Name: Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę dotchawicznego podawania Haemophilus influenzae w modelach mysich do badania zapalenia dróg oddechowych. Technika ta pozwala analizować mechanizmy odpowiedzi immunologicznej w płucach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorowi Carsonowi Harrodowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy również panu Minghui Zeng oraz doktorom Mahesh Kathania i Prashant Khare za ich wkład. Praca ta była wspierana przez granty American Cancer Society (grant Research Scholar, 122713-RSG-12-260-01-LIB) oraz Sammons Cancer Center (grant Pilot Project) dla K. Venuprasad.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Instytutu Badawczego Baylor.
1. Hodowla nietypizowanych Haemophilus influenzae (NTHi) i przygotowanie inokulum
<ol>
	<li>Umieść NTHi na płycie z agarem czekoladowym i trzymaj płytkę do góry nogami w nawilżanym inkubatorze CO2 przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Następnego dnia posadź bakterie w bulionie z naparu do serca mózgu. Następnie dodaj 1 ml bulionu do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 4 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnego 1x PBS. Powtórz ten krok raz.</li>
	<li>Przenieść 100 μl ponownie zawieszonego roztworu do 900 μl 1x PBS i zmierzyć absorbancję rozcieńczonej kultury przy długości fali 600 nm w spektrofotometrze.</li>
	<li>Określić żywotność i jednostki tworzące kolonie (CFU) inokulum poprzez hodowlę seryjnych rozcieńczeń w stosunku 1:10 na płytkach agaru czekoladowego i inkubację przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Opierając się na żywotności i jtk określonych w poprzednim kroku, dostosować inokulum do końcowego stężenia 20 x 106 jtk/ml.</li>
</ol>
2. Wkraplanie dotchawicze (i.t)
<ol>
	<li>Wstrzyknąć myszowi dootrzewnowo (i.p) 0,1 ml/10 g masy ciała myszy roztworem 150 mg/ml ketaminy + 20 mg/ml ksylazyny. Zabieg należy wykonać w kapturze ze źródłem światła, aby utrzymać zwierzę w cieple.</li>
	<li>Ściśnij przestrzeń międzypalcową myszy, aby sprawdzić, czy mysz jest odpowiednio znieczulona.</li>
	<li>Umieść mysz na plecach. Ogol brzuszną część szyi i zdezynfekuj chlorheksydyną i 70% alkoholem etylowym.</li>
	<li>Podnieś skórę górnej brzusznej części szyi za pomocą kleszczy do zębów szczurów. Wykonaj małe nacięcie (0,5-1,0 cm) nad grasicą za pomocą skalpela i ostrożnie wypreparuj mięsień, aby odsłonić tchawicę.
	<ol>
		<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 27 g powoli wstrzyknąć 0,05 ml powietrza, następnie 0,05 ml NTHi uzyskanego z sekcji 1 lub soli fizjologicznej jako kontroli, a następnie kolejne 0,05 ml powietrza. Trzymaj zwierzę w pozycji pionowej przez około 1 minutę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij nacięcie klejem chirurgicznym. Trzymaj mysz w pozycji bocznej leżącej i ciepłej przez około 10 minut.</li>
</ol>
3. Kolekcja BALF
<ol>
	<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy 24 godziny po zakażeniu.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną myszy anatomicznymi nożyczkami i przetnij aortę brzuszną, aby krwawić. Odsłoń brzuszną część płuca.</li>
	<li>Odsłoń tchawicę i zaintubuj ją cewnikiem o rozmiarze 20. Wkroplić 0,8 ml buforu BALF (1x PBS, 0,1% dekstrozy, 10 U/ml heparyny) i zebrać płukanie przez delikatne zasysanie. Powtórz tę procedurę trzy razy.</li>
	<li>Policz całkowitą liczbę komórek w 100 μl zawiesiny BALF za pomocą hemocytometru pod 10-krotnym powiększeniem z barwieniem błękitem trypanowym.</li>
	<li>Przygotuj szkiełka do zmodyfikowanego barwienia Giemsa. Porcjować 100 μl BALF do odpowiednich studzienek cytospiny i odwirować przy 500 x g przez 5 min. Suszyć szkiełka przez 10 minut i barwić komórki modyfikowaną barwierą Giemsa zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Użyj pozostałych komórek do późniejszej analizy, takiej jak sortowanie komórek aktywowane florescencją (FACS), mikroskopia konfokalna, ekspresja genów i western blot11-13.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do badania histopatologicznego
<ol>
	<li>W celu analizy histopatologicznej należy zainfekować myszy NTHi zgodnie z opisem w kroku 2.4. Po 24 godzinach od zakażenia należy złożyć zwierzęta w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy. Rozetnij klatkę piersiową anatomicznymi nożyczkami, aby odsłonić płuca i tchawicę, jak wspomniano wcześniej. Następnie włóż cewnik o rozmiarze 20 do tchawicy.</li>
	<li>Napełnij płuca 2% ciepłym roztworem agarozy przygotowanym w 4% formalinie. Gdy płuca są całkowicie napompowane, umieść lód na płucach, aby zestalić roztwór agarozy.</li>
	<li>Następnie ostrożnie wyjmij zatyczkę piersiową i umieść ją w 50 ml roztworu 4% formaliny w 1x PBS, aż zostanie przetworzona na sekcje hematoksyliny i eozyny (H&E).</li>
</ol>
5. Komórki barwiące FACS w BALF
<ol>
	<li>Umieść 1 x 105 komórek z płynu BALF w 96-dołkowej płytce z mikromiareczkowaniem w kształcie litery V.</li>
	<li>Umyj komórki 300 μl zimnego 1x PBS i wiruj w temperaturze 4.000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wybarwić komórki roztworem do barwienia komórek w 100 μl 1x PBS (rozcieńczenie 1:1,000) i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Umyć komórki 300 μl zimnej wody 1x PBS o stężeniu 4.000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przechowywać komórki w 100 μl buforu płuczącego FACS [Bufor do przemywania (1x PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% azydku sodu] zawierającego 1:100 rozcieńczony blok Fc przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 4 000 x g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zabarwić komórki za pomocą 100 μl koktajlu barwiącego powierzchnię (rozcieńczenie 1:100) w buforze płuczącym FACS przez 30 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie 300 μl buforu płuczącego FACS o stężeniu 4 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Utrwal komórki w 100 μl 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 300 μl 1x PBS przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 300 μl buforu płuczącego FACS.</li>
	<li>Wykonaj jednokolorowe kontrole barwienia za pomocą kulek cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Dodaj jedną kroplę kulek do 96-dołkowej płytki mikrolitrowej z dnem w kształcie litery V i przemyj 200 μl 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 1 μl przeciwciała barwiącego do 100 μl 1x PBS i kulek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Umyj koraliki dwukrotnie za pomocą 300 μl 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj pojedynczo barwione kontrole i komórki za pomocą cytometrii przepływowej14.</li>
</ol>
6. Homogenizacja tkanki płucnej w celu wyizolowania RNA
<ol>
	<li>Po zakażeniu należy pobrać mały fragment płuca (20-40 mg) i przechowywać go przez noc w odczynniku stabilizującym RNA w temperaturze 4 °C. Następnie przechowuj go w temperaturze -80 °C do następnego kroku.</li>
	<li>Umyj tkanki płuc w zimnym 1x PBS, aby pozbyć się odczynnika stabilizującego RNA.</li>
	<li>Umieścić tkankę w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej bufor do lizy (1 ml buforu do lizy + 10 μl β-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Pokrój tkankę na małe kawałki za pomocą spiczastych nożyczek i homogenizuj za pomocą tłuczka do granulek z silnikiem akumulatorowym przez 20-40 sekund.</li>
	<li>Trzymaj lizat na lodzie przez 5 minut i przejdź do kroku 7.1.</li>
</ol>
7. Izolacja RNA z płuc
<ol>
	<li>Odwirować lizat przy stężeniu 18 000 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą pipetowania i ostrożnie przenieść go do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 1 objętość 70% etanolu do lizatu. Natychmiast wymieszać pipetując i odczekać 2-4 minuty.</li>
	<li>Przenieść do 700 μl lizatu do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Odwirować przy 9 600 x g przez 15 sekund i odrzucić przepływ.</li>
	<li>Dodać 350 μl rygorystycznego buforu do przemywania i odwirować przy 9 600 x g przez 15 sekund. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Dodać 80 μl DNazy I bezpośrednio do membrany kolumny wirującej i utrzymywać w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 350 μl rygorystycznego buforu do płukania do kolumny wirowej i odwirować przy 9 600 x g przez 15 sekund. Odrzucić przepływ.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego RNA i odwirować przy 9 600 x g przez 15 sekund. Odrzucić przepływ.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego RNA i wirować w temperaturze 9 600 x g przez 2 min. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i odwirować przy 9 600 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Dodać 30-50 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do kolumny wirowej i wirować przy 9 600 x g przez 1 min. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wykonaj analizę RNAseq14.</li>
</ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+asthma+and+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).</li>
<li>Sethi, S., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+the+pathogenesis+and+course+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease.</a> N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).</li>
<li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+Immune+Response+to+Nontypeable+Haemophilus+influenzae+%28Lung+Immunity+to+NTHi%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi).</a> J Immunol Res. 2015, 706376(2015).</li>
<li>Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+airway+microbiology+and+cellularity+in+children+with+newly+diagnosed+non-CF+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis.</a> Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).</li>
<li>King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+PT+%22Respir+Med%22">Respir Med</a>. 101, 1633-1638 (2007).</li>
<li>Shuto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NF-kappa+B+by+nontypeable+Hemophilus+influenzae+is+mediated+by+toll-like+receptor+2-TAK1-dependent+NIK-IKK+alpha+%2Fbeta-I+kappa+B+alpha+and+MKK3%2F6-p38+MAP+kinase+signaling+pathways+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).</li>
<li>Moghaddam, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+lysate+induces+aspects+of+the+chronic+obstructive+pulmonary+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+exposure+to+bacterial+superantigens+induces+airway+inflammation+in+HLA+class+II+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice.</a> Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).</li>
<li>Ganesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase%2FLPS-exposed+mice+exhibit+impaired+innate+immune+responses+to+bacterial+challenge%3A+role+of+scavenger+receptor+A%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A.</a> Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).</li>
<li>Hogner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-expressed+IFN-beta+contributes+to+apoptotic+alveolar+epithelial+cell+injury+in+severe+influenza+virus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia.</a> PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).</li>
<li>Karisola, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+Natural+Killer+T+Cells+Play+a+Role+in+Chemotaxis%2C+Complement+Activation+and+Mucus+Production+in+a+Mouse+Model+of+Airway+Hyperreactivity+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation.</a> PloS one. 10, e0129446(2015).</li>
<li>Theivanthiran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+Itch+inhibits+p38alpha+signaling+and+skin+inflammation+through+the+ubiquitylation+of+Tab1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1.</a> Sci Signal. 8, 22(2015).</li>
<li>Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+role+of+the+ubiquitin+ligase+Itch+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation.</a> Immunol Cell Biol. , (2015).</li>
<li>Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic obstructive pulmonary disease.</a> Lancet. 379, 1341-1351 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy unikalną i minimalnie inwazyjną procedurę inokulacji płuc płuc bakteryjnym patogenem płuc. Pokazujemy, że ta procedura może być wykorzystana do badania funkcji różnych genów przy użyciu myszy, które mają niedobór genów zapalnych szlaków sygnałowych. Procedura ta może być również stosowana do badania reakcji zapalnych na wirusowe i grzybicze infekcje płuc. Zalety tej procedury w porównaniu z innymi metodami, takimi jak inhalacja donosowa lub aerozolowa, to: (1) w tej procedurze patogenne inokulum j...

Stan zapalny jest podstawowym mechanizmem immunologicznym obrony przed czynnikami zakaźnymi. Wspomaga eliminację patogenów i naprawę uszkodzonej tkanki. Ułatwia również powrót do normalnego, zdrowego stanu1. Jednak rozregulowany stan zapalny często prowadzi do przewlekłych chorób zapalnych2. Zapalenie dróg oddechowych jest początkowym czynnikiem wyzwalającym różne choroby płuc, takie jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), astma i zwłóknienie płuc3.
Nietypowany (nieobudowany) Haemophilus influenzae (NTHi) jest związany z przewlekłymi chorobami zapalnymi górnych i dolnych płuc4,5. Jest to gatunek dominujący izolowany z dolnych dróg oddechowych u dzieci i dorosłych z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc4,6,7. Odpowiedź zapalna po zakażeniu NTHi charakteryzuje się zwiększeniem liczby cytokin prozapalnych (takich jak TNF i IL-1β) i jest wywoływana przez kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK) i czynnik jądrowy κB (NF-κB) poprzez receptory toll-podobne (TLR)8.
Modele mysie są bardzo użytecznymi narzędziami do analizy podstawowej patologii choroby zapalnej płuc ze względu na dostępność różnych linii z niedoborem genów. Do inokulacji żywych/atenuowanych bakterii i produktów bakteryjnych zastosowano kilka metod, w tym wkraplanie donosowe i inhalację w aerozolu9,10. Tutaj pokazujemy wkraplanie dotchawicze. Chociaż jest ono stosowane rzadziej, jest bardziej skuteczne i wysoce powtarzalne ze względu na bezpośrednie dostarczanie inokulum do dolnych dróg oddechowych.

<table><tbody><tr><td>Czekoladowy talerz agarowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza bezwodna</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira, Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Szybkie rozwiązanie</td><td>Deft Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa 20/26G&nbsp;</td><td>BD(</td><td>REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Iml</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr> 381433 <tr><td>Nożyczki preparacyjne, proste, długość 10 cm</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do irysów, ząbkowane, o długości 10 cm</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta #5 Stal nierdzewna, długość 11 cm</td><td>Kentscientific</td><td></td><td></td>INS600095</tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5ml polistyrenowe probówki okrągłodenne</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&nbsp; zestaw&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Silnik do granulek pestile (homoginizator tkankowy)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania V dół</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp</td><td>eBeads eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Rozcieńczenie robocze 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy zestaw do naprawy aqua dead cell</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/ CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Facs polistyren okrągłodenny rurka</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

dotchawicze podawanie haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Tutaj opisujemy szczegółową procedurę skutecznego i bezpośredniego dostarczania Haemophilus influenzae do dolnych dróg oddechowych myszy. Przedstawiono procedurę przygotowania inokulum H. influenzae, dotchawniczego wkraplania H. influenzae do płuc, pobierania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), analizy komórek odpornościowych w BALF oraz izolacji RNA do analizy różnicowej ekspresji genów. Ta procedura może być stosowana do badania odpowiedzi zapalnej płuc na wszelkie bakterie, wirusy lub grzyby. Bezpośrednie wkraplanie tchawicy jest najczęściej preferowane w stosunku do procedur inhalacji donosowej lub aerozolowej, ponieważ skuteczniej dostarcza inokulum bakteryjne do dolnych dróg oddechowych z mniejszą niejednoznacznością.

Instylacja wewnątrzkrtaniowa doprowadziła do znacznego zwiększenia liczby leukocytów w płyku z przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BALF) (Rycina 1A, lewy panel) niż w przypadku instalacji z solą fizjologiczną. Analiza różnicowego obliczenia leukocytów wyraźnie wykazała zwiększoną infiltrację neutrofili (Rysunek 1, prawy panel). Analiza FACS komórek w płycie BALF dodatkowo potwierdziła zwiększoną liczbę neutrofili (Rycina 1B). Ana...

Demonstrujemy procedurę dotchawniczego inokulacji Haemophilus influenzae do dolnych dróg oddechowych myszy. Jest to bardzo przydatne narzędzie do badania szlaków sygnałowych regulujących stan zapalny dróg oddechowych w modelach mysich.

Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie odpowiedzi odpornościowych w płucach podczas infekcji bakteryjnej. Kwestia ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na niektóre kluczowe pytania w dziedzinie stanu zapalnego płuc, takie jak to, jakie są główne mechanizmy regulacyjne i geny hamujące lub promujące zapalenie płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona bardzo wydajna i wysoce powtarzalna dzięki bezpośredniemu podaniu inokulum bakteryjnego do dolnych dróg oddechowych.Na początek należy wysiać NTHi na płytkę z agarem czekoladowym. Płytkę inkubować w pozycji odwróconej przez noc, w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide. Następnego dnia bakterie należy hodować w bulionie brain-heart infusion.Następnie do probówki do mikrowirówki należy dodać jeden mililitr pożywki. Odwiruj mieszaninę przy 4 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odlej nadsącz i resuspenduj osad w jednym mililitrze PBS.Powtórz ten etap płukania jeszcze raz. Następnie rozcieńcz 100 µL zawiesiny w 900 µL PBS i zmierz absorbancję hodowli przy 600 nm. Wykorzystaj te informacje do dostosowania miana inokulum do 20 milionów CFUs na mL.Następnie należy określić żywotność i liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) inokulum. Przesiać od jednej do dziesięciu rozcieńczeń seryjnych bulionu na płytki z agarem czekoladowym i inkubować płytki przez noc. Rozpocząć od znieczulenia myszy i sprawdzenia, czy znieczulenie jest wystarczające, stosując test uszczypnięcia palca.Następnie ułóż mysz na plecach i ogol brzuszny obszar szyi. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę. Teraz unieś skórę górnej, brzusznej części szyi za pomocą pęsety stomatologicznej do szczurów i za pomocą skalpela wykonaj nacięcie o długości od pół centymetra do jednego centymetra powyżej grasicy.Następnie ostrożnie rozsunąć mięśnie, aby odsłonić tchawicę. Do tchawicy powoli wstrzyknąć 50 µL powietrza, następnie 50 µL przygotowanego NTHi, a na koniec kolejne 50 µL powietrza. W procedurze kontrolnej ujemnej zamiast NTHi należy wstrzyknąć sól fizjologiczną.Po wstrzyknięciu należy utrzymać zwierzę w pozycji pionowej przez około minutę. Następnie zamknąć nacięcie za pomocą kleju tkankowego i utrzymać mysz w pozycji bocznej oraz w cieple przez około 10 minut. 24 godziny po zakażeniu należy poddać zainfekowane zwierzę eutanazji i otworzyć jamę brzuszną za pomocą nożyczek anatomicznych.Następnie przetnij aortę brzuszną, aby upuścić krew z organizmu zwierzęcia. Potem odsłoń brzuszną część płuca, aby uzyskać dostęp do tchawicy. Wprowadź do tchawicy kaniulę o rozmiarze 20 G.Za pomocą cewnika wprowadź 0,8 ml buforu do BALF, a następnie pobierz płczynę za pomocą aspiracji stomatologicznej. Powtórz tę procedurę jeszcze trzy razy, łącząc cztery pobrane próbki w jedną zawiesinę. Pobierz aliquot o objętości 100 µl i odwiruj przez dwie minuty przy 2 000 RPM.Usunąć supernatant i zawiesić ponownie w buforze do lizy RBC. Odwiruj i zawieś ponownie osad w 1x PBS. Następnie, za pomocą hemocytometru pod powiększeniem 10x z zastosowaniem barwienia błękitem trypanu, policz całkowitą liczbę komórek w 100 µL zawiesiny.Następnie należy przygotować preparaty do barwienia komórek. Do odpowiednich pól szkiełek do cytocentryfugacji należy nalać po 100 µL zawiesiny BALF, a następnie wirować szkiełka przy 500 g przez pięć minut. Następnie szkiełka należy suszyć przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zabarwić komórki za pomocą zmodyfikowanego barwnika Giemsy zgodnie z protokołami producenta.Pozostałe komórki należy wykorzystać do kolejnych analiz, takich jak FACS, mikroskopia konfokalna i tym podobne. Po pobraniu płynu z przemywania z zakażonego płuca należy wyciąć fragment płuca o masie 20-40 mg i inkubować go w odczynniku stabilizującym RNA w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie przechowywać długoterminowo w temperaturze -80 °C. Przed rozpoczęciem analizy próbki tkanki płucnej należy przemyć zimnym PBS, aby usunąć odczynnik stabilizujący RNA.Następnie umieść tkankę w probówce do wirowania o objętości 1,5 ml zawierającej bufor do lizy z beta-merkaptoetanolem. Następnie za pomocą małych nożyczek posiekaj tkankę na kawałki i homogenizuj je przy użyciu zmechanizowanego tłuczka przez 20-40 sekund. Przechowuj lizat w lodzie przez pięć minut, a następnie odwiruj go przy 18 000 g przez trzy minuty.Ostrożnie usuń supernatant i przenieś go do nowej probówki. Następnie dodaj objętość 70% ethanol i wymieszaj zawiesinę przez triturację. Pozostaw mieszaninę w temperaturze 25 °C przez dwie do czterech minut.Następnie przenieś do 700 µL do kolumny wirującej osadzonej na probówce odbiorczej o pojemności 2 mL i wiruj kolumnę przy 9600 g przez 15 s. Odrzuć filtrat, dodaj 350 µL buforu do płukania i powtórz wirowanie. Następnie inkubuj membranę z 80 µL roztworu DNazy I przez 15 min w temperaturze pokojowej.Następnie dodać 350 µL buforu do płukania do kolumny i powtórzyć wirowanie. Dalej, dodać 500 µL buforu do płukania RNA. Powtórzyć krótkie wirowanie i odrzucić filtrat.Przeprowadzić dwa przemycia buforem do przemywania RNA. Na koniec, umieszczając kolumnę nad nową probówką kolekcją, dodać 30-50 µL wody wolnej od RNaz bezpośrednio do kolumny i wirować przez jedną minutę, aby zebrać próbkę RNA w frakcji przepływu. Procedurę przeprowadzono zgodnie z opisem na zdrowych myszach w stanie normalnym.Instylacja dokanałowa doprowadziła do znacznego wzrostu liczby leukocytów w płynie z przemywania pęcherzyków płucnych (BALF) u myszy inokulowanych NTHi w porównaniu z grupą kontrolną traktowaną solą fizjologiczną. Analiza różnicowa leukocytów wyraźnie wykazuje zwiększoną infiltrację neutrofili. Analiza faktów dotyczących komórek w BALF dodatkowo potwierdza zwiększoną liczbę neutrofili.Przymocowane barwieniem HNE przekroje tkanki płuc wykazują nasilenie stanu zapalnego dróg oddechowych. Wspólnie dane te sugerują, że instylacja dotchawicza indukuje stan zapalny dróg oddechowych u myszy. W analogicznym eksperymencie z udziałem myszy mutantów oraz grupy kontrolnej, RNA z tkanki płucnej przeanalizowano za pomocą sekwencjonowania całego transkryptomu.W porównaniu z kontrolami typu dzikiego, niedobór Itch doprowadził do różnicowej ekspresji kilku genów. Uważa się, że Itch jest regulatorem zapalnych szlaków sygnalizacyjnych, zatem wynik ten może posłużyć jako podstawa do nowych badań. W miarę swojego rozwoju technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny chorób płuc do zgłębiania sygnalizacji komórkowej w komórkach odpornościowych podczas infekcji i stanu zapalnego płuc.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie szczególnych środków ostrożności podczas takich etapów jak odsłonięcie tchawicy i wprowadzanie bakterii do tchawicy. Po opanowaniu techniki, instalacja wewnądtchawiczna może zostać przeprowadzona w ciągu dziesięciu minut, a płyn z probówki może zostać zebrany w ciągu 10-15 minut. Po zakończeniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe analizy, takie jak sekwencjonowanie RNA, cytometria przepłyewowa i immunoblokowanie, aby odpowiedzieć na kolejne pytania, np. które geny ulegają nadekspresji lub supresji.

intra-tracheal-administration-haemophilus-influenzae-mouse-models-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Venuprasad, K., et al. Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania stanu zapalnego dróg oddechowych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje dotchawicze podawanie patogennego dla płuc inokulum bakteryjnego do znieczulonej myszy w celu modelowania infekcji dolnych dróg oddechowych.

Przeprowadzanie dotchawiczego podawania bakterii w modelu mysim

Źródło: Venuprasad, K., et al. Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania stanu zapalnego dróg oddechowych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje pobieranie i przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego od myszy poddanej eutanazji zakażonej nietypowalnym Haemophilus influenzae do dalszej analizy.

Pobranie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego od modelu myszy zakażonego nietypizowalnym Haemophilus influenzae

Źródło: Lenhard, A. i in. Model myszy przedstawiający przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogena po współinfekcji wirusowej powtarza chorobę zaostrzoną przez wiek. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje model współinfekcji myszy, w którym wirus grypy wywołuje przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogenu. Opisuje etapy związane z kolonizacją bakteryjną, infekcją wirusową i postępem choroby.

Model myszy do badania patogennej przejścia paciorkowca pneumoniae po współinfekcji wirusowej

Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.

Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu

Użycie modelu, który naśladuje stan chorób płuc u ludzi, jest kluczowe dla badania patofizjologii i/lub etiologii danej choroby oraz dla opracowania interwencji terapeutycznej. W artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej, która może bezpośrednio dostarczać materiały egzogenne do płuc myszy.

Nieinwazyjna intubacja dotchawicza w celu zbadania patologii i fizjologii płuc myszy

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.

Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące podawania IAV w ciągu nosa oraz dalszej analizy uszkodzeń płuc myszy i związanych z tym zmian transkrypcyjnych typów komórek płucnych.

Modelowanie dysplastycznej i funkcjonalnej naprawy płuc pęcherzyków płucnych po zakażeniu grypą

Poznaj metodę dotchawicznego podawania Haemophilus influenzae w modelach mysich do badania zapalenia dróg oddechowych. Technika ta pozwala analizować mechanizmy odpowiedzi immunologicznej w płucach.

Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych

Przeglądaj więcej filmów