Name: Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Naucz się izolacji mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych w celu badań kardiologicznych. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność i czystość komórek, wspierając zaawansowane eksperymenty molekularne i obrazowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z National Institutes of Health (HL115578 dla A. Makino).

Badania na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Arizony i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH).
UWAGA: Sekcje 1, 2 i 3 należy wykonać dzień przed eksperymentem jako przygotowanie.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Bufor CD31 (50 ml)
	<ol>
		<li>Dodać 50 ml 1× roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) do probówki o pojemności 50 ml. Odważyć 0,05 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,037 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i dodać do probówki o pojemności 50 ml i obracać probówką przez około 1 godzinę, aż proszek się rozpuści. Doprowadzić pH do 7,4, przefiltrować przez filtr 0,2 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) z HEPES (500 ml)
	<ol>
		<li>Dodaj 1,1915 g HEPES, aby uzyskać 10 mM HEPES w roztworze HBSS i dobrze wymieszaj. Zmierzyć pH i dostosować do 7,4. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1x roztwór Kreba (1 L)
	<ol>
		<li>Dodać 100 ml 10× roztworu Kreba [Tabela 1] do podwójnie destylowanej wody w kolbie o pojemności 1 l. Odważyć 2,1 g wodorowęglanu sodu i 2 g D-glukozy i dodać do kolby. Wymieszaj i dostosuj całkowitą objętość do 1 l.</li>
		<li>Roztwór bąbelkowy z 95% gazem O2/5% CO2 przez 30 minut i roztwór filtrujący wewnątrz okapu. Przechowywać w temperaturze 4 °C i przechowywać na lodzie podczas eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie koralików magnetycznych
<ol>
	<li>Dodać 1 ml buforu CD31 do każdej probówki o pojemności 1,5 ml (jedna probówka na próbkę). Wymieszać owcze kulki IgG przeciw szczurom i dodać odpowiednią ilość do każdej próbki [Tabela 1]. Wstrząśnij energicznie probówkami 30 razy i umieść je w płycie magnetycznej na 1 minutę wstrząsania. Otwórz probówki na talerzu i wrzuć roztwory do wiadra.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu CD31 do każdej probówki. Dodać 2 μl szczurzego przeciwciała anty-mysiego CD31 do każdej probówki i obrócić probówki O/N w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Autoklawowanie 
<ol>
	<li>Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i końcówki do pipet. Odetnij końce końcówek pipet tak, aby były końcówki o 4 różnych średnicach, od najszerszej do najwęższej. Przybliżone średnice końcówek to odpowiednio 3 mm, 2,5 mm, 2 mm i 1,5 mm. Odetnij końcówki i przeprowadź autoklaw dzień wcześniej z 30 minutową sterylizacją w temperaturze 121 ºC. 
	UWAGA: Sekcje 4 - 11 należy wykonać w dniu eksperymentu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować bufor do przemywania zawierający 2% surowicy cielęcej wzbogaconej żelazem (IFCS) w M199. Do obrazowania przygotuj 30 ml/mysz.</li>
	<li>Przygotować roztwór enzymatyczny (10 ml na próbkę). Odważyć 0,6 jednostki/ml leku Dispaza i 1 mg/ml kolagenazy typu II do probówki o pojemności 50 ml. Dodać M199 i obracać probówkę w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przefiltrować przez filtr 0,2 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml wewnątrz okapu i utrzymywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować HBSS/HEPES z heparyną. Dodać 10 ml HBSS z 10 mM HEPES do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 100 μl heparyny do probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
5. Mycie koralików
<ol>
	<li>Wyjąć rurki z koralikami z rotatora w temperaturze 4 ºC i przynieść, do okapu. Umieść probówki w płytce magnetycznej i potrząsaj przez 1 minutę. Zrzucić roztwór i dodać 1 ml buforu CD31 do każdej probówki.</li>
	<li>Wyjmij probówki z płytki magnetycznej i energicznie wstrząśnij 30 razy. Włóż probówki z powrotem do płytki magnetycznej i powtórz w sumie 3 prania. Po zakończeniu włóż probówki z powrotem do 4°C i obracaj je aż do użycia.</li>
</ol>
6. Sekcja
<ol>
	<li>Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 0,1 ml heparyny, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Odczekaj 10 minut, a następnie znieczul myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 0,01 ml pentobarbitalu. Sprawdź, czy mysz odczuwa ból, ściskając stopę.</li>
	<li>Umieść mysz na styropianowej płycie głową do góry i przytrzymaj ramiona za szpilki. Użyj kleszczy i twardych nożyczek, aby przeciąć skórę w górnej części klatki piersiowej aż do gardła.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie na środku klatki piersiowej tuż nad przeponą. Przetnij kość na boki i w górę w kierunku gardła, aby utworzyć trójkąt odsłaniający serce i płuca. Przetnij aortę tuż nad przeponą.</li>
	<li>Trzymaj grasicę kleszczami bez ciągnięcia i użyj nożyczek, aby ostrożnie przeciąć tkankę łączną, aby usunąć płuca i serce razem. Umieść chusteczki w zlewce z 1× Kreba, wstrząśnij kleszkami i przenieś do 6 cm naczynia z 1× Kreba.</li>
	<li>Usuń płaty płuc za pomocą nożyczek i kleszczy. Wprowadzić sterylny cewnik o wadze 20 G do aorty. Przepłukać krew w układzie krążenia wieńcowego za pomocą HBSS/heparyny. Wykonaj małe nacięcie w komorze, potrząśnij sercem i przenieś do probówki z próbką M199. Trzymaj probówki na lodzie.</li>
</ol>
7. Trawienie tkankowe
<ol>
	<li>Przełóż serce do 6 cm naczynia wypełnionego 10 ml roztworu enzymu i zmiel je na małe kawałki za pomocą nożyczek. Umieścić naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 ºC na 15 minut. Mieszaj strawione materiały, pipetując w górę i w dół 30 razy przez końcówkę z odciętym końcem, aby umożliwić łatwiejsze przejście tkanki.</li>
	<li>Umieścić go z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 ºC na kolejne 15 minut. Powtórzyć mieszanie trzy razy, za każdym razem używając końcówek pipet od największych otworów do najwęższych i 15 minut inkubacji między nimi.</li>
	<li>Po ostatnich 15 minutach inkubacji wyjąć próbki i umieścić je w kapturze. Odpipetować roztwór 30 razy w górę i w dół za pomocą końcówki pipety z najwęższym otworem i przepuścić przez sitko o wielkości 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyć naczynie 10 ml buforem do płukania za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść na sitko do komórek. Umieścić probówki o pojemności 50 ml w wirówce i wirować z prędkością 400 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
8. Mycie i koniugacja za pomocą koralików
<ol>
	<li>Usunąć supernatant bez naruszania osadu. Dwukrotnie przemyć komórki 5 ml buforu do mycia.</li>
	<li>Weź jedną z wcześniej przygotowanych tubek o pojemności 1,5 ml z koralikami i pracuj nad jedną tubką na raz. Umieść jedną tubkę o pojemności 1,5 ml w płytce magnetycznej, wstrząśnij 3 razy i otwórz.</li>
	<li>Po ostatnim wirowaniu usuń jak najwięcej supernatantu, nie przerywając osadu. Odłącz grudki komórek, energicznie przesuwając.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do przemywania do probówki o pojemności 50 ml i wymieszać komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Wylej roztwór z probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 1 ml zawiesiny komórek z probówki o pojemności 50 ml do kulek. Przesuń probówki 30 razy, a następnie obracaj w temperaturze 4 ºC przez 30 minut.</li>
</ol>
9. Przygotowanie do hodowli komórkowej/obrazowania
<ol>
	<li>Przygotuj komory do posiewania komórek. Dodać roztwór żelatyny (5% m/v, 300 μl) do studzienki komory, aby pokryć powierzchnię i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji usuń żelatynę i osusz powierzchnię.</li>
	<li>Po 30 minutach obrotu wyjmij rurki z koralikami/komórkami i włóż płytkę magnetyczną do wnętrza okapu. Wstrząsać przez 2 minuty, wysypać i dodać 1 ml buforu do mycia.</li>
	<li>Wyjmij rurki z talerza, energicznie wstrząśnij 30 razy, a następnie przesuń 30 razy. Włóż je z powrotem do płytki magnetycznej i potrząsaj przez 1 minutę. Powtórz 4 razy, w sumie 5 prań, ale z 1 minutą potrząsania talerzem.</li>
	<li>Po ostatnim praniu wyjmij jedną tubkę i pracuj nad każdą tubką pojedynczo. Potrząśnij 30 razy, a następnie przesuń 30 razy. Połóż go na płycie magnetycznej i potrząsaj przez 1 minutę. Wylać i dodać 1 ml 20% pożywki IFCS EC (wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 ºC).</li>
	<li>Wstrząśnij energicznie 30 razy, a następnie przesuń 30 razy. Ustawić pipetę na 500 μl i pipetować w górę i w dół 10 razy. Przenieś 500 μl do każdej komory.</li>
	<li>Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 ºC i pozostawić O/N. Następnego dnia umyj komórki 10% pożywką FBS EC.</li>
</ol>
10. Przygotowanie do próbek Western Blot (WB)
<ol>
	<li>Wyjmij probówki z koralikami/komórkami po 1 godzinie obrotu. Umieść je w płytce magnetycznej i potrząsaj przez 2 minuty. Zrzuć supernatant i dodaj 1 ml zimnego HBSS. Wstrząśnij energicznie 30 razy, a następnie przesuń 30 razy. Powtórz dwa razy przez 3 prania, ale z 1 minutą potrząsania talerzem.</li>
	<li>Po ostatnim przemyciu umieścić probówki na płytce magnetycznej i wstrząsać przez 1 min. Usunąć bufor za pomocą pipety i zdać komórki na WB metodą opisaną wcześniejw punkcie 11,12. Zebrany lizat zawiera zwykle około 30 μg białka.</li>
</ol>
11. Obrazowanie
<ol>
	<li>Umyć komórki 3 razy pożywką, o końcowej objętości 250 μl na komorę. Dodaj 1,5 μl Dil-acLDL do komórek. Od tego momentu utrzymuj komórki w ciemności.</li>
	<li>Inkubować przez 3,5 godziny w temperaturze 37 °C. Dodać 1,5 μl Hoechst, dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć komórki PBS i utrwalić 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć dwukrotnie PBS i zablokować 5% BSA-PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyć dwukrotnie 1% BSA-PBS. Rozcieńczyć BS-lectin-FITC za pomocą 1% BSA-PBS do stężenia 2 μg/ml i dodać 300 μl do każdej komory.</li>
	<li>Umieść komorę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze RT na 30 minut. Przemyj PBS 3 razy.</li>
	<li>Wizualizacja komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym z czasem ekspozycji 200 ms dla FITC (barwienie lektyny, marker EC, wzbudzenie/emisja 488 nm/519 nm), 30 ms dla DAPI (Hoechst, barwienie jądrowe, wzbudzenie/emisja przy 358 nm/461 nm) i 300 ms dla TRITC (barwienie acLDL, marker EC, wzbudzenie/emisja przy 557 nm/576 nm). Rób zdjęcia za pomocą obiektywu 20x.</li>
</ol>

<ol><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li>
<li>Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+focus%3A+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells in focus: endothelial cell.</a> Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li>
<li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%3A+testing+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115, 1285-1295 (2007).</li>
<li>Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+vascular+endothelial+cells+from+murine+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung.</a> Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).</li>
<li>Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+connexin40+is+associated+with+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev Cell. 26, 204-219 (2013).</li>
<li>Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+pulmonary+endothelial+cells+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAcase+overexpression+reverses+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+type+1+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).</li>
<li>Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC%3A+old+protein+with+new+roles+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">VDAC: old protein with new roles in diabetes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najczęściej stosowanymi komórkami śródbłonka w badaniach są ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) ze względu na ich wygodę i łatwość hodowli. Jednak wiele badań wymaga dostępności modelu fizjologicznego uzyskanego poprzez izolację komórek śródbłonka z innych określonych narządów10. Komórki śródbłonka stanowią bardzo niewielką populację komórek w tkance serca; Ich izolacja i hodowla mogą okazać się bardzo trudne.
W ramach tego protokołu istnieją trzy kluczowe kroki. Pie...

Mysie modele różnych chorób sercowo-naczyniowych i zaburzeń metabolicznych wykazują zmiany fizjologiczne i molekularne, które są podobne do tych, które występują u pacjentów. Co więcej, zmiany genetyczne myszy są potężnym narzędziem, które pozwala nam badać patogenną rolę określonych genów w rozwoju i postępie chorób. W dzisiejszych czasach myszy z genami specyficznymi dla typu komórkowego są łatwo generowane w wielu laboratoriach, a pomiar poziomów mRNA i białek w określonych typach komórek jest pierwszym krokiem do ustalenia, czy myszy były naprawdę zmodyfikowane genetycznie.
Śródbłonek to cienka pojedyncza warstwa komórek śródbłonka (EC), która wyściela wewnętrzną ścianę naczyń krwionośnych. Komórki śródbłonka odgrywają kluczową rolę w regulacji napięcia naczyniowego, przepuszczalności naczyń krwionośnych i tworzenia nowych naczyńkrwionośnych 1,2. Dysfunkcja śródbłonka jest cechą charakterystyczną wielu stanów patologicznych, a zmiany w funkcji śródbłonka mogą prowadzić do różnych chorób sercowo-naczyniowych3,4. W związku z tym istotne jest badanie funkcji komórek śródbłonka w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.
Istnieje kilka sposobów na izolację EC5-8 i metoda izolacji musi być zoptymalizowana w zależności od tego, jakie tkanki i gatunki zostaną użyte. Dzieje się tak, ponieważ EC z różnych tkanek wykazują wysoki poziom niejednorodności w odniesieniu do ich markerów powierzchniowych i ekspresji białek9. Skuteczna izolacja komórek śródbłonka może być często trudna i wymaga pewnego stopnia szkolenia i praktyki. Po osiągnięciu tego celu metoda izolacji zaproponowana w tym protokole okazuje się stabilna i skuteczna.
Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie mysich wieńcowych EC (MCEC) o wysokiej jakości i ilości. Mimo że ilość komórek pobranych z serca jest mniejsza niż komórek pobranych z innych tkanek przy użyciu innych technik, technika ta nadal zapewnia lepszą jakość. Czystość komórek śródbłonka w powstałej populacji jest większa niż 90%. Dlatego technika ta byłaby idealna do zastosowań, które opierają się na czysto izolowanych komórkach śródbłonka, takich jak obrazowanie komórek.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td></td><td>Sigma A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads pan mysz Koraliki IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało przeciw myszom CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (neutralna proteaza)</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ml</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8340-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-Valine</td><td>Sigma</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>Corning</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Komórki śródbłonka wyściełają wewnętrzną ścianę naczyń krwionośnych i odgrywają ważną rolę w regulacji napięcia naczyniowego, przepuszczalności naczyń krwionośnych i tworzenia nowych naczyń. Dysfunkcja komórek śródbłonka jest zaangażowana w rozwój i progresję wielu chorób sercowo-naczyniowych, w tym choroby niedokrwiennej serca. Aby zbadać funkcję i charakterystykę komórek śródbłonka naczyń wieńcowych, pierwszym krokiem jest izolacja komórek, która wymaga wysokiej czystości i ilości do przeprowadzenia kolejnych eksperymentów. Protokół ten opisuje skuteczną metodę izolowania dorosłych komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy. Serce myszy jest preparowane i mielone na małe kawałki. Po wytrawieniu serca za pomocą dypazy i kolagenazy II, komórki są myte i inkubowane za pomocą kulek magnetycznych, które są sprzężone z przeciwciałem anty-CD31. Koraliki z komórkami śródbłonka są kilkakrotnie myte i są gotowe do użycia w różnych zastosowaniach, w tym w obrazowaniu i eksperymentach biologii molekularnej. Wydajna izolacja daje około 104 komórek na jedno serce o czystości ponad 90%.

Pomyślna izolacja komórek śródbłonka wieńcowego z serca myszy zazwyczaj pozwala na uzyskanie około 104 komórek o czystości powyżej 90% i charakterystycznym brukowym kształcie. W celu uzyskania czystej populacji komórek śródbłonka, na każdym etapie protokołu należy zachować ostrożność, aby zapewnić środowisko sterylne i wolne od zanieczyszczeń. Pojawienie się w populacji komórek wydłużonych lub powiększonych wskazuje na zanieczyszczenie innymi typami komórek, takimi jak komórki ...

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest uzyskanie dużej liczby wysoko oczyszczonych, wysokiej jakości komórek śródbłonka tętnic wieńcowych myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych. Główną zaletą tej techniki jest ułatwienie uzyskania wysokiej wydajności dobrej jakości komórek śródbłonka.Procedurę tę zademonstrują Shizhen Luo, specjalista ds. badań, oraz dr Ayako Makino, nasz główny badacz. Do jednego tygodnia przed rozpoczęciem procedury należy dodać 1 mL buforu CD31 do jednej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL dla każdej próbki. Następnie, mieszając delikatnie pipetą, należy wymieszać kulki anty-IgG owcze i dodać odpowiednią objętość kulek do każdej probówki.Po dodaniu wszystkich kulek energicznie potrząśnij probówkami 30 razy, a następnie umieść je na płycie magnetycznej i wytrząsaj przez jedną minutę. Następnie, nie zdejmując probówek z płyty, odlej bufor i dodaj do każdej probówki 1 mL świeżego buforu CD31. Dodaj 2 µL znakowanego przeciwciała anty-mysie CD31 i pozostaw probówki na rotatorze w temperaturze 4 °C przez noc.Następnego dnia przenieść probówki do komory z laminarnym przepływem powietrza i umieścić je ponownie na płycie magnetycznej, wytrząsając przez jedną minutę. Następnie zastąpić nadsącz jednym mililitrem świeżego buforu CD31 i energicznie potrząsnąć probówkami ręcznie 30 razy. Po trzecim przemyciu zwrócić probówki do rotatora w temperaturze czterech stopni Celsius.W dniu zabiegu należy rozpocząć od podania zwierzęciu doświadczalnemu dożylnie 0,1 ml heparyny w celu zapobiegania krzepnięciu krwi. Po dziesięciu minutach uśpić mysz, wstrzykując 0,01 ml pentobarbitalu. Następnie należy potwierdzić brak reakcji na uciśnięcie palca.Po wspólnym usunięciu serca i tkanki płucnej, należy umieścić je w zlewce z buforem Krebsa i wypłukać tkanki, delikatnie potrząsając naczyniem. Następnie przenieść tkanki do szalki o średnicy sześciu centymetrów zawierającej świeży bufor Krebsa i za pomocą nożyczek oraz pęsety usunąć płaty płuc. Teraz wprowadzić cewnik 20G do aorty i przepłukać układ krążenia wieńcowego roztworem HBSS uzupełnionym o heparynę.Po usunięciu całej krwi należy wykonać niewielkie nacięcie w komorze, wypłukać serce, delikatnie nim potrząsając, a następnie umieścić tkankę serca w probówce z próbką na lodzie. Po strawieniu tkanki w celu uwolnienia komórek śródbłonka tętnic wieńcowych, należy odwirować i przemyć komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami buforu do mycia. Następnie probówkę z wcześniej przygotowanymi kulkami należy umieścić na płytce magnetycznej i potrząsnąć nią trzy razy, aby równomiernie rozprowadzić kulki.Po drugim przemyciu usunąć jak największą ilość supernatantu, nie naruszając osadu, a następnie rozbić grudki komórek poprzez energiczne potrząsanie probówką. Następnie resuspender komórki w jednym mililitrze buforu do przemywania, delikatnie mieszając, i usunąć bufor CD31 z kulek. Połączyć komórki z kulkami i potrząsnąć probówką 30 razy.Następnie umieść komórki i roztwór kulek w rotatorze w temperaturze 4°C przez 30 minut. Podczas inkubacji komórek pokryj powierzchnię jednej dołka komory wysiewczej na każdą próbkę roztworem żelatyny, a następnie pozostaw komory w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po zestaleniu się żelatyny usuń nadmiar roztworu żelu i osusz powierzchnię dołka komory.Następnie przenieś komórki sprzężone z kuleczkami na płytkę magnetyczną pod wyciągiem i inkubuj przez dwie minuty przy potrząsaniu, po czym odlej bufor płuczący. Dodaj jeden mililitr świeżego buforu płuczącego do komórek, zdejmij probówkę z płytki i energicznie potrząśnij nią 30 razy, a następnie 30 razy szybkim ruchem nadgarstka. Ponownie umieść probówkę na płytce i potrząsaj przez kolejną minutę.Po ostatnim mieszaniu należy ponownie umieścić probówkę na płycie magnetycznej na ostatnią minutę wstrząsania, a następnie zastąpić bufor do mycia jednym mililitrem pożywki dla komórek śródbłonka o temperaturze 37 °C, uzupełnionej o 20% serum cielęce wzbogacone żelazem. Probówki należy wstrząsnąć i potrząsnąć ostatnie 30 razy. Następnie, używając pipety o objętości jednego mililitra ustawionej na 500 µL, należy dziesięciokrotnie wymieszać koniugowane komórki, a następnie przenieść alikwoty 500 µL komórek śródbłonka tętnic wieńcowych do każdego dołka komory wysiewowej w celu inkubacji nocnej w temperaturze 37 °C.Następnego dnia komórki należy przemyć pożywką do komórek śródbłonka, uzupełnioną o 10% FBS. Czystość komórek śródbłonka wieńcowego wyizolowanych tą metodą można potwierdzić poprzez barwienie immunohistochemiczne przeciwko markerom powierzchniowym komórek śródbłonka, lektynie BS i AC LDL; w typowej hodowli komórek śródbłonka wieńcowego myszy ponad 90% komórek wykazuje podwójną pozytywną ekspresję obu markerów. Po zastosowaniu tej procedury, jako metody, można przeprowadzić różnorodne analizy krwi, immunoreceptoryczne oraz obrazowanie fluorescencyjne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, które białko może ulegać modyfikacjom w różnych stanach chorobowych.Po opracowaniu technika ta dostarcza narzędzi niezbędnych badaczom do rozszerzenia ich prac w obszarze komórek śródbłonka tętnic wieńcowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak wyizolować komórki śródbłonka tętnic wieńcowych myszy o wysokiej ilości i jakości. W trakcie tej procedury istnieje kilka kluczowych punktów.Najważniejszym elementem jest zachowanie sterylnych warunków przez cały proces izolacji. Po drugie, należy całkowicie i jak najszybciej wypłukać krew, aby uniknąć krzepnięcia krwi w sieci naczyń kapilarnych. Po trzecie, należy zmierzyć pH wszystkich buforów, w szczególności buforu CD31.

isolation-of-mouse-coronary-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Naucz się izolacji mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych w celu badań kardiologicznych. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność i czystość komórek, wspierając zaawansowane eksperymenty molekularne i obrazowanie.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Przeglądaj więcej filmów