Name: Analiza Cycloheximide Chase degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę cycloheximide chase do analizy degradacji białek w Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem western blottingu. Technika ta pozwala badać stabilność białek bez izotopów promieniotwórczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują obecnym i byłym członkom laboratorium Rubensteina za zapewnienie wspierającego i entuzjastycznego środowiska badawczego. Autorzy dziękują Markowi Hochstrasserowi (Uniwersytet Yale) za podzielenie się odczynnikami i wiedzą specjalistyczną. E.M.R. dziękuje Stefanowi Kreftowi (Uniwersytet w Konstancji) i Jennifer Bruns (Uniwersytet w Pittsburghu) za podzielenie się bezcenną wiedzą z zakresu analizy kinetycznej białek. Praca ta była wspierana przez grant National Institutes of Health (R15 GM111713) dla E.M.R., nagrodę badawczą Ball State University ASPiRE dla E.M.R., nagrodę badawczą od oddziału Ball State University Sigma Xi dla S.M.E. oraz fundusze z Biura Rektora i Wydziału Biologii Uniwersytetu Stanowego Ball.

1. Wzrost i zbiór komórek drożdży
<ol>
	<li>Jeśli nie analizujesz kinetyki degradacji endogennego białka drożdży, przekształć pożądany szczep (szczepy) drożdży za pomocą plazmidu kodującego interesujące białko. Wiarygodne metody przemiany drożdży zostały już wcześniej opisane 37.</li>
	<li>Zaszczepić drożdże w 5 ml odpowiedniej pożywki (np. selektywnej pożywki syntetycznej zdefiniowanej (SD) do utrzymania plazmidu w transformowanych komórkach lub nieselektywnej pożywki z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) dla komórek nieprzekształconych). Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C, obracając się. 
	UWAGA: 30 °C to optymalna temperatura wzrostu dla typowych szczepów drożdży laboratoryjnych typu dzikiego 38. Ponieważ jednak niektóre zmutowane szczepy drożdży nie rosną optymalnie w temperaturze 30 °C, a niektóre białka ulegają degradacji zależnej od temperatury, temperatury stosowane do wzrostu komórek drożdży i pogoni cykloheksymidu powinny być określone empirycznie 39.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) każdej nocnej hodowli. 
	UWAGA: Komórki mogą znajdować się w logarytmicznej lub stacjonarnej fazie wzrostu, ale powinny osiągnąć minimalną gęstość, która pozwoli na rozcieńczenie do OD600 = 0,2 w 15 ml świeżej pożywki.</li>
	<li>Rozcieńczyć kultury na noc do wartości OD600 wynoszącej 0,2 w 15 ml świeżej pożywki.</li>
	<li>Drożdże inkubować w temperaturze 30 °C, wstrząsając aż do momentu, gdy komórki osiągną środkową logarytmiczną fazę wzrostu (tj. OD600 między 0,8 a 1,2).</li>
	<li>Podczas wzrostu komórek drożdży należy wykonać następujące czynności, aby przygotować się do zabiegu pościgu cykloheksymimidowego:
	<ol>
		<li>Ustawić blok grzewczy, który może pomieścić 15 ml stożkowych probówek, do temperatury 30 °C w celu inkubacji komórek w obecności cykloheksymidu. Dodaj wodę do studzienek bloku grzewczego, aby umożliwić efektywne rozprowadzanie ciepła do kultur. Dodaj wodę do każdej studzienki tak, aby stożkowa rurka o pojemności 15 ml spowodowała podniesienie się poziomu wody do krawędzi studni, ale nie przelanie się przez nią.</li>
		<li>Ustaw drugi blok grzewczy, który może pomieścić 1,5 ml probówek mikrowirówkowych, do 95 °C w celu denaturacji białek po lizie komórek.</li>
		<li>Wstępnie ogrzać świeżą pożywkę wzrostową (1,1 ml na punkt czasowy na badaną kulturę) do 30 °C.</li>
		<li>Dodać 50 μl 20x Stop Mix do wstępnie oznakowanych probówek do mikrowirówek (jedna probówka na punkt czasowy na kulturę, która ma być oznaczona). Umieść probówki na lodzie. 
		UWAGA: Azydek sodu, składnik 20x Stop Mix, jest toksyczny po spożyciu doustnym lub kontakcie ze skórą. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta podczas przygotowywania, przechowywania i obchodzenia się z azydkiem sodu. W przypadku przypadkowego narażenia należy zapoznać się z kartą charakterystyki dostarczonej przez producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy komórki osiągną średni wzrost logarytmiczny, zbierz 2,5 OD600 jednostek każdej kultury na punkt czasowy, który ma być oznaczony (np. 7,5 OD600 jednostek, aby przeanalizować obfitość białka w trzech punktach czasowych). Odwirować zebrane komórki w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml przy 3 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 min. 
	UWAGA: Jedna jednostka OD600 jest równa ilości drożdży obecnych w 1 ml kultury przy OD600 1,0. Objętość kultury (w ml) wymagana do zebrania X OD600 jednostek (V) może być określona za pomocą następującego równania: V = X OD600 jednostek/Zmierzony OD600. Na przykład, aby zebrać 7,5 OD600 jednostek kultury komórkowej drożdży przy OD600 1,0, zbierz 7,5 OD600 jednostek/1,0 = 7,5 ml kultury drożdży.</li>
	<li>Zawiesić każdą komórkę w 1 ml świeżej pożywki o temperaturze 30 °C (wstępnie podgrzanej) na 2,5 OD600 jednostek komórek (np. 3 ml na 7,5 OD600 jednostek).</li>
</ol>
2. Pogoń za cykloheksymidem
<ol>
	<li>Zrównoważyć zawiesiny komórek drożdży przez inkubację przez 5 minut w bloku grzewczym o temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Przygotuj minutnik do liczenia od 0:00.</li>
	<li>Aby rozpocząć pościg za cykloheksymimidem, naciśnij "Start" na timerze. Szybko, ale ostrożnie, wykonaj następujące kroki:
	<ol>
		<li>Dodać cykloheksymid do końcowego stężenia 250 μg/ml do pierwszej zawiesiny komórek drożdży (np. dodać 37,5 μl 20 mg/ml cykloheksymidu do 3 ml zawiesiny komórek) i krótko zmieszać. 
		UWAGA: Cykloheksymid działa drażniąco na skórę i jest toksyczny po spożyciu doustnym. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta podczas przygotowywania, przechowywania i obchodzenia się z cykloheksymidem. W przypadku przypadkowego narażenia należy zapoznać się z kartą charakterystyki dostarczonej przez producenta.</li>
		<li>Natychmiast po dodaniu cykloheksymidu i wirowaniu, przenieś 950 μl (~2,4 OD600 jednostek) zawiesiny komórek drożdży z dodatkiem cykloheksymidu do wstępnie znakowanej probówki mikrowirówki zawierającej 50 μl lodowatej mieszanki 20x. Zwiruj probówkę do mikrowirówki i umieść na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną zebrane.</li>
		<li>Przywrócić zawiesinę komórek drożdży do temperatury 30 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 2.3.1 do 2.3.3 dla każdej z pozostałych zawiesin komórek drożdży w regularnych odstępach czasu (np. co 30 sekund, tak aby cykloheksymid był dodawany do próbki #1 o godzinie 0:00, próbki #2 o godzinie 0:30, próbki #3 o godzinie 1:00 itd.).</li>
	<li>W każdym kolejnym punkcie czasowym odwirować zawiesiny komórek drożdży i przenieść 950 μl do znakowanych probówek wirówkowych zawierających 50 μl wstępnie schłodzonego 20x Stop Mix. Wiruj i umieść zebrane komórki na lodzie. Umieścić 15 ml stożkowych probówek z powrotem w bloku grzewczym o temperaturze 30 °C.
	<ol>
		<li>Na przykład, w przypadku pobierania komórek 30 minut po dodaniu cykloheksymidu (zakładając 30-sekundowe odstępy czasu między dodaniem cykloheksymidu do zawiesin komórek drożdży na początku przebiegu czasu), należy odwirować i usunąć 950 μl zawiesiny komórkowej z próbki #1 o godzinie 30:00. Powtórz dla próbki #2 o 30:30 i tak dalej. 
		UWAGA: Aby zapobiec osadzaniu się drożdży, zawiesiny komórek wirowych w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml należy umieszczać mniej więcej co 5 minut przez cały czas trwania pościgu. Alternatywnie, zawiesiny komórek drożdży mogą być utrzymywane w stale mieszającej kąpieli wodnej przez czas trwania eksperymentu z pościgiem cykloheksymidu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pobraniu wszystkich próbek, zebrać komórki w osadach przez odwirowanie w temperaturze 6 500 x g w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację. Komórki są teraz gotowe do lizy alkalicznej. Alternatywnie, zatrzaskowo zamrozić granulowane komórki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja białek po alkalicze (zmodyfikowana z 16,40)
<ol>
	<li>Do każdej komórki dodać 100 μl wody destylowanej. Zawiesić przez pipetowanie w górę i w dół lub wirowanie.</li>
	<li>Dodać 100 μl 0,2 M NaOH do każdej próbki. Mieszać, pipetując w górę i w dół lub wirując.</li>
	<li>Inkubować zawieszone komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Na tym etapie komórki drożdży nie zostały poddane lizie, a białka nie zostały uwolnione 40.</li>
	<li>Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 18 000 x g w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację.</li>
	<li>Aby poddać lizie komórki, dodaj 100 μl buforu do próbki Laemmli do każdej osadki komórkowej. Zawiesić ponownie, pipetując w górę i w dół lub wirując. 
	UWAGA: Sekwencyjna inkubacja komórek z buforem próbki NaOH i Laemmli uwalnia białka w postaci zgodnej z elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu (SDS-PAGE) przy użyciu systemu buforowego Tris-glicyna.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut do całkowitej denaturacji białek. 
	UWAGA: Inkubacja w temperaturze 95 °C może nie być odpowiednia do analizy białek, które są podatne na agregację (np. białek z kilkoma segmentami transbłonowymi). Białka te mogą stać się nierozpuszczalne podczas inkubacji w podwyższonych temperaturach 41. Tak więc, do analizy takich białek, lizaty powinny być inkubowane w niższych temperaturach (np. 37 °C - 70 °C) przez 10 - 30 minut, jak określono empirycznie.</li>
	<li>Odwirować lizaty przy 18 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę do granulowania nierozpuszczalnego materiału. Supernatant (rozpuszczone, wyekstrahowane białko) jest gotowy do separacji za pomocą SDS-PAGE i późniejszej analizy western blot. Alternatywnie przechowywać lizaty w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Reprezentatywna SDS-PAGE i procedura Western Blotting (Dostosowane z 16)
<ol>
	<li>Załaduj wzorce masy cząsteczkowej białka i empirycznie oznaczoną objętość lizatów do żelu SDS-PAGE. 
	UWAGA: Wybierz procentową zawartość akrylamidu i bis-akrylamidu w żelu SDS-PAGE na podstawie masy cząsteczkowej interesującego Cię białka. Ogólnie rzecz biorąc, żele o niższym procencie lepiej nadają się do rozpuszczania białek o wyższej masie cząsteczkowej.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 200 V, aż przód barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.</li>
	<li>Przenieść białka z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) metodą transferu na mokro pod napięciem 20 V przez 60-90 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Błonę blokową przez inkubację w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) zawierającą 5% odtłuszczonego mleka, kołysząc, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów w obecności membrany inkubowanej przez noc, zaleca się włączenie azydku sodu do roztworu blokującego w końcowym stężeniu 0,02%.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem specyficznym dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w TBS z 0,1% Tween-20 (TBS/T) i 1% odtłuszczonym mlekiem, kołysząc, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Membranę prać w temperaturze pokojowej 3 x 5 min z TBS/T, bujanie.</li>
	<li>Inkubować błonę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem w TBS/T z 1% odtłuszczonym mlekiem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, kołysząc. 
	UWAGA: Fluorofory są wrażliwe na światło. W związku z tym rozcieńczenia przeciwciał sprzężonych z fluoroforami powinny być przygotowywane w ciemności, a inkubacja błon w obecności przeciwciał sprzężonych z fluoroforami i następujące po nich etapy płukania powinny odbywać się w pojemnikach odpornych na światło (np. owiniętych folią).</li>
	<li>Membranę prać w temperaturze pokojowej 3 x 5 min z TBS/T, bujanie.</li>
	<li>Membranę obrazową należy wykonać przy użyciu oprogramowania LI-COR Odyssey CLx i Image Studio (lub porównywalnego sprzętu i oprogramowania do obrazowania), zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Po uzyskaniu obrazu błony inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem specyficznym dla białka kontrolnego obciążenia w TBS/T z 1% odtłuszczonym mlekiem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, kołysząc.</li>
	<li>Membranę prać w temperaturze pokojowej 3 x 5 min z TBS/T, bujanie.</li>
	<li>Inkubować błonę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem w TBS/T z 1% odtłuszczonym mlekiem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, kołysząc.</li>
	<li>Membranę prać w temperaturze pokojowej 3 x 5 min z TBS/T, bujanie.</li>
	<li>Membrana obrazu jak w kroku 4.9.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy przedstawiono metodę analizy kinetyki degradacji białek. Technika ta może być z łatwością zastosowana do szeregu białek degradowanych przez różne mechanizmy. Należy zauważyć, że eksperymenty z cykloheksymidem donoszą o kinetyce degradacji puli stanu stacjonarnego danego białka. Inne techniki mogą być stosowane do analizy kinetyki degradacji określonych populacji białek. Na przykład, degradacyjny los powstających polipeptydów może być śledzony za pomocą analizy pościgu impulsowego 55. W takich eksperyme...

Białka pełnią kluczowe funkcje w praktycznie każdym procesie komórkowym. Wiele procesów fizjologicznych wymaga obecności określonego białka (lub białek) przez określony czas lub w określonych okolicznościach. Organizmy monitorują zatem i regulują obfitość białka, aby zaspokoić potrzeby komórkowe 1. Na przykład cykliny (białka kontrolujące podział komórkowy) są obecne w określonych fazach cyklu komórkowego, a utrata regulowanych poziomów cyklin jest związana z powstawaniem nowotworów złośliwych 2. Oprócz regulowania poziomu białka w celu zaspokojenia potrzeb komórkowych, komórki wykorzystują degradacyjne mechanizmy kontroli jakości w celu wyeliminowania nieprawidłowo sfałdowanych, niezłożonych lub w inny sposób nieprawidłowych cząsteczek białka 3. Kontrola obfitości białek obejmuje regulację zarówno syntezy makromolekularnej (transkrypcja i translacja), jak i degradacji (rozpad RNA i proteoliza). Upośledzona lub nadmierna degradacja białek przyczynia się do wielu patologii, w tym raka, mukowiscydozy, chorób neurodegeneracyjnych i zaburzeń sercowo-naczyniowych 4-8. Mechanizmy proteolityczne stanowią zatem obiecujące cele terapeutyczne dla szeregu chorób 9-12.
Analiza białek w jednym punkcie czasowym (np. za pomocą western blot 13, cytometrii przepływowej 14 lub mikroskopii fluorescencyjnej 15) daje obraz obfitości białek w stanie ustalonym, nie ujawniając względnego wkładu syntezy lub degradacji. Podobnie, testy reporterowe oparte na wzroście odzwierciedlają poziomy białka w stanie ustalonym przez dłuższy czas bez rozróżniania między wpływami syntezy i degradacji 15-20. Możliwe jest wywnioskowanie udziału procesów degradacyjnych w poziomach białek w stanie stacjonarnym, porównując obfitość przed i po zahamowaniu określonych składników mechanizmu degradacji (np. poprzez farmakologiczną dezaktywację proteasomu 21 lub wyeliminowanie genu, co do którego przypuszczalnie wymagany jest do degradacji 13). Zmiana poziomu białek w stanie stacjonarnym po zahamowaniu szlaków degradacyjnych dostarcza mocnych dowodów na udział proteolizy w kontroli obfitości białek 13. Jednak taka analiza nadal nie dostarcza informacji na temat kinetyki obrotu białek. Pogoń za cykloheksymidem, a następnie western blotting przezwycięża te słabości, umożliwiając naukowcom wizualizację degradacji białek w czasie 22-24. Ponadto, ponieważ wykrywanie białek po pościgu cykloheksymidu jest zwykle wykonywane za pomocą western blot, izotopy promieniotwórcze i długie etapy immunoprecypitacji nie są wymagane do pościgu cykloheksymidu, w przeciwieństwie do wielu powszechnie stosowanych technik pościgu impulsowego, które są również wykonywane w celu wizualizacji degradacji białka25.
Cykloheksymid został po raz pierwszy zidentyfikowany jako związek o właściwościach przeciwgrzybiczych, wytwarzany przez bakterię Gram-dodatnią Streptomyces griseus 26,27. Jest to cząsteczka przepuszczalna dla komórek, która specyficznie hamuje eukariotyczną cytozolową (ale nie organellarną) translację poprzez upośledzenie translokacji rybosomalnej 28-31. W eksperymencie z pościgiem cykloheksymidu cykloheksymid jest dodawany do komórek, a porcje komórek są zbierane natychmiast i w określonych punktach czasowych po dodaniu związku 22. Komórki są poddawane lizie, a obfitość białka w każdym punkcie czasowym jest analizowana, zwykle za pomocą western blot. Zmniejszenie obfitości białka po dodaniu cykloheksymidu można z pewnością przypisać degradacji białek. Niestabilne białko będzie z czasem zmniejszać swoją liczebność, podczas gdy stosunkowo stabilne białko będzie wykazywać niewielkie zmiany w obfitości.
Mechanizmy selektywnej degradacji białek zostały bardzo zachowane w całej Eukarya. Wiele z tego, co wiemy o degradacji białek, po raz pierwszy poznano u modelowego jednokomórkowego eukarionta, Saccharomyces cerevisiae (pączkujące drożdże) 25,32-36. Badania z udziałem drożdży prawdopodobnie będą kontynuowane i dostarczą nowych i ważnych informacji na temat degradacji białek. Przedstawiono metodę pościgu cykloheksymidu w komórkach drożdży, a następnie analizę obfitości białek metodą western blot.

<table><tbody><tr><td>Pożądane szczepy drożdży, plazmidy, pożywka wzorcowa i składniki</td><td></td><td></td><td></td>buforowe</tr><tr><td>Jednorazowe probówki ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>Inkubator z regulacją temperatury (np. Inkubator Heratherm model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>Wymienny bęben New Brunswick do rur 18 mm (rolka rurowa)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Rolka rurowa jest zalecana do utrzymywania przez noc&nbsp; kultur starterowych komórek drożdży w zawiesinie. Alternatywnie, jeśli walec rurowy nie jest dostępny, do nocnych kultur starterowych można użyć wytrząsarki platformowej w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze. Wytrząsarka platformowa lub rolka rurowa mogą być używane do utrzymywania większych kultur w zawiesinie.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Bęben rolkowy 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Do użytku z rolką rurową</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektrofotometr</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>Wirówka 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&nbsp;</td><td>Wirnik sprzedawany z urządzeniem zawiera probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 i 2,0 ml. Rotor można wymienić na taki, który mieści probówki stożkowe o pojemności 15 i 50 ml</td></tr><tr><td>Rotor o stałym kącie nachylenia F-35-6-30 z pokrywą i adapterami do wirówki model 5430/R, probówki stożkowe 15/50 ml, 6-miejscowe</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15-ml rurka z sitodrukiem 17 x 20 mm stożkowa, polipropylenowa</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>1,5-ml flex-tube, Czyste, naturalne probówki do mikrowirówek do PCR</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Dostępne u różnych producentów</td></tr><tr><td>Analogowe grzałki do kąpieli Dri-Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Zaleca się, aby dostępne były dwie grzałki (jedna do inkubacji komórek podczas leczenia cykloheksymidem i jedna do gotowania lizatów w celu denaturacji białek). Alternatywnie, 30 &deg; Kąpiel wodna C może być stosowana do inkubacji komórek w obecności cykloheksymidu. Wrząca kąpiel wodna z gorącą płytą może być naprzemiennie stosowana do denaturacji białek.</td></tr><tr><td>Blok grzewczy do probówek stożkowych 12 x 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>Do stosowania z grzałką Dri-Bath podczas inkubacji komórek w obecności cykloheksymidu.</td></tr><tr><td>Blok grzewczy do probówek stożkowych 20 x 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>Do użytku z podgrzewaczem Dri-Bath do gotowania lizatów w celu denaturacji białek.</td></tr><tr><td>Aparatura do uruchamiania i przenoszenia SDS-PAGE, zasilacze i sprzęt do obrazowania lub ciemnie dla SDS-PAGE i transferu na membranę</td><td></td><td></td><td>Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania</td></tr><tr><td>System obrazowania Western blot (np. Skaner Li-Cor Odyssey CLx i oprogramowanie Image Studio)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania</td></tr><tr><td>Membrany transferowe EMD Millipore Immobilon PVDF</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe (np. Kinaza fosfoglicerynianowa (Pgk1) Przeciwciało monoklonalne, mysz (klon 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Będzie się różnić w zależności od laboratorium i aplikacji</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe (np. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania</td></tr></tbody></table>

analiza cycloheximide chase degradacji białek u saccharomyces cerevisiae

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulacja obfitości białka jest kluczowa dla praktycznie każdego procesu komórkowego. Obfitość białek odzwierciedla integrację szybkości syntezy białek i degradacji białek. Wiele testów opisujących obfitość białek (np. jednorazowy western blotting w punkcie czasowym, cytometria przepływowa, mikroskopia fluorescencyjna lub testy reporterowe oparte na wzroście) nie pozwala na rozróżnienie względnego wpływu translacji i proteolizy na poziomy białka. W artykule opisano zastosowanie cykloheksymidu, a następnie western blot, w celu specyficznej analizy degradacji białek w modelowym jednokomórkowym eukarioncie, Saccharomyces cerevisiae (drożdże pączkujące). W tej procedurze komórki drożdży są inkubowane w obecności inhibitora translacji cykloheksymidu. Podwielokrotności komórek pobiera się natychmiast po dodaniu cykloheksymidu i w określonych punktach czasowych po jego dodaniu. Komórki są poddawane lizie, a lizaty są rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w celu analizy obfitości białka western blot w każdym punkcie czasowym. Procedura pościgu cykloheksymidu pozwala na wizualizację kinetyki degradacji populacji w stanie stacjonarnym różnych białek komórkowych. Procedura ta może być wykorzystana do zbadania wymagań genetycznych i wpływów środowiska na degradację białek.

Aby zilustrować metodologię śledzenia z użyciem cykloheksymidu, przeanalizowano stabilność Deg1-Sec62 (Rysunek 1), modelowego substratu degradacji związanej z retikulum endoplazmatycznym (ERAD) u drożdży 42-44. W procesie ERAD enzymy ubikwitynoligazy kontroli jakości kowalencyjnie przyłączają łańcuchy małego białka ubikwityny do aberrantnych białek zlokalizowanych w błonie ER. Takie białka poliubikwitynowane są następnie usuwane z ER i degradowane prze...

Obfitość białek odzwierciedla tempo zarówno syntezy białek, jak i ich degradacji. W artykule opisano zastosowanie cykloheksymidu, po którym następuje western blot, do analizy degradacji białek w modelowym jednokomórkowym eukarioncie, Saccharomyces cerevisiae (drożdże pączkujące).

Analiza Cycloheximide Chase degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja degradacji populacji białka w stanie stacjonarnym w organizmie Saccharomyces cerevisiae. Metodę tę można wykorzystać do określenia wymagań genetycznych oraz wpływu czynników środowiskowych na degradację badanego białka. Główną zaletą tej techniki jest brak konieczności stosowania izotopów promieniotwórczych i czasochłonnych etapów immunoprecypitacji, w przeciwieństwie do technik pulse-chase, które są również wykorzystywane do wizualizacji degradacji białek.Niniejszą procedurę można wykorzystać do analizy białka endogennego drożdży lub białka ekspresowanego z plazmidu. W tym drugim przypadku szczep drożdży jest transformowany plazmidem kodującym interesujące białko zgodnie ze standardowym protokołem transformacji drożdży. Zaszczep drożdże w pięciu mililitrach odpowiedniego medium.Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C przy jednoczesnym obracaniu. Następnego dnia rano zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach, czyli OD600, dla każdej kultury nocnej. Rozcieńczyć kultury do poziomu OD600 wynoszącego 0,2 w 15 ml świeżej pożywki.Inkubować w temperaturze 30 °C wstrząsając do momentu, aż komórki osiągną średnią fazę wzrostu logarytmicznego. Podczas wzrostu komórek drożdży należy przygotować procedurę śledzenia z użyciem cykloheksymidu. Ustawić blok grzejny mieszczący probówki stożkowe o pojemności 15 ml na temperaturę 30 °C w celu inkubacji komórek w obecności cykloheksymidu.Aby zapewnić efektywny rozkład ciepła w kulturach, należy dolać wodę do każdego otworu bloku grzejnego w taki sposób, aby po włożeniu stożkowej probówki o pojemności 15 ml poziom wody podniósł się do krawędzi otworu, ale nie doprowadził do jego przelania. Drugi blok grzejny, przystosowany do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml, należy ustawić na 95 °C w celu denaturacji białek po lizie komórek. Świeżą pożywkę wzrostową należy uprzednio ogrzać do 30 °C.Na każdy punkt czasowy dla każdej hodowli poddawanej analizie potrzeba 1,1 ml medium. Do wcześniej oznakowanych probówek do mikrocentryfugi należy dodać 50 µl 20x Stop Mix. Przygotuj jedną probówkę na każdy punkt czasowy dla każdej hodowli poddawanej analizie.Umieść probówki w lodzie. Gdy komórki drożdży osiągną fazę średnio-logarytmicznego wzrostu, pobierz 2,5 jednostek OD600 z każdej kultury dla każdego punktu czasowego przeznaczonego do analizy. Jedna jednostka OD600 odpowiada ilości drożdży obecnej w jednym mililitrze kultury przy OD600 równym 1,0.Odwiruj zebrane komórki w 15 mililitrowych probówkach stożkowych przy 3 000 ×g w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Usuń nadsącz. Ponownie zawieś każdy osad komórkowy w jednym mililitrze świeżej pożywki wzrostowej o temperaturze 30 °C na każde 2,5 jednostek OD600 komórek.Przed rozpoczęciem eksperymentu typu cycloheximide chase, należy wyrównać temperaturę zawiesin komórek drożdży poprzez inkubację w bloku grzewczym o temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć minut. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest precyzyjne zaplanowanie czasu dodania cykloheksymidu oraz poboru komórek dla każdej próbki. Aby zapewnić sukces, opracowujemy i ściśle przestrzegamy harmonogramu dodawania cykloheksymidu i zbierania komórek.Aby rozpocząć analizę kinetyki degradacji (cycloheximide chase), naciśnij przycisk „Start” na stoperze. Szybko, lecz ostrożnie dodaj cykloheksymid do pierwszej zawiesiny komórek drożdży do stężenia końcowego 250 µg/mL, a następnie krótko wymieszaj na wirówce typu vortex. Natychmiast przenieś 950 µL (około 2,4 jednostek OD600) zawiesiny komórek drożdży z dodanym cykloheksymidem do uprzednio oznakowanej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 50 µL lodowatego 20x Stop Mix.Wymieszaj probówkę do mikrowirówki na wirówce typu vortex i pozostaw na lodzie do czasu zebrania wszystkich próbek. Rozpocznij proces wypłukiwania cykloheksymidą (cycloheximide chase) dla każdej z pozostałych zawiesin komórek drożdży w regularnych odstępach czasu, zgodnie z demonstracją. W każdym kolejnym punkcie czasowym wymieszaj zawiesiny komórek drożdży na vortexie i przenieś 950 microliters do oznakowanych probówek do mikrowirówki zawierających 50 microliters schłodzonego 20x Stop Mix.Wymieszać w wirówce wortexowej i umieścić zebrane komórki na lodzie. Aby zapobiec osiadaniu komórek drożdży, należy mieszać zawiesiny komórkowe w 15 ml probówkach stożkowych w wirówce wortexowej w przybliżeniu co pięć minut przez cały czas trwania etapu śledzenia (chase). Po zebraniu wszystkich próbek, osadzić komórki poprzez wirowanie przy 6 500 ×g w temperaturze pokojowej przez 30 sekund.Usunąć nadsącz za pomocą pipety lub aspiracji. Komórki są teraz gotowe do lizy alkalicznej. Przygotować komórki do lizy alkalicznej, dodając 100 µL wody destylowanej do każdego osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić poprzez pipetowanie w górę i w dół.Do każdej próbki należy dodać 100 µL 0,2 M wodorotlenku sodu. Wymieszać za pomocą wortexa. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Na tym etapie komórki drożdży nie zostały poddane lizie, a białka nie zostały uwolnione. Następnie należy ocenić komórki poprzez wirowanie przy 18,000 ×g w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Nadpływ należy usunąć za pomocą pipety lub aspiracji.Aby zlizować komórki, należy dodać 100 µL buforu do próbek Laemmli do każdego osadu komórkowego. Ponownie zawiesić próbki, pipetując w górę i w dół. Inkubować w temperaturze 95 °C przez pięć minut, aby całkowicie zdenaturować białka.Odwiruj lizaty przy 18 000 ×g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę, aby wytrącić materiał nierozpuszczalny. Nadsącz, stanowiący rozpuszczone białko wyekstrahowane, jest gotowy do rozdziału metodą SDS PAGE i późniejszej analizy Western blot. Alternatywnie lizaty można przechowywać w temperaturze -20 °C.Stabilność Deg1-Sec62, modelowego substratu degradacji stowarzyszonej z retikulum endoplazmatycznym u drożdży, przeanalizowano metodą chase z cykloheksymidą. Białko Deg1-Sec62 w elektroforezie SDS-PAGE migruje jako wiele form i ulega szybkiej degradacji w komórkach typu dzikiego. Pgk1 służy jako kontrola załadunku, której poziom nie ulega zmianie w badanych warunkach.Utrata rezydentnej w ER ligazy ubikwityny hrd1 lub enzymu konjugującego ubikwitynę ubc7 doprowadziła do znacznej stabilizacji białka Deg1-Sec62, co potwierdza wcześniej zaobserwowaną rolę tych białek w degradacji Deg1-Sec62. Cue1 jest białkiem transbłonowym, które zakotwicza ubc7 w błonie ER i aktywuje ten enzym, jednak zapotrzebowanie na cue1 w procesie degradacji Deg1-Sec62 nie było bezpośrednio badane. Obserwacja z niniejszego badania, według której Deg1-Sec62 uległ stabilizacji w przypadku braku cue1, potwierdziła rolę cue1 w degradacji Deg1-Sec62 związanej z ER.Wynik analizy Western blot został poddany kwantyfikacji przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Aby porównać obfitość białka Deg1-Sec62 w poszczególnych próbkach, dla każdej z nich wyznaczono stosunek skorygowanych intensywności sygnału Deg1-Sec62 do Pgk1. Należy pamiętać, że procedura ta w sposób najbardziej bezpośredni informuje o kinetyce degradacji populacji białka zainteresowania w stanie stacjonarnym.Aby zwizualizować degradację nowo powstałej populacji badanego białka, można zastosować inne techniki, takie jak eksperymenty typu pulse-chase. Należy pamiętać, że cykloheksymida i azotek sodu są niezwykle toksyczne, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować ostrożność, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z tymi odczynnikami.

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje test degradacji dla nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą leczenia cykloheksymidem wraz z frakcjonowaniem detergentem. Metoda ta pomaga w badaniu dynamiki nieprawidłowo sfałdowanych białek i odkrywaniu dogłębnych mechanizmów obrotu białkami.

Test degradacji białek podatnych na nieprawidłowe fałdowanie: technika monitorowania nieprawidłowo sfałdowanej degradacji białek przy użyciu obróbki cykloheksymidem i frakcjonowania detergentem

Ten film opisuje test mikropłytek in vitro oparty na fluorescencji w celu zbadania kinetyki degradacji znakowanego fluorescencyjnie, nieprawidłowo sfałdowanego zmutowanego białka lucyferazy, ulegającego ekspresji w jądrach transfekowanych komórek ssaków. Test polega na traktowaniu komórek eksprymujących zmutowane białko fluorescencyjne za pomocą inhibitora translacji i inhibitora proteasomu w celu oceny degradacji nieprawidłowo sfałdowanego białka za pośrednictwem proteasomu.

Test pościgowy cykloheksymidu oparty na mikropłytkach fluorescencyjnych: technika monitorowania kinetyki degradacji fluorescencyjnych nieprawidłowo sfałdowanych białek jądrowych

Tutaj opisujemy solidny test biologiczny do ilościowego określania względnego tempa proteolizy przez układ ubikwityna-proteasom. Odczyt testu to tempo wzrostu drożdży w płynnej kulturze, które zależy od poziomów komórkowych białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji połączonego z niezbędnym markerem metabolicznym.

Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego i specyficznego usuwania interesującego białka w drożdżach Saccharomyces cerevisiae za pomocą systemu AID β-est.

Dostrajanie degradacji w celu osiągnięcia specyficznego i wydajnego zubożenia białek

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę cycloheximide chase do analizy degradacji białek w Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem western blottingu. Technika ta pozwala badać stabilność białek bez izotopów promieniotwórczych.

Analiza Cycloheximide Chase degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów