Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest zobrazowanie rozwoju oka zarodka danio pręgowanego w mikroskopie arkuszowym światła i przetworzenie uzyskanego zestawu danych multiview w Figi za pomocą wtyczki do rekonstrukcji multiview. Ta metoda może pomóc w zrozumieniu zdarzeń morfogenetycznych w rozwoju zwierząt. Główną zaletą tej metody jest to, że można obserwować zdarzenia morfogenetyczne w rozwijającym się in takt zarodku z dużą rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Główną zaletą mikroskopii arkuszowej światła jest niska fototoksyczność metody, szybki czas akwizycji, z jakim można obrazować próbkę oraz możliwość obrazowania próbki pod różnymi kątami, tzw. widokami. Uchwycenie próbki z różnych widoków pozwala nam przezwyciężyć degradację sygnału i zadanej osi. Te różne obrazy mogą być następnie wykorzystywane i rejestrowane za pomocą mikrosfer fluorescencyjnych wokół próbki.

Możemy zrekonstruować trójwymiarową objętość osiągającą rozdzielczość izotropową. Chociaż demonstrujemy zastosowanie mikroskopii fluorencyjnej z jasnym arkuszem do rozwoju oka danio pręgowanego, metoda ta może być również wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na różne pytania z zakresu biologii rozwoju i neuronauki przy użyciu różnych organizmów modelowych. Aby rozpocząć, przykręć obiektyw detekcyjny do mikroskopu, jednocześnie zakrywając obiektywy oświetlające.

Następnie odkręć obiektywy i ostrożnie wsuń komorę na próbkę do mikroskopu. Zabezpiecz komorę, dokręcając. Następnie podłącz sondę temperatury i blok Peltiera do mikroskopu.

Dwie rurki, które cyrkulują ciecz chłodzącą dla bloku Peltiera, są kompatybilne z obydwoma złączami i mogą pracować w dowolnej orientacji. Następnie za pomocą strzykawki załadować komorę przez strzykawkę z roztworem do górnej krawędzi okien komory i sprawdzić, czy nie ma wycieków. Teraz włącz mikroskop, komputer i inkubację.

Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu i ustaw temperaturę inkubacji na 28,5 stopnia Celsjusza. Podczas gdy temperatura wymaga zmiany przez godzinę, przygotuj próbkę. Zacznij od przygotowania agarozy.

Rozpuść przygotowany mililitr podwielokrotności 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w E trzech podłożach w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Po około 15 minutach przenieś 600 mikrolitrów stopionej agarozy do świeżej 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 250 mikrolitrów E trzy podłoża, 50 mikrolitrów 0,4% MS 222 i 25 mikrolitrów roztworu podstawowego kulek fluorescencyjnych wirowych. Umieść probówkę w bloku grzewczym w temperaturze około 39 stopni Celsjusza, aby agaroza zbliżyła się do punktu żelowania.

Następnie wepchnij tłoki z teflonem w dół do dna szklanych kapilar o średnicy wewnętrznej jednego milimetra. Przygotuj pięć z nich. Teraz krótko zmieszaj mieszaninę agarozy, a następnie przenieś do niej pięć zarodków z minimalną ilością płynu.

Następnie włóż kapilarnę i najpierw odessaj jedną głowę zarodka. Głowa musi wchodzić przed ogonem i nie może być żadnych pęcherzyków powietrza. Pobrać wystarczającą ilość roztworu, aby nad zarodkiem znajdowało się około dwóch centymetrów agarozy, a pod nim jeden centymetr agarozy.

Przed kontynuowaniem narysuj jeden zarodek do każdej naczynia włosowatego. Ten krok wymaga trochę praktyki do opanowania. Przygotuj się do tego, używając niewartościowych zarodków.

Gdy agaroza całkowicie zastygnie, należy przechowywać próbki w pożywce E trzy, podpierając naczynia włosowate plasteliną do ścianki zlewki z dolnym otworem w roztworze. Teraz zmontuj uchwyt na próbkę. Najpierw włóż dwie plastikowe tuleje o odpowiednim rozmiarze do siebie do łodygi.

Rozcięcia na rękawach muszą być skierowane na zewnątrz. Następnie przymocuj zaciskową. I przełóż kapilarę przez uchwyt, aż pasek stanie się widoczny po drugiej stronie.

Unikać dotykania tłoka. Następnie dokręć zaciskową. Następnie wypchnij centymetr agarozy z naczynia włosowatego i odetnij go.

Następnie włóż trzpień do dysku uchwytu próbki. Przed załadowaniem dysku z próbką sprawdź, czy stolik znajduje się w najwyższej pozycji w oprogramowaniu sterującym. Następnie użyj szyn prowadzących, aby wsunąć uchwyt i próbkę w dół do mikroskopu.

Teraz zobrazuj wybraną próbkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przetwarzanie danych odbywa się w Figi. Jest to dystrybucja klasy ImageJ.

Przed rozpoczęciem Figi powinien zostać zaktualizowany. Zapisz pozyskany zestaw danych obrazu w jednym folderze. Pliki pośrednie przetwarzania obrazu zostaną zapisane w tym samym folderze.

Teraz uruchom aplikację do rekonstrukcji wielu widoków. Następnie zdefiniuj nowy zestaw danych. Wybierz opcję Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats i utwórz nazwę pliku danych wyjściowych.

Następnie wybierz pierwszy plik CZI ze zbioru danych. Metadane zostaną załadowane automatycznie. W metadanych obrazu sprawdź dokładnie, czy liczba kątów, kanałów, iluminacji i rozmiar wokseli są ustawione prawidłowo.

Po naciśnięciu przycisku OK otworzy się okno dziennika, okno eksploratora konfiguracji widoku i okno konsoli. Eksplorator konfiguracji widoku zapewnia przyjazny dla użytkownika interfejs. Wybierz pliki, które mają zostać przetworzone i naciśnij prawy przycisk myszy.

Otworzy się nowe okno pokazujące różne etapy przetwarzania w trakcie ich wykonywania. W prawym górnym rogu znajdują się przyciski informacji i zapisywania. Info wyświetla podsumowanie zawartości zapisanego pliku danych, a naciśnięcie przycisku zapisz zapisze wyniki przetwarzania.

W przeciwnym razie program nie zapisuje wyników etapów przetwarzania. Aby ponownie zapisać cały zestaw danych, najpierw zaznacz wszystkie pliki, naciskając Ctrl+A i klikając prawym przyciskiem myszy. Następnie wybierz pozycję Zapisz ponownie zestaw danych i jako HDF5.

Następnie należy odznaczyć potwierdzenie czynności ponownego zapisu. Po kilku minutach dla każdego punktu czasowego program wskaże, kiedy ponowne zapisywanie zostało zakończone. Następnie przystąp do wykrywania punktów zainteresowania w danych.

Zaznacz wszystkie punkty czasu, naciskając Ctrl+A i klikając prawym przyciskiem myszy. Aby wybrać, wykryj punkty zainteresowania. Z opcji wybierz różnicę Gaussa

I wybierz, w dół przykładowe obrazy przed segmentacją. W następnym oknie wybierz ustawienia wykrywania. Z opcji lokalizacji subpikseli wybierz opcję 3-wymiarowe dopasowanie kwadratowe.

Następnie w specyfikacji punktu zainteresowania wybierz opcję interaktywny. Dla opcji XY próbki w dół wybierz opcję dopasuj rozdzielczość Z. A dla próbki Z wybierz 1x.

Następnie wykonaj operację, wybierając opcję obliczeń na procesorze Java. W wyskakującym oknie wybierz jeden widok do testowania parametrów. Po załadowaniu widoku dostosuj jasność i kontrast, naciskając Ctrl+Shift+C na klawiaturze.

Ponadto, aby wykrywać koraliki, przełącz opcję wyglądu dla maksymalnej zieleni. Teraz obserwuj segmentację jako zielone pierścienie wokół wykryć. Dostosuj wartości różnicy gaussia dla parametrów sigma one i threshold, aby optymalnie segmentować koraliki przy minimalnej liczbie wyników fałszywie dodatnich.

Każdy koralik może być wykryty tylko raz. Po określeniu optymalnych parametrów naciśnij gotowe. Po załadowaniu przez komputer każdego pojedynczego widoku punktu czasu i posegmentowaniu koralików, program wyprowadza plik dziennika z liczbą wykrytych koralików w każdym widoku.

Na jeden widok powinno przypadać od 600 do kilku tysięcy koralików. W przeciwnym razie parametry wykrywania wymagają dostosowania. To trudny proces.

Piramida wykrywania rzadko jest dokładna za pierwszym razem, a resety mogą się różnić w zależności od punktów czasowych jednego filmu. Rozluźnienie świeżości wykryje wszystkie prawdziwe koraliki i pozwoli na więcej fałszywych alarmów. Jeśli żadna kombinacja piramidy nie działa, należy pozyskać nowy zestaw danych przy użyciu różnych kulek fluorescencyjnych.

Teraz przystąp do rejestrowania wykryć i tworzenia dekonwolucji w wielu widokach ze stosu. LSFM jest idealną metodą obrazowania procesów rozwojowych w wielu skalach, od struktur międzykomórkowych po komórki i całe tkanki przez długi czas. Bardzo szybkie zdarzenia międzykomórkowe mogą być rejestrowane w wysokiej rozdzielczości, takie jak wzrost mikrotubul w komórkach progenitorowych neuro.

Na podstawie pojedynczego widoku filmu możliwe jest ilościowe określenie wzrostu mikrotubul. Struktury wewnątrzkomórkowe można obserwować przez wiele godzin, takich jak centrosom w komórkach zwojowych siatkówki. Zachowanie pojedynczej komórki można wyodrębnić z obrazów całych tkanek, takich jak lokalizacja trans komórki zwojowej w siatkówce.

Dekonwolucja wielu widoków tworzy jeden izotropowy stos Z poprzez połączenie kilku różnych widoków za pomocą funkcji rozproszenia punktowego. Zapewnia to znacznie lepsze obrazy w porównaniu z pojedynczymi widokami lub fuzjami ze średnią ważoną. Na przykład przekształcenie pęcherzyka wzrokowego w miseczkę optyczną można badać z warstw optycznych w różnych orientacjach za pomocą pokazanego zestawu danych.

Dodatkowo widoczna jest ogólna dobra jakość obrazu, nawet głęboko w zarodku. Na przykład podczas oglądania morfogenezy miseczki wzrokowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zamontować obraz zarodków danio pręgowanego w mikroskopie z arkuszami świetlnymi.

I jak przetwarzać zestawy danych z wieloma widokami w Figi. Po opanowaniu zajmie około dwóch godzin, aby rozpocząć eksperyment poklatkowy na mikroskopie z blachą świetlną. Późniejsza analiza danych zajmie znacznie więcej czasu.

Korzystne może być użycie klastra komputerowego do tego zadania. Więcej praktycznych wskazówek, porad dotyczących rozwiązywania problemów i linków do innych zasobów można znaleźć w protokole tekstowym. Przed eksperymentem musi być dostępna wystarczająca pojemność pamięci masowej i przejrzysty plan potoku przetwarzania danych.

Jeśli masz jakiekolwiek problemy, pytania lub przyszłe prośby, zapoznaj się z odpowiednią witryną internetową funkcji lub problemami z plikami w odpowiednich repozytoriach github.