Name: Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Poznaj mikroskopię arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Ta metoda umożliwia obserwację morfogenetycznych zdarzeń w żywych zarodkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy podziękować Tobiasowi Pietzschowi za udostępnienie jego potężnego oprogramowania open source BigDataViewer. Dziękujemy Zakładowi Mikroskopii Świetlnej Instytutu Biologii Molekularnej Komórki i Genetyki im. Maxa Plancka (MPI-CBG), a mianowicie Janowi Peychlowi, Sebastianowi Bundschuhowi i Davide Accardi za pomoc techniczną, doskonałą konserwację mikroskopów użytych w badaniu oraz za uwagi do manuskryptu oraz H. Moonowi (MPI-CBG Scientific Computing Facility) za BigDataServer. Dziękujemy Julii Eichhorn za zmontowanie filmu 1. Członkowie laboratorium Nordena i Svea Grieb dostarczyli wielu pomocnych komentarzy na temat manuskryptu. Jaroslav Icha, Christopher Schmied i Jaydeep Sidhaye są członkami Międzynarodowej Szkoły Badawczej Biologii Komórki, Rozwoju i Systemów im. Maxa Plancka oraz doktorantami Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie. Pavel Tomancak otrzymał wsparcie w ramach ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development oraz grantu dla młodych badaczy Human Frontier Science Program RGY0093/2012. Caren Norden jest wspierana przez Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) oraz Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) [SFB 655, A25].

<ol><li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high-content%2Fhigh-throughput+imaging+and+analysis+of+embryonic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis.</a> Genesis. 49 (7), 555-569 (2011).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Morphogenesis%3A+Technological+Advances+and+Biological+Insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168-1234168 (2013).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> J Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophoton. 6 (11-12), 920-928 (2012).</li>
<li>Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nat Meth. 12 (1), 23-26 (2015).</li>
<li>Chen, B. C., Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Ahrens, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Whole-Brain+Activity+and+Development+at+the+Single-Cell+Level+Using+Light-Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy.</a> Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29+for+the+quantitative+imaging+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues.</a> Cell Tissue Res. 360 (1), 129-141 (2015).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeber%2C+M+%22Quantitative+Imaging+in+Cell+Biology%22">Quantitative Imaging in Cell Biology</a>. , Elsevier Inc. 193-215 (2014).</li>
<li>Strobl, F., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+long-term+fluorescence+live+imaging+of+Tribolium+castaneum+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos.</a> Development. 141 (11), 2361-2361 (2014).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+live+imaging+of+plant+growth+in+near+physiological+bright+conditions+using+light+sheet+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy.</a> Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).</li>
<li>Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2010).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Wu, Y., Ghitani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li>
<li>Sarov, M., Barz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> bioRxiv. , 028308(2015).</li>
<li>Amat, F., Lemon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat Meth. 11 (9), 951-958 (2014).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Meth. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicing+of+single+plane+illumination+microscopy+images+using+groupwise+registration+and+fast+content-based+image+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22SPIEMed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion.</a> SPIEMed Imaging. 6914, 69140E(2008).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Meth. 12 (1), 30-34 (2015).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Scanned+Laser+Light-Sheet+Fluorescence+Microscopy+%28DSLM%29+of+Zebrafish+and+Drosophila+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (10), (2011).</li>
<li>Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair-cell+development+and+regeneration+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish.</a> Front Neuroanat. , (2013).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish embryogenesis.</a> METHODS. , 1-11 (2013).</li>
<li>Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+an+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nat Meth. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSpinMicroscopy%3A+an+open-source+integrated+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform.</a> Nat Meth. 10 (7), 599-600 (2013).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ojoplano-mediated+basal+constriction+is+essential+for+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis.</a> Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).</li>
<li>Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+Nuclear+Migration+Is+Centrosome+Independent+and+Ensures+Apical+Cell+Division+to+Maintain+Tissue+Integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity.</a> Dev Cell. 32 (2), 203-219 (2015).</li>
<li>Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+SPIM+to+track+the+development+of+the+focal+power+of+the+zebrafish+lens%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+BiOS%22%5BJournal%5D)">Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens.</a> SPIE BiOS. 9334, 933408(2015).</li>
<li>Preibisch, S., Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Bayesian-based+multiview+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Efficient Bayesian-based multiview deconvolution.</a> Nat Meth. 11 (6), 645-648 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigDataViewer%3A+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nat Meth. 12 (6), 481-483 (2015).</li>
<li>Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. , BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).</li>
<li>Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+volume+reconstruction+from+series+of+ultra-thin+microscopy+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections.</a> Nat Meth. 9 (7), 717-720 (2012).</li>
<li>Fischler, M. A., Bolles, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+sample+consensus%3A+a+paradigm+for+model+fitting+with+applications+to+image+analysis+and+automated+cartography%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+ACM%22%5BJournal%5D)">Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography.</a> Commun ACM. 24 (6), 381-395 (1981).</li>
<li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1 (1), 2(2006).</li>
<li>Stepanova, T., Slemmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> J Neurosci. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+Mounting+for+Long-term+Light+Sheet+Microscopy+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).</li>
<li>Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+quantitative+analysis+of+gastrulation+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy+and+3D+tracking+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools.</a> Nat Protoc. 9 (3), 575-585 (2014).</li>
<li>Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+solutions+for+SPIMage+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open-source solutions for SPIMage processing.</a> Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).</li>
<li>Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://arxiv.org/abs/1507.08575">http://arxiv.org/abs/1507.08575</a> (2015).</li>
<li>Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+processing+and+analysis+of+large-scale+light-sheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1679-1696 (2015).</li>
<li>Schmid, B., Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4, 1-10 (2013).</li>
<li>Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIM-fluid%3A+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomed Opt Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li>
<li>McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-top+selective+plane+illumination+microscope+for+conventionally+mounted+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens.</a> Opt Express. 23 (12), 16142-16153 (2015).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Features+of+the+Growth+of+a+Bacterial+Species+Colonizing+the+Zebrafish+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut.</a> mBio. 5 (6), e01751-14-8(2014).</li>
</ol>

Opłaty za publikację w otwartym dostępie zostały zapewnione przez Carl Zeiss Microscopy GmbH.

Morfogeneza to proces, który kształtuje zarodek i wraz ze wzrostem i różnicowaniem napędza ontogenezę z zapłodnionej komórki jajowej do dojrzałego organizmu wielokomórkowego. Procesy morfogenetyczne zachodzące podczas rozwoju zwierząt można najlepiej przeanalizować poprzez obrazowanie nienaruszonych żywych osobników1-3. Dzieje się tak dlatego, że takie obrazowanie całego zarodka zachowuje wszystkie składniki, które napędzają i regulują rozwój, w tym gradienty cząsteczek sygnałowych, macierz zewnątrzkomórkową, unaczynienie, unerwienie, a także właściwości mechaniczne otaczającej tkanki. Aby połączyć skale, w których zachodzi morfogeneza, szybkie zdarzenia subkomórkowe muszą zostać uchwycone w minutowej skali czasowej w kontekście rozwoju całej tkanki w ciągu godzin lub dni. Aby spełnić wszystkie te wymagania, opracowano nowoczesną implementację4 mikroskopu oświetlenia w płaszczyźnie ortogonalnej5. Pierwotnie nosiła nazwę Selektywnej Mikroskopii Oświetlenia Płaskiego (SPIM)4; obecnie zwykle stosuje się wszechstronny termin mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego (LSFM). LSFM umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości czasowej, przy jednoczesnym wywoływaniu mniejszej fototoksyczności niż skanowanie laserowe lub mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem6,7. Obecnie istnieje już wiele implementacji podstawowej zasady oświetlenia arkusza świetlnego i jest ona wykorzystywana do obrazowania wielu różnych próbek i procesów, które wcześniej były niedostępne dla badaczy8-11.
Chcielibyśmy najpierw podkreślić kilka kluczowych zalet LSFM w porównaniu z konwencjonalnymi metodami mikroskopii konfokalnej:
Aby uzyskać znaczące wyniki z eksperymentów mikroskopowych na żywo, ważne jest, aby obserwacja tylko minimalnie wpływała na próbkę. Jednak wiele organizmów, w tym danio pręgowany, jest bardzo podatnych na ekspozycję na światło laserowe, co utrudnia zobrazowanie ich w mikroskopie konfokalnym z wysoką rozdzielczością czasową bez skutków fototoksyczności, takich jak zatrzymany lub opóźniony rozwój6,7. LSFM jest obecnie techniką obrazowania fluorescencyjnego o najmniejszym wpływie zakłócającym na próbkę7. Ponieważ cienki arkusz światła laserowego oświetla tylko tę część próbki, która jest obrazowana w określonym punkcie czasowym, mikroskop arkusza świetlnego bardzo efektywnie wykorzystuje fotony. W związku z tym ekspozycja przy słabym oświetleniu pozwala na dłuższe obserwacje poklatkowe zdrowszych okazów, np. 12-17. Co więcej, dzięki minimalnej inwazyjności LSFM, liczba pozyskanych obrazów nie jest już podyktowana ilością światła, które próbka może tolerować, ale raczej tym, ile danych można przetworzyć i przechowywać.
Podobnie jak w przypadku utrzymywania próbki w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, LSFM oferuje alternatywne strategie montażu próbek, które dobrze nadają się do żywych zarodków. W technikach LSFM zarodki są zwykle osadzone w cienkiej kolumnie agarozy o niskiej zawartości procentowej. Montaż w cylindrach z agarozy pozwala na pełną swobodę obrotu, dzięki czemu próbka może być obserwowana pod idealnym kątem (w LSFM określanym jako widok) i z kilku widoków jednocześnie. Obrazowanie wielowidokowe i późniejsza fuzja multiview jest korzystne szczególnie w przypadku dużych, rozpraszających się próbek i umożliwia ich uchwycenie z wysoką, izotropową rozdzielczością. Podsumowanie innych możliwych strategii montażu LSFM można znaleźć w oficjalnej instrukcji obsługi mikroskopu, w rozdziale dotyczącym przygotowania próbki napisanym przez laboratorium E. Reynaud. Jest to lektura zalecana, zwłaszcza jeśli celem jest zobrazowanie innych próbek niż opisane tutaj.
Akwizycja obrazu w LSFM odbywa się za pomocą kamery, w przeciwieństwie do laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Skutkuje to wyższym stosunkiem sygnału do szumu (SNR) dla pozyskanych obrazów i może być niezwykle szybkie (dziesiątki do setek klatek na sekundę). Wysoka czułość LSFM umożliwia ponadto obrazowanie słabo fluorescencyjnych próbek, takich jak czynniki transkrypcyjne wyrażane na poziomie endogennym18 lub, w niedalekiej przyszłości, endogenne białka znakowane za pomocą CRISPR/Cas9. Wysoki stosunek sygnału do szumu (SNR) jest również ważny dla udanej analizy obrazu na dalszym etapie. Duża prędkość jest wymagana nie tylko do uchwycenia szybkich procesów wewnątrzkomórkowych, ale także do wystarczająco szybkiego zobrazowania całego zarodka z wielu widoków. Płynne połączenie wielu widoków można osiągnąć tylko wtedy, gdy obserwowane zjawisko nie zmienia się podczas pozyskiwania tych kilku stosów z pochodzących z oddzielnych widoków.
Zalety LSFM zazwyczaj nie kosztują jakości obrazu. Rozdzielczość boczna LSFM jest nieco gorsza niż rozdzielczość mikroskopu konfokalnego. Dzieje się tak, ponieważ obiektywy detekcyjne stosowane w LSFM mają niższą aperturę numeryczną (zwykle 1,0 lub mniej) w porównaniu do 1,2-1,3 obiektywów zanurzeniowych w wodzie lub krzemie w standardowych konfokalnych konfokalnych. Dodatkowo, ze względu na szerokie pole detekcji w LSFM (brak otworka), jest więcej nieostrego światła w porównaniu z mikroskopem konfokalnym. Ilość nieostrego światła zależy od grubości blachy świetlnej. Niemniej jednak te wady są kompensowane przez wyższy stosunek sygnału do szumu (SNR) w LSFM. W praktyce skutkuje to obrazami o podobnej jakości w porównaniu na przykład z konfokalną akwizycją z wirującym dyskiem15. W związku z tym umożliwia to niezawodną ekstrakcję cech, takich jak błony komórkowe lub jądra komórkowe, np. w celu śledzenia linii komórkowych15,19.
Rozdzielczość osiowa LSFM jest określana, oprócz celu wykrywania, przez grubość lekkiego arkusza. Rozdzielczość osiowa LSFM może w niektórych przypadkach przewyższać rozdzielczość mikroskopów konfokalnych. Po pierwsze, poprawa rozdzielczości następuje, gdy arkusz światła jest cieńszy niż rozdzielczość osiowa obiektywu detekcji, co zwykle ma miejsce w przypadku dużych próbek obrazowanych za pomocą obiektywu o małym powiększeniu. Drugim sposobem, w jaki LSFM może osiągnąć lepszą rozdzielczość osiową, jest fuzja wielu widoków, w której informacje o wysokiej rozdzielczości xy z różnych widoków są łączone w jeden stos obrazów. Wynikowy scalony stos ma rozdzielczość izotropową zbliżoną do wartości rozdzielczości w kierunku bocznym20,21. Opisana w tym artykule strategia rejestrowania wielu widoków na siebie nawzajem opiera się na użyciu fluorescencyjnych kulek polistyrenowych jako znaczników powierniczych osadzonych w agarozie wokół próbki20,21.
W wyniku komercjalizacji LSFM, technika ta jest teraz dostępna dla szerokiej społeczności naukowców22. Dlatego motywacją do napisania tego protokołu jest udostępnienie tej technologii biologom rozwojowym, którzy nie mają praktycznego doświadczenia w LSFM i skłonienie tych naukowców do korzystania z tej technologii w swoich próbkach. W naszym protokole wykorzystano komercyjny mikroskop z arkuszami świetlnymi, który jest koncepcyjnie prostym mikroskopem, który jest łatwy w obsłudze. Chcielibyśmy również wspomnieć o innych najnowszych protokołach obrazowania danio pręgowanego za pomocą domowych konfiguracji LSFM, które mogą być odpowiednie do udzielenia odpowiedzi na konkretne pytania23-25. Inną opcją wejścia do LSFM są otwarte platformy26,27, które wykorzystują zasady otwartego dostępu, aby udostępnić mikroskopię arkuszową światła szerszej społeczności. Dokumentację zarówno sprzętu, jak i oprogramowania można znaleźć na stronach http://openspim.org i https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.
W tym protokole używamy danio pręgowanego teleost jako systemu modelowego do badania procesów rozwojowych za pomocą LSFM. Morfogeneza oka danio pręgowanego jest przykładem, który podkreśla wiele korzyści płynących z LSFM. LSFM był już stosowany w przeszłości do badania rozwoju oka u medaka28 i u danio pręgowanego29,30. Na wczesnym etapie rozwoju oka prawidłowe ustawienie zarodka w konwencjonalnej mikroskopii jest skomplikowane, ponieważ masywne żółtko nie pozwala zarodkowi leżeć na boku z okiem skierowanym w stronę obiektywu. Jednak dzięki zamontowaniu LSFM w kolumnie agarozowej, próbka może być odtwarzalnie pozycjonowana. Dodatkowo, podczas przejścia od stadium pęcherzyka wzrokowego do stadium miseczki wzrokowej, oko ulega poważnym rearanżacjom morfogenetycznym, którym towarzyszy wzrost, co wymaga uchwycenia dużego stosu z i dużego pola widzenia. Również w przypadku tych wyzwań LSFM jest lepszy od konwencjonalnego obrazowania konfokalnego. Proces powstawania kubka optycznego jest trójwymiarowy, dlatego trudno go zrozumieć i zwizualizować wyłącznie poprzez obrazowanie z jednego widoku. To sprawia, że obrazowanie wielowidokowe z rozdzielczością izotropową jest korzystne. Po uformowaniu się miseczki wzrokowej siatkówka staje się coraz bardziej wrażliwa na ekspozycję lasera. W związku z tym niska fototoksyczność związana z LSFM jest główną zaletą w przypadku obrazowania długoterminowego.
Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania zarodków i larw danio pręgowanego w wieku od jednego do trzech dni, z naciskiem na rozwój oka. Nasza metoda pozwala na nagrywanie filmów poklatkowych obejmujących do 12-14 godzin z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Co ważne, pokazujemy również potok przetwarzania danych, który jest niezbędnym krokiem w LSFM, ponieważ technika ta niezmiennie generuje duże zbiory danych, często w zakresie terabajtów.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop Lightsheet Z.1</td> Mikroskopia <td></td><td></td><td>Carl Zeiss</td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Sigma</td><td>A4018 lub A9414</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu (MESAB/MS-222/Trikaina)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne czerwone 500 nm F-Y 050</td><td>Milipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l (1&nbsp; mm średnica wewnętrzna, oznaczona na czarno) kapillary</td><td>Marka</td><td>701904</td><td>sprzedawane jako część zamienna do transferpettor</td></tr><tr><td>Tłoki teflonowe do 20&nbsp; &mu; l kapilary</td><td>Marka</td><td>701932</td><td>sprzedawane jako część zamienna do transferpettor</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe średnica 18 mm, wybrana grubość 0,17&nbsp; mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oringi do okien komorowych 17 razy; </td> Pęseta mikroskopowa <td></td><td></td><td>Carl Zeiss</td> 1,5 mm</tr><tr><td>, styl 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Strzykawki Luer-Lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm przedłużacz do infuzji kompatybilny ze strzykawkami Luer-Lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>Links</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Aplikacja</td><td></td><td></td> do rekonstrukcji Multiview<td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration</a> <a href="http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction">http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</a></td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer"> https://github.com/bigdataviewer</a></td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataViewer">http://fiji.sc/BigDataViewer</a></td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues</a></td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues">https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues</a></td></tr><tr>Link <td>6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataServer">http://fiji.sc/BigDataServer</a></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem (LSFM) zyskuje coraz większą popularność jako metoda obrazowania rozwoju embrionalnego. Głównymi zaletami LSFM w porównaniu z systemami konfokalnymi są niska fototoksyczność, delikatne strategie montażu, szybka akwizycja z wysokim stosunkiem sygnału do szumu oraz możliwość obrazowania próbek pod różnymi kątami (widokami) przez długi czas. Obrazowanie z wielu widoków uwalnia pełny potencjał LSFM, ale jednocześnie może tworzyć zestawy danych o rozmiarze terabajta. Przetwarzanie takich zbiorów danych jest największym wyzwaniem związanym z korzystaniem z LSFM. W tym protokole przedstawiamy kilka rozwiązań tego problemu. Do niedawna LSFM był wykonywany głównie w laboratoriach, które posiadały doświadczenie w budowie i obsłudze własnych mikroskopów arkuszowych. Jednak w ciągu ostatnich trzech lat pojawiło się kilka komercyjnych implementacji LSFM, które są uniwersalne i łatwe w użyciu dla każdego biologa rozwojowego. Niniejszy artykuł skierowany jest przede wszystkim do tych badaczy, którzy nie są twórcami technologii LSFM, ale chcą wykorzystać LSFM jako narzędzie do odpowiedzi na konkretne pytania z zakresu biologii rozwojowej. 
Tutaj używamy obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego jako przykładu, aby zapoznać czytelnika z technologią LSFM i demonstrujemy zastosowania LSFM w wielu skalach przestrzennych i czasowych. W tym artykule opisano kompletny protokół eksperymentalny, rozpoczynający się od zamontowania zarodków danio pręgowanego do LSFM. Następnie przedstawiamy opcje obrazowania za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Co ważne, wyjaśniamy również potok późniejszej rejestracji i fuzji zestawów danych multiview przy użyciu rozwiązania open source zaimplementowanego jako wtyczka Fidżi. Chociaż protokół ten koncentruje się na obrazowaniu rozwijającego się oka danio pręgowanego i przetwarzaniu danych z określonej konfiguracji obrazowania, większość przedstawionych tutaj spostrzeżeń i sugestii dotyczących rozwiązywania problemów ma ogólne zastosowanie, a protokół można dostosować do różnych eksperymentów mikroskopowych z użyciem arkuszy świetlnych.

LSFM jest idealną metodą obrazowania procesów rozwojowych w różnych skalach. Przedstawiono tutaj kilka zastosowań ukazujących obrazowanie struktur wewnątrzkomórkowych, a także komórek i całych tkanek w krótkim i długim okresie czasu. Przykłady te demonstrują również, że LSFM jest użytecznym narzędziem na różnych etapach rozwoju oka, od formowania się pucharu optycznego po neurogenezę w siatkówce. Film 1 służy jako ilustracja ogólnego podejścia LSFM, pokazując najpierw widok ogólny nienaruszonego zarodka w cylindrze z agarozy w świetle przechodzącym, a następnie szczegółowy widok siatkówki w kanale fluorescencyjnym.
<img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> 
Film 1: LSFM siatkówki danio prążkowanego. Aby zilustrować podejście LSFM, film ten pokazuje najpierw w jasnym polu, że obrazowanie zarodka odbywa się w całości wewnątrz cylindra agarowego przed przejściem do fluorescencji. Następnie wykazano, że szerokie pole widzenia umożliwia obserwację całej siatkówki. Dalej film prezentuje powiększony, niewielki obszar siatkówki, aby podkreślić wysoką rozdzielczość subkomórkową. Do obrazowania wykorzystano transgeniczny zarodek danio prążkowanego Ath5:gap-GFP37. Transgen ten znakuje różne neurony w siatkówce (głównie komórki zwojowe i prekursory fotoreceptorów). Część fluorescencyjna filmu została zarejestrowana jako pojedynczy zapis z dwustronnym oświetleniem przy użyciu obiektywu 40X/1.0 W w odstępach 5 min. Przedstawiono maksymalną projekcję intensywności dla objętości o grubości 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Film 2 demonstruje, jak bardzo szybkie zdarzenia wewnątrzkomórkowe mogą zostać zarejestrowane z wysoką rozdzielczością; w tym przypadku jest to wzrost mikrotubul na ich końcach plus w komórkach progenitorowych neuronów siatkówki. Informacje zawarte w filmie umożliwiają śledzenie i kwantyfikację wzrostu końców plus mikrotubul.
<img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> 
Film 2: Dynamika mikrotubul w pojedynczej komórce. Film ten przedstawia rosnące końce plus mikrotubul oznakowane białkiem markerem końców plus EB3-GFP38. Białko jest ekspresowane w pojedynczej komórce progenitorowej siatkówki. Mikrotubule rosną głównie w kierunku od strony apikalnej do bazalnej (z góry na dół). Średnią prędkość komet EB3 określono na 0,28 ±0,05 µm/sec. Jasny punkt po stronie apikalnej komórki, wykazujący wysoką aktywność nukleacji mikrotubul, to centrosom. Zarodek typu dzikiego wstrzyknięto plazmidowym DNA hsp70:EB3-GFP. Film zarejestrowano 4 h po szoku termicznym (15 min w 37 °C), około 28 h po zapłodnieniu (hpf), jako nagranie z jednego widoku z jednostronnym oświetleniem przy użyciu obiektywu 63X/1.0 W i 1-sekundowymi odstępami czasu. Pojedyncza komórka została wycięta z pola widzenia obejmującego większość siatkówki. Przedstawiono maksymalną projekcję intensywności dwóch przekrojów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek 3 pokazuje, w jaki sposób można śledzić struktury wewnątrzkomórkowe przez wiele godzin. Przedstawiono tutaj centrumsom w przemieszczających się komórkach zwojowych siatkówki (RGCs).
<img alt="Rycina 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Lokalizacja centrosomu podczas translokacji komórek zwojowych siatkówki. Ten montaż z eksperymentu time-lapse pokazuje pozycję centrosomu podczas dojrzewania komórek zwojowych siatkówki (RGC). W progenitorach neuronalnych centrosom zlokalizowany jest w samym wierzchołku wypustki apikalnej (1:00). Podczas podziału komórkowego dwa centrosomy pełnią rolę biegunów wrzeciona mitotycznego (2:25). Podział ten prowadzi do powstania jednej komórki potomnej, która różnicuje się w RGC, oraz drugiej komórki potomnej, która staje się prekursorem komórki fotoreceptora. Po podziale ciało komórki RGC przemieszcza się na stronę bazalną siatkówki, podczas gdy wypustka apikalna pozostaje przytwierdzona po stronie apikalnej. Gdy RGC dotrze do strony bazalnej, jej wypustka apikalna odrywa się, a centrosom przemieszcza się wraz z nią (6:15). Można obserwować centrosom podczas stopniowego retrakcji wraz z wypustką apikalną (6:50, 7:20, 8:10). Na ostatniej klatce (8:55) komórka zwojowa rozwija akson ze swojej strony bazalnej, podczas gdy centrosom nadal jest zlokalizowany apikalnie. Ekspresję mozaikową uzyskano poprzez wstrzyknięcie pDNA do zarodka typu dzikiego na etapie jednej komórki. Komórki są wizualizowane za pomocą konstruktu Ath5:GFP-caax (zielony), który znakuje RGC i inne neurony. Centrosomy (groty strzałek) są znakowane Centrin-tdTomato.29 ekspresja (magenta). Strona apikalna siatkówki znajduje się u góry obrazu, a strona bazalna u dołu. Maksymalna projekcja intensywności (MIP) fragmentu 30 &#181;m przedstawiono gruby wolumen. Obrazy zostały wycięte z filmu obejmującego całą siatkówkę. Film rozpoczyna się około 34 godziny po zapłodnieniu (hpf). Serię obrazów z-stack pozyskiwano co 5 min przy użyciu obiektywu 40X/1.0 W. Czas podano w formacie gg:mm. Pasek skali reprezentuje 10 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Na Rysunku 4 przedstawiono, w jaki sposób można wyodrębnić zachowanie pojedynczej komórki z danych obejmujących całą tkankę, tak jak pokazano w Filmie 1. Można z łatwością śledzić translokację RGC oraz monitorować jej wypustki apikalne i bazalne.
<img alt="Rycina 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Translokacja pojedynczej komórki zwojowej siatkówki. Translokacja RGC ze strony apikalnej na stronę bazalną siatkówki następuje po mitozie końcowej, zgodnie z opisem na Rycinie 3. Komórka RGC została oznakowana poprzez ekspresję transgenu Ath5:gap-GFP37. Przedstawiono maksymalną projekcję intensywności dla objętości o grubości 30 µm. Obrazy zostały wycięte z filmu obejmującego całą siatkówkę. Film rozpoczyna się około 34 hpf. Seria obrazów (z-stack) była pozyskiwana co 5 min przy użyciu obiektywu 40X/1.0 W. Czas podano w formacie hh:mm. Pasek skali reprezentuje 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek 5 demonstruje zdolność wielowidokowego LSFM do obrazowania procesów morfogenetycznych w skali tkanki z rozdzielczością komórkową na przykładzie morfogenezy pucharka optycznego, podczas której pęcherzyk optyczny przekształca się w pucharzek optyczny. Jakość obrazu może zostać znacząco poprawiona dzięki obrazowaniu wielowidokowemu, gdy końcowy obraz jest łączony z informacji pochodzących z 5 różnych widoków (w tym przypadku) w jeden stos z (z-stack) o izotropowej rozdzielczości. Rysunek ten ilustruje poprawę jakości obrazu po fuzji średniej ważonej oraz dalszy wzrost kontrastu i rozdzielczości obrazu po dekonwolucji wielowidokowej. Rysunek przedstawia dwa przekroje optyczne w różnych orientacjach przez zestaw danych. Dodatkowo, montaż z dekonwolucyjnego zestawu danych pokazuje morfogenezę pucharka optycznego w czasie. Wszystkie punkty czasowe są następnie przedstawione w Filmie 3.

<img alt="Rycina 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> 
Rycina 5: Porównanie jakości obrazu pomiędzy pojedynczym widokiem a dwiema metodami fuzji wielowidokowej (multiview fusion). (A) Pojedynczy przekrój optyczny danych z pojedynczego widoku przedstawiony z widoku bocznego oraz (B) widoku grzbietowego. Widoczne są artefakty w postaci prążków oraz degradacja sygnału głębiej wewnątrz próbki. Ponadto część obrazu widoczna w danych zfuzowanych (C-F) nie została zarejestrowana w tym konkretnym widoku. (C) Ten sam przekrój optyczny, tym razem jako zfuzowane dane wielowidokowe przedstawione z widoku bocznego oraz (D) widoku grzbietowego. Należy zauważyć, że artefakty w postaci prążków zostały stłumione, a struktury głęboko w próbce są lepiej rozdzielone. (E) Ten sam przekrój optyczny, tym razem jako dane po dekonwolucji wielowidokowej przedstawione z widoku bocznego oraz (F) widoku grzbietowego. Zwrócono uwagę na zwiększony kontrast i rozdzielczość, dzięki czemu poszczególne błony komórkowe i jądra są dobrze rozróżnialne. Rozdzielczość nie pogarsza się znacząco głębiej wewnątrz próbki. Zbiór danych został pozyskany przy dwustronnym oświetleniu z 5 widoków oddalonych od siebie o około 20 stopni. Stosy z (z stacks) o grubości około 100 µm z krokiem 1.5 µm były pozyskiwane dla każdego widoku w odstępach 10 min przez 10 godzin przy użyciu obiektywu 20X/1.0 W. Obrazy wejściowe do fuzji wielowidokowej i dekonwolucji zostały poddane downsamplingowi 2× w celu przyspieszenia przetwarzania obrazów. Wykonano 15 iteracji dekonwolucji wielowidokowej. (G) Montaż przedstawia wycięty obszar widoku grzbietowego z danych po dekonwolucji, aby wyróżnić zdarzenia morfogenetyczne podczas wczesnego rozwoju oka, od stadium pęcherzyka optycznego do stadium kielicha optycznego. Dwie warstwy pęcherzyka optycznego, które początkowo są podobnymi nabłonkami kolumnowymi, różnicują się w odrębne populacje komórek. Warstwa dystalna, bliska nabłonkowi zewnętrznemu, staje się neuroepitelium siatkówki (RN), a warstwa proksymalna, bliska rurce neuralnej, staje się nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RP). Komórki w RN wydłużają się i ulegają inwaginacji, tworząc kielich optyczny (1:40 do 5:00); w tym samym czasie komórki RP spłaszczają się. Ektoderma powierzchniowa zostaje indukowana do utworzenia soczewki (1:40), która później ulega inwaginacji (5:00). Film rozpoczyna się w 17 hpf. Czas podano w formacie gg:mm. Wszystkie błony komórkowe są znakowane transgenem β-actin:ras-GFP, a wszystkie jądra transgenem hsp70:H2B-RFP. Pasek skali reprezentuje 30 µm. FB przodomózgowie, LE soczewka, OP placoda węchowa, RN neuroepitelium siatkówki, RP nabłonek barwnikowy siatkówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> 
Film 3: Morfogeneza pucharka optycznego przedstawiona w pojedynczym widoku oraz za pomocą dwóch metod fuzji wielowidokowej.Film poklatkowy ilustruje pełny proces morfogenezy pucharka optycznego, od stadium pęcherzyka optycznego do stadium pucharka optycznego. Przedstawiono pojedynczy przekrój optyczny w widoku bocznym (góra) oraz pojedynczy przekrój optyczny w widoku grzbietowym (dół). Komórki rozwijającego się pęcherzyka optycznego przechodzą złożone reorganizacje, aby ostatecznie utworzyć półkolisty pucharzek optyczny z wewnętrznym neuroepitelium siatkówki i zewnętrznym nabłonkiem barwnikowym siatkówki. Soczewka powstaje z ektodermy powierzchniowej. Ulega ona inwaginacji wraz z neuroepitelium i osadza się w pucharku optycznym. Wszystkie błony komórkowe są znakowane ekspresją transgenu β-actin:ras-GFP (zielony), a jądra komórkowe są znakowane hsp70:H2B-RFP (magenta). Film rozpoczyna się około 17 hpf. Zbiór danych uzyskano przy dwustronnym oświetleniu z 5 widoków oddalonych od siebie o około 20 stopni; stosy z-stack o grubości około 100 µm były pozyskiwane co 10 min przy użyciu obiektywu 20X/1.0 W. Czas podano w formacie hh:mm. Pasek skali reprezentuje 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest zobrazowanie rozwoju oka zarodka danio pręgowanego w mikroskopie arkuszowym światła i przetworzenie uzyskanego zestawu danych multiview w Figi za pomocą wtyczki do rekonstrukcji multiview. Ta metoda może pomóc w zrozumieniu zdarzeń morfogenetycznych w rozwoju zwierząt. Główną zaletą tej metody jest to, że można obserwować zdarzenia morfogenetyczne w rozwijającym się in takt zarodku z dużą rozdzielczością przestrzenną i czasową.Główną zaletą mikroskopii arkuszowej światła jest niska fototoksyczność metody, szybki czas akwizycji, z jakim można obrazować próbkę oraz możliwość obrazowania próbki pod różnymi kątami, tzw. widokami. Uchwycenie próbki z różnych widoków pozwala nam przezwyciężyć degradację sygnału i zadanej osi. Te różne obrazy mogą być następnie wykorzystywane i rejestrowane za pomocą mikrosfer fluorescencyjnych wokół próbki.Możemy zrekonstruować trójwymiarową objętość osiągającą rozdzielczość izotropową. Chociaż demonstrujemy zastosowanie mikroskopii fluorencyjnej z jasnym arkuszem do rozwoju oka danio pręgowanego, metoda ta może być również wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na różne pytania z zakresu biologii rozwoju i neuronauki przy użyciu różnych organizmów modelowych. Aby rozpocząć, przykręć obiektyw detekcyjny do mikroskopu, jednocześnie zakrywając obiektywy oświetlające.Następnie odkręć obiektywy i ostrożnie wsuń komorę na próbkę do mikroskopu. Zabezpiecz komorę, dokręcając. Następnie podłącz sondę temperatury i blok Peltiera do mikroskopu.Dwie rurki, które cyrkulują ciecz chłodzącą dla bloku Peltiera, są kompatybilne z obydwoma złączami i mogą pracować w dowolnej orientacji. Następnie za pomocą strzykawki załadować komorę przez strzykawkę z roztworem do górnej krawędzi okien komory i sprawdzić, czy nie ma wycieków. Teraz włącz mikroskop, komputer i inkubację.Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu i ustaw temperaturę inkubacji na 28,5 stopnia Celsjusza. Podczas gdy temperatura wymaga zmiany przez godzinę, przygotuj próbkę. Zacznij od przygotowania agarozy.Rozpuść przygotowany mililitr podwielokrotności 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w E trzech podłożach w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Po około 15 minutach przenieś 600 mikrolitrów stopionej agarozy do świeżej 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 250 mikrolitrów E trzy podłoża, 50 mikrolitrów 0,4% MS 222 i 25 mikrolitrów roztworu podstawowego kulek fluorescencyjnych wirowych. Umieść probówkę w bloku grzewczym w temperaturze około 39 stopni Celsjusza, aby agaroza zbliżyła się do punktu żelowania.Następnie wepchnij tłoki z teflonem w dół do dna szklanych kapilar o średnicy wewnętrznej jednego milimetra. Przygotuj pięć z nich. Teraz krótko zmieszaj mieszaninę agarozy, a następnie przenieś do niej pięć zarodków z minimalną ilością płynu.Następnie włóż kapilarnę i najpierw odessaj jedną głowę zarodka. Głowa musi wchodzić przed ogonem i nie może być żadnych pęcherzyków powietrza. Pobrać wystarczającą ilość roztworu, aby nad zarodkiem znajdowało się około dwóch centymetrów agarozy, a pod nim jeden centymetr agarozy.Przed kontynuowaniem narysuj jeden zarodek do każdej naczynia włosowatego. Ten krok wymaga trochę praktyki do opanowania. Przygotuj się do tego, używając niewartościowych zarodków.Gdy agaroza całkowicie zastygnie, należy przechowywać próbki w pożywce E trzy, podpierając naczynia włosowate plasteliną do ścianki zlewki z dolnym otworem w roztworze. Teraz zmontuj uchwyt na próbkę. Najpierw włóż dwie plastikowe tuleje o odpowiednim rozmiarze do siebie do łodygi.Rozcięcia na rękawach muszą być skierowane na zewnątrz. Następnie przymocuj zaciskową. I przełóż kapilarę przez uchwyt, aż pasek stanie się widoczny po drugiej stronie.Unikać dotykania tłoka. Następnie dokręć zaciskową. Następnie wypchnij centymetr agarozy z naczynia włosowatego i odetnij go.Następnie włóż trzpień do dysku uchwytu próbki. Przed załadowaniem dysku z próbką sprawdź, czy stolik znajduje się w najwyższej pozycji w oprogramowaniu sterującym. Następnie użyj szyn prowadzących, aby wsunąć uchwyt i próbkę w dół do mikroskopu.Teraz zobrazuj wybraną próbkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przetwarzanie danych odbywa się w Figi. Jest to dystrybucja klasy ImageJ.Przed rozpoczęciem Figi powinien zostać zaktualizowany. Zapisz pozyskany zestaw danych obrazu w jednym folderze. Pliki pośrednie przetwarzania obrazu zostaną zapisane w tym samym folderze.Teraz uruchom aplikację do rekonstrukcji wielu widoków. Następnie zdefiniuj nowy zestaw danych. Wybierz opcję Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats i utwórz nazwę pliku danych wyjściowych.Następnie wybierz pierwszy plik CZI ze zbioru danych. Metadane zostaną załadowane automatycznie. W metadanych obrazu sprawdź dokładnie, czy liczba kątów, kanałów, iluminacji i rozmiar wokseli są ustawione prawidłowo.Po naciśnięciu przycisku OK otworzy się okno dziennika, okno eksploratora konfiguracji widoku i okno konsoli. Eksplorator konfiguracji widoku zapewnia przyjazny dla użytkownika interfejs. Wybierz pliki, które mają zostać przetworzone i naciśnij prawy przycisk myszy.Otworzy się nowe okno pokazujące różne etapy przetwarzania w trakcie ich wykonywania. W prawym górnym rogu znajdują się przyciski informacji i zapisywania. Info wyświetla podsumowanie zawartości zapisanego pliku danych, a naciśnięcie przycisku zapisz zapisze wyniki przetwarzania.W przeciwnym razie program nie zapisuje wyników etapów przetwarzania. Aby ponownie zapisać cały zestaw danych, najpierw zaznacz wszystkie pliki, naciskając Ctrl+A i klikając prawym przyciskiem myszy. Następnie wybierz pozycję Zapisz ponownie zestaw danych i jako HDF5.Następnie należy odznaczyć potwierdzenie czynności ponownego zapisu. Po kilku minutach dla każdego punktu czasowego program wskaże, kiedy ponowne zapisywanie zostało zakończone. Następnie przystąp do wykrywania punktów zainteresowania w danych.Zaznacz wszystkie punkty czasu, naciskając Ctrl+A i klikając prawym przyciskiem myszy. Aby wybrać, wykryj punkty zainteresowania. Z opcji wybierz różnicę Gaussa.I wybierz, w dół przykładowe obrazy przed segmentacją. W następnym oknie wybierz ustawienia wykrywania. Z opcji lokalizacji subpikseli wybierz opcję 3-wymiarowe dopasowanie kwadratowe.Następnie w specyfikacji punktu zainteresowania wybierz opcję interaktywny. Dla opcji XY próbki w dół wybierz opcję dopasuj rozdzielczość Z. A dla próbki Z wybierz 1x.Następnie wykonaj operację, wybierając opcję obliczeń na procesorze Java. W wyskakującym oknie wybierz jeden widok do testowania parametrów. Po załadowaniu widoku dostosuj jasność i kontrast, naciskając Ctrl+Shift+C na klawiaturze.Ponadto, aby wykrywać koraliki, przełącz opcję wyglądu dla maksymalnej zieleni. Teraz obserwuj segmentację jako zielone pierścienie wokół wykryć. Dostosuj wartości różnicy gaussia dla parametrów sigma one i threshold, aby optymalnie segmentować koraliki przy minimalnej liczbie wyników fałszywie dodatnich.Każdy koralik może być wykryty tylko raz. Po określeniu optymalnych parametrów naciśnij gotowe. Po załadowaniu przez komputer każdego pojedynczego widoku punktu czasu i posegmentowaniu koralików, program wyprowadza plik dziennika z liczbą wykrytych koralików w każdym widoku.Na jeden widok powinno przypadać od 600 do kilku tysięcy koralików. W przeciwnym razie parametry wykrywania wymagają dostosowania. To trudny proces.Piramida wykrywania rzadko jest dokładna za pierwszym razem, a resety mogą się różnić w zależności od punktów czasowych jednego filmu. Rozluźnienie świeżości wykryje wszystkie prawdziwe koraliki i pozwoli na więcej fałszywych alarmów. Jeśli żadna kombinacja piramidy nie działa, należy pozyskać nowy zestaw danych przy użyciu różnych kulek fluorescencyjnych.Teraz przystąp do rejestrowania wykryć i tworzenia dekonwolucji w wielu widokach ze stosu. LSFM jest idealną metodą obrazowania procesów rozwojowych w wielu skalach, od struktur międzykomórkowych po komórki i całe tkanki przez długi czas. Bardzo szybkie zdarzenia międzykomórkowe mogą być rejestrowane w wysokiej rozdzielczości, takie jak wzrost mikrotubul w komórkach progenitorowych neuro.Na podstawie pojedynczego widoku filmu możliwe jest ilościowe określenie wzrostu mikrotubul. Struktury wewnątrzkomórkowe można obserwować przez wiele godzin, takich jak centrosom w komórkach zwojowych siatkówki. Zachowanie pojedynczej komórki można wyodrębnić z obrazów całych tkanek, takich jak lokalizacja trans komórki zwojowej w siatkówce.Dekonwolucja wielu widoków tworzy jeden izotropowy stos Z poprzez połączenie kilku różnych widoków za pomocą funkcji rozproszenia punktowego. Zapewnia to znacznie lepsze obrazy w porównaniu z pojedynczymi widokami lub fuzjami ze średnią ważoną. Na przykład przekształcenie pęcherzyka wzrokowego w miseczkę optyczną można badać z warstw optycznych w różnych orientacjach za pomocą pokazanego zestawu danych.Dodatkowo widoczna jest ogólna dobra jakość obrazu, nawet głęboko w zarodku. Na przykład podczas oglądania morfogenezy miseczki wzrokowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zamontować obraz zarodków danio pręgowanego w mikroskopie z arkuszami świetlnymi.I jak przetwarzać zestawy danych z wieloma widokami w Figi. Po opanowaniu zajmie około dwóch godzin, aby rozpocząć eksperyment poklatkowy na mikroskopie z blachą świetlną. Późniejsza analiza danych zajmie znacznie więcej czasu.Korzystne może być użycie klastra komputerowego do tego zadania. Więcej praktycznych wskazówek, porad dotyczących rozwiązywania problemów i linków do innych zasobów można znaleźć w protokole tekstowym. Przed eksperymentem musi być dostępna wystarczająca pojemność pamięci masowej i przejrzysty plan potoku przetwarzania danych.Jeśli masz jakiekolwiek problemy, pytania lub przyszłe prośby, zapoznaj się z odpowiednią witryną internetową funkcji lub problemami z plikami w odpowiednich repozytoriach github.

using-light-sheet-fluorescence-microscopy-to-image-zebrafish-eye

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten artykuł opisuje przygotowanie próbki do mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkuszy świetlnych. Zademonstrowano również metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego w celu długoterminowego obrazowania, co pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Przygotowanie próbki do mikroskopii świetlnej: montaż żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Poznaj mikroskopię arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Ta metoda umożliwia obserwację morfogenetycznych zdarzeń w żywych zarodkach.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów