Name: Cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka Lymnaea stagnalis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj metodę całej hybrydyzacji in situ dla Lymnaea stagnalis, umożliwiającą wizualizację wzorców ekspresji genów w embriogenie i larwach. Technika ta wspiera badania w dziedzinie biologii rozwoju i ewolucyjno-rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez fundusze dla DJJ poprzez projekt DFG #JA2108/2-1.

UWAGA: Poniższe kroki opisują naszą metodę przeprowadzania eksperymentu in situ na stadiach embrionalnych i larwalnych L. stagnalis. W przypadku gdy dany etap wiąże się z użyciem niebezpiecznej substancji chemicznej, jest to oznaczone słowem "UWAGA" i należy przyjąć wszystkie odpowiednie procedury bezpieczeństwa. Linki do reprezentatywnych kart charakterystyki substancji chemicznych stwarzających zagrożenie znajdują się w pliku uzupełniającym 1. Receptury dla wszystkich odczynników znajdują się w pliku uzupełniającym 2.
1. Montaż aparatury do dekapsulacji
<ol>
	<li>W tym celu należy podłączyć jednorazową strzykawkę o pojemności 20 ml do silikonowej rurki (o średnicy wewnętrznej 1 mm i średnicy zewnętrznej 3 mm) za pomocą końcówki P1 000 przyciętej na odpowiednią długość, jak pokazano na rysunku 2A.</li>
	<li>Przyklej standardowy szkiełko mikroskopowe do odwróconej dużej szalki Petriego. Przyklej taśmą silikonową rurkę bezpośrednio przylegającą do szkiełka mikroskopowego, jak pokazano na rysunku 2C i 2D.</li>
	<li>Oprzyj wyciągniętą szklaną igłę na szkiełku mikroskopu i delikatnie włóż ją do silikonowej rurki, aż końcówka igły wystaje około 20% w poprzek wewnętrznej średnicy rurki (patrz Rysunek 2C i 2D). Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu, przyklej ją do szalki Petriego.</li>
	<li>Pozwól, aby wolny koniec rurki silikonowej spoczywał na innej szalce Petriego, która będzie zbierać zdekapsulowany materiał.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek, utrwalanie i dekapsulacja
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w RT, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Ostrożnie zbieraj sznurki jaj ze ścian akwarium. Aby to zrobić, użyj płaskiego kawałka elastycznego plastiku jako szpatułki, aby zeskrobać sznurek do jajek z podłoża i użyj plastikowego sitka do herbaty, aby wyłowić pływający sznurek do jajek z wody. Przygotować i posortować materiał pod mikroskopem, korzystając z przewodnika dostarczonego na rysunku 1.</li>
	<li>Umieść sznurek do jajek na ręczniku papierowym i wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż masy jajowej za pomocą szczypiec do pióra. Rozwałkuj kapsułki jajowe ze sznurka do jajek i usuń jak najwięcej galaretki z każdej kapsułki, popychając je wokół ręcznika papierowego za pomocą szczypiec do piórka.</li>
	<li>Za pomocą szczypiec do piórek przenieś kapsułki jajowe na szalkę Petriego zawierającą 5 ml wody z kranu. Kontynuuj zbieranie do tego naczynia pozbawionych galaretki jaj o pożądanych stadiach rozwojowych. Zbierz wystarczającą ilość kapsułek ze wszystkich etapów rozwoju do planowanego eksperymentu WMISH, a następnie przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Podczas pracy z bardziej rozwiniętymi larwami (5 dni po pierwszym rozszczepieniu (dpfc) i starsze) należy je znieczulić przed utrwaleniem. 
	UWAGA: Zapobiegnie to kurczeniu się mięśni, co bardzo utrudnia interpretację wzorów barwienia in situ.
	<ol>
		<li>Rozluźnić larwy (gdy są jeszcze w kapsułkach) w 2% w/v roztworze MgCl2•6H2O przez 30 minut przed utrwaleniem.</li>
		<li>Ocenić stopień relaksacji po 30 minutach, zanurzając kilka larw jeszcze w kapsułkach jajowych w roztworze utrwalającym i monitorując ich reakcję pod mikroskopem. Nie w pełni zrelaksowane larwy chowają się w swoich skorupach, podczas gdy w pełni zrelaksowane larwy nie reagują. Gdy te larwy zostaną zrelaksowane, przejdź do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść kapsułki jajowe za pomocą plastikowej pipety o szerokim otworze do zamykanej probówki, która zapewnia 10-krotność objętości kapsułek jajowych (np. 1 ml osadzonych kapsułek wymagałoby probówki o pojemności 10+ ml).</li>
	<li>Odessać jak najwięcej płynu z probówki i zastąpić objętością roztworu utrwalającego, która jest 10 razy większa niż objętość osadzonych kapsułek jajowych. Delikatnie obracać kapsułki jajowe w utrwalaczu w temperaturze pokojowej przez odpowiedni czas dla każdego etapu rozwoju (patrz ryc. 1).</li>
	<li>Przerwać obracanie i pozostawić kapsułki do zatonięcia, a następnie zassać roztwór utrwalający do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
	<li>Umyć kapsułki jajowe, zastępując roztwór utrwalający roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 0,1% Tween-20 (PBTw) i obracając w temperaturze RT przez 5 minut. Odessać PBTw i powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Usunąć zarodki i larwy z ich kapsułek za pomocą przyrządu (szczegółowe informacje patrz sekcja 1) pokazanego na rysunku 2. Pobrać kapsułki do strzykawki o pojemności 20 ml, założyć rurkę, a następnie wyprowadzić kapsułki przez rurkę i przez szklaną igłę do naczynia zbiorczego. 
	UWAGA: Zwykle większość (>90%) wszystkich kapsułek powinna wymagać tylko jednego przejścia przez urządzenie. W wielu przypadkach błona torebki jest uszkodzona, ale zarodki i larwy pozostają wewnątrz pękniętej torebki. Ponownie przetworzyć ten materiał, po prostu wciągając go do strzykawki i ponownie usuwając.</li>
	<li>Zebrać zdekapsulowane zarodki i larwy do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety (P20 dla larw w wieku 0-3 dni i P200 dla starszych larw z odciętym końcem końcówki). 
	UWAGA: Na tym etapie można zrobić przerwę (do kilku miesięcy) w protokole. Jeśli jest to wymagane, zdekapsuowany materiał należy zebrać do probówki o pojemności 1,5 ml w celu przechowywania (przejdź do następnego kroku). W przeciwnym razie należy niezwłocznie przejść do Protokołu 3.</li>
	<li>Pozwolić, aby zarodki i larwy opadły na dno probówki i zassać supernatant. Zastąp 33% etanolem (EtOH) w PBTw i odstaw na 5 - 10 minut. Powtórz z 66% EtOH w PBTw i 100% EtOH. Przemyć larwy dwukrotnie w 100% EtOH w temperaturze pokojowej schodu. Przechowywać materiał w temperaturze -20 °C w 100% EtOH.</li>
	<li>Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, ponownie uwodnić próbki, usuwając 100% EtOH i zastępując go 66% EtOH w PBTw, odstaw na 5 - 10 minut. Powtórz z 33% EtOH w PBTw, pozostaw na 5 - 10 minut. Na koniec umyj 3 razy 5-minutowe płukanie PBTw, aby upewnić się, że cały EtOH został usunięty.</li>
</ol>
3. Proteinaza-K, herbata i post-fiksacja
 UWAGA: Uważamy, że wykonywanie następujących kroków w małych koszach z siatkową podłogą jest najbardziej efektywną i delikatną metodą szybkiej wymiany rozwiązań krytycznych czasowo. Chociaż mogą one być wykonane w domu, używamy koszy (średniej wielkości), które są kompatybilne z robotem do obsługi cieczy Intavis InSituPro-Vsi (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Takie kosze można szybko i łatwo przenosić między studzienkami 12-dołkowego naczynia do hodowli tkankowych (TCD) w celu wymiany roztworów lub roztwór można zassać ze studzienki za pomocą pipety. Alternatywnie, wszystkie wymiany roztworów mogą być przeprowadzane bez tych koszyczków, po prostu odsysając supernatant z larw. W takim przypadku delikatny ruch wirowy skoncentruje wszystkie zarodki i larwy na środku naczynia, umożliwiając usunięcie supernatantu z krawędzi studzienki. Poniżej założono, że użytkownik korzysta z koszyków do wymiany rozwiązań.
<ol>
	<li>Za pomocą pipety przenieść zarodki i larwy do kosza umieszczonego w 12-dołkowym TCD z 2 ml PBTw. 
	UWAGA: Liczba zarodków i/lub larw, które można dodać, zależy od badanego etapu rozwoju, jednak ogólną zasadą jest, aby co najmniej 25% powierzchni podłogi było wolne od zarodków/larw (tj. nie należy przepełniać kosza).</li>
	<li>Przygotować sąsiedni studzienka z 2 ml odpowiedniego roztworu proteinazy-K (patrz rysunek 1) i kolejne 2 studzienki z 2 ml 0,2% glicyny każda. Przenieś każdy kosz do studzienki zawierającej odpowiednie stężenie Proteinazy-K i natychmiast rozpocznij odmierzanie czasu.</li>
	<li>Po 10 minutach przenieś każdy kosz do studzienki zawierającej 0,2% glicyny i inkubuj przez 5 minut. Następnie przenieś każdy kosz do drugiego dołka z 0,2% glicyną i inkubuj przez 5 minut. Wypłucz glicynę za pomocą 3 razy 5 minut wymiany 3 ml PBTw.</li>
	<li>Usunąć roztwór PBTw i potraktować próbki świeżo przygotowanym roztworem trietanoloaminy (TEA) przez 5 minut UWAGA! Nie agitować. Zastąp 3 ml świeżo przygotowanego roztworu herbaty na 5 minut. Nie agitować. Odessać większość roztworu herbaty z próbek. Dodać świeżo przygotowaną trietanoloaminę z roztworem bezwodnika octowego (TEAAA) i inkubować przez 5 minut. UWAGA! Nie agitować.</li>
	<li>OPCJONALNIE - Podczas gdy powyższy krok jest inkubacją, przygotuj kolejną świeżą partię roztworu TEAAA i powtórz powyższy krok. 
	UWAGA: To drugie leczenie TEAAA jest opcjonalne, ale może pomóc w całkowitym wyeliminowaniu całego tła z sondami podatnymi na generowanie tła.</li>
	<li>Usunąć roztwór TEAAA, odsysając go ze studzienki i zastąpić 3 ml PBTw. Nie agitować. Usuń PBTw i nałóż 3 ml 3,7% formaldehydu w PBTw. Delikatnie obracaj od czasu do czasu podczas 30-minutowej inkubacji.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz poprzez zassanie go ze studzienki i zastąpić go 3 ml PBTw. Przenieść materiał do probówki o pojemności 1,5 ml. Zastąp PBTw buforem hybrydyzacyjnym i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej - UWAGA.</li>
	<li>Umieść probówki w gorącym bloku w temperaturze pokojowej i ustaw temperaturę na żądaną temperaturę hybrydyzacji. 
	UWAGA: Temperatura hybrydyzacji jest specyficzna dla sondy i będzie musiała zostać empirycznie zoptymalizowana, jednak uważamy, że 55 °C jest dobrą temperaturą do wstępnego przetestowania. Pozwól, aby blok osiągnął temperaturę hybrydyzacji i pozwól próbkom na wstępną hybrydyzację przez około 15 minut (tj. czas potrzebny na przygotowanie rybosond, dłużej nie jest konieczne). Przygotować odpowiednie objętości (zwykle 100 μl) rozcieńczonych rybosond. Zazwyczaj testujemy stężenia sondy 100 i 500 ng/ml jako początkowy zakres. Przygotowujemy rybosondy zgodnie z 12.</li>
	<li>Usunąć bufor hybrydyzacyjny z próbek i dodać sondę w buforze hybrydyzacyjnym do próbek. Nałożyć 100 μl (lub odpowiednią objętość, aby utworzyć fazę powyżej buforu hybrydyzacyjnego) oleju mineralnego. 
	UWAGA: Olej mineralny zapobiega nadmiernej kondensacji, która powstanie podczas długiego etapu hybrydyzacji. Rozległa kondensacja znacząco zmieni zarówno skład chemiczny roztworu hybrydyzacyjnego, jak i stężenie sondy.</li>
	<li>Denaturacja sondy i docelowego RNA poprzez podgrzewanie próbek do temperatury 75 °C przez 10 minut, a następnie zmniejszenie ciepła do pożądanej temperatury hybrydyzacji. Pozwól, aby hybrydyzacja postępowała przez co najmniej 12 godzin (O/N) lub dłużej (24 - 48 godzin).</li>
	<li>Podczas hybrydyzacji wyjmij pojedynczą rurkę z bloku grzewczego, szybko obróć ją między kciukiem a palcem wskazującym, aby zawiesić larwy bez naruszania fazy olejowej, i umieść ją w bloku grzewczym. Powtarzaj to raz na około 6-12 godzin.</li>
</ol>
4. Gorące pranie i immunodetekcja
UWAGA: Chociaż używamy robota do obsługi płynów do następujących kroków, można je również łatwo wykonać ręcznie. W takim przypadku zarodki i larwy powinny być trzymane w probówkach o pojemności 1,5 ml, w których zostały zhybrydyzowane. Wszystkie kolejne wymiany roztworów są zasysane i dodawane za pomocą pipety P1 000. W przypadku wykonywania ręcznego każdy z poniższych kroków powinien zawierać 1 ml każdego roztworu.
<ol>
	<li>Podgrzać odpowiednie objętości (po 3 ml na każdą próbkę) roztworów 4x, 2x i 1x do temperatury hybrydyzacji.</li>
	<li>Przemyć wszystkie próbki trzykrotnie w 4-krotnym buforze do przemywania przez 15 minut każda w temperaturze hybrydyzacji. Przemyć wszystkie próbki trzykrotnie w 2x buforze do przemywania przez 15 minut każda w temperaturze hybrydyzacji. Przemyć wszystkie próbki trzy razy w 1x buforze do przemywania przez 15 minut każda w temperaturze hybrydyzacji.</li>
	<li>Przemyć wszystkie próbki raz 1x buforem chlorku sodu i cytrynianu sodu + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) w temperaturze hybrydyzacji. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umyj wszystkie próbki dwukrotnie w 1x SSC + 0,1% Tween przez 15 minut Zastąp ten 1x roztwór SSC buforem kwasu maleinowego (MAB) i pozostaw na 10 minut Powtórz mycie MAB. Zastąp MAB roztworem blokowym i inkubuj przez 1,5 godziny.</li>
	<li>Zamianę roztworu blokowego na roztwór przeciwciała (rozcieńczenie przeciwciała w roztworze blokowym w stosunku 1:10 000) i inkubować przez 12 godzin (O/N) w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
</ol>
5. Rozwój i montaż kolorów
<ol>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała i przemyć 15 razy PBTw przez 10 minut każdy. Zastąp PBTw 1x alkalicznym buforem fosfatazy (AP) i inkubuj przez 10 minut.</li>
	<li>Podczas gdy powyższy etap inkubacji postępuje, przygotuj roztwór barwiący AP (patrz Plik Uzupełniający 2) - UWAGA. Przenieś materiał do studzienki TCD i zastąp 1x roztwór AP roztworem barwiącym AP. Zanotuj teraz czas, aby można było zarejestrować czas, w którym zachodzi reakcja barwna. Monitoruj rozwój wzoru barwienia, aż stosunek sygnału do tła będzie optymalny.</li>
	<li>Aby zatrzymać rozwój koloru, usuń 1x roztwór barwiący AP (wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na odpady) i nałóż 2 ml PBTw i zanotuj teraz czas. Płukać jeszcze dwa razy PBTw przez 5 minut każdy. Użyj jednego z tych płukanek, aby przenieść materiał do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Usunąć PBTw i nałożyć 1 ml 3,7% formaldehydu w PBTw i mieszać lub obracać przez co najmniej 30 minut w temperaturze suchej (można to również zrobić O/N).</li>
	<li>Wypłukać utrwalacz 3 praniami PBT (odpadowy utrwalacz wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady). Umyć próbki 3 razy w temperaturze 50 °C w wodzie dejonizowanej. 
	UWAGA: Te płukania eliminują wytrącanie się soli, które mogą stać się widoczne podczas etapów oczyszczania i wizualizacji.</li>
	<li>Zdecyduj, czy próbki powinny być zamontowane w benzoesanie benzylu: alkohol benzylowy (BB:BA, znany również jako klarowny Murraya) czy w glicerolu. 
	UWAGA: Preferujemy silniejszy środek usuwający BB:BA, ponieważ zarodki L. stagnalis są nieco nieprzezroczyste. Próbki, które mają być zamontowane w BB:BA, będą musiały najpierw zostać odwodnione za pomocą serii etanolu. Próbki, które mają być zamontowane w 60% glicerolu, można je natychmiast zamontować.</li>
	<li>Przenieść próbki do roztworu montażowego (BB:BA lub 60% glicerolu) za pomocą pipety. 
	UWAGA: W przypadku montażu w BB:BA należy to zrobić w szklanej studzience (BB:BA stopi plastik poliwęglanowy).</li>
	<li>Pozostawić próbki do opróżnienia przez 5 - 10 minut, a następnie zamontować je na szkiełku podstawowym za pomocą odpowiedniej liczby szkiełek nakrywkowych ułożonych w stos jako przekładki (1 szkiełko nakrywkowe dla próbek <1 dpfc, 2 szkiełka nakrywkowe dla próbek >1 dpfc). 
	UWAGA: Całe mocowania mogą być teraz obrazowane za pomocą mikroskopu złożonego z optyką DIC.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Brusca, R. C., Brusca, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrusca%2C+RC+%22Invertebrates%22">Invertebrates</a>. , Sinauer. Sunderland. (2002).</li>
<li>Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en">http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en</a> (2013).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%3A+number+of+people+treated+in+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Week.+Epi.+Rec%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis: number of people treated in 2011.</a> Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).</li>
<li>Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slipper+snail%2C+Crepidula.%3A+an+emerging+lophotrochozoan+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+modification+in+the+mollusc%2C+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata.</a> Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Rep%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses.</a> Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).</li>
<li>Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+gene+expression+with+larval+competence%2C+and+the+effect+of+age+and+parentage+on+metamorphosis+in+the+tropical+abalone+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina.</a> Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).</li>
<li>Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+a+molluscan+RXR+and+evidence+for+its+novel%2C+nongenomic+role+in+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance.</a> Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).</li>
<li>Rittschof, D., McClellan-Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molluscs+as+multidisciplinary+models+in+environment+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology.</a> Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).</li>
<li>Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+set+of+maternal+genes%3F+Insights+from+a+molluscan+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome.</a> Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).</li>
<li>Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+whole+mount+in+situ.+hybridisation+protocol+for+the+mollusc+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis.</a> BMC Dev. Biol. 15 (1), 19(2015).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+stagnalis.+L.+from+oviposition+till+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+Stagnalis.+L.+from+the+first+cleavage+till+the+troghophore+stage%2C+with+special+reference+to+its%27+chemical+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+in+Limnaea+stagnalis.+and+its+disturbance+by+lithium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium.</a> J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+and+origin+of+the+cortical+morphogenetic+field+in+Limnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea.</a> Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).</li>
<li>Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulative+development+in+the+pulmonate+gastropod%2C+Lymnaea+palustris.%2C+as+determined+by+blastomere+deletion+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments.</a> J Exp Zool. 183 (1), (1973).</li>
<li>Van Den Biggelaar, J. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+the+phases+of+the+cell+cycle+during+the+period+of+asynchronous+division+up+to+the+49-cell+stage+in+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Emb.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea.</a> J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).</li>
<li>Verdonk, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+early+development+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis.</a> Dev. Biol. 35 (1), 29(1973).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Detection+of+Rna-Dna+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+functions+of+Dpp+in+gastropod+shell+formation+and+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling.</a> Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).</li>
<li>Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+MAPK+signaling+in+patterning+and+establishing+axial+symmetry+in+the+gastropod+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina.</a> Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).</li>
<li>Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Brachyury+in+the+mollusc+Patella+vulgata+suggests+a+conserved+role+in+the+establishment+of+the+AP+axis+in+Bilateria%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria.</a> Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).</li>
<li>Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160(2007).</li>
<li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15(2013).</li>
<li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li>
<li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43(2011).</li>
<li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited%2C+lateralized+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li>
<li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li>
<li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li>
<li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745(2011).</li>
<li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+%28LCav-beta%29+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941(2014).</li>
<li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+genome+size+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda pozwala na efektywną wizualizację transkryptów RNA o przypuszczalnie różnych poziomach ekspresji we wszystkich stadiach rozwojowych Lymnaea stagnalis. Aby usunąć zarodki i larwy z ich kapsułek, przetestowaliśmy różne metody leczenia chemicznego, wstrząsu osmotycznego i fizykalnego opisane w przypadku innych organizmów modelowych rozwijających się w kapsułkach. Jednak w naszych rękach metoda, którą tutaj opisujemy, jest jedyną techniką o wysokiej przepustowości, która usuwa twardą błonę toreb...

to grupa zwierząt, która cieszy się zainteresowaniem wielu dyscyplin naukowych. Pomimo ich różnorodności morfologicznej1, bogactwa gatunkowego (ustępującego tylko stawonogom pod względem liczbygatunków 2) i znaczenia dla szerokiego zakresu zagadnień komercyjnych3, medycznych4 i naukowych5-8, istnieje stosunkowo niewiele gatunków, które mogą twierdzić, że są zarówno dobrze wyposażonymi modelami naukowymi, jak i łatwymi do utrzymania w środowisku laboratoryjnym. Jednym z, który jest często używany przez dyscypliny takie jak neurobiologia9, ekotoksykologia10, a ostatnio biologia ewolucyjna11,12, jest Lymnaea stagnalis, głównie ze względu na jego szerokie rozpowszechnienie i wyjątkową łatwość utrzymania. Pomimo jego popularności jako organizmu "modelowego" i długiej historii stosowania przez biologów rozwojowych13-19, zakres i moc narzędzi molekularnych dostępnych dla społeczności naukowej L. stagnalis pozostaje daleko w tyle za bardziej tradycyjnymi modelami zwierzęcymi (Drosophila, mysz, jeżowce, nicienie).
Nasze pragnienie rozwoju Lymnaea jako modelu molekularnego wynika z zainteresowania mechanizmami molekularnymi, które kierują tworzeniem się otoczek. To zmotywowało nas do udoskonalenia zestawu technik, które pozwoliłyby na wydajną, spójną i czułą wizualizację ekspresji genów podczas rozwoju Lymnaea. Hybrydyzacja in situ (WMISH) jest szeroko stosowana w przypadku różnych organizmów modelowych i jest stosowana od ponad 40 lat20. W różnych postaciach ISH może być stosowany do przestrzennej lokalizacji określonych loci na chromosomach, rRNA, mRNA i mikro-RNA.
Jednym z wyzwań, które musieliśmy rozwiązać przed udoskonaleniem metody WMISH dla L. stagnalis, była kwestia delikatnego i skutecznego pobierania zarodków i larw w różnym stadium z kapsułek jajowych, w których są zdeponowane. Ekstrakcja ta, czyli "dekapsulacja", musi być przeprowadzona w sposób skuteczny w celu zebrania odpowiedniego materiału do danego doświadczenia in situ, przy jednoczesnym zachowaniu integralności morfologicznej i komórkowej. Podczas gdy inne organizmy modelowe również przechodzą rozwój w kapsułkach, w naszych rękach żadna z metod opisanych dla tych gatunków nie mogła być z powodzeniem zastosowana u L. stagnalis.
Ogólne cele tej metody to: ekstrakcja zarodków i larw L. stagnalis z ich kapsułek w sposób wysokoprzepustowy, zastosowanie zabiegów pre-hybrydyzacyjnych, które optymalizują sygnał WMISH, przygotowanie zarodków i larw z zadowalającymi sygnałami WMISH do obrazowania.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze do wagi piórkowej</td><td>Ehlert & Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>Glasger&auml; tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Szklane naczynia włosowate</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>UWAGA - Może powodować raka. Działa toksycznie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Toksyczny: niebezpieczeństwo wystąpienia bardzo poważnych, nieodwracalnych skutków poprzez wdychanie, w kontakcie ze skórą i po połknięciu.</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>UWAGA - DZIAŁA DRAŻNIĄCO NA OCZY. MOŻE POWODOWAĆ PODRAŻNIENIE DRÓG ODDECHOWYCH I SKÓRY. Unikaj wdychania pyłu. Unikać kontaktu z oczami, skórą i odzieżą. Stosować tylko przy odpowiedniej wentylacji</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>UWAGA - Może być szkodliwy w przypadku wdychania. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może być szkodliwy, jeśli jest wchłaniany przez skórę. Może powodować podrażnienie skóry. Może powodować podrażnienie oczu. Może działać szkodliwie w przypadku połknięcia.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll typ 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>poliwinylopirolidon K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>UWAGA - Może być szkodliwy w przypadku wdychania. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może być szkodliwy, jeśli jest wchłaniany przez skórę. Może powodować podrażnienie skóry. Może powodować podrażnienie oczu. Może działać szkodliwie w przypadku połknięcia.</td></tr><tr><td>Bez nukleaz Surowica bydlęca Albumina</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Nasienie łososia</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>UWAGA - DZIAŁANIA NIEPOŻĄDANE OBEJMUJĄ KRWOTOK, MIEJSCOWE PODRAŻNIENIE. MOŻLIWA REAKCJA ALERGICZNA W PRZYPADKU WDYCHANIA, SPOŻYCIA/KONTAKTU. DRAŻNIĄCE OCZY/SKÓRĘ/DROGI ODDECHOWE. MOŻLIWE NADWRAŻLIWOŚĆ. W CZASIE CIĄŻY DONOSZONO O ZWIĘKSZENIU RYZYKA URODZENIA MARTWEGO DZIECKA</td></tr><tr><td>Proteinaza-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>UWAGA - Działa drażniąco na oczy i skórę. Może działać szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Higroskopijny.</td></tr><tr><td>Standardowy formamid</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>UWAGA - Działa drażniąco na oczy i skórę. Może działać szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Higroskopijny.</td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>UWAGA - Unikać wdychania pary lub mgły. Unikać kontaktu z oczami. Unikać długotrwałego lub powtarzającego się kontaktu ze skórą. Po użyciu dokładnie umyć.</td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>UWAGA - POWODUJE POWAŻNE OPARZENIA SKÓRY I OCZU. GWAŁTOWNIE WCHODZI W REAKCJĘ Z WODĄ. DZIAŁA SZKODLIWIE PO POŁKNIĘCIU. PARA DRAŻNIĄCA OCZY I DROGI ODDECHOWE</td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>UWAGA - Bardzo niebezpieczny w przypadku kontaktu z oczami (drażniący), po spożyciu, . Stwarza zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą (działanie drażniące), wdychania (działanie drażniące na płuca). Lekko niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą (permeator). Działa żrąco na oczy i skórę.</td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>UWAGA - Może być szkodliwy w przypadku wdychania. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może być szkodliwy, jeśli jest wchłaniany przez skórę. Może powodować podrażnienie skóry. Może powodować podrażnienie oczu. Działa szkodliwie po połknięciu.</td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>UWAGA - Działa szkodliwie w przypadku połknięcia. Działa szkodliwie w przypadku wdychania. Działa drażniąco na oczy.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Proszek blokujący</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Fragmenty Anti DIG Fab AP sprzężone</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Carl</td><td>Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-nitro niebieski chlorek tetrazolu w dimetyloformamidzie&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>UWAGA - Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe i w kontakcie ze skórą. Działa drażniąco na oczy.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforan</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>UWAGA - Potencjalnie szkodliwy w przypadku spożycia. Nie dopuścić do kontaktu ze skórą, oczami ani na ubraniem. Potencjalne działanie drażniące na skórę i oczy.</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>UWAGA - Może powodować podrażnienie oczu i skóry. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych i pokarmowych. Właściwości toksykologiczne tego materiału nie zostały w pełni zbadane.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>UWAGA - Może działać szkodliwie w przypadku wdychania. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może być szkodliwy, jeśli jest wchłaniany przez skórę. Może powodować podrażnienie skóry. Może powodować podrażnienie oczu. Może działać szkodliwie w przypadku połknięcia.</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>UWAGA - Działa szkodliwie po połknięciu. Działa toksycznie w kontakcie ze skórą. Działa drażniąco na skórę. Powoduje poważne uszkodzenie oczu. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-sodowy wodorofosforan dwuwodny (Na2HPO4&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodu dwuwodny (C6H5Na3O7&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>UWAGA - Może powodować podrażnienie oczu, skóry i dróg oddechowych. Właściwości toksykologiczne tego materiału nie zostały w pełni zbadane.</td></tr><tr><td>Olej mineralny&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-VSI&nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka lymnaea stagnalis

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Hybrydyzacja in situ (WMISH) to technika, która pozwala na przestrzenne rozdzielenie cząsteczek kwasu nukleinowego (często mRNA) w obrębie "całego wierzchowca" przygotowania tkankowego lub etapu rozwoju (takiego jak zarodek lub larwa) będącego przedmiotem zainteresowania. WMISH jest niezwykle silny, ponieważ może znacząco przyczynić się do funkcjonalnej charakterystyki złożonych genomów metazoan, wyzwania, które staje się coraz bardziej wąskim gardłem w zalewie danych sekwencyjnych nowej generacji. Pomimo koncepcyjnej prostoty tej techniki, często potrzeba dużo czasu na optymalizację różnych parametrów nieodłącznie związanych z eksperymentami WMISH dla nowatorskich systemów modelowych; Subtelne różnice we właściwościach komórkowych i biochemicznych między typami tkanek i stadiami rozwojowymi oznaczają, że jedna metoda WMISH może nie być odpowiednia we wszystkich sytuacjach. Opracowaliśmy zestaw metod WMISH dla ponownie pojawiającego się modelu ślimaka Lymnaea stagnalis, które generują spójne i wyraźne sygnały WMISH dla szeregu genów i na wszystkich etapach rozwoju. Metody te obejmują przypisanie larw o nieznanym wieku chronologicznym do okna ontogenetycznego, skuteczne usuwanie zarodków i larw z ich torebek jajowych, zastosowanie odpowiedniego leczenia Proteinazą-K dla każdego okna ontogenetycznego oraz etapy hybrydyzacji, po hybrydyzacji i immunodetekcji. Metody te stanowią podstawę, na której uzyskany sygnał dla danego transkryptu RNA może być dalej udoskonalany za pomocą regulacji specyficznych dla sondy (przede wszystkim stężenia sondy i temperatury hybrydyzacji).

Reprezentatywne wzory barwienia WMISH przedstawione na Rysunku 3 zostały uzyskane przy użyciu opisanej powyżej techniki i odzwierciedlają różnorodne przestrzenne wzory ekspresji genów zaangażowanych w szereg procesów molekularnych – od tworzenia muszli (Novel gene 1, 2, 3 oraz 4), przez sygnalizację międzykomórkową (Dpp), aż po regulację transkrypcji (Brachyury) na różnych etapach rozwoju. Chociaż nie określiliśmy ilościowo poziomów eks...

Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom zestawu metod do wysokoprzepustowej dekapsulacji zarodków i larw Lymnaea stagnalis w ramach przygotowań do hybrydyzacji in situ całego wierzchowca oraz do późniejszych zabiegów przed i po hybrydyzacji.

Cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest efektywna wizualizacja przestrzennych wzorców ekspresji pojedynczych genów w całych preparatach embrionów i larw słodkowodnego brzuchonoga Lymnaea stagnalis. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu Evo-Devo i biologii rozwoju, takie jak: gdzie i kiedy dochodzi do ekspresji genów, w jaki sposób oddziałują one na siebie oraz jakie mogą być ich funkcje. Główną zaletą tej techniki jest to, że usuwanie materiału embrionalnego i larwalnego z kapsułek jajowych jest szybkie, łatwe i skuteczne.Materiał ten jest następnie kategoryzowany zgodnie z mapą rozwoju dostarczoną w materiale uzupełniającym, a następnie poddawany etapowym krokom przedhybrydyzacyjnym. Aby rozpocząć tę procedurę, podłącz jednorazową strzykawkę o pojemności 20 ml do rurki silikonowej. Następnie przyklej taśmą standardowe szkiełko przedmiotowe do dużego odwróconego naczynia Petriego.Następnie przyklej taśmą rurkę silikonową bezpośrednio przy szkiełku przedmiotowym. Po tym czasie umieść wyciągniętą szklaną igłę na szkiełku przedmiotowym. Delikatnie wprowadź ją do rurki silikonowej, aż końcówka igły będzie wystawać na około 20% średnicy wewnętrznej rurki.Po ustawieniu igły w odpowiedniej pozycji, należy przymocować ją taśmą do szalki Petriego. Wolny koniec rurki silikonowej powinien spoczywać w drugiej szalce Petriego, w której zostanie zebrany materiał po dekapsulacji. Aby zebrać szczepy jaj ze ścianek akwarium, należy użyć kawałka płaskiego, elastycznego tworzywa sztucznego jako szpatułki do zeskrobania szczepu jaj z podłoża.Następnie za pomocą plastikowego sitka do herbaty wyłów z wody pływający kłąb jaj. Po tym etapie przygotuj materiał i posortuj go pod mikroskopem zgodnie z niniejszym przewodnikiem. Umieść kłąb jaj na ręczniku papierowym i za pomocą pęsety precyzyjnej wykonaj nacięcie wzdłuż masy jaj.Następnie należy przetoczyć kapsuły jajowe przez sito do jaj i usunąć jak największą ilość materiału galaretowatego z każdej kapsuły, przesuwając ją po ręczniku papierowym. Następnie, używając pęsety precyzyjnej, należy przenieść kapsuły jajowe do szalki Petriego zawierającej 5 milliliters wody z kranu. Należy kontynuować zbieranie oczyszczonych z galaretki kapsuł jajowych o pożądanych stadiach rozwojowych do tej szalki.Przed przejściem do następnego kroku należy zebrać wystarczającą liczbę kapsuł ze wszystkich stadiów rozwojowych do planowanego eksperymentu WMISH. Następnie larwy starsze niż pięć dni od pierwszego podziału należy poddać relaksacji w 2% (masy do objętości) roztworze sześciowodnego chlorku magnezu przez 30 minut przed utrwaleniem. Po 30 minutach należy ocenić stopień relaksacji, zanurzając kilka larw wraz z kapsułami jajowymi w roztworze utrwalającym i monitorując ich reakcję pod mikroskopem.Niedostatecznie zrelaksowane larwy cofnią się do swoich muszli, podczas gdy w pełni zrelaksowane larwy nie będą reagować. Po zrelaksowaniu larw należy przenieść kapsuły jajowe za pomocą plastikowej pipety o szerokim otworze do szczelnej probówki, zapewniającej 10-krotnie większą objętość niż objętość kapsuł jajowych.Następnie odessać z probówki jak najwięcej cieczy i zastąpić ją roztworem utrwalającym w objętości 10-krotnie większej niż objętość osiadłych kapsuł jajowych. Delikatnie obracać kapsuły jajowe w utrwalaczu w temperaturze pokojowej przez czas odpowiedni dla każdego stadium rozwojowego. Następnie przerwać obracanie i pozwolić kapsułom opaść na dno.Odssać roztwór utrwalający do odpowiedniego pojemnika na odpady. Przepłukać kapsuły jajowe, zastępując roztwór utrwalający PBTw i obracając je w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Odssać PBTw i wypłukać jeszcze dwa razy. Następnie, przy użyciu aparatu, usunąć embriony i larwy z ich kapsułek. Naciągnąć kapsułki do strzykawki o pojemności 20 ml.Następnie należy przymocować strzykawkę do rurki. Wypchnąć kapsułki przez rurkę i szklaną igłę do naczynia zbiorczego. Po tym zabiegu zebrać odkapsułkowane embriony i larwy do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety.Następnie należy odwodnić i przechowywać utrwalony materiał lub przeprowadzić etapy z użyciem Proteinazy K, TEA oraz postutrwalania. Po zakończeniu tych kroków materiał należy krótko prehybrydyzować, a następnie dodać ribosondy. Odpowiednia obróbka Proteinazą K ma kluczowe znaczenie dla końcowych wyników eksperymentu in situ w przypadku Lymnaea stagnalis.Odzwierciedla to szeroki zakres stężeń Pro K wymaganych w zależności od poszczególnych etapów rozwoju, wynoszący od 0 do 500 micrograms to mil. Podczas hybrydyzacji należy wyjąć jedną probówkę z bloku grzejnego. Szybko obrócić ją między kciukiem a palcem wskazującym, aby zawiesić larwy bez naruszania fazy olejowej, a następnie umieścić ją z powrotem w bloku grzejnym.Powtarzać tę procedurę raz na 6 do 12 godzin. Przedstawione tutaj wzorce ekspresji genów zostały wygenerowane z larw na różnych etapach rozwoju. Wszystkie próbki zamontowano i obrazowano w medium Murray's Clear.Przybliżony wiek jest wskazany w prawym górnym rogu każdego obrazu. Orientacja widoku jest zaznaczona w prawym dolnym rogu, a ortologia genów w lewym dolnym rogu. Wyniki te ilustrują wzorce ekspresji genów zaangażowanych w szereg procesów molekularnych, od tworzenia muszli, przez transkrypcję, aż po sygnalizację międzykomórkową.W każdym przypadku widoczny jest unikalny i wyraźny wzór barwienia komórkowego, a wyniki są wysoce spójne pomiędzy poszczególnymi larwami w ramach jednego eksperymentu oraz wysoce powtarzalne pomiędzy różnymi eksperymentami. Po opanowaniu metody całkowity czas pracy nad tą techniką wynosi mniej niż dwa dni. Większość czasu poświęca się na zbieranie i przygotowywanie materiału embrionalnego i larwalnego do hybrydyzacji oraz na utrwalanie obrazów z wynikami.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że każda sonda rybonukleotydowa prawdopodobnie będzie wymagała subtelnych korekt istotnych parametrów, takich jak temperatura hybrydyzacji, stężenie sondy oraz czas trwania hybrydyzacji. Po opracowaniu ta technika pozwoliła nam na rzetelną charakterystykę zestawu genów zaangażowanych w formowanie muszli, które zostały zidentyfikowane w poprzednich badaniach transcriptomicznych i proteomicznych.

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

W tym filmie pokazujemy metodę wytwarzania rozwojowo zsynchronizowanej populacji bezpłodnych dorosłych C. elegans. Przykładowy protokół synchronizuje robaki w celu zbadania wskaźników zużycia tlenu u żywych zwierząt.

Synchronizacja nicieni: metoda uzyskiwania populacji robaków w identycznych stadiach rozwoju

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku.  Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Wywołane przez rybołówstwo zmiany w eksploatowanych połowach skorupiaków, takie jak amerykańskie połowy homarów, mogą potencjalnie wpłynąć na ich dynamikę reprodukcyjną, prowadząc do zmniejszenia sukcesu godowego. Celem tego badania było opracowanie nieinwazyjnej metody ustalania sukcesu godowego samic homarów, które mogą być fizjologicznie lub funkcjonalnie dojrzałe.

Nieinwazyjna metoda określania in situ udanego krycia u samic homarów amerykańskich (Homarus americanus)

Ten protokół wideo demonstruje metodę badania wpływu płynu nasiennego na ślimaki, przy użyciu hermafrodytycznego ślimaka słodkowodnego Lymnaea stagnalis.

Wpływ produktów z męskich gruczołów dodatkowych na składanie jaj u ślimaków

Diagnoza zakażenia Eimeria u kurcząt pozostaje wymagająca. Podejścia oparte na morfologii pasożytów i patologii żywiciela są zwykle niejednoznaczne, podczas gdy podejścia molekularne oparte na PCR okazały się wymagające pod względem kosztów i wiedzy specjalistycznej. Celem tego protokołu jest ustanowienie amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) jako prostej diagnostyki molekularnej infekcji eimeriana.

Testy amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do specyficznego dla gatunku wykrywania emerii, które infekują kurczaki

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

Celem tego protokołu jest genotyp ukwiału Nematostella vectensis podczas gastrulacji bez poświęcania zarodka.

Genotypowanie ukwiałów morskich we wczesnym okresie rozwoju

Ochrona małży słodkowodnych zależy od monitorowania wzorców i procesów reprodukcyjnych gatunków. Badanie to standaryzuje nieśmiertelny protokół pobierania próbek zawartości skrzeli, charakteryzowania rozwoju larwalnego i zapewnienia cyfrowego repozytorium zebranych danych. Ten pakiet protokołów i baz danych będzie ważnym narzędziem dla badaczy małży w odbudowie zagrożonych gatunków.

Standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (Bivalvia: Unionida)

Artykuł przedstawia metody hodowli larw ślimaka Crepidula fornicata w systemie laboratoryjnym o małej objętości oraz w systemie mezokosmosu z otaczającą wodą morską, który może być stosowany w terenie.

Hodowla laboratoryjna i terenowa larw skałoczepa pantofelkowego, Crepidula fornicata

Poznaj metodę całej hybrydyzacji in situ dla Lymnaea stagnalis, umożliwiającą wizualizację wzorców ekspresji genów w embriogenie i larwach. Technika ta wspiera badania w dziedzinie biologii rozwoju i ewolucyjno-rozwojowej.

Cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka Lymnaea stagnalis

Przeglądaj więcej filmów