Name: In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Poznaj metodę wykrywania nieapoptozowej aktywności kaspaz w zdrowych komórkach Drosophila za pomocą biosensora CaspaseTracker. To narzędzie pozwala śledzić aktywność enzymów w żywych organizmach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Polan Santos i Darrenowi Obbardowi za ilustracje Drosophila na Ryc. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena za użycie insekty JHMRI. Praca ta była wspierana przez stypendium Fundacji Badań nad Naukami Przyrodniczymi (H.L.T.), Komitet ds. Grantów Uniwersyteckich Hong Kong AoE/B-07/99 (MCF) oraz granty NIH NS096677, NS037402 i NS083373 (J.M.H.). Ho Lam Tang jest stypendystką Fundacji Nauk Przyrodniczych (Life Sciences Research Foundation) i Kay Curci.

1. Przygotowanie muchy CaspaseTracker
<ol>
	<li>Aby przygotować muchy CaspaseTracker (DQVD) do eksperymentów, wykonaj następujące krzyżowanie: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; Bezzałogowy statek powietrzny-FLP; Ubi>Stop>GFP-nls), przenosząc 7-10 dziewiczych samic (lub samców) much przenoszących substrat biosensora kaspazy mCD8-DIAP1-Gal4 napędzany promotorem ubikwityny35 wraz z taką samą liczbą samców (lub samic) much G-TRACE, które mają równoważnik drugiego chromosomu CyO, aby uniknąć śmiertelności homozygotycznej kombinacji G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP i Ubi>Stop>GFP-nls)34. Umieść muchy w fiolce ze świeżą żywnością ze świeżą pastą drożdżową jako źródłem białka.</li>
	<li>Inkubować pilniki w temperaturze 18 °C przez 5 do 7 dni (maksymalnie 2 tygodnie), a następnie usunąć muchy rodzicielskie z fiolki, aby uniknąć przepełnienia nowym potomstwem i założyć nowe fiolki hodowlane.</li>
	<li>Kontynuować inkubację w temperaturze 18 °C aż do momentu, gdy muchy potomne zbliżą się do siebie. Wybierz potomstwo non-CyO [non-curly wing] o prawidłowym genotypie CaspaseTracker, które jest transgeniczne dla elementów CaspaseTracker i G-TRACE35.</li>
	<li>Równocześnie, generuj równolegle kontrolne rodzicielskie nietransgeniczne muchy w118 i muchy niewrażliwe na kaspazę (DQVA), aby zweryfikować określoną fluorescencję CaspaseTracker RFP i GFP.</li>
	<li>Wykonaj genotypowanie PCR, aby potwierdzić pliki za pomocą CaspaseTracker przy użyciu starterów: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, dając produkt 3,897 pz. Do genotypowania loci G-Trace należy użyć następujących starterów dla GFP (474 pz), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC GC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; dla zapytania ofertowego (258 bp), 5'-GGC, TGC, TTC, ATC, TAC, AAG, GTG, AAG, TTC, ATC, GG, 3'-GAT, GTC, CAG, CTT, GGA, GTC, CCAT, GTC, GTA, GTA, GC; i dla Flpase (655 pz), 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Do genotypowania Gal4 w wektorze pUWR (554 pz), 5'-GAA, GCA, CCT, CCT, CGC, ATC, GCT, CAG, TCA, TCA, CGC, CGC, 3'-TGG, AAT, TGG, GGT, ACG, TCT, AGA.</li>
</ol>
2. Przygotowanie, barwienie i montaż tkanek
<ol>
	<li>W przypadku preparacji much należy unikać przywierania wypreparowanych tkanek do plastikowych końcówek pipet i probówek wirówkowych, końcówek płaszcza i probówek z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczoną w wodzie.</li>
	<li>Wypreparuj muchy na silikonowej poduszce za pomocą kleszczy.
	<ol>
		<li>Aby uniknąć uszkodzenia końcówek kleszczyków na twardej powierzchni podczas wykonywania sekcji tkanek, należy przeprowadzić sekcję na powierzchni silikonowej. Aby wykonać silikonowe płytki preparacyjne, stopić silikon w zestawie komercyjnym zgodnie z instrukcjami producenta (Lista materiałów). Po stopieniu silikonu dodaj 3 do 4 ml do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm. Naczynia silikonowe można ponownie wykorzystać.</li>
		<li>Znieczulij muchę CO2 i przenieś ją na silikonową płytkę z 1 ml zimnego PBS. Wprowadzić CO2 do fiolki zawierającej muchę za pomocą dmuchawki, a następnie przenieść znieczuloną muchę do podkładki z zapasem CO2.</li>
		<li>Użyj pary kleszczy, aby przytrzymać głowę muchy, i drugiej pary kleszczy, aby pociągnąć klatkę piersiową w przeciwnym kierunku, aby odłączyć głowę muchy od pokrycia ciała bez uszkadzania połączenia między głową a jelitem przednim.</li>
		<li>Użyj 2 par kleszczy, aby usunąć skrzydła i nogi z klatki piersiowej.</li>
		<li>Użyj pary kleszczy, aby przytrzymać klatkę piersiową, a drugiej pary kleszczy, aby pociągnąć brzuch, aby ponownie oddzielić go od klatki piersiowej, nie uszkadzając połączenia między jelitem przednim a środkowym.</li>
		<li>Przeprowadź sekcję narządów wewnętrznych, w tym mózgu, jelit, kanalików malpighiego i jajników, jak wykazano wcześniej. 39-41 Rozdział 39-41</li>
		<li>Usuń wszystkie kawałki naskórka i ciałka tłuszczowe za pomocą kleszczy, ponieważ tkanki te wytwarzają silną autofluorescencję. Cierpliwość i praktyka są wymagane, aby przygotować kompletny układ narządów, jak pokazano.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś wypreparowane tkanki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i utrwal tkanki 0,5 ml 4% paraformaldehydu w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut z rotacją w ciemności, aby uniknąć wybielania RFP i GFP w tkankach. Unikaj długotrwałego utrwalania, które może zagrozić późniejszym wynikom barwienia.</li>
	<li>Usunąć paraformaldehyd za pomocą delikatnego pipetowania i przemyć 3 razy 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepuszczalność tkanek za pomocą 0,5 ml PBST w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie wstrząsając. Krótsze inkubacje mogą powodować niepełną przepuszczalność i pogarszać wyniki barwienia.
	<ol>
		<li>Jeśli konieczne jest zmniejszenie barwienia tła, należy rozważyć inkubację tkanek w 0,5 ml PBST z 1% BSA, zamiast PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj chusteczki 3 razy 0,5 ml PBST.</li>
	<li>Do barwienia jąder i aktyny nitkowatej (F-aktyny) należy nałożyć 0,5 ml PBST z 10 μg/ml niebieskiego barwnika jądrowego Hoechst 33342 i 0,3 μM barwienia F-aktyną Alexa Fluor 633 Phalloidin i inkubować jednocześnie z tkankami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem w ciemności. Unikaj długotrwałego barwienia, ponieważ zwiększy to tło.
	<ol>
		<li>W celu barwienia immunologicznego inkubować utrwalone i przepuszczalne tkanki z 0,1% Triton X-100 w 0,5 ml PBS przez noc w temperaturze 4 °C, wybarwić przeciwciałem anty-ELAV w rozcieńczeniu 1:100 lub w rozcieńczeniu anty-kaspazy-3 w stosunku 1:200 przez noc w temperaturze 4 °C (300 μL). Następnie należy zastosować odpowiednie przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:100 i inkubować przez 1 do 3 godzin w temperaturze pokojowej. Zobacz Listę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje o przeciwciałach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj chusteczki 3 razy, każdy przez 5 minut w 0,5 ml PBST z delikatnym obracaniem.</li>
	<li>Za pomocą pipety usuń cały PBST, a następnie dodaj 200 μl środka mocującego przeciw wybielaniu (patrz materiały), aby całkowicie pokryć tkanki przez 1-3 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc. Optymalne tkanki, które w pełni wchłonęły środek mocujący, opadną na dno tuby.</li>
	<li>Wstępnie oczyść szkiełko szkiełkowe wodą lub 70% etanolem i przenieś chusteczki ze środkiem montażowym na szkiełko podstawowe.</li>
	<li>Ostrożnie umieść szklaną osłonę na chusteczkach. Nałóż wazelinę na szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć zniszczenia tkanki przez nadmierną kompresję. Usuń dodatkowy środek montażowy za pomocą bibuły.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe, nakładając lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć wycieku środków mocujących z chusteczek.</li>
</ol>
3. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Użyj odwróconego konfokalnego mikroskopu epifluorescencyjnego. Można jednak również używać mikroskopów pionowych. Aby obrazować tkanki za pomocą kafelków, utrzymuj stabilną temperaturę pokojową, aby uniknąć dryfu ostrości i przesunięcia płaszczyzny x-y z powodu rozszerzalności cieplnej i kurczenia się składników. Systemy kontroli warunków środowiskowych i systemy kompensacji dryftu ostrości pomagają uniknąć tego problemu spowodowanego utratą równowagi termicznej systemu mikroskopu.</li>
	<li>Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Wykonaj kilka obrazów testowych w niskiej rozdzielczości (125 x 125 pikseli) i określ odpowiednią liczbę kafelków potrzebnych do pokrycia całego obszaru zainteresowania (ROI).</li>
	<li>Ustaw system skanowania mikroskopu tak, aby rejestrował obrazy o rozdzielczości skanowania, takiej jak 500 x 500 pikseli. Wybierz obiektyw, taki jak obiektyw planapochromatyczny 20X NA 0,8 lub 63X NA 1,4 do analizy tkanek przez szklane szkiełka nakrywkowe, tak aby każdy z obrazów (płytek) zachodził na siebie ze wszystkich stron na 20%.</li>
	<li>Ustaw sekwencję obrazu od najdłuższej do najkrótszej długości fali wzbudzenia, ponieważ światło o długiej długości fali powoduje mniejsze wybielanie zdjęć. Sekwencja od najdłuższej do najkrótszej długości fali wzbudzenia to: (i) 633 nm dla F-aktyny falloidyny i przeciwciał przeciwko aktywowanym kaspazom, (ii) 561 nm dla RFP, (iii) 488 nm dla GFP i (iv) 405 nm dla barwienia jądrowego Hoechsta.</li>
	<li>Podczas obrazowania zminimalizuj ekspozycję komórek na fluorescencyjne wzbudzenie laserowe podczas procesu obrazowania, aby uniknąć fotowybielania poprzez zmniejszenie intensywności lasera w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów tkanek.</li>
	<li>Po zebraniu obrazów połącz je za pomocą oprogramowania mikroskopowego.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj ilustrujemy budowę i wewnętrzne działanie CaspaseTracker, które ułatwiają wykrywanie rozległej podstawowej aktywności kaspazy w zdrowych tkankach. Kluczowymi etapami wykrywania nieapoptotycznej aktywności kaspazy in vivo są: 1) generowanie much za pomocą transgenu biosensora, 2) weryfikacja funkcji reporterowej specyficznej dla kaspazy za pomocą odpowiednich kontroli, 3) ćwiczenie technik preparacyjnych w celu obserwacji wszystkich układów narządów wewnętrznych dorosłej Drosophila oraz 4) odróżnia...

Kaspazy to proteazy cysteinowe, które pośredniczą w apoptotycznej śmierci komórki, rozszczepiając wiele białek wewnątrzkomórkowych po kluczowych resztach asparaginianu. Na przykład kaspazy inicjujące aktywują kaspazy efektorowe, depreparują nukleazy DNA, rozszczepiają składniki cytoszkieletu i zmieniają skład lipidowy błon komórkowych, aby szybko rozmontować komórki i stymulować ich rozpoznawanie i pochłanianie przez sąsiednie komórki, które pozbywają się zwłok komórkowych. 1-4 Szacuje się, że miliardy komórek umierają dziennie w ludzkim ciele, a apoptoza jest ważnym mechanizmem śmierci komórek nowotworowych wywołanej chemioterapią. 5 Inny zestaw kaspaz może powodować śmierć komórki przez różne procesy nieapoptotyczne w celu stymulacji odporności wrodzonej. 6 Dlatego większość badań nad kaspazami skupia się na ich prośmiercionośnych funkcjach.
Interesujące, wczesne dowody w tej dziedzinie ujawniły, że te same kaspazy odpowiedzialne za promowanie śmierci komórki mają również funkcje niezwiązane ze śmiercią. Pionierskie badania wykazały, że kaspazy biorą udział w różnych funkcjach komórkowych w zdrowych komórkach, w tym w regulacji proliferacji i migracji komórek podczas embriogenezy. 7-9 Kaspazy są wymagane do indywidualizacji spermatyd u Drosophila10,11, do blokowania alternatywnego szlaku nekroptotycznej śmierci komórek u myszy12,13 oraz do przetwarzania mikroRNA u C. elegans. W prawdopodobnie najdłużej żyjących komórkach neurony, kaspazy i inne mechanizmy apoptotyczne są zaangażowane w regulację aktywności neuronalnej poprzez przycinanie zakończeń synaptycznych, proces uważany za niezbędny do wzmocnienia innych synaps do uczenia się i pamięci. 16-18 Możliwe, że kaspazy ułatwiają przycinanie synaps poprzez rodzaj mini-apoptozy maleńkich wypustek neuronalnych bez śmierci całej komórki. 19 Kaspazy mogą jednak pełnić alternatywne funkcje, niezwiązane ze zdarzeniami podobnymi do apoptozy. 20,21 Podwójne role w życiu i śmierci nie są charakterystyczne wyłącznie dla kaspaz; Białka z rodziny BCL-2 i cytochrom c odgrywają rolę w energetyce komórkowej w zdrowych komórkach, ale są również częścią rdzenia szlaku apoptotycznego, który jest aktywowany przez wiele rodzajów stresu komórkowego. Chociaż nie zostało to udowodnione, wydaje się logiczne, że ewolucja powiązała pracę dzienną z pracą śmiercią w obrębie tych samych cząsteczek, aby zapewnić szybką eliminację nieodpowiednich lub niepożądanych komórek.
Obecnie nie są znane molekularne mechanizmy nieapoptotycznej aktywności kaspazy, a zakres nieapoptotycznej aktywności kaspazy podczas rozwoju embrionalnego i w tkankach dorosłych również nie jest znany. Dużym wyzwaniem jest trudność w odróżnieniu pracy dziennej od pracy na śmierć w przypadku kaspaz. W przeciwieństwie do apoptozy i pyroptozy, gdy aktywność kaspazy jest wzmacniana przez kaskadę proteolityczną, oczekuje się, że dzienne zadania kaspaz będą występować na znacznie niższych poziomach aktywności enzymatycznej, prawdopodobnie poniżej wykrytych przez wiele dostępnych technologii.
Przed prezentowaną tutaj pracą, inni opracowali różne biosensory kaspazy do różnych celów. Bioczujniki SCAT (np. ECFP-DEVD-Venus) szybko wykrywają aktywność kaspazy w czasie rzeczywistym w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych za pomocą FRET. 26,27 Po rozszczepieniu kaspazy, ugrupowanie GFP Apoliner (mCD8-RFP-DQVD-nucGFP) ulega relokalizacji subkomórkowej w ciągu kilku minut, gdy jego pęta błony komórkowej jest rozszczepiane przez kaspazy. 28 Podobnie, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) przemieszcza się z cytozolu do jądra po rozszczepieniu kaspazy. Niedawno chromofor w iCasper został sprytnie zmodyfikowany tak, aby fluoryzował po rozszczepieniu przez kaspazy, co pozwoliło na wykrycie aktywności biosensorów w czasie rzeczywistym w neuronach zarodków Drosophila, ale przede wszystkim w związku ze śmiercią komórki rozwojowej. 31 Zależna od kaspazy śmierć neuronów węchowych podczas starzenia się została wykazana przez immunodetekcję rozszczepionej przez kaspazę formy biosensorów CPV (np. mCD8-PARP-Venus). 32,33 Co ważne, aktywowana forma kaspazy-3 została wykryta przy braku śmierci komórki przez wrażliwe barwienie immunologiczne w kolcach hodowanych neuronów oraz w somie przy użyciu zależnej od kaspazy fluorescencji jądrowego barwnika reporterowego CellEvent, ale napotkano trudności z powodu fototoksyczności, chociaż śmierć komórki była opóźniona do czasu po eliminacji kręgosłupa. 19 W związku z tym potrzebne są nowe biosensory kaspazy do wykrywania i śledzenia komórek o podstawowej aktywności kaspazy in vivo.
Aby przezwyciężyć te trudności, stworzyliśmy nowatorski dwukolorowy biosensor kaspazy, nazwany CaspaseTracker. Strategia ta łączy zmodyfikowaną wersję wrażliwego na kaspazę biosensora Apoliner28 z systemem rekombinazy Drosophila G-TRACE FRT 34 w celu trwałego znakowania i śledzenia komórek in vivo. 35 System G-TRACE aktywowany przez Gal4 pozwala na bardzo niskie poziomy kaspaz do aktywacji CaspaseTracker, co skutkuje ekspresją RFP w cytoplazmie i stałą ekspresją GFP ukierunkowaną jądrowo w każdej komórce, która kiedykolwiek doświadczyła aktywności kaspazy. 35 System ten może oznaczać komórki przez całe życie u całych zwierząt za pomocą Drosophila melanogaster, łatwego w obsłudze i szeroko stosowanego systemu modelowego do badania kaspaz i śmierci komórek. 36-38 Rozdział 36-38

<table><tr><tbody><td colspan="4">Materiały eksploatacyjne i odczynniki</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Produkty wektorowe</td><td>H-1000</td><td>Kleszcze montażowe</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Pęseta Dumont klasa biologiczna, stal nierdzewna</td></tr><tr><td>Wiszące prowadnice upuszczane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Szkiełka szklane</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td></td> <td>Hoechst 33342H1399</td><td>Barwienie DNA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633</td><td>Sondy molekularne</td> falloidyny <td>A22284</td><td>Barwienie aktyny</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 przeciwciało anty-elav</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>Identyfikator rejestru przeciwciał:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>Barwnik do Drosophla pan-neuronal ELAV</td></tr><tr><td>Rozszczepione przeciwciało kaspazy-3 (Asp175)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td>#<td>9661</td><td>Barwnik do aktywnego fragmentu kaspazy-3</td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>w celu zachowania fluoroforów&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>w celu zachowania fluoroforów&nbsp;</td></tr><tr><td>SylGard 182 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>Kod produktu: 0001023934</td><td>do płytek</td></tr><tr> sekcyjnych<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LSM780 mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomikroskop Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila preparacja</td></tr><tr><td>AmScope Światłowodowy podwójny oświetlacz mikroskopu na gęsiej szyi, 150&nbsp; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Źródło światła</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Kaspazy są kluczowymi mediatorami apoptotycznej śmierci komórek poprzez ich aktywność proteolityczną. Kiedy kaspazy są aktywowane w komórkach do poziomów wykrywalnych przez dostępne technologie, ogólnie zakłada się, że apoptoza następuje wkrótce potem. Kaspazy mogą rozszczepiać wiele składników funkcjonalnych i strukturalnych, powodując szybkie i całkowite zniszczenie komórek w ciągu kilku minut. Jednak coraz więcej dowodów wskazuje, że w normalnych zdrowych komórkach te same kaspazy pełnią inne funkcje, przypuszczalnie na niższych poziomach enzymatycznych. Badania nad nieapoptotyczną aktywnością kaspazy były utrudnione przez trudności z wykryciem niskich poziomów aktywności kaspazy i śledzeniem ostatecznego losu komórek in vivo. Tutaj ilustrujemy użycie ultraczułego reportera kaspazy, CaspaseTracker, który trwale oznacza komórki, które doświadczyły aktywności kaspazy u całych zwierząt. Ten dwukolorowy bioczujnik CaspaseTracker in vivo dla Drosophila melanogaster przejściowo wyraża czerwone białko fluorescencyjne (RFP), aby wskazać niedawną lub trwającą aktywność kaspazy, i trwale wyraża zielone białko fluorescencyjne (GFP) w komórkach, które doświadczyły aktywności kaspazy w dowolnym momencie w przeszłości, ale nie umarły. Co ważne, ten zależny od kaspazy bioczujnik in vivo z łatwością ujawnia obecność nieapoptotycznej aktywności kaspazy w tkankach układów narządowych u dorosłej muchy. Wykazano to za pomocą całych sekcji poszczególnych muszek w celu wykrycia aktywności biosensorów w zdrowych komórkach w mózgu, jelitach, kanalikach malpighiego, wpustie, przewodach jajnikowych i innych tkankach. CaspaseTracker wykrywa nieapoptotyczną aktywność kaspazy w długowiecznych komórkach, ponieważ aktywność biosensora jest wykrywana w dorosłych neuronach i innych tkankach co najmniej 10 dni po aktywacji kaspazy. Ten bioczujnik służy jako ważne narzędzie do odkrywania ról i mechanizmów molekularnych nieapoptotycznej aktywności kaspazy u żywych zwierząt.

CaspaseTracker składa się z dwóch kluczowych komponentów, które umożliwiają wykrywanie aktywności kaspazy w normalnych, zdrowych komórkach (Rycyna 1a). Pierwszym z nich jest 146-aminokwasowy polipeptyd rozszczepialny przez kaspazę, opracowany na podstawie biosensora kaspazy Apoliner (Rycyna 1b).28 Polipeptyd ten pochodzi z DIAP1 (inhibitora apoptozy Drosophila) i zawiera pojedynczą, naturalnie występującą sekwencję rozpoznawania kaspaz...

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wykrywanie i śledzenie nieapoptotycznej aktywności kaspaz w żywych zwierzętach z wykorzystaniem *Drosophila melanogaster* jako modelu. Kaspazy są proteazami, które rozszczepiają wiele komponentów komórkowych, wywołując apoptotyczną śmierć komórek. W związku z tym przyjmuje się często, że obecność aktywnych kaspaz w komórkach odzwierciedla nadchodzącą śmierć komórkową.Jednak coraz więcej dowodów wskazuje na to, że te same kaspazy, które wywołują śmierć komórki, pełnią również normalne role w zdrowych komórkach. Do tych codziennych funkcji kaspaz należy regulacja aktywności neuronalnej, funkcji mitochondriów, a nawet tłumienie alternatywnych szlaków śmierci komórkowej. Badanie tych codziennych funkcji kaspaz wiąże się z dwiema głównymi trudnościami.Po pierwsze, normalne podstawowe poziomy aktywności kaspaz zazwyczaj znajdują się poniżej granic wykrywalności dostępnych technologii. Po drugie, nawet gdy podstawowa aktywność kaspaz jest wykrywalna, trudno ją odróżnić od aktywności kaspaz, która doprowadzi do śmierci komórki w najbliższej przyszłości. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy tracker kaspaz: bardziej czuły biosensor kaspaz, któr

in-vivo-biosensor-tracks-non-apoptotic-caspase-activity-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Pewne zaburzenia genetyczne lub narażenie na toksyny mogą zakłócić normalne procesy rozwojowe, prowadząc do śmierci określonych typów komórek. Analiza aktywowanej kaspazy 3 metodą immunofluorescencji całej góry w zarodkach danio pręgowanego ujawnia specyficzną dla etapu i tkanki lokalizację komórek specyficznie ulegających apoptozie.

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania ran na żywo i związanej z tym reakcji zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej in vivo. Metoda ta wykorzystuje stadium poczwarki rozwoju Drosophila, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie i śledzenie określonych populacji komórek w czasie i jest kompatybilna z wydajną inaktywacją genów za pośrednictwem RNAi.

Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania i oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila Dronc i Drice oraz ich zastosowanie w testach rozszczepienia in vitro.

In vitro Testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz Drosophila do badań przesiewowych substratów

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Poznaj metodę wykrywania nieapoptozowej aktywności kaspaz w zdrowych komórkach Drosophila za pomocą biosensora CaspaseTracker. To narzędzie pozwala śledzić aktywność enzymów w żywych organizmach.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów