Analiza przesiewowa o wysokiej zawartości w celu oceny skutków toksykologicznych szkodliwych i potencjalnie szkodliwych składników (HPHC)

Ogólnym celem tego podejścia, które łączy analizator komórek w czasie rzeczywistym oparty na impedancji i platformę opartą na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości, jest dostarczenie informacji na temat skutecznych dawek, toksyczności i skutków biologicznych, aby uzyskać profil toksyczny badanych związków. Takie podejście może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie toksykologii. Zajmowanie się na przykład cytotoksycznością, genotoksycznością i reakcjami na stres komórkowy.

Co więcej, nie tylko dostarczają informacji o wielu parametrach biochemicznych i morfologicznych jednocześnie, ale mogą być również stosowane do różnych typów komórek i modeli hodowli komórkowych. Ze względu na jurysdykcję i ograniczenia, całe podejście zostanie przeprowadzone podczas oceny tylko krótkiego fragmentu związku. Z tego samego powodu zostanie pokazany tylko jeden protokół w celu zademonstrowania oceny przesiewowej wysokiej zawartości.

Procedurę zademonstrują Stefano Acali i Alexander Laurent, technicy z mojego laboratorium. Aby zobaczyć normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli lub komórki NHBE, zaprogramuj przyrząd tak, aby określił liczbę i czas trwania pomiarów impedancji. W tym badaniu dane są rejestrowane co 15 minut przez 48 godzin.

Zmierz tło płytki, pipetując 50 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do każdego dołka 96-dołkowej płytki RTCA. Ten etap stanowi wymóg techniczny dla przyrządu do obliczania ośrodka oporu elektrycznego, który ma być używany jako punkt odniesienia dla obliczeń opartych na komórkach. Następnie dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej o stężeniu 144 000 komórek na mililitr do pożywki już w każdym dołku płytki RTCA.

Po podgrzaniu komórki bardzo ważne jest, aby pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej na 40 minut, aby umożliwić komórkom przyczepienie się i uzyskanie jednorodnego rozmieszczenia komórek. Inkubować płytki RTCA w kołysce w inkubatorze i rozpocząć rejestrowanie danych przez następne 24 godziny, plus minus dwie godziny przed podaniem. W celu kontroli dodatniej rozcieńczyć 10-milimolowy roztwór podstawowy staurosporyny, jeden do 10, w DMSO.

Dodać pięć mikrolitrów rozcieńczenia do 195 mikrolitrów pożywki, aby uzyskać 5x roztwór roboczy. W przypadku składników szkodliwych i potencjalnie szkodliwych, każdy z nich należy rozpuścić w nośniku, aby wytworzyć jednomolowy roztwór podstawowy. Następnie rozcieńczyć każdy roztwór podstawowy substancji badanej, jeden do 10, w pożywce, aby uzyskać roztwór o stężeniu 100 milimolowym.

Wygeneruj złożoną płytkę wzorcową, dodając najpierw pożywkę plus 10% nośnik w studzienkach od B do F, a 100-milimolowy roztwór w studzience A. Wykonaj pięcioetapowe rozcieńczenie, od jednego do 10, szeregowego, aby uzyskać 5-krotne roztwory robocze. Aby dozować, wstrzymaj przyrząd RTCA, otwórz podstawkę, aby wyjąć płytkę naświetlacyjną i umieść płytkę w narzędziu do pomiaru temperatury RTCA, aby uniknąć wychłodzenia ogniw, co mogłoby wpłynąć na pomiar impedancji. Dodać 25 mikrolitrów 5x roztworu z płytki głównej Compound do komórek w trzech egzemplarzach, zachowując tę samą kolejność dozowania, co na płytce głównej Compound.

Nie usuwaj istniejącego podłoża do hodowli komórkowych. Następnie dodaj 25 mikrolitrów 5x roztworu kontroli pozytywnej do komórek w prawej połowie dolnego rzędu, bez usuwania istniejącej pożywki hodowlanej. Podobnie dodaj 25 mikrolitrów pożywki do komórek w lewej połowie dolnego rzędu.

Po uszczelnieniu płytki za pomocą zgrzewarki do płyt, umieść płytkę z powrotem w kołysce RTCA i zablokuj ją. Uruchom ponownie zapis danych dla żądanego czasu ekspozycji. Po zarejestrowaniu danych przeanalizuj dane dotyczące żywotności komórek RTCA, aby określić, którą substancję badaną należy użyć w analizie HCS.

W tym eksperymencie do analizy HCS wybrano 1-aminonaftalen, arsen, chrom i aldehyd krotonowy. Aby zobaczyć komórki NHBE, dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej o stężeniu 120 000 komórek na mililitr do każdego dołka 96-dołkowej czarnej płytki. Po pozostawieniu płytki HCS w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do studzienek, inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 godziny, plus minus dwie godziny, przed dawkowaniem.

Do kontroli dodatniej należy dozować 40 mikrolitrów roztworu podstawowego każdej kontroli dodatniej w kolumnie drugiej. Następnie dozować 20 mikrolitrów pojazdu w kolumnach trzeciej i piątej. I 40 mikrolitrów pojazdu w kolumnie czwartej.

Pobrać 12 mikrolitrów ze studzienek w kolumnie drugiej, przelać do studzienek w kolumnie trzeciej i wymieszać. Kontynuować aż do uzyskania końcowego seryjnego rozcieńczenia trzema dawkami i nośnikiem dla każdego związku kontroli dodatniej. Aby wytworzyć płytkę kontroli dodatniej, należy przygotować rozcieńczenie w stosunku jeden do 40 w pożywce trzech dawek i nośnika.

Aby przygotować złożoną płytkę wzorcową, ponownie zawiesić i rozcieńczyć każdy roztwór podstawowy substancji badanej, jeden do 10 w pożywce o stężeniu 100 milimolowym. Przeprowadzić rozcieńczenia przy użyciu pożywki z 10% nośnikiem, aby uzyskać wybrane 5 dawek dla każdej substancji badanej. Zarówno kontrole dodatnie, jak i płytka złożona są teraz gotowe do dozowania na płytkę ekspozycyjną.

Następnie dodaj 25 mikrolitrów 5x roztworów z płytki głównej Compound do komórek w trzech egzemplarzach, zachowując tę samą kolejność dozowania, co na płytce głównej Compound. Nie usuwaj istniejącego podłoża do hodowli komórkowych. Następnie dodaj 25 mikrolitrów 5x roztworu z płytki kontroli dodatniej do komórek w dolnym rzędzie, zachowując tę samą kolejność dozowania, co na płytce kontroli pozytywnej.

Przygotować wystarczającą ilość roztworu do barwienia żywych komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie rozcieńczyć zarówno barwnik mitochondriów, jak i barwnik przepuszczalności błony w roztworze do barwienia żywych komórek, zgodnie z instrukcjami dostawcy. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu do barwienia żywych komórek do każdego dołka płytki oznaczonej testem cytotoksyczności.

Nie usuwaj pożywki do hodowli komórkowych i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. Delikatnie zassać pożywkę i roztwór barwiący i dodać 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.

Po inkubacji delikatnie zassać roztwór utrwalający i przemyć raz 100 mikrolitrami na studzienkę buforu do płukania. Usuń bufor do przemywania i dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę 1x buforu przepuszczalnego do każdej studzienki, przed inkubacją przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Odessać bufor permeabilacyjny i przemyć płytkę dwukrotnie 100 mikrolitrami buforu do płukania na studzienkę.

Następnie odessać bufor do płukania i dodać 100 mikrolitrów 1x buforu blokującego do każdej studzienki. Następnie inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Rozcieńczyć przeciwciało antycytochromu C, jeden do 250, w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego.

Następnie odessać bufor blokujący i dodać 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na studzienkę do każdej studzienki, przed inkubacją przez 60 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Rozcieńczyć przeciwciało anty-mysie, jeden do 500, w przeciwciałie drugorzędowym i roztworze jądrowym. Rozcieńczyć również barwnik jądrowy, jeden do 1 000, w przeciwciałie wtórnym i roztworze jądrowym.

Po odessaniu roztworu przeciwciała pierwotnego przemyć płytkę trzykrotnie 100 mikrolitrami buforu do płukania na studzienkę, używając myjki do płytek. Odessać bufor do przemywania i dodać 50 mikrolitrów na studzienkę przeciwciała wtórnego i roztworu jądrowego do każdego dołka płytki. Teraz inkubuj płytkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.

Po aspiracji przeciwciała drugorzędowego i roztworu jądrowego, przemyć płytkę trzykrotnie 100 mikrolitrami buforu do przemywania na studzienkę za pomocą myjki do płytek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę buforu do mycia. Płytka jest teraz gotowa do oceny na instrumencie HCS i rozpoczyna się pozyskiwanie.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki badania substancją badaną w zakresie żywotności komórek RTCA. Efekt toksyczny zależny od dawki uzyskuje się w ciągu 24 godzin ekspozycji tylko w przypadku 1-aminonaftalenu, arsenu, chromu i aldehydu krotonowego, ponieważ wszystkie wykazywały obliczony LD50 mniejszy niż 20 milimolów. Nie uzyskano efektu toksycznego w przypadku pozostałych związków.

Pokazane tutaj są reprezentatywne wyniki HCS tylko dla leczenia 1-aminonaftalenem. Toksyczne działanie 1-aminonaftalenu powoduje poważne uszkodzenie błony komórkowej, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności błony komórkowej w sposób zależny od dawki, po czterech godzinach ekspozycji. Związek wpływa również na mitochondria, wywołując wzrost masy po czterech godzinach ekspozycji, wraz z uwalnianiem cytochromu C, który jest następnie wykrywalny w jądrach po czterech i 24 godzinach ekspozycji.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech dni, ponieważ większość z nich wymaga około godziny dziennie czasu praktycznego na ustawienie i dozowanie. W zależności od wybranego protokołu, badanie przesiewowe o wysokiej zawartości wymaga maksymalnie trzech i 1/2 godziny na wykonanie całej procedury barwienia. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że chociaż wybór szerszego zakresu punktów końcowych zwiększa złożoność przepływu pracy, nie wydłuży znacznie czasu.

Przy optymalnym przebiegu pracy można bowiem równolegle ocenić kilka płyt. Ciągły rozwój platformy badań przesiewowych o wysokiej zawartości, w tym w pełni zautomatyzowane ustawianie komórek, rozcieńczanie związków, dozowanie i barwienie oraz dodawanie nowych punktów końcowych, jeszcze bardziej rozszerzy możliwości platformy badań przesiewowych o wysokiej zawartości jako potężnego narzędzia do profilowania toksykologicznego. Co więcej, połączenie wielu, pojedynczych toksykologicznych punktów końcowych przy tak wysokiej przepustowości pozwoli nam pójść o krok dalej w naszych wysiłkach na rzecz ograniczenia testów chemicznych na zwierzętach.