Analiza Cycloheximide Chase degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja degradacji populacji białka w stanie stacjonarnym w organizmie Saccharomyces cerevisiae. Metodę tę można wykorzystać do określenia wymagań genetycznych oraz wpływu czynników środowiskowych na degradację badanego białka. Główną zaletą tej techniki jest brak konieczności stosowania izotopów promieniotwórczych i czasochłonnych etapów immunoprecypitacji, w przeciwieństwie do technik pulse-chase, które są również wykorzystywane do wizualizacji degradacji białek.

Niniejszą procedurę można wykorzystać do analizy białka endogennego drożdży lub białka ekspresowanego z plazmidu. W tym drugim przypadku szczep drożdży jest transformowany plazmidem kodującym interesujące białko zgodnie ze standardowym protokołem transformacji drożdży. Zaszczep drożdże w pięciu mililitrach odpowiedniego medium.

Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C przy jednoczesnym obracaniu. Następnego dnia rano zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach, czyli OD600, dla każdej kultury nocnej. Rozcieńczyć kultury do poziomu OD600 wynoszącego 0,2 w 15 ml świeżej pożywki.

Inkubować w temperaturze 30 °C wstrząsając do momentu, aż komórki osiągną średnią fazę wzrostu logarytmicznego. Podczas wzrostu komórek drożdży należy przygotować procedurę śledzenia z użyciem cykloheksymidu. Ustawić blok grzejny mieszczący probówki stożkowe o pojemności 15 ml na temperaturę 30 °C w celu inkubacji komórek w obecności cykloheksymidu.

Aby zapewnić efektywny rozkład ciepła w kulturach, należy dolać wodę do każdego otworu bloku grzejnego w taki sposób, aby po włożeniu stożkowej probówki o pojemności 15 ml poziom wody podniósł się do krawędzi otworu, ale nie doprowadził do jego przelania. Drugi blok grzejny, przystosowany do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml, należy ustawić na 95 °C w celu denaturacji białek po lizie komórek. Świeżą pożywkę wzrostową należy uprzednio ogrzać do 30 °C.

Na każdy punkt czasowy dla każdej hodowli poddawanej analizie potrzeba 1,1 ml medium. Do wcześniej oznakowanych probówek do mikrocentryfugi należy dodać 50 µl 20x Stop Mix. Przygotuj jedną probówkę na każdy punkt czasowy dla każdej hodowli poddawanej analizie.

Umieść probówki w lodzie. Gdy komórki drożdży osiągną fazę średnio-logarytmicznego wzrostu, pobierz 2,5 jednostek OD600 z każdej kultury dla każdego punktu czasowego przeznaczonego do analizy. Jedna jednostka OD600 odpowiada ilości drożdży obecnej w jednym mililitrze kultury przy OD600 równym 1,0.

Odwiruj zebrane komórki w 15 mililitrowych probówkach stożkowych przy 3 000 ×g w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Usuń nadsącz. Ponownie zawieś każdy osad komórkowy w jednym mililitrze świeżej pożywki wzrostowej o temperaturze 30 °C na każde 2,5 jednostek OD600 komórek.

Przed rozpoczęciem eksperymentu typu cycloheximide chase, należy wyrównać temperaturę zawiesin komórek drożdży poprzez inkubację w bloku grzewczym o temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć minut. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest precyzyjne zaplanowanie czasu dodania cykloheksymidu oraz poboru komórek dla każdej próbki. Aby zapewnić sukces, opracowujemy i ściśle przestrzegamy harmonogramu dodawania cykloheksymidu i zbierania komórek.

Aby rozpocząć analizę kinetyki degradacji (cycloheximide chase), naciśnij przycisk „Start” na stoperze. Szybko, lecz ostrożnie dodaj cykloheksymid do pierwszej zawiesiny komórek drożdży do stężenia końcowego 250 µg/mL, a następnie krótko wymieszaj na wirówce typu vortex. Natychmiast przenieś 950 µL (około 2,4 jednostek OD600) zawiesiny komórek drożdży z dodanym cykloheksymidem do uprzednio oznakowanej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 50 µL lodowatego 20x Stop Mix.

Wymieszaj probówkę do mikrowirówki na wirówce typu vortex i pozostaw na lodzie do czasu zebrania wszystkich próbek. Rozpocznij proces wypłukiwania cykloheksymidą (cycloheximide chase) dla każdej z pozostałych zawiesin komórek drożdży w regularnych odstępach czasu, zgodnie z demonstracją. W każdym kolejnym punkcie czasowym wymieszaj zawiesiny komórek drożdży na vortexie i przenieś 950 microliters do oznakowanych probówek do mikrowirówki zawierających 50 microliters schłodzonego 20x Stop Mix.

Wymieszać w wirówce wortexowej i umieścić zebrane komórki na lodzie. Aby zapobiec osiadaniu komórek drożdży, należy mieszać zawiesiny komórkowe w 15 ml probówkach stożkowych w wirówce wortexowej w przybliżeniu co pięć minut przez cały czas trwania etapu śledzenia (chase). Po zebraniu wszystkich próbek, osadzić komórki poprzez wirowanie przy 6 500 ×g w temperaturze pokojowej przez 30 sekund.

Usunąć nadsącz za pomocą pipety lub aspiracji. Komórki są teraz gotowe do lizy alkalicznej. Przygotować komórki do lizy alkalicznej, dodając 100 µL wody destylowanej do każdego osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić poprzez pipetowanie w górę i w dół.

Do każdej próbki należy dodać 100 µL 0,2 M wodorotlenku sodu. Wymieszać za pomocą wortexa. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Na tym etapie komórki drożdży nie zostały poddane lizie, a białka nie zostały uwolnione. Następnie należy ocenić komórki poprzez wirowanie przy 18,000 ×g w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Nadpływ należy usunąć za pomocą pipety lub aspiracji.

Aby zlizować komórki, należy dodać 100 µL buforu do próbek Laemmli do każdego osadu komórkowego. Ponownie zawiesić próbki, pipetując w górę i w dół. Inkubować w temperaturze 95 °C przez pięć minut, aby całkowicie zdenaturować białka.

Odwiruj lizaty przy 18 000 ×g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę, aby wytrącić materiał nierozpuszczalny. Nadsącz, stanowiący rozpuszczone białko wyekstrahowane, jest gotowy do rozdziału metodą SDS PAGE i późniejszej analizy Western blot. Alternatywnie lizaty można przechowywać w temperaturze -20 °C.

Stabilność Deg1-Sec62, modelowego substratu degradacji stowarzyszonej z retikulum endoplazmatycznym u drożdży, przeanalizowano metodą chase z cykloheksymidą. Białko Deg1-Sec62 w elektroforezie SDS-PAGE migruje jako wiele form i ulega szybkiej degradacji w komórkach typu dzikiego. Pgk1 służy jako kontrola załadunku, której poziom nie ulega zmianie w badanych warunkach.

Utrata rezydentnej w ER ligazy ubikwityny hrd1 lub enzymu konjugującego ubikwitynę ubc7 doprowadziła do znacznej stabilizacji białka Deg1-Sec62, co potwierdza wcześniej zaobserwowaną rolę tych białek w degradacji Deg1-Sec62. Cue1 jest białkiem transbłonowym, które zakotwicza ubc7 w błonie ER i aktywuje ten enzym, jednak zapotrzebowanie na cue1 w procesie degradacji Deg1-Sec62 nie było bezpośrednio badane. Obserwacja z niniejszego badania, według której Deg1-Sec62 uległ stabilizacji w przypadku braku cue1, potwierdziła rolę cue1 w degradacji Deg1-Sec62 związanej z ER.

Wynik analizy Western blot został poddany kwantyfikacji przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Aby porównać obfitość białka Deg1-Sec62 w poszczególnych próbkach, dla każdej z nich wyznaczono stosunek skorygowanych intensywności sygnału Deg1-Sec62 do Pgk1. Należy pamiętać, że procedura ta w sposób najbardziej bezpośredni informuje o kinetyce degradacji populacji białka zainteresowania w stanie stacjonarnym.

Aby zwizualizować degradację nowo powstałej populacji badanego białka, można zastosować inne techniki, takie jak eksperymenty typu pulse-chase. Należy pamiętać, że cykloheksymida i azotek sodu są niezwykle toksyczne, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować ostrożność, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z tymi odczynnikami.