Sekwencyjne zastosowanie szkiełek nakrywkowych do oceny sztywności na ściskanie soczewki myszy: odkształcenia i analizy morfometryczne

Ogólnym celem tej procedury jest ocena sztywności ściskającej i geometrii soczewek myszy przy użyciu prostego i niedrogiego podejścia. Ta metoda może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie soczewek. Na przykład, jak różne zaburzenia genetyczne i eksperymentalne wpływają na właściwości biomechaniczne soczewek.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest precyzyjna, powtarzalna i nie wymaga drogiego ani specjalistycznego sprzętu. Metoda ta zapewnia wgląd we właściwości soczewek myszy, z potencjalnym zastosowaniem do większych organizmów modelowych, takich jak szczury i króliki. Wizualizacja metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy preparowania soczewek i nakładania szkiełek nakrywkowych są trudne do nauczenia się bez demonstracji.

Procedurę zademonstruje Catherine Cheng, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Rozpocznij sekcję za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby wcisnąć tkankę wokół oka myszy poddanej eutanazji, wyjmując oko z oczodołu. Następnie usuń oko i umieść je w naczyniu separacyjnym zawierającym świeży PBS pod mikroskopem preparacyjnym

Odetnij nerw wzrokowy jak najbliżej gałki ocznej. I delikatnie i ostrożnie włóż cienką, prostą pęsetę do gałki ocznej przez otwór, w którym nerw wzrokowy wychodzi z tylnej części narządu. Ostrożnie wykonaj nacięcie nożyczkami od tyłu do krawędzi rogówki, uważając, aby nie uszkodzić soczewki.

Kontynuuj nacięcie wzdłuż połączenia rogówki i twardówki, co najmniej w połowie długości wokół gałki ocznej. I delikatnie naciśnij rogówkę, aby wyjąć soczewkę z oka przez otwór. Następnie użyj prostych kleszczyków z cienką końcówką, aby ostrożnie usunąć wszelkie duże zanieczyszczenia, które są nadal przymocowane do obiektywu.

I wizualnie potwierdź, że obiektyw jest wolny od uszkodzeń. Co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem pomiarów sztywności należy za pomocą wagi analitycznej zważyć co najmniej 10 szkiełek nakrywkowych z tego samego pudełka. Określ średnią wagę szkiełek nakrywkowych.

Następnie wstępnie zwilż szkiełka okładki i lustro pod kątem prostym w PBS o temperaturze pokojowej. Podczas hydratacji materiałów napełnij komorę pomiarową 65 do 75 mililitrami PBS. I umieść komorę pod mikroskopem preparacyjnym ustawionym na 30-krotne powiększenie, z oświetleniem od dołu i światłowodowym źródłem światła po lewej i prawej stronie.

Gdy szkiełka nakrywkowe są gotowe, umieść lustro pod odpowiednim kątem w komorze w stałej odległości od wgłębienia, które będzie używane do trzymania soczewki. Następnie za pomocą zakrzywionych kleszczy ostrożnie przenieś wypreparowane soczewki do komory pomiarowej. Ustaw zasilanie optyki na 80% maksymalnego natężenia światła i dostosuj moc wyjściową zasilacza w zależności od oświetlenia otoczenia, preferencji użytkownika i jakości obrazu zgodnie z potrzebami.

Uzyskaj obrazy z góry rozładowanych soczewek bezpośrednio nad głową komory. Następnie zrób zdjęcie krawędzi lustra w ostrości, a następnie obraz z boku nieobciążonej soczewki przez lustro na zewnątrz divota. Następnie umieść soczewkę w wgłębieniu i upewnij się, że soczewka jest bezpiecznie i prosto osadzona w wgłębieniu na swoim przednim lub tylnym biegunie.

Zrób zdjęcie obiektywu w lustrze. Następnie delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na soczewkę. Po dwóch minutach zrób kolejne zdjęcie załadowanego obiektywu w widoku z boku.

Kontynuuj dodawanie szkiełek nakrywkowych, uzyskując obrazy w widoku z boku dwie minuty po dodaniu każdego szkiełka nakrywkowego, aż do nałożenia łącznie 10 szkiełek nakrywkowych. Następnie usuń wszystkie szkiełka nakrywkowe, odczekaj ostatnie dwie minuty i uzyskaj zdjęcia obiektywu w widoku z boku wewnątrz i na zewnątrz divot. I widok z góry obiektywu na zewnątrz divot.

Aby określić rozmiar jądra soczewki, umieść soczewkę na czystej szalce Petriego wypełnionej PBS i użyj cienkich, prostych kleszczyków, aby delikatnie zdecapsulować soczewkę. Aby usunąć komórki włókien korowych, przetocz soczewkę między palcami w rękawiczce. Następnie delikatnie przepłucz jądro soczewki w PBS i umieść jądro z powrotem w komorze pomiarowej.

Uzyskaj obraz jądra soczewki przez lustro pod kątem prostym. Wreszcie, aby przeanalizować obrazy, użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć średnicę równikową i osiową soczewek przed i po każdym etapie ładowania. Zmierz również średnicę każdego jądra soczewki.

W tym reprezentatywnym eksperymencie zmierzono sztywność i wymiary soczewek dwu-, cztero- i ośmiomiesięcznych myszy oraz obliczono odkształcenia osiowe i równikowe. Odkształcenie osiowe jest funkcją logarytmiczną przyłożonego obciążenia ze statystycznie istotnym, zależnym od wieku spadkiem odkształceń osiowych i równikowych pod maksymalnym przyłożonym obciążeniem, co wskazuje, że soczewka myszy sztywnieje z wiekiem. Dane obrazowe zebrane podczas tego eksperymentu wykorzystano również do określenia kilku innych cech morfologicznych soczewki.

Zgodnie z oczekiwaniami, średnice osiowe i paralaktyczne oraz objętość soczewki zwiększały się wraz z wiekiem. Współczynnik proporcji wskazuje, że obiektyw ma nieco większą średnicę równikową niż średnicę osiową. I ten parametr nie zmieniał się z wiekiem.

Średnica, objętość i ułamek jądra soczewki zwiększają się wraz z wiekiem, co sugeruje, że jądro soczewki przebudowuje się, aby zwiększyć swój względny rozmiar wraz ze starzeniem się soczewki. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu 30 do 45 minut na soczewkę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ustawić soczewkę równomiernie wewnątrz wgłębienia i pozwolić soczewce na rozluźnienie naprężeń przez dwie minuty między każdym dodatkowym szkiełkiem nakrywkowym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić sztywność ściskającą i morfometrię soczewek myszy za pomocą sekwencyjnego nakładania szkiełek nakrywkowych. Ta precyzyjna, prosta i niedroga technika toruje drogę badaczom zajmującym się soczewkami do badania biomechanicznych skutków mutacji genów u myszy.