość RNA, która dobrze nadaje się do transkryptomiki, czego przykładem jest izolacja komórek żeńskiej linii zarodkowej w apomiktycznym Boechera. W protokole tym opisano procedury przygotowania tkanek i LAM, a także w odniesieniu do ekstrakcji RNA i kontroli jakości.

Przygotowanie próbek oraz LAM są przeprowadzane w kolejnych etapach
Przygotowanie RNA do analizy transkrypcyjnej z wybranych typów komórek metodą LAM wymaga szeregu następujących po sobie etapów (Rysunek 1). Proces ten rozpoczyna się od zbioru kwiatów i ich natychmiastowej fiksacji, aby zapewnić niezmienność populacji RNA po zbiorze. Tkankę zatapia się w medium, wykonuje jej przekroje i osadza n...

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu LAM jest izolacja specyficznych komórek roślinnych w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analiz transkrypcyjnych. Koncentracja skupia się na komórkach trudnodostępnych, takich jak komórki jajowe, u płciowych i apomiktycznych gatunków boechera. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu genetyki rozwojowej roślin, takie jak transkrypcyjne podstawy płciowej i bezpłciowej reprodukcji roślin poprzez nasiona.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykonania określonych specyficznych stylów. Pozwala to przezwyciężyć efekt maskowania transkrypcji rzadkich typów komórek w analizie tkanek aterogenezy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć stacji do blokowania i wypełnić uprzednio podgrzaną, świeżą plastikową kasetę balansującą roztopioną parafiną w temperaturze 56 °C.Podnieś pokrywę kąpieli parafinowej i wyjmij kasety po jednej. Przenieś próbkę do ciekłej parafiny o temperaturze 56 stopni Celsjusza w tacy balansującej. Postępuj szybko, aby zapobiec twardnieniu wosku wokół próbki podczas manipulowania kasetą.Następnie, za pomocą igły preparacyjnej, ustaw próbkę zgodnie z planem eksperymentalnym. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie próbki zostaną przeniesione. Aby przygotować cienkie skrawki do LAM, na stole świetlnym usuń parafinę z próbki znajdującej się w plastikowej kuwecie.Wyciąć blok woskowy zawierający próbkę, np. pąk lub kwiat, używając wolnego od RNaz ostrza do golenia. Następnie roztopić niewielką kroplę parafiny na końcówce szpatułki. Za pomocą gorącego wosku przymocować blok z zatopioną próbką do podkładki.Usuń nadmiar wosku otaczający próbkę za pomocą żyletki i upewnij się, że blok ma kwadratową powierzchnię z równoległymi krawędziami. Następnie ustaw płytę grzewczą na 42 °C. Bezpiecznie zamocuj próbkę w mikrotomie.Przygotuj przekroje o grubości siedmiu mikrometrów dla komórek dojrzałego gametofitu boechera. Następnie przenieś parafiniowe taśmy o długości od 10 do 15 centymetrów do plastikowego pudełka z czarną tekturą na dnie, a następnie umieść je na szkiełkach LAM. Aby przygotować szkiełka do LAM, umieść od pięciu do dziesięciu szkiełek w metalowych ramkach na płycie grzewczej płaskimi powierzchniami do góry.Nanieś pipetą od jednego do dwóch mililitrów wody wolnej od RNaz na plastikową część szkiełek. Za pomocą żyletki potnij wstążki parafiny na krótkie fragmenty o długości około czterech do pięciu centymetrów. Powinny być one wystarczająco długie, aby zakryć plastikowe okienka szkiełek.Następnie, za pomocą pęsety i igły preparacyjnej, ułóż paski parafiny równolegle do siebie na plastikowym okienku szkiełek. Ostrożnie unieś szkiełka z jednego końca, aby usunąć wodę, a następnie odstaw je na miejsce. Przykryj płytkę grzewczą plastikową pokrywą, nie dotykając szkiełek, upewniając się, że pokrywa umożliwia wymianę powietrza.Suszyć preparaty w temperaturze 42°C przez noc. W dygestorium odparafynować preparaty w ksylolu dwukrotnie, po 10 minut za każdym razem. Należy upewnić się, że zanurzona jest tylko plastikowa część szkiełek, a szerszy koniec metalowej ramki każdego preparatu pozostaje suchy, aby umożliwić ich wyjęcie.Pozostaw preparaty do wyschnięcia na 10 minut w dygestorium przed wykonaniem LAM. W ramach tej procedury włącz komputer oraz mikroskop do LAM. Następnie uruchom program sterujący mikroskopem i laserem.Włącz zasilacz kontrolny lasera i uruchom laser, naciskając odpowiedni przycisk na panelu sterowania. Następnie umieść nakrętkę w uchwycie na nakrętki. Połóż preparat LAM na szkiełku mikroskopowym, upewniając się, że płaska powierzchnia preparatu z przytwierdzonymi tkankami przylega do szkiełka.Następnie umieść preparat w urządzeniu, kładąc pod nim szkiełko przedmiotowe. Na koniec umieść w urządzeniu uchwyt z nakrętką. Wybierz obiektyw 4x.W programie przesuń obiektyw w górę. Następnie wykonaj skan preparatu. Przeszukaj preparat i zidentyfikuj interesujące struktury.Dokładnie określ i zapisz ich pozycje na szkiełku, aby umożliwić powrót do tej samej lokalizacji podczas etapu wycinania. Następnie wybierz odpowiedni obiektyw. Zweryfikuj położenie lasera, naciskając raz przycisk wystrzału lasera.Idealnie w części błony pozbawionej tkanki. Mając nakładkę w pozycji dolnej, należy użyć narzędzia pisaka ręcznego, aby zaznaczyć granice interesującego nas typu komórek lub tkanki. Na przykład komórki jajowej.Wykonaj wycięcie laserowe, naciskając przycisk Cut. Aby wyizolować pojedyncze komórki, kluczowe jest ich wyraźne zidentyfikowanie w odpowiednich przekrojach. Ponadto komórki powinny mieć średnicę co najmniej 8 µm, aby umożliwić przeprowadzenie analizy transkrypcyjnej specyficznej dla danego typu komórek.Należy pamiętać, że sekcjonowanie musi zostać powtórzone, jeśli obrzeże wokół komórki nie zostało całkowicie wycięte, co zazwyczaj można zaobserwować na ekranie. W takim przypadku zaleca się ustawienie oprogramowania tak, aby standardowo automatycznie wykonywało dwa powtórzenia sekcji. Następnie należy podnieść pokrywkę i przenieść się do następnej pozycji zapisu z interesującą strukturą oraz wycinać kolejne sekcje komórek, aż do momentu zebrania wszystkich interesujących komórek z jednego preparatu.Upewnij się, że nakrętka jest ustawiona w taki sposób, aby nowa sekcja przylegała do pustego miejsca na nakrętce. Po wyizolowaniu interesujących typów komórek ze wszystkich slajdów, wyjmij slajd z urządzenia. Ustaw uchwyt nakrętki w pozycji dolnej i dokonaj inspekcji wizualnej powierzchni nakrętki.Następnie należy użyć obiektywu 4x, aby wykluczyć nieswoiste zanieczyszczenia próbki. Po tym czasie należy zamknąć zakrętkę. Suche skrawki należy mrozić w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.Oto schematyczny rysunek dojrzałego gametofitu żeńskiego. Przedstawione obrazy to cienkie przekroje przez zalążki zawierające gametofity żeńskie u boechera divaricarpa, w których komórki jajowe są wyraźnie identyfikowalne dzięki charakterystycznej morfologii gametofitu żeńskiego. Analiza wykazała, że RNA uzyskane z przekrojów komórek jajowych charakteryzowało się podobną jakością co RNA pozyskane z większych obszarów tkankowych pobranych z tych samych preparatów w ramach kontroli.Osiągnięta jakość RNA była odpowiednia do sekwencjonowania RNA specyficznego dla typu komórek, co pozwoliło na zidentyfikowanie 236 genów ekspresjonowanych w apomiktycznej komórce jajowej, ale nie w apomiktycznej komórce centralnej, komórce synergidy ani apomiktycznej komórce inicjalnej. Nie stwierdzono ich również w komórkach dojrzałego płciowego gametofitu arabidopsis thaliana. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania z zakresu genetyki rozwoju można przeprowadzić profilowanie innych typów komórek i tkanek z różnych gatunków.Taka jak molekularna podstawa imprintingów w endospermie i embrionach nasion roślin. Po opracowaniu, technika ta utoruje drogę badaczom z dziedziny genetyki rozwojowej i reprodukcji roślin do zbadania transkrypcyjnych podstaw rozmnażania apomiktycznego w rodzaju Boechera. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak uzyskać wysokiej jakości RNA do specyficznych dla typu komórek analiz transkrypcyjnych z wykorzystaniem mikrodysekcji wspomaganej laserem.

laser-assisted-microdissection-lam-as-tool-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia z przechwytywaniem laserowym, znana również jako laserowa mikrodysekcja (LMD), umożliwia użytkownikowi izolację niewielkiej liczby komórek lub tkanek z zamrożonych lub ...

Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Celem tego protokołu jest wykorzystanie mikro-dysekcji laserowej jako skutecznej metody izolowania czystych populacji typów komórek z heterogenicznych tkanek prostaty do dalszej analizy RNA.

Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Laserowe mikrodyparowanie tkanek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej pozwala na precyzyjne pobieranie komórek z interesujących obszarów histologicznych w celu analizy danych multi-omicznych z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi.

Izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Poznaj mikrodysekcję wspomaganą laserowo do izolacji komórek roślinnych w celu profilowania transkrypcyjnego. Technika ta umożliwia uzyskanie RNA o wysokiej jakości z komórek jajowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Przeglądaj więcej filmów