Name: Nowatorska technika pasmowania ex ovo w celu zmiany hemodynamiki wewnątrzsercowej w embrionalnym układzie kurcząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj technikę pasmowania ex ovo do modyfikacji hemodynamiki w embrionalnym sercu kurcząt. Ta metoda pozwala badać konsekwencje genetyczne zmian przepływu krwi w rozwoju układu sercowo-naczyniowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Robertowi Price'owi i personelowi Instrumentation Resource Facility w University of South Carolina School of Medicine. Prace te były częściowo wspierane przez grant SPARC Graduate Research Grant z Biura Wiceprezydenta ds. Badań na Uniwersytecie Południowej Karoliny (JDP/VM). Ponadto prace te były wspierane przez Cook Biotech Research Agreement (JDP) oraz przez FirstString Research Inc (JDP) i NIH 2 P20-RR016434-06 (JDP). Ponadto grant NIH IDeA Networks of Biomedical Research Excellence (INBRE) dla P20GM103499 Południowej Karoliny (JE)

Ptasie embriony nie są uważane za kręgowce zgodnie z przepisami IUCAC.
1. Pozyskiwanie zarodków do operacji
<ol>
	<li>Inkubować 80 - 90 zapłodnionych jaj kurzych Bovan (koniec do góry) w nawilżanym (60%) inkubatorze kołyskowym w temperaturze 40 °C przez około 72 godziny, aby uzyskać zarodki w stadium 17 Hamiltona i Hamburgera (HH). Określ dokładną liczbę komórek jajowych na podstawie analizy mocy i przeżywalności zarodków 17. Do inkubacji używaj plastikowych tacek na jajka, aby zapewnić odpowiednią cyrkulację powietrza.</li>
	<li>Po osiągnięciu tego pożądanego stadium rozwojowego wlać około 20 ml ciepłego (37 °C) buforu Tyrode'a (uzupełnionego wodorowęglanem sodu (1 g/l)) na szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 26 mm.</li>
	<li>Wysterylizuj skorupkę jajka 70% etanolem.</li>
	<li>Delikatnie rozłup skorupę trzonkiem skalpela i ostrożnie uwolnij jej zawartość do naczynia zawierającego bufor Tyrode'a. Wyrzuć zarodki, jeśli (i) wizualnie wydają się nieprawidłowe, (ii) nie są we właściwym stadium rozwoju, (iii) są nieprawidłowo ułożone na żółtku i/lub (iv) wystąpi jakiekolwiek krwawienie. Zarodki, które nie zostały poddane zabiegowi chirurgicznemu, należy zachować bezpośrednio po umieszczeniu ich ex ovo w temperaturze 40 °C, aby nie zaburzać rozwoju. 
	Uwaga: Inscenizacja odbywa się w oparciu o Hamilton i Hamburger 18. Nieprawidłowości w zarodkach piskląt określa się gołym okiem i w zakresie sekcji. Upewnij się, że zarodek ma odpowiednie fałdowanie i zginanie oraz unaczynienie.</li>
</ol>
2. Banderole OFT
<ol>
	<li>Wyciągnij pojedyncze nici o długości 1 cm z pojedynczego nylonowego szwu chirurgicznego 11/0 i uformuj luźny węzeł. Sterylizuj UV wszystkie wstępnie uformowane węzły.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym upewnij się, że serce bije w normalnym tempie (~ 120 uderzeń/min). Jeśli nie, wyrzuć zarodek.</li>
	<li>Tuż przed zabiegiem należy nanieść 5 - 6 ml ciepłego (37 °C) buforu Tyrode'a na powierzchnię zarodka za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Przełóż jeden wolny koniec wstępnie uformowanego węzła pod OFT, umieść szew na połączeniu OFT/komora (OVJ) (lub w pożądanym miejscu) i przełóż wolny koniec do węzła, zwężając w ten sposób OFT, w tym błony otaczające serce.</li>
	<li>Po zabiegu chirurgicznym zwilżyć powierzchnię żółtka 5 - 6 ml ciepłego (37 °C) buforu Tyrode'a za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Zarodki kontrolne należy utrzymywać ex ovo jak zarodki prążkowane, nie należy jednak poddawać ich zabiegowi chirurgicznemu.</li>
	<li>Inkubować zarodki przez żądany czas w temperaturze 40 °C w wilgotnym (60%) inkubatorze.</li>
	<li>Po osiągnięciu pożądanego punktu czasowego wytnij zarodek z żółtka za pomocą prostych nożyczek. Wypreparuj serce za pomocą cienkich kleszczy i użyj do kilku dalszych badań, takich jak zmiany w morfologii serca spowodowane zmienioną hemodynamiką 17.</li>
</ol>
3. Potwierdzenie, że interwencja w pasmo powoduje zmianę hemodynamiki
Uwaga: Częściowe zwężenie spowodowane interwencją w banderolowanie prowadzi do wzrostu prędkości przepływu krwi w OVJ. Ten parametr hemodynamiczny jest wygodnie oceniany za pomocą obrazowania ultradźwiękowego 2D, które jest wykonywane w pożądanym punkcie czasowym eksperymentu.
<ol>
	<li>Ze względu na to, że w danym momencie można zobrazować tylko jeden zarodek, wszystkie pozostałe zarodki przeznaczone do obrazowania ultrasonograficznego należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego zawierającą zarodek, który ma być zobrazowany, na poduszce grzewczej ustawionej na 40 °C.</li>
	<li>Napełnij naczynie po brzegi ciepłym (37 °C) buforem Tyrode. Powoli wlewaj roztwór buforowy do naczynia, aby żółtko pozostało nienaruszone. Jeśli jednak na tym etapie integralność żółtka zostanie naruszona, należy wyrzucić zarodek.</li>
	<li>Ustaw zarodek w taki sposób, aby środkowa oś zarodka była prostopadła do sondy ultradźwiękowej, która jest zawieszona na regulowanym stojaku.</li>
	<li>Gdy aparat ultrasonograficzny pracuje w trybie B, uzyskaj obraz 2D bijącego serca na ekranie i przesuń stolik (poduszkę grzewczą) tak, aby OFT, komora i OVJ były wyraźnie widoczne.</li>
	<li>Przełącz się w tryb fali pulsacyjnej (PW) z żądaną częstotliwością powtarzania impulsów (np. 20 kHz) i uzyskaj dane o prędkości dokładnie w OVJ. Na ekranie uzyskuje się obraz bijącego serca w trybie B.
	<ol>
		<li>Przesuń scenę, aby zobaczyć OFT, komorę i OVJ. Korzystając z oprogramowania ultrasonografu, uzyskaj pomiary prędkości dokładnie w OVJ.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli tętno zarodka spada podczas obrazowania, uzyskane w ten sposób dane dotyczące prędkości nie powinny być wykorzystywane do analizy. Zaleca się, aby wszystkie zarodki używane do pomiarów prędkości nie były wykorzystywane do żadnych innych eksperymentów po obrazowaniu ultrasonograficznym.

<ol><li>Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+outflow+tract+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac outflow tract anomalies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 499-530 (2013).</li>
<li>Combs, M., Yutzey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+development%3A+regulatory+networks+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Heart valve development: regulatory networks in development and disease.</a> Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).</li>
<li>Hinton, R., Yutzey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).</li>
<li>von Gise, A., Pu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+and+epicardial+epithelial+to+mesenchymal+transitions+in+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease.</a> Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).</li>
<li>Person, A., Klewer, S., Runyan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+cardiac+cushion+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of cardiac cushion development.</a> Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).</li>
<li>de Vlaming, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrioventricular+valve+development%3A+new+perspectives+on+an+old+theme%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme.</a> Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).</li>
<li>Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).</li>
<li>Hove, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracardiac+fluid+forces+are+an+essential+epigenetic+factor+for+embryonic+cardiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis.</a> Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+forces+and+rhoA+regulate+fibrous+development+of+the+atrioventricular+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves.</a> Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).</li>
<li>Biechler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+flow-induced+forces+on+the+morphogenesis+of+the+outflow+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract.</a> Front Physiol. 5, (2014).</li>
<li>Hu, N., Clark, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+of+the+stage+12+to+stage+29+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo.</a> Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).</li>
<li>Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+vitelline+vein+ligation+alters+intracardiac+blood+flow+patterns+and+morphogenesis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo.</a> Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).</li>
<li>Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraembryonic+venous+obstructions+lead+to+cardiovascular+malformations+and+can+be+embryolethal%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal.</a> Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).</li>
<li>Reckova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+is+a+key+epigenetic+factor+in+development+of+the+cardiac+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system.</a> Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).</li>
<li>Stekelenburg-de Vos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acutely+altered+hemodynamics+following+venous+obstruction+in+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo.</a> J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).</li>
<li>Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+hemodynamics+and+mechanical+properties+after+circulatory+intervention+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo.</a> J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).</li>
<li>Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Hemodynamics+in+the+Embryonic+Heart+Affects+Outflow+Valve+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Dev.+Dis%22%5BJournal%5D)">Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 473-481 (1951).</li>
<li>Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+dynamics+reflect+degree+of+outflow+tract+banding+in+Hamburger-Hamilton+stage+18+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos.</a> J R Soc Interface. 11 (100), (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ta technika jest stosunkowo szybka i łatwa do wykonania, jednak należy pamiętać o kilku kluczowych punktach, aby uzyskać dokładne wyniki. Zarodki powinny być utrzymywane ex ovo na szalce Petriego, która zawiera bufor Tyrode'a w celu zapewnienia odpowiedniego nawodnienia. Ważne jest również, aby nawodnić żółtko po operacji buforem Tyrode'a i upewnić się, że komora inkubacyjna jest odpowiednio nawodniona. Nie należy wykonywać operacji na zarodku, jeśli widoczne jest krwawienie lub żółtko jest nawet nieznacznie zła...

Nieprawidłowo uformowane zastawki odpływowe są najczęstszym rodzajem wrodzonych wad serca 1. Jednak wadliwa budowa i funkcja zastawki serca, mimo że występuje przy urodzeniu, może dać się nasilić dopiero w wieku dorosłym. W rzeczywistości kilka chorób zastawek u dorosłych można przypisać wrodzonemu pochodzeniu. Leczenie takich pacjentów często wiąże się z wymianą uszkodzonych zastawek, a co ważne, wykazano, że wymienione zastawki aortalne mają wady wrodzone 2. Biorąc pod uwagę fakt, że krytyczne procesy związane z rozwojem zastawki rozpoczynają się wcześnie w okresie embriogenezy, podkreślono znaczenie lepszego zrozumienia mechanizmów regulujących te zdarzenia. 
Prymitywna rurka serca, która jest pierwszym działającym organem w embrionie, posiada dwie odrębne warstwy - śródbłonek otoczony mięśniem sercowym - oddzielony macierzą zewnątrzkomórkową (galaretką sercową), która jest głównie wytwarzana i wydzielana przez mięsień sercowy 3-5. W miarę rozwoju zawiązki zastawek (poduszki wsierdziowe) powstają, po prawostronnym zapętleniu serca zarodkowego, przez miejscowe rozszerzenie galaretki serca w kanale przedsionkowo-komorowym (AV) i drodze odpływu (OFT) 4,6. W tej ekspansji pośredniczy wysoce regulowany proces przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), podczas którego galaretka serca zostaje zaludniona przez komórki mezenchymalne pochodzące z wsierdzia 6. Oprócz populacji mezenchymalnej pochodzącej z EMT, komórki grzebienia nerwowego są również zaangażowane w walwurogenezę OFT 3. 
Bodźce hemodynamiczne, takie jak stres ścinający, są ważnymi czynnikami epigenetycznymi, które regulują rozwój serca w zarodku 7,8. Korzystając z systemu 3D in vitro, wykazaliśmy wcześniej, że naprężenie ścinające jest czynnikiem wpływającym na ekspresję i odkładanie się włóknistych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w poduszkach AV i OFT 9,10. Co więcej, badania przeprowadzone przez kilku badaczy wykazały, że zmieniony przepływ krwi prowadzi do nieprawidłowych zastawek i tworzenia przegród 11-16. Niedawno, stosując przedstawioną tutaj nowatorską procedurę pasmowania, wykazaliśmy, że zmiana hemodynamiki w embrionalnym sercu piskląt wpływa na wczesne procesy związane z tworzeniem zastawki OFT 17.
Technika opisana tutaj dostarcza nowatorskiego modelu zmiany hemodynamiki w rozwijającym się sercu pisklęcia poprzez częściowe zwężenie OFT ex ovo. Ta powtarzalna procedura jest stosunkowo szybka i pozwala naukowcom uzyskać wystarczającą liczbę zarodków/całych serc/tkanek OFT itp. do dalszych analiz, w tym badań ekspresji genów. Co więcej, ten nowy model może być wykorzystany do badania "przewlekłego" wpływu zmienionej hemodynamiki na rozwój zastawki OFT.

<table><tbody><tr><td>Zapłodnione jaja kurze Bovan</td><td>Clemson University, Clemson, SC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11 / 0 Nylonowy szew</td><td>Ashaway</td><td>S30001</td><td>Sterylizacja UV węzłów przed zabiegiem</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100 x 26 mm</td><td>VWR</td><td>25387-030</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>232-20S</td> Rękojeść skalpela <td></td></tr><tr><td>#3</td><td>Fine Science Tools</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki proste</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 kleszcze drobnoziarniste</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Bufor tyrodów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2145-10L</td><td>Filtr sterylizowany przed użyciem&nbsp;</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 System obrazowania ultrasonograficznego</td><td>VisualSonics, Inc.</td><td>VS-11392</td><td></td></tr><tr><td>708 Przetwornik ultradźwiękowy&nbsp;</td><td>VisualSonics, Inc.</td><td>VS-11171</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

nowatorska technika pasmowania ex ovo w celu zmiany hemodynamiki wewnątrzsercowej w embrionalnym układzie kurcząt

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Nowy model prezentowany tutaj może być wykorzystany do zrozumienia wpływu hemodynamiki na określone procesy rozwojowe serca, na poziomie komórkowym i molekularnym. Aby zmienić hemodynamikę wewnątrzsercową, zapłodnione jaja kurze inkubuje się w wilgotnej komorze w celu uzyskania zarodków o pożądanym stadium (HH17). Po osiągnięciu tego etapu rozwojowego zarodek jest utrzymywany ex ovo, a hemodynamika w sercu embrionalnym jest zmieniana poprzez częściowe zwężenie drogi odpływu (OFT) za pomocą szwu chirurgicznego na styku OFT i komory (OVJ). Zarodki kontrolne są również hodowane ex ovo, ale nie są poddawane interwencji chirurgicznej. Zarodki prążkowane i kontrolne są następnie inkubowane w wilgotnym inkubatorze przez pożądany okres czasu, po czym stosuje się ultradźwięki 2D do analizy zmiany prędkości przepływu krwi w OVJ w wyniku prążkowania OFT. Gdy zarodki są utrzymywane ex ovo, ważne jest, aby zapewnić odpowiednie nawodnienie w komorze inkubacyjnej, aby zapobiec wysuszeniu i ostatecznie śmierci zarodka. Korzystając z tego nowego modelu pasmowego, możliwe jest teraz przeprowadzanie analiz zmian w ekspresji kluczowych czynników zaangażowanych w rozwój zastawki oraz zrozumienie roli hemodynamiki w odpowiedziach komórkowych in vivo, co wcześniej nie było możliwe.

Na Rysunku 1 przedstawiono zalecane instrumenty niezbędne do pasmowania OFT. Szalka Petriego (Rysunek 1A) zawierająca embrion ex ovo powinna być wystarczająco głęboka, aby nie uszkodzić zarodka po przykryciu pokrywką. Głębokie szalki Petriego (Rysunek 1C) należy stosować również podczas obrazowania ultrasonograficznego, aby umożliwić wlanie na żółtko odpowiedniej objętości buforu Tyrode'a.
<p class="jove_content" fo:keep-toge...

Po raz pierwszy prezentujemy tutaj powtarzalną procedurę bandingu zmieniającą hemodynamikę w rozwijającym się sercu ex ovo. Osiąga się to poprzez częściowe zwężenie drogi odpływu (OFT).

Nowatorska technika pasmowania ex ovo w celu zmiany hemodynamiki wewnątrzsercowej w embrionalnym układzie kurcząt

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Ogólnym celem procedury bandażowania ex ovo jest stworzenie powtarzalnej, nieletalnej zmiany w hemodynamice serca w celu zbadania wynikających z niej konsekwencji genetycznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny rozwoju układu sercowo-naczyniowego, takie jak rozwój zastawek serca oraz powiązane z nimi stany chorobowe. Atutem tego systemu jest możliwość badania szlaków genetycznych reagujących na zmieniającą się hemodynamikę w rozwijającym się sercu i zastawkach, a także pomoc w znalezieniu punktu krytycznego, po którym uratowanie serca nie wywołuje długotrwałych szkodliwych efektów.Procedury zaprezentują Lorain Junor, technik z mojego laboratorium, oraz pan Vinal Menon, doktorant w laboratorium, który zademonstruje sposób obchodzenia się z jajami oraz obsługę urządzenia do ultrasonografii. Inkubuj od 80 do 90 zapłodnionych jaj kurzych rasy Bovan, ułożonych tępym końcem do góry na plastikowych tacach do jaj w nawilżanym inkubatorze kołyskowym ustawionym na 40 °C. Pozostaw je do rozwoju przez około 72 godziny do stadium HH 17.Po osiągnięciu stadium 17 wlej około 20 mililitrów ciepłego buforu Tyrode'a z dodatkiem wodorowęglanu sodu do szalki o wymiarach

a-novel-ex-ovo-banding-technique-to-alter-intracardiac-hemodynamics

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Kurze zarodki, jako klasyczny model rozwojowy, są używane w naszym laboratorium do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po ekspozycji na różne zanieczyszczenia środowiska. Metody ekspozycji i metody oceny morfologicznej/funkcjonalnej zostały opisane w niniejszym manuskrypcie.

Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualny do wykonania modelu podwiązania lewego przedsionka (LAL) w zarodku ptaka. Model LAL zmienia przepływ wewnątrzsercowy, który zmienia obciążenie naprężeniem ścinającym ścianę, naśladując zespół niedorozwoju lewego serca. Przedstawiono podejście do przezwyciężenia wyzwań związanych z tym trudnym modelem mikrochirurgii.

Podwiązanie lewego przedsionka w zarodku ptaka jako model zmienionego obciążenia hemodynamicznego we wczesnym rozwoju naczyniowym

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj technikę pasmowania ex ovo do modyfikacji hemodynamiki w embrionalnym sercu kurcząt. Ta metoda pozwala badać konsekwencje genetyczne zmian przepływu krwi w rozwoju układu sercowo-naczyniowego.

Nowatorska technika pasmowania ex ovo w celu zmiany hemodynamiki wewnątrzsercowej w embrionalnym układzie kurcząt

Przeglądaj więcej filmów