Name: Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj metodę hybrydyzacji miRNA in situ do analizy ekspresji mikroRNA w tkankach raka piersi. Technika ta pozwala wykryć lokalizację komórkową miRNA i zrozumieć ich rolę w onkologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH (5R01 CA178386-03) oraz grant USC ASPIRE-1 dla HC. Chcielibyśmy podziękować Vrushabowi Gowdzie za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the Chonnam National University Hwasun Hospital i University of South Carolina. Próbki TMA składające się z raka piersi i dopasowanych do sąsiednich normalnych tkanek piersi zostały dostarczone przez Biobank Szpitala Narodowego Uniwersytetu Chonnam w Hwasun, członka Korea Biobank Network.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l wody wolnej od DNaz i RNaz. Wszystkie roztwory chemiczne należy przygotować przy użyciu wody uzdatnionej przez dietylopirowęglan (DEPC). Potraktuj 1 l wody 500 μl DEPC i inkubuj przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Autoklaw wody, aby dezaktywować DEPC. 
	Uwaga: Nie wdychać DEPC, ponieważ jest on znany jako rakotwórczy.</li>
	<li>Przygotuj 1x PBS z 10x PBS przy użyciu uzdatnionej wody DEPC.</li>
	<li>Przygotować 20x SSC (rozpuść 175,3 g NaCl i 88,2 g cytrynianu sodu w 800 ml wody, dostosuj pH do 7,0 za pomocą kilku kropli 14 N roztworu HCl i dostosuj objętość do 1 L wodą), 4% paraformaldehydu, 95% etanolu, 80% etanolu używając wody uzdatnionej DEPC.</li>
	<li>Dodać 8 ml trietanoloaminy i 1,05 ml HCl do 590 ml wody uzdatnionej DEPC i dodać 1,5 ml bezwodnika octowego do acetylacji.</li>
	<li>Przygotować 50 μg/μl proteinazy K w buforze (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 w wodzie uzdatnionej DEPC).</li>
	<li>Przygotować bufor hybrydyzacyjny składający się z 500 μl formamidu, 250 μl 20x SSC, 100 μl 50x roztworu Denhardta, 12,5 μl t-RNA, 2,5 μl DNA plemników śledzia, 30 μl RVC, 0,02 g odczynnika blokującego i 50 μl wody DEPC. Przygotuj świeże.</li>
</ol>
2. Skrawki tkanki piersi
<ol>
	<li>Wyciąć 5 μm skrawki zatopione w parafinie utrwalonym w formalinie za pomocą mikrotomu i nałożyć sekcję na szkiełko nasadowe14. 
	Uwaga: Użyta tutaj tkanka piersi została wcześniej przygotowana z Korea Biobank Network.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Usuń parafinę z tkanki, zanurzając szkiełka w słoiku Coplin 2x w świeżym ksylenie na 10 minut każdy i ponownie nawodnij sekcję tkanki przez 5 minut inkubacji w zmniejszających się stężeniach etanolu (100%, 95% i 80%) w ddH2O. Wykonaj ten krok w dygestorium.</li>
	<li>Zanurz chusteczkę w wodzie uzdatnionej DEPC na 5 minut. W tym momencie wyznacz granice wokół przekroju tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.</li>
	<li>Utrwal tkankę 4% PFA przez 15 minut, a następnie przemyj PBS.</li>
	<li>Zanurz chusteczkę w 0,3% Triton X-100/PBS na 10 minut, a następnie przemyj PBS.</li>
	<li>Inkubować próbkę w 50 μg/μl roztworu proteinazy K przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Następnie inkubować skrawki tkanek z trietanoloaminą i bezwodnikiem octowym przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemywać PBS. Nie jest wymagane płukanie PBS między leczeniem proteinazą K a leczeniem trietanoloaminą/bezwodnikiem octowym.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja
<ol>
	<li>Dokładnie umyj tkankę i inkubuj wycinek tkanki z buforem hybrydyzacyjnym przez 2 do 3 godzin w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj 120 μl buforu hybrydyzacyjnego wystarcza do pokrycia wycinka tkanki.</li>
	<li>Rozcieńczyć sondę LNA znakowaną 5'-DIG do końcowego stężenia 3 pM w 120 μl roztworu hybrydyzacyjnego. Ponieważ stężenie wyjściowe wynosi zwykle 40 ng/μl, dodać 3 μl bulionu do 120 μl buforu hybrydyzacyjnego i inkubować mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować wycinek tkanki za pomocą sondy przez noc w temperaturze 54 °C (Tm) w wilgotnej komorze. Zazwyczaj 120 μl wystarcza na pokrycie jednego odcinka. Stwórz wilgoć za pomocą dwóch mokrych ręczników papierowych. Idealny rozmiar komory to 10 cali na 8 cali.</li>
	<li>Uwaga: Tm może być różne dla różnych miRNA. 54 °C jest wspomniane dla miR-489.</li>
</ol>
5. Pranie surowości
<ol>
	<li>Myj tkankę 5x SSC przez 7 minut (po etapie hybrydyzacji warunki wolne od RNazy nie są już wymagane).</li>
	<li>Przemyć wycinek chusteczki 1x SSC przez 7 minut dwa razy w temperaturze 57 °C.</li>
	<li>Przemyć wycinek tkanki 0,2x SSC przez 7 minut w temperaturze 57 °C.</li>
	<li>Myć wycinek chusteczki 0,2x SSC przez 7 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować wycinek tkanki w PBS przez 10 minut.</li>
</ol>
6. Blokowanie
<ol>
	<li>Inkubować wycinek tkanki z buforem blokującym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w wilgotnej komorze (Aby uzyskać bufor blokujący, dodać 2 ml FBS, 10 μl Tween-20 i 3 μl BSA w 18 m PBS. Przechowywać bufor blokujący w temperaturze 4 °C).</li>
</ol>
7. Inkubacja i rozwój przeciwciał pierwotnych
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało anty-DIG-AP w stosunku 1:300 w buforze blokującym i inkubować wycinek tkanki z przeciwciałem w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przemyć sekcje buforem do płukania 3 razy, po 5 minut każdy (bufor dostarczany przez zestaw rozwojowy).</li>
	<li>Rozwiń sekcję tkankową za pomocą komercyjnego zestawu do fosfatazy alkalicznej, która wytwarza światło fluorescencyjne CY-3.</li>
	<li>Przemyć sekcję buforem do przemywania przez 5 minut. Część bejcowania 100 μl 2,5 ng/μl barwnika Hoechst przez 5 minut, a następnie przemyć 5 minut buforem do płukania.</li>
	<li>Zamontuj sekcję z odbojem montażowym zgodnie z protokołem producenta. Użyj 15 μl na fragment tkanki i przetrzyj nadmiar roztworu montażowego chusteczką higieniczną. Uszczelnij szkiełko przezroczystym lakierem do paznokci, aby zapobiec przeciekaniu.</li>
	<li>Obserwuj przekrój mikroskopu fluorescencyjnego za pomocą soczewki 10X, tak aby całkowite powiększenie wynosiło 100X.</li>
</ol>

<ol><li>Shah, N. R., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+pathogenesis+of+breast+cancer%3A+Implications+in+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment.</a> World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-185+suppresses+tumor+proliferation+by+directly+targeting+E2F6+and+DNMT1+and+indirectly+upregulating+BRCA1+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).</li>
<li>Ye, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+miR-375+induces+trastuzumab+resistance+in+HER2-positive+breast+cancer+by+targeting+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R.</a> BMC Cancer. 14, 134(2014).</li>
<li>Oneyama, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+downregulation+of+mTOR%2FFGFR3+controls+tumor+growth+induced+by+Src-related+oncogenic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways.</a> Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).</li>
<li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+breast+cancer%3A+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).</li>
<li>Quesne, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+prognostic+associations+of+miR-205+and+let-7b+in+breast+cancer+revealed+by+in+situ+hybridization+analysis+of+micro-RNA+expression+in+arrays+of+archival+tumour+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue.</a> J Pathol. 227, 306-314 (2012).</li>
<li>Fernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-340+inhibits+tumor+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+by+targeting+multiple+negative+regulators+of+p27+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).</li>
<li>Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-224+upregulation+and+AKT+activation+synergistically+predict+poor+prognosis+in+patients+with+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-146+up-regulation+predicts+the+prognosis+of+non-small+cell+lung+cancer+by+miRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization.</a> Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+in+situ+hybridization+for+formalin+fixed+kidney+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues.</a> J Vis Exp. , e50785(2013).</li>
<li>Ucar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-212+and+miR-132+are+required+for+epithelial+stromal+interactions+necessary+for+mouse+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development.</a> Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).</li>
<li>Nuovo, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+microRNAs+in+paraffin+embedded%2C+formalin+fixed+tissues+and+the+co-localization+of+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets.</a> Methods. 52, 307-315 (2010).</li>
<li>Kierzek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+locked+nucleic+acid+residues+on+the+thermodynamic+properties+of+2%27-O-methyl+RNA%2FRNA+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+miR-182+and+miR-503+cooperatively+targets+FBXW7%2C+contributing+to+the+malignant+transformation+of+colon+adenoma+to+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma.</a> J Pathol. 234, 488-501 (2014).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Celem tego badania było określenie poziomu ekspresji miRNA w tkankach raka piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ . Należy zauważyć, że w tym eksperymencie wszystkie warunki zostały zoptymalizowane pod kątem tkanki raka piersi. W przypadku innych typów tkanek może być wymagana dalsza optymalizacja. Wszystkie roztwory muszą być wykonane z wodą DEPC, a wszystkie pojemniki, które mają być używane, należy przepłukać wodą uzdatnioną DEPC, a następnie sterylizować w autoklawie. Nawet niewielkie zanieczyszczenie R...

Rak piersi jest jednym z najczęstszych nowotworów złośliwych dotykających populację kobiet na całym świecie. Każdego roku na całym świecie odnotowuje się ponad 1,3 miliona przypadków raka piersi1,2. Chociaż komórki nowotworowe są tradycyjnie uważane za biologicznie jednorodne i wysoce proliferacyjne, stało się oczywiste, że rak piersi jest genetycznie i klinicznie niejednorodny. Oporność na powszechne leki przeciwnowotworowe jest cechą charakterystyczną zaawansowanego raka piersi, prowadząc do śmiertelności u większości pacjentek poprzez ułatwienie progresji raka i przerzutów na odległość3.
MikroRNA (miRNA) to klasa małych cząsteczek RNA o długości około 22 nukleotydów, które regulują ekspresję genów poprzez blokowanie translacji mRNA lub pośredniczenie w degradacji mRNA4. Do tej pory u ludzi zidentyfikowano ponad 2000 różnych miRNA, które są powiązane z chorobami u ludzi5. Coraz więcej badań wykazało, że miRNA mogą funkcjonować jako onkogeny i supresory nowotworów i często są rozregulowane w nowotworach6. miRNA silnie wpływają na całą pierwotną nowopłodność, kontrolując główne regulatory progresji cyklu komórkowego, starzenia się, apoptozy i autofagii, a także ruchliwości komórek nowotworowych, inwazji i przerzutów7.
Nieprawidłowa ekspresja miRNA została również powiązana z implikacjami klinicznymi, takimi jak stadium, różnicowanie, rokowanie i odpowiedź na terapię adiuwantową8. W szczególności zwiększona ekspresja miR-146 jest skorelowana ze złym rokowaniem u pacjentów z rakiem płuc9. Inne badanie wykazało, że utrata ekspresji miRNA-let7b jest związana ze złośliwymi fenotypami, a w konsekwencji ze słabym przeżyciem6. Zrozumienie typów komórek i struktur, które wyrażają miRNA, jest ważną częścią zrozumienia mechaniki, poprzez którą zmiany w ekspresji miRNA wpływają na fenotypy komórek i tkanek10. Niektóre miRNA, które są wydzielane w komórkach zrębu, są pobierane przez komórki nabłonkowe i specyficznie działają na swoje cele. W tym samym duchu miR-212 i miR-132 są wydzielane przez zrąb i regulują interakcje nabłonkowo-zrębowe wymagane do przerostem przewodowym podczas rozwoju gruczołu sutkowego11. Ogólnym celem tego artykułu jest wyjaśnienie szczegółowego protokołu wykrywania ekspresji miRNA w tkankach raka piersi poprzez hybrydyzację miRNA in situ. Zoptymalizowaliśmy wszystkie warunki, aby oznaczyć poziomy ekspresji miRNA-489 w próbkach pacjentów z rakiem piersi. W tym celu w naszym eksperymencie użyliśmy sondy z zablokowanym kwasem nukleinowym (LNA) oznaczonej znakiem DIG. Niektóre z jego nukleotydów miały modyfikację LNA, czyli mostek metylenowy łączący 2' atom tlenu i 4' atom węgla szkieletu rybozy, który utrwala nukleotyd tak, że pozostaje "zablokowany na miejscu" po hybrydyzacji. W rezultacie zhybrydyzowanemu kompleksowi znacznie trudniej jest denaturować12,13.

<table><tbody><tr><td>Technologia ELF-97</td><td>Life&nbsp;</td><td>E6604</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhard't&nbsp;</td><td>Technologia życiowa&nbsp;</td><td></td><td></td>750018</tr><tr><td>t-RNA</td><td>Roche</td><td>109541</td><td>Rozpuszcza się w wodzie DEPC</td></tr><tr><td>DNA plemników śledzia</td><td>Promega&nbsp;</td><td>D1815</td><td></td></tr><tr><td>Roche Blokowanie&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>RVC</td><td>Fisher</td><td>50-812-650</td><td>Przed użyciem odkręć go przy 16.1 RCF i weź supernatant&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda miR-489&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>38599-01</td><td></td></tr><tr><td>Bez nukleaz BSA</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>711454</tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne anty DIG</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11093274910</tr><tr><td>Pirowęglan dietylu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1609478</td><td></td></tr></tbody></table>

kliniczno-patologiczna analiza ekspresji mirna w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji mirna in situ

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół wykrywania miRNA w tkance raka piersi za pomocą hybrydyzacji in situ z sondą LNA (Locked Nucleic Acid) znakowaną digoksygeniną. Sonda została rozpoznana na podstawie przeciwciał fosfatazy alkalicznej anty-DIG, a następnie opracowana przy użyciu substratu fosfatazy alkalicznej wytwarzającego sygnały fluorescencyjne. Tutaj wykorzystaliśmy technikę hybrydyzacji miRNA in situ (MISH) do analizy ekspresji miR-489 w tkankach pacjentów z rakiem piersi. Technika ta może wykryć lokalizację miRNA będącego przedmiotem zainteresowania w poszczególnych próbkach tkanek. Technika ta może być wykorzystana do porównania ekspresji pożądanego miRNA w tkance nowotworowej z ekspresją w sąsiedniej normalnej tkance oraz do identyfikacji specyficznych struktur odpowiedzialnych za ekspresję tego miRNA. Technika ta może być bardzo przydatna w udzielaniu odpowiedzi na niektóre pytania kliniczne, takie jak rola specyficznego miRNA w rozwoju raka. Nasze wyniki wskazują, że komórki nabłonka sutka wyrażają znacznie wyższe poziomy miR-489 niż sąsiednie komórki nowotworowe.

Do oznaczenia ekspresji miRNA-489 wykorzystano ludzką tkankę raka piersi. Stwierdzono, że w przewodach gruczołu mlekowego oraz komórkach nabłonkowych u dwóch pacjentek występuje znacznie wyższy poziom miRNA-489 niż w przyległej tkance nowotworowej (Rysunek 1A i 1B). Wyraźnie pokazuje to, że w tkance nowotworowej utracono ekspresję miRNA-489, co sugeruje aktywność supresorową miRNA-489. Aby dodatkowo potwierdzić te wyniki, porównano tkankę nowotworową z pr...

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania ekspresji miRNA w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ.

Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Ogólnym celem tej metody hybrydyzacji in situ mikroRNA jest wykrycie lokalizacji interesującego nas mikroRNA w tkance raka piersi. Dzięki temu uzyskane wyniki mogą odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka piersi, na przykład czy dane mikroRNA pełni rolę onkogenną, czy jest supresorem nowotworowym.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykrywania jądrowości komórek o określonych cechach w tkance raka piersi. Przygotowanie tkanki należy rozpocząć od usunięcia parafiny z wcześniej przygotowanych skrawków tkanki piersi. Slajdy należy zanurzyć w słoiku Coplina w świeżym ksylenie dwukrotnie po dziesięć minut.Ponownie nawodnij przekrój tkanki, inkubując go przez pięć minut w roztworach etanolu o malejących stężeniach w wodzie dwukrotnie destylowanej. Następnie zanurz tkankę na pięć minut w wodzie traktowanej diethylopyrokarbonianem (DEPC). Podczas gdy tkanka jest zanurzona, wyznacz granice wokół przekroju tkanki za pomocą wodoodpornego pisaka do tworzenia barier hydrofobowych.Po zanurzeniu w DEPC utrwal tkankę w 4% PFA przez 15 minut. Po utrwalaniu przemyj tkankę roztworem PBS. Następnie zanurz tkankę w 0,3% Triton X-100 w PBS na dziesięć minut.Inkubować próbkę z roztworem Proteinazy K o stężeniu 50 µg/µL przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Następnie inkubować skrawki tkanki z trietanolaminą i bezwodnikiem octowym przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po tym etapie przeprowadzić przemywanie w PBS.Dokładnie przemyj tkankę. Następnie inkubuj przekrój tkanki w 120 µL buforu do hybrydyzacji przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. W kolejnym kroku rozcieńcz sondę NLA znakowaną DIG 5' do końcowego stężenia 3 pM w 120 µL roztworu do hybrydyzacji.Następnie do 120 µL buforu do hybrydyzacji należy dodać 3 µL roztworu zapasowego o stężeniu 40 ng/µL. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Przekładamy skrawek tkanki do pojemnika o wymiarach 10x8 cali i pokrywamy go 120 µL sondy w taki sposób, aby tkanka była całkowicie zakryta.Zmocz dwa ręczniki papierowe i przykryj nimi pojemnik, aby stworzyć komorę wilgotnościową. Inkubuj przekrój tkanki przez noc w temperaturze 54 °C. Po hybrydyzacji przemyj tkankę pięciokrotnym buforem cytrynianowo-solnym (SSC) przez siedem minut w temperaturze 57 °C.Następnie przemyć przekrój tkanki dwukrotnie roztworem 1 X SSC. Następnie przemyj przekrój tkanki roztworem 0,2 X SSC. Potem przemyj przekrój tkanki roztworem 0,2 X SSC przez siedem minut w temperaturze pokojowej.Inkubować skrawki tkanki w PBS przez dziesięć minut. Inkubować skrawki tkanki w buforze blokującym w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w komorze wilgotnościowej. Rozcieńczyć przeciwciało anty-DIG AP w stosunku 1:300 w buforze blokującym.Następnie inkubować skrawki tkanki z przeciwciałem w temperaturze 4 stopni Celsiusia przez noc. Następnego dnia przemyć skrawki buforem do płukania trzykrotnie, przez pięć minut za każdym razem. Postępować zgodnie z instrukcją komercyjnego zestawu ELF 97, aby wywołać obraz na skrawku tkanki za pomocą fosfatazy alkalicznej, która generuje fluorescencję o wielkości trzy.Następnie przemyj przekrój buforem do płukania przez pięć minut. Barw przekrój, stosując 100 µL barwnika Hoeshct w stężeniu 2,5 ng/µL przez pięć minut. Po barwieniu przeprowadź pięciominutowe płukanie buforem do płukania.Użyj 15 µL buforu montującego na każdy przekrój tkanki. Nadmiar roztworu montującego usuń za pomocą chusteczki do tkanek. Następnie zabezpiecz preparat bezbarwnym lakierem do paznokci, aby zapobiec wyciekaniu.Na koniec obserwuj przekrój pod mikroskopem fluorescencyjnym przy całkowitym powiększeniu 100 X. Do oznaczenia ekspresji Micro RNA 489 wykorzystano tkankę raka piersi u dwóch pacjentek. Stwierdzono, że w przewodach gruczołów mlekowych oraz komórkach nabłonkowych poziom Micro RNA 489 był znacznie wyższy niż w sąsiedniej tkance nowotworowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania hybrydyzacji Micro RNA in situ z wykorzystaniem próbek od pacjentek z rakiem piersi.

clinicopathological-analysis-mirna-expression-breast-cancer-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Tutaj opisujemy uproszczony protokół analiz ekspresji mikroRNA (miRNA) w archiwalnych tkankach klinicznych z utrwalonym formaliną, parafiną (FFPE) lub świeżo mrożonym rakiem prostaty (PCa) z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) i hybrydyzacji in situ (ISH).

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

Degradacja kwasów nukleinowych w tkance archiwalnej, niejednorodność guzów i brak świeżo zamrożonych próbek tkanek mogą negatywnie wpłynąć na usługi diagnostyczne raka w laboratoriach patologicznych na całym świecie. Niniejszy manuskrypt opisuje optymalizację panelu biomarkerów przy użyciu multipleksowego testu kulek magnetycznych do klasyfikacji raka piersi.

Optymalizacja testu ekspresji opartego na multipleksowym RNA z wykorzystaniem materiału archiwalnego raka piersi

Próbki zatopione w parafinie w formalinie stanowią cenne źródło molekularnych biomarkerów chorób ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy laboratoryjny protokół przygotowania biblioteki cDNA, początkowo zaprojektowany ze świeżo mrożonym RNA i zoptymalizowany do analizy zarchiwizowanych mikroRNA z tkanek przechowywanych do 35 lat.

Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Przedstawiamy protokół analizy strukturalnej i składu naturalnego biofilmu jamy ustnej pobranego z aparatów ortodontycznych z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) oraz konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM). Próbki biofilmu jamy ustnej pobrano z aparatów do rozszerzania podniebienia, zeskrobując z ich powierzchni płatki żywicy akrylowej i przekazując je do obróbki molekularnej.

Analiza biofilmu jamy ustnej w aparatach do rozszerzania podniebienia z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej i konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej

W patogenezie przerzutów do kości angiogeneza jest procesem kluczowym, w związku z czym stanowi cel obrazowania i terapii. W niniejszej pracy przedstawiamy szczurzy model miejscowych przerzutów raka piersi do kości oraz opisujemy strategie nieinwazyjnego obrazowania angiogenezy in vivo z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultrasonografii.

Wielomodalne obrazowanie angiogenezy w modelu przerzutów raka piersi do kości u szczurów nago z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultradźwięków

Poznaj metodę hybrydyzacji miRNA in situ do analizy ekspresji mikroRNA w tkankach raka piersi. Technika ta pozwala wykryć lokalizację komórkową miRNA i zrozumieć ich rolę w onkologii.

Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

Przeglądaj więcej filmów