Name: Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Poznaj metodę analizy przesiewowej o wysokiej zawartości do oceny toksyczności składników dymu tytoniowego przy użyciu ludzkich komórek nabłonkowych oskrzeli. Technika ta pozwala określić skuteczne dawki i mechanizmy działania związków szkodliwych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Karsta Luettich i Grégory Vuillaume za recenzję rękopisu.

<ol><li>Rodgman, A., Perfetti, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodgman%2C+A+%22The+chemical+components+of+tobacco+and+tobacco+smoke%22">The chemical components of tobacco and tobacco smoke</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , Methuen, London. (1959).</li>
<li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research+combinatorial+chemistry+%26+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).</li>
<li>US Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Harmful+and+potentially+harmful+constituents+in+tobacco+products+and+tobacco+smoke%3B+established+list%2C+federal+register%22">Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register</a>. , 20034-20037 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Suarez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Biology+Approach+for+Evaluating+the+Biological+Impact+of+Environmental+Toxicants+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro.</a> Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).</li>
<li>Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+alterations+in+mitochondrial+mass+and+function+characterize+different+models+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis.</a> Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+and+dATP-dependent+formation+of+Apaf-1%2Fcaspase-9+complex+initiates+and+apoptotic+protease+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade.</a> Cell. 91 (4), 479-489 (1997).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+%CE%B1+stimulates+AP-1+activity+through+prolonged+activation+of+the+c-jun+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase.</a> J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).</li>
<li>Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+in+rat+hippocampal+neurons%3A+selective+imaging+with+hydroethidine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine.</a> J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).</li>
<li>Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+glutathione+in+anchored+cells+with+monochlorobimane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane.</a> J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).</li>
<li>Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pardaxin+an+antimicrobial+peptide%2C+triggers+caspase-dependent+and+ROS-mediated+apoptosis+in+HT-1080+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells.</a> Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).</li>
<li>Bao, S., Knoell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+modulates+cytokine-induced+lung+epithelial+cell+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+Cytotoxicity+Profiling+Using+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening.</a> Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Philip Morris International. Philip Morris International jest jedynym źródłem finansowania i sponsorem tego projektu.

W ostatnich latach szeroko dyskutowano o potrzebie znalezienia alternatyw dla doświadczeń na zwierzętach oraz nowych podejść do badań o wysokiej przepustowości. To skłoniło naukowców i organy regulacyjne do zbadania alternatywnych metod standardowych testów toksyczności, wykorzystujących testy komórkowe, które ściśle naśladują fizjologię tkanek docelowych. W tym badaniu wykazaliśmy możliwość zastosowania połączenia analizatora komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) z platformą badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) w celu oceny wpływu ekspozycji na pojedyncze składniki CS na ludzkie komórki nabłonka płuc. Układ ten można analogicznie zastosować do oceny cytotoksyczności indukowanej przez różne inne zanieczyszczenia powietrza, cząstki unoszące się w powietrzu i nanocząstki. Co więcej, uzyskane wyniki można porównać z wynikami transkryptomiki całego genomu i metod obliczeniowych opartych na przyczynowych sieciach biologicznych. Jak wcześniej informowaliśmy, podejście to pozwoliło nam potwierdzić dane dotyczące zaburzeń szlaku molekularnego po ekspozycji na CS5 z punktami końcowymi HCS, rozwiązując te perturbacje szlaku również fenotypowo.
Jako test schematu blokowego, analiza komórek w czasie rzeczywistym dostarcza informacji związanych z żywotnością komórek w rozdzielczości zależnej od dawki i czasu, co pozwala na lepsze podejmowanie decyzji, która dawka i punkt czasowy ekspozycji mogą być korzystne dla dalszej analizy14. Zasada działania analizatora opiera się na zmianach impedancji elektrycznej generowanej przez ogniwa, gdy przyczepiają się i rozprzestrzeniają na powierzchni studzienki hodowlanej pokrytej złotą mikroelektrodą. Impedancja jest przekształcana w bezwymiarowy parametr o nazwie cell-index, który może być używany do monitorowania adhezji komórek, rozprzestrzeniania się, morfologii i ostatecznie żywotności komórek. Chociaż technika ta nie dostarcza informacji na temat mechanizmów cytotoksycznych, jej czułość umożliwia wykrywanie morfologicznych zmian komórkowych nawet przy bardzo niskich dawkach, przy których HCS nie ma charakteru informacyjnego (dane nie pokazane). Na podstawie wcześniejszych eksperymentów zauważyliśmy, że metodologia RTCA jest w stanie wykryć zmiany morfologiczne przy niższych dawkach w porównaniu z punktami końcowymi HCS.
Po wstępnym badaniu przesiewowym za pomocą analizatora komórkowego w czasie rzeczywistym, wykorzystano platformę HCS w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat rodzaju cytotoksyczności wywoływanej przez każdy HPHC. Panel testowy HCS pozwolił na profilowanie HPHC pod kątem ich potencjalnego wpływu na przedziały komórkowe/organelle, a także na zidentyfikowanie tych, które wywołują genotoksyczność lub stres oksydacyjny. Analiza ujawniła odrębne profile, w których wybrane HPHC indukują cytotoksyczność w komórkach NHBE. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzono, że wszystkie związki, z wyjątkiem fenolu, wywołują martwicę przy najwyższych testowanych dawkach. Zgodnie z potencjalną rolą w rozwoju raka, fosforylacja H2AX indukowana przez 1-aminonaftalen jako marker genotoksyczności, jednak panel HCS odkrył również aktywność tego HPHC w odczycie toksyczności mitochondrialnej (wzrost masy i uwalnianie cytochromu C) i stresie oksydacyjnym (wyczerpanie GSH). Podobnie, jak opisano wcześniej, stwierdzono, że fenol wywołuje dysfunkcję mitochondriów i powoduje uszkodzenie DNA, a także wyczerpanie GSH. Chrom (VI), jeden ze związków sklasyfikowanych jako czynniki rakotwórcze grupy I, oraz aldehyd krotonowy zostały również zidentyfikowane jako genotoksyczne, w szczególności chrom (VI) również indukował apoptozę (aktywacja kaskady kaspazy), a aldehyd krotonowy powodował zwiększone wytwarzanie ROS. Wreszcie, stwierdzono, że arsen (V) indukuje fosforylację cJun, która jest markerem aktywacji szlaku kinazy stresowej.
W tym badaniu wykorzystaliśmy komórki NHBE jako model komórek nabłonka płuc in vitro. Wykorzystanie tych komórek w warunkach HCS jest bezprecedensowe i umożliwiło zbadanie szerszego zakresu punktów końcowych, w tym genotoksyczności i markerów stresu oksydacyjnego. Zarówno podejścia do barwienia żywych komórek, jak i utrwalonych komórek zostały opisane w naszych protokołach, co świadczy o elastyczności całej techniki. W rzeczywistości te same protokoły można zastosować do szerszego zakresu celów, które można rozwiązać za pomocą dowolnego barwnika fluorescencyjnego lub przeciwciała. Aby pomyślnie wykonać protokoły barwienia na żywo, ważne jest, aby przestrzegać czasu inkubacji, ponieważ niektóre barwniki mają ograniczony okres półtrwania, a sygnał fluorescencji może się zmniejszyć przed zakończeniem akwizycji obrazu. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że jeśli używany jest inny typ komórek, wszystkie warunki barwienia powinny zostać ponownie ocenione, ponieważ optymalne stężenie barwnika i czas inkubacji mogą być różne.
W niniejszym artykule opisaliśmy scenariusz, w którym tylko pięć związków zostało przebadanych za pomocą metodologii HCS. Biorąc pod uwagę wcześniej opisany układ płytek, dozowano je na 2 różnych zestawach płytek, co daje łącznie 24 płytki (6 testów i 2 punkty czasowe). Można również zwiększyć liczbę płytek, co pozwoli na jednoczesne badanie przesiewowe większej liczby związków lub badanie większej liczby punktów końcowych. Zanim to jednak zrobimy, należy wziąć pod uwagę, że niektóre punkty końcowe (GSH i ROS) wymagają natychmiastowego pobrania, a w konsekwencji dozowanie płytek powinno odbywać się w sposób rozłożony w czasie, aby umożliwić nabycie poprzedniej płytki. Z drugiej strony, stosowanie protokołu barwienia komórek o utrwalonym kształcie stanowi zaletę, ponieważ płytki można układać w stosy, przerywając protokół na dowolnym etapie po utrwaleniu, w celu zakończenia procedury barwienia na późniejszym etapie. Takie podejście, na przykład, zapewniłoby operatorowi czas na wykonanie wszystkich płytek do barwienia żywych komórek bez uszczerbku dla jakości danych.
Aby jeszcze bardziej zoptymalizować przepływ pracy poprzez zmniejszenie liczby płyt, możliwe byłoby również multipleksowanie większej liczby punktów końcowych razem. Na przykład w tym kontekście, uszkodzenia DNA i kinazy stresowej można badać razem, po prostu używając dwóch drugorzędowych przeciwciał z fluorochromami emitującymi w różnych kanałach. Ciągły rozwój platformy HCS, w tym w pełni zautomatyzowane wysiewanie komórek, rozcieńczanie związków, dozowanie i barwienie, a także dodawanie nowych punktów końcowych, jeszcze bardziej rozszerzy możliwości platformy HCS jako potężnego narzędzia do profilowania HPHC na nabłonku i innych typach komórek.

Ocena ryzyka toksykologicznego historycznie opierała się na wykorzystaniu modeli zwierzęcych, które, choć fundamentalne w naukach przyrodniczych, są również związane z niedociągnięciami, takimi jak niespójna przekładalność na ludzi i wysokie koszty. Co więcej, coraz częściej dąży się do znalezienia alternatyw dla testów na zwierzętach w duchu "3R"2 (wymiana, redukcja i udoskonalenie). Wysiłki te zostały przyspieszone w ciągu ostatnich kilku lat, nie tylko ze względu na niedawne postępy, takie jak techniki wysokoprzepustowe i podejścia biologii systemowej, ale także ze względu na prawodawstwo ograniczające stosowanie testów na zwierzętach, zwłaszcza w Unii Europejskiej.
Złożoność komórkowych szlaków sygnałowych regulujących reakcję na toksyczne obelgi sprawia, że oczywiste jest, że użycie pojedynczych toksykologicznych punktów końcowych nie będzie wystarczające do opisania toksykologicznych podstaw niektórych związków. W tym celu należy również wziąć pod uwagę wzajemne oddziaływanie setek oddziałujących ze sobą białek przyczyniających się do sieci biologicznej. Aby zbadać wpływ substancji toksycznych na te sieci, przydatne jest podejście toksykologiczne systemowe w połączeniu z fenotypowymi średnio- i wysokoprzepustowymi testami przesiewowymi, aby wywnioskować potencje i jednocześnie dostarczyć więcej informacji na temat mechanizmu działania poszczególnych substancji toksycznych.
W tym badaniu wykorzystaliśmy HCS jako potężne narzędzie do badań przesiewowych, które składa się z automatycznego mikroskopu i aplikacji biologicznej, która może pozyskiwać, przetwarzać i analizować dane obrazowe pochodzące z określonych testów komórkowych opartych na fluorescencji. Pozwala to na ilościowe określenie zmian wizualnych w komórce, na poziomie pojedynczej komórki lub subkomórki, a także na jednoczesną analizę wielu parametrów. 3 Na przykład pęknięcia dwuniciowych DNA oceniano za pomocą identyfikacji fosforylacji histonu H2AX na podstawie przeciwciał, a reaktywne formy tlenu (ROS) określono ilościowo za pomocą przepuszczalnego dla komórek barwnika wrażliwego na ponadtlenek.
Ponieważ komórki nabłonka płuc stanowią pierwszą biologiczną barierę przed wdychanymi toksynami, w tym dymem papierosowym, wykorzystaliśmy pierwotne komórki nabłonka oskrzeli jako model in vitro do profilowania wpływu HPHC opublikowanego przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków. 4 Niniejszy manuskrypt jest kontynuacją poprzedniego badania5, w którym oceniliśmy biologiczny wpływ innego podzbioru HPHC.
W ramach naszego przepływu pracy do oceny cytotoksyczności in vitro, początkowo oceniliśmy potencje wybranych 15 HPHC, używając systemu analizy komórkowej w czasie rzeczywistym opartego na impedancji (RTCA), który pozwolił nam ustalić zakresy dawek, odpowiednie do późniejszej analizy HCS (Rysunek 1). Następnie przeprowadzono toksykologiczną ocenę HCS przy użyciu dziewięciu wieloparametrycznych punktów końcowych toksyczności komórkowej, z których każdy był monitorowany w dwóch punktach czasowych (4 i 24 godziny). Zastosowane markery wskazywały na toksyczność mitochondrialną, uszkodzenia DNA, kinazę stresową, reaktywne formy tlenu (ROS), zawartość glutationu (GSH), aktywność kaspazy 3 - 7, uwalnianie cytochromu C i przepuszczalność błon komórkowych, jak opisano w tabeli 1.
Nasze podejście umożliwiło identyfikację i scharakteryzowanie wpływu składników dymu papierosowego poprzez pobieranie próbek zależne od dawki i czasu. Ostatecznie uzyskano w ten sposób profil toksykologiczny in vitro dla każdego HPHC. Podejścia multiomiczne mogą być również stosowane w celu dalszego uzupełnienia analizy HCS. Pozwoliłoby to również na głębsze zrozumienie efektów na poziomie sygnalizacji komórkowej i/lub transkrypcji.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td></td><td></td></tr> 05331625001 <tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY licznik TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz płytek oddechowych</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>niepalący 60-letni dawca rasy kaukaskiej&nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C przed użyciem</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Zestaw odczynników</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Ciepły w 37 & stopniach; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka filtra Easy Flask 75&nbsp; cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 płytka testowa dołka&nbsp;&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik mitochondrialny: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik mitochondrialny: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Barwnik: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Barwnik: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Barwnik: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>GSH Barwnik: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td></td></tr><tr><td>Toksyczna przepuszczalność membrany Barwnik: YO-PRO-1&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>Y3603 Irytujące</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Przepuszczalność membrany Barwnik: TO-PRO-1&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>T3602</td><td>Irytujące&nbsp;</td></tr><tr><td>Przepuszczalność membrany Barwnik: TOTO-1&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>T3600</td><td>Irytujące&nbsp;</td></tr><tr><td>Barwnik kaspazy: Cellevent Kaspaza 3/7 zielony</td><td>Technologie życia</td><td>C10423</td><td>Drażniące&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cytochromu C (mysz)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-phospho-c-Jun (mysz)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fosfo-H2AX (mysz)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG DyLight 650&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor permeabilizacyjny</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% roztwór formaldehydu</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>10x bufor blokujący</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toksyczna</td></tr><tr><td>walinomycyna</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>parakwat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toksyczna</td></tr><tr><td>anisomycyna</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>kwas etakrylowy</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>1-aminonaftalen</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>2-nitropropan</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>acetamid</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>aceton</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>akryloamid</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>arsen (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>Benzen</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>chrom (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>aldehyd krotonowy</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>keton metylowo-etylowy</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>nikiel&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>nitrobenzen</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>fenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>chinolinowy</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>toluen</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Toksyczny</td></tr></tbody></table>

analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (hphc)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Dym papierosowy (CS) jest głównym czynnikiem ryzyka chorób układu krążenia i płuc. Ponieważ CS jest złożonym aerozolem zawierającym ponad 7000 substancji chemicznych1, trudno jest ocenić udział poszczególnych składników w jego ogólnej toksyczności. Profile toksykologiczne poszczególnych składników, jak również mieszanin, można jednak ustalić in vitro, stosując wysokoprzepustowe narzędzia przesiewowe, które umożliwiają profilowanie szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC) dymu tytoniowego, zgodnie z definicją amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA). cyfra arabska
Do wstępnej oceny, użyto przyrządu opartego na impedancji, który w czasie rzeczywistym, bez etykietowania oceny toksyczności związku. Odczyt przyrządu opiera się na adhezji komórek, żywotności i morfologii, które razem zapewniają przegląd stanu komórki. Parametr bezwymiarowy, nazwany indeksem komórki, jest używany do kwantyfikacji. Opracowano zestaw różnych protokołów barwienia na potrzeby badania opartego na obrazowaniu fluorescencyjnym, a platformę HCS wykorzystano w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat rodzaju cytotoksyczności wywoływanej przez każdy HPHC.
Z 15 testowanych składników, tylko pięć zostało wybranych do analizy opartej na HCS, ponieważ zarejestrowały one obliczalną LD50 (< 20 mM). Należały do nich 1-aminonaftalen, arsen (V), chrom (VI), aldehyd krotonowy i fenol. Na podstawie ich wpływu na HCS, 1-aminonaftalen i fenol mogą być zidentyfikowane jako wywołujące dysfunkcję mitochondriów, a wraz z chromem (VI) jako genotoksyczne w oparciu o zwiększoną fosforylację histonów H2AX. Aldehyd krotonowy został zidentyfikowany jako induktor stresu oksydacyjnego, a arsen jako aktywator szlaku kinazy stresowej.
To badanie pokazuje, że połączenie technologii opartych na impedancji i HCS dostarcza solidnego narzędzia do oceny in vitro składników CS.

Celem badania była ocena biologicznego wpływu 15 składników dymu papierosowego przy użyciu kombinacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym opartego na impedancji i platformy opartej na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) do oceny toksykologicznej in vitro. Badanie to dostarcza informacji na temat skutecznych dawek, toksyczności i sposobów działania badanych związków.

Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Ogólnym celem tego podejścia, które łączy analizator komórek w czasie rzeczywistym oparty na impedancji i platformę opartą na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości, jest dostarczenie informacji na temat skutecznych dawek, toksyczności i skutków biologicznych, aby uzyskać profil toksyczny badanych związków. Takie podejście może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie toksykologii. Zajmowanie się na przykład cytotoksycznością, genotoksycznością i reakcjami na stres komórkowy.Co więcej, nie tylko dostarczają informacji o wielu parametrach biochemicznych i morfologicznych jednocześnie, ale mogą być również stosowane do różnych typów komórek i modeli hodowli komórkowych. Ze względu na jurysdykcję i ograniczenia, całe podejście zostanie przeprowadzone podczas oceny tylko krótkiego fragmentu związku. Z tego samego powodu zostanie pokazany tylko jeden protokół w celu zademonstrowania oceny przesiewowej wysokiej zawartości.Procedurę zademonstrują Stefano Acali i Alexander Laurent, technicy z mojego laboratorium. Aby zobaczyć normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli lub komórki NHBE, zaprogramuj przyrząd tak, aby określił liczbę i czas trwania pomiarów impedancji. W tym badaniu dane są rejestrowane co 15 minut przez 48 godzin.Zmierz tło płytki, pipetując 50 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do każdego dołka 96-dołkowej płytki RTCA. Ten etap stanowi wymóg techniczny dla przyrządu do obliczania ośrodka oporu elektrycznego, który ma być używany jako punkt odniesienia dla obliczeń opartych na komórkach. Następnie dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej o stężeniu 144 000 komórek na mililitr do pożywki już w każdym dołku płytki RTCA.Po podgrzaniu komórki bardzo ważne jest, aby pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej na 40 minut, aby umożliwić komórkom przyczepienie się i uzyskanie jednorodnego rozmieszczenia komórek. Inkubować płytki RTCA w kołysce w inkubatorze i rozpocząć rejestrowanie danych przez następne 24 godziny, plus minus dwie godziny przed podaniem. W celu kontroli dodatniej rozcieńczyć 10-milimolowy roztwór podstawowy staurosporyny, jeden do 10, w DMSO.Dodać pięć mikrolitrów rozcieńczenia do 195 mikrolitrów pożywki, aby uzyskać 5x roztwór roboczy. W przypadku składników szkodliwych i potencjalnie szkodliwych, każdy z nich należy rozpuścić w nośniku, aby wytworzyć jednomolowy roztwór podstawowy. Następnie rozcieńczyć każdy roztwór podstawowy substancji badanej, jeden do 10, w pożywce, aby uzyskać roztwór o stężeniu 100 milimolowym.Wygeneruj złożoną płytkę wzorcową, dodając najpierw pożywkę plus 10% nośnik w studzienkach od B do F, a 100-milimolowy roztwór w studzience A. Wykonaj pięcioetapowe rozcieńczenie, od jednego do 10, szeregowego, aby uzyskać 5-krotne roztwory robocze. Aby dozować, wstrzymaj przyrząd RTCA, otwórz podstawkę, aby wyjąć płytkę naświetlacyjną i umieść płytkę w narzędziu do pomiaru temperatury RTCA, aby uniknąć wychłodzenia ogniw, co mogłoby wpłynąć na pomiar impedancji. Dodać 25 mikrolitrów 5x roztworu z płytki głównej Compound do komórek w trzech egzemplarzach, zachowując tę samą kolejność dozowania, co na płytce głównej Compound.Nie usuwaj istniejącego podłoża do hodowli komórkowych. Następnie dodaj 25 mikrolitrów 5x roztworu kontroli pozytywnej do komórek w prawej połowie dolnego rzędu, bez usuwania istniejącej pożywki hodowlanej. Podobnie dodaj 25 mikrolitrów pożywki do komórek w lewej połowie dolnego rzędu.Po uszczelnieniu płytki za pomocą zgrzewarki do płyt, umieść płytkę z powrotem w kołysce RTCA i zablokuj ją. Uruchom ponownie zapis danych dla żądanego czasu ekspozycji. Po zarejestrowaniu danych przeanalizuj dane dotyczące żywotności komórek RTCA, aby określić, którą substancję badaną należy użyć w analizie HCS.W tym eksperymencie do analizy HCS wybrano 1-aminonaftalen, arsen, chrom i aldehyd krotonowy. Aby zobaczyć komórki NHBE, dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej o stężeniu 120 000 komórek na mililitr do każdego dołka 96-dołkowej czarnej płytki. Po pozostawieniu płytki HCS w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do studzienek, inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 godziny, plus minus dwie godziny, przed dawkowaniem.Do kontroli dodatniej należy dozować 40 mikrolitrów roztworu podstawowego każdej kontroli dodatniej w kolumnie drugiej. Następnie dozować 20 mikrolitrów pojazdu w kolumnach trzeciej i piątej. I 40 mikrolitrów pojazdu w kolumnie czwartej.Pobrać 12 mikrolitrów ze studzienek w kolumnie drugiej, przelać do studzienek w kolumnie trzeciej i wymieszać. Kontynuować aż do uzyskania końcowego seryjnego rozcieńczenia trzema dawkami i nośnikiem dla każdego związku kontroli dodatniej. Aby wytworzyć płytkę kontroli dodatniej, należy przygotować rozcieńczenie w stosunku jeden do 40 w pożywce trzech dawek i nośnika.Aby przygotować złożoną płytkę wzorcową, ponownie zawiesić i rozcieńczyć każdy roztwór podstawowy substancji badanej, jeden do 10 w pożywce o stężeniu 100 milimolowym. Przeprowadzić rozcieńczenia przy użyciu pożywki z 10% nośnikiem, aby uzyskać wybrane 5 dawek dla każdej substancji badanej. Zarówno kontrole dodatnie, jak i płytka złożona są teraz gotowe do dozowania na płytkę ekspozycyjną.Następnie dodaj 25 mikrolitrów 5x roztworów z płytki głównej Compound do komórek w trzech egzemplarzach, zachowując tę samą kolejność dozowania, co na płytce głównej Compound. Nie usuwaj istniejącego podłoża do hodowli komórkowych. Następnie dodaj 25 mikrolitrów 5x roztworu z płytki kontroli dodatniej do komórek w dolnym rzędzie, zachowując tę samą kolejność dozowania, co na płytce kontroli pozytywnej.Przygotować wystarczającą ilość roztworu do barwienia żywych komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie rozcieńczyć zarówno barwnik mitochondriów, jak i barwnik przepuszczalności błony w roztworze do barwienia żywych komórek, zgodnie z instrukcjami dostawcy. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu do barwienia żywych komórek do każdego dołka płytki oznaczonej testem cytotoksyczności.Nie usuwaj pożywki do hodowli komórkowych i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. Delikatnie zassać pożywkę i roztwór barwiący i dodać 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.Po inkubacji delikatnie zassać roztwór utrwalający i przemyć raz 100 mikrolitrami na studzienkę buforu do płukania. Usuń bufor do przemywania i dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę 1x buforu przepuszczalnego do każdej studzienki, przed inkubacją przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Odessać bufor permeabilacyjny i przemyć płytkę dwukrotnie 100 mikrolitrami buforu do płukania na studzienkę.Następnie odessać bufor do płukania i dodać 100 mikrolitrów 1x buforu blokującego do każdej studzienki. Następnie inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Rozcieńczyć przeciwciało antycytochromu C, jeden do 250, w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego.Następnie odessać bufor blokujący i dodać 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na studzienkę do każdej studzienki, przed inkubacją przez 60 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Rozcieńczyć przeciwciało anty-mysie, jeden do 500, w przeciwciałie drugorzędowym i roztworze jądrowym. Rozcieńczyć również barwnik jądrowy, jeden do 1 000, w przeciwciałie wtórnym i roztworze jądrowym.Po odessaniu roztworu przeciwciała pierwotnego przemyć płytkę trzykrotnie 100 mikrolitrami buforu do płukania na studzienkę, używając myjki do płytek. Odessać bufor do przemywania i dodać 50 mikrolitrów na studzienkę przeciwciała wtórnego i roztworu jądrowego do każdego dołka płytki. Teraz inkubuj płytkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.Po aspiracji przeciwciała drugorzędowego i roztworu jądrowego, przemyć płytkę trzykrotnie 100 mikrolitrami buforu do przemywania na studzienkę za pomocą myjki do płytek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę buforu do mycia. Płytka jest teraz gotowa do oceny na instrumencie HCS i rozpoczyna się pozyskiwanie.Przedstawiono reprezentatywne wyniki badania substancją badaną w zakresie żywotności komórek RTCA. Efekt toksyczny zależny od dawki uzyskuje się w ciągu 24 godzin ekspozycji tylko w przypadku 1-aminonaftalenu, arsenu, chromu i aldehydu krotonowego, ponieważ wszystkie wykazywały obliczony LD50 mniejszy niż 20 milimolów. Nie uzyskano efektu toksycznego w przypadku pozostałych związków.Pokazane tutaj są reprezentatywne wyniki HCS tylko dla leczenia 1-aminonaftalenem. Toksyczne działanie 1-aminonaftalenu powoduje poważne uszkodzenie błony komórkowej, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności błony komórkowej w sposób zależny od dawki, po czterech godzinach ekspozycji. Związek wpływa również na mitochondria, wywołując wzrost masy po czterech godzinach ekspozycji, wraz z uwalnianiem cytochromu C, który jest następnie wykrywalny w jądrach po czterech i 24 godzinach ekspozycji.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech dni, ponieważ większość z nich wymaga około godziny dziennie czasu praktycznego na ustawienie i dozowanie. W zależności od wybranego protokołu, badanie przesiewowe o wysokiej zawartości wymaga maksymalnie trzech i 1/2 godziny na wykonanie całej procedury barwienia. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że chociaż wybór szerszego zakresu punktów końcowych zwiększa złożoność przepływu pracy, nie wydłuży znacznie czasu.Przy optymalnym przebiegu pracy można bowiem równolegle ocenić kilka płyt. Ciągły rozwój platformy badań przesiewowych o wysokiej zawartości, w tym w pełni zautomatyzowane ustawianie komórek, rozcieńczanie związków, dozowanie i barwienie oraz dodawanie nowych punktów końcowych, jeszcze bardziej rozszerzy możliwości platformy badań przesiewowych o wysokiej zawartości jako potężnego narzędzia do profilowania toksykologicznego. Co więcej, połączenie wielu, pojedynczych toksykologicznych punktów końcowych przy tak wysokiej przepustowości pozwoli nam pójść o krok dalej w naszych wysiłkach na rzecz ograniczenia testów chemicznych na zwierzętach.

high-content-screening-analysis-to-evaluate-toxicological-effects

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Opisujemy metodologię łączącą zautomatyzowaną hodowlę komórek z obrazowaniem wysokotreściowym w celu wizualizacji i kwantyfikacji wielu procesów oraz struktur komórkowych w sposób wysokoprzepustowy. Takie metody mogą wspomagać dalszą adnotację funkcjonalną genomów, a także identyfikację sieci genów związanych z chorobami i potencjalnych punktów uchwytu dla leków.

Badania wysokoprzepustowe wysokiej treści (High Content Screening) w chorobach neurodegeneracyjnych

Protokoły opisują dwa systemy testów toksyczności rozwojowej in vitro (UKK i UKN1) oparte na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i badaniach transkryptomu. Systemy testowe przewidują zagrożenie toksycznym wpływem na rozwój człowieka i mogą przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach, kosztów i czasu potrzebnego na przeprowadzenie badań bezpieczeństwa chemicznego.

Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

Z punktu widzenia zasady 3R, modele oddechowe jako alternatywa dla badań na zwierzętach ewoluują. Zwłaszcza w odniesieniu do oceny ryzyka związanego z substancjami oddechowymi brakuje odpowiednich testów. W tym miejscu opisujemy zastosowanie precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc do oceny substancji unoszących się w powietrzu.

Ocena cytotoksycznego i immunomodulującego działania substancji w precyzyjnie pokrojonych ludzkich wycinkach płuc

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNA hamującego małą próbę jest ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. W niniejszym artykule przedstawiono rozwój i walidację modeli i metod ekspozycji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych uszkodzeń nabłonka rogówki wywołanych fluorowodorem i chloropikryną.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Metoda ilościowa została opracowana do identyfikacji i przewidywania ostrej toksyczności chemikaliów poprzez automatyczną analizę profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans. Protokół ten opisuje, jak leczyć robaki chemikaliami w 384-dołkowej płytce, przechwytywać filmy i określać ilościowo fenotypy związane z toksykologią.

Wysokoprzepustowy test do przewidywania toksyczności chemicznej za pomocą zautomatyzowanego profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Demonstracja ilościowego oznaczenia dsDNA przy użyciu barwnika PicoGreen firmy Molecular Probes oraz spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 wyposażonego w akcesorium do odczytu mikropłytek.

Ilościowe oznaczenie dsDNA przy użyciu spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 i barwnika PicoGreen

Opisano metodę wysokoprzepustowego screeningu służącą do identyfikacji nowych kompetentnych sygnałowo receptorów błonowych. Metoda ta nadaje się do automatyzacji na dużą skalę i pozwala na przewidywanie wiązania białek in vivo oraz subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych w komórkach ssaków.

Przepływ pracy obrazowania wysokotreściowego do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 za pomocą klonowania ekspresyjnego

Protokół został opracowany w celu zbadania wpływu epigenetycznego leku DZNep na rozwój, płodność i przeżywalność komarów.  W tym miejscu opisujemy procedury wodnej ekspozycji DZNep na niedojrzałe komary oraz ekspozycji DZNep we krwi na dorosłe komary, a także pomiar hamowania hydrolazy SAH.

Testy toksykologiczne do badania wpływu leku epigenetycznego na rozwój, płodność i przeżywalność komarów malarii

Poznaj metodę analizy przesiewowej o wysokiej zawartości do oceny toksyczności składników dymu tytoniowego przy użyciu ludzkich komórek nabłonkowych oskrzeli. Technika ta pozwala określić skuteczne dawki i mechanizmy działania związków szkodliwych.

Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC) (Wideo) | JoVE Journal

Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC)

Przeglądaj więcej filmów