Name: In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Poznaj metodę wykrywania nieapoptozowej aktywności kaspaz w zdrowych komórkach Drosophila za pomocą biosensora CaspaseTracker. To narzędzie pozwala śledzić aktywność enzymów w żywych organizmach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Polan Santos i Darrenowi Obbardowi za ilustracje Drosophila na Ryc. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena za użycie insekty JHMRI. Praca ta była wspierana przez stypendium Fundacji Badań nad Naukami Przyrodniczymi (H.L.T.), Komitet ds. Grantów Uniwersyteckich Hong Kong AoE/B-07/99 (MCF) oraz granty NIH NS096677, NS037402 i NS083373 (J.M.H.). Ho Lam Tang jest stypendystką Fundacji Nauk Przyrodniczych (Life Sciences Research Foundation) i Kay Curci.

1. Przygotowanie muchy CaspaseTracker
<ol>
	<li>Aby przygotować muchy CaspaseTracker (DQVD) do eksperymentów, wykonaj następujące krzyżowanie: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; Bezzałogowy statek powietrzny-FLP; Ubi>Stop>GFP-nls), przenosząc 7-10 dziewiczych samic (lub samców) much przenoszących substrat biosensora kaspazy mCD8-DIAP1-Gal4 napędzany promotorem ubikwityny35 wraz z taką samą liczbą samców (lub samic) much G-TRACE, które mają równoważnik drugiego chromosomu CyO, aby uniknąć śmiertelności homozygotycznej kombinacji G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP i Ubi>Stop>GFP-nls)34. Umieść muchy w fiolce ze świeżą żywnością ze świeżą pastą drożdżową jako źródłem białka.</li>
	<li>Inkubować pilniki w temperaturze 18 °C przez 5 do 7 dni (maksymalnie 2 tygodnie), a następnie usunąć muchy rodzicielskie z fiolki, aby uniknąć przepełnienia nowym potomstwem i założyć nowe fiolki hodowlane.</li>
	<li>Kontynuować inkubację w temperaturze 18 °C aż do momentu, gdy muchy potomne zbliżą się do siebie. Wybierz potomstwo non-CyO [non-curly wing] o prawidłowym genotypie CaspaseTracker, które jest transgeniczne dla elementów CaspaseTracker i G-TRACE35.</li>
	<li>Równocześnie, generuj równolegle kontrolne rodzicielskie nietransgeniczne muchy w118 i muchy niewrażliwe na kaspazę (DQVA), aby zweryfikować określoną fluorescencję CaspaseTracker RFP i GFP.</li>
	<li>Wykonaj genotypowanie PCR, aby potwierdzić pliki za pomocą CaspaseTracker przy użyciu starterów: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, dając produkt 3,897 pz. Do genotypowania loci G-Trace należy użyć następujących starterów dla GFP (474 pz), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC GC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; dla zapytania ofertowego (258 bp), 5'-GGC, TGC, TTC, ATC, TAC, AAG, GTG, AAG, TTC, ATC, GG, 3'-GAT, GTC, CAG, CTT, GGA, GTC, CCAT, GTC, GTA, GTA, GC; i dla Flpase (655 pz), 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Do genotypowania Gal4 w wektorze pUWR (554 pz), 5'-GAA, GCA, CCT, CCT, CGC, ATC, GCT, CAG, TCA, TCA, CGC, CGC, 3'-TGG, AAT, TGG, GGT, ACG, TCT, AGA.</li>
</ol>
2. Przygotowanie, barwienie i montaż tkanek
<ol>
	<li>W przypadku preparacji much należy unikać przywierania wypreparowanych tkanek do plastikowych końcówek pipet i probówek wirówkowych, końcówek płaszcza i probówek z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczoną w wodzie.</li>
	<li>Wypreparuj muchy na silikonowej poduszce za pomocą kleszczy.
	<ol>
		<li>Aby uniknąć uszkodzenia końcówek kleszczyków na twardej powierzchni podczas wykonywania sekcji tkanek, należy przeprowadzić sekcję na powierzchni silikonowej. Aby wykonać silikonowe płytki preparacyjne, stopić silikon w zestawie komercyjnym zgodnie z instrukcjami producenta (Lista materiałów). Po stopieniu silikonu dodaj 3 do 4 ml do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm. Naczynia silikonowe można ponownie wykorzystać.</li>
		<li>Znieczulij muchę CO2 i przenieś ją na silikonową płytkę z 1 ml zimnego PBS. Wprowadzić CO2 do fiolki zawierającej muchę za pomocą dmuchawki, a następnie przenieść znieczuloną muchę do podkładki z zapasem CO2.</li>
		<li>Użyj pary kleszczy, aby przytrzymać głowę muchy, i drugiej pary kleszczy, aby pociągnąć klatkę piersiową w przeciwnym kierunku, aby odłączyć głowę muchy od pokrycia ciała bez uszkadzania połączenia między głową a jelitem przednim.</li>
		<li>Użyj 2 par kleszczy, aby usunąć skrzydła i nogi z klatki piersiowej.</li>
		<li>Użyj pary kleszczy, aby przytrzymać klatkę piersiową, a drugiej pary kleszczy, aby pociągnąć brzuch, aby ponownie oddzielić go od klatki piersiowej, nie uszkadzając połączenia między jelitem przednim a środkowym.</li>
		<li>Przeprowadź sekcję narządów wewnętrznych, w tym mózgu, jelit, kanalików malpighiego i jajników, jak wykazano wcześniej. 39-41 Rozdział 39-41</li>
		<li>Usuń wszystkie kawałki naskórka i ciałka tłuszczowe za pomocą kleszczy, ponieważ tkanki te wytwarzają silną autofluorescencję. Cierpliwość i praktyka są wymagane, aby przygotować kompletny układ narządów, jak pokazano.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś wypreparowane tkanki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i utrwal tkanki 0,5 ml 4% paraformaldehydu w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut z rotacją w ciemności, aby uniknąć wybielania RFP i GFP w tkankach. Unikaj długotrwałego utrwalania, które może zagrozić późniejszym wynikom barwienia.</li>
	<li>Usunąć paraformaldehyd za pomocą delikatnego pipetowania i przemyć 3 razy 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepuszczalność tkanek za pomocą 0,5 ml PBST w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie wstrząsając. Krótsze inkubacje mogą powodować niepełną przepuszczalność i pogarszać wyniki barwienia.
	<ol>
		<li>Jeśli konieczne jest zmniejszenie barwienia tła, należy rozważyć inkubację tkanek w 0,5 ml PBST z 1% BSA, zamiast PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj chusteczki 3 razy 0,5 ml PBST.</li>
	<li>Do barwienia jąder i aktyny nitkowatej (F-aktyny) należy nałożyć 0,5 ml PBST z 10 μg/ml niebieskiego barwnika jądrowego Hoechst 33342 i 0,3 μM barwienia F-aktyną Alexa Fluor 633 Phalloidin i inkubować jednocześnie z tkankami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem w ciemności. Unikaj długotrwałego barwienia, ponieważ zwiększy to tło.
	<ol>
		<li>W celu barwienia immunologicznego inkubować utrwalone i przepuszczalne tkanki z 0,1% Triton X-100 w 0,5 ml PBS przez noc w temperaturze 4 °C, wybarwić przeciwciałem anty-ELAV w rozcieńczeniu 1:100 lub w rozcieńczeniu anty-kaspazy-3 w stosunku 1:200 przez noc w temperaturze 4 °C (300 μL). Następnie należy zastosować odpowiednie przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:100 i inkubować przez 1 do 3 godzin w temperaturze pokojowej. Zobacz Listę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje o przeciwciałach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj chusteczki 3 razy, każdy przez 5 minut w 0,5 ml PBST z delikatnym obracaniem.</li>
	<li>Za pomocą pipety usuń cały PBST, a następnie dodaj 200 μl środka mocującego przeciw wybielaniu (patrz materiały), aby całkowicie pokryć tkanki przez 1-3 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc. Optymalne tkanki, które w pełni wchłonęły środek mocujący, opadną na dno tuby.</li>
	<li>Wstępnie oczyść szkiełko szkiełkowe wodą lub 70% etanolem i przenieś chusteczki ze środkiem montażowym na szkiełko podstawowe.</li>
	<li>Ostrożnie umieść szklaną osłonę na chusteczkach. Nałóż wazelinę na szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć zniszczenia tkanki przez nadmierną kompresję. Usuń dodatkowy środek montażowy za pomocą bibuły.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe, nakładając lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć wycieku środków mocujących z chusteczek.</li>
</ol>
3. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Użyj odwróconego konfokalnego mikroskopu epifluorescencyjnego. Można jednak również używać mikroskopów pionowych. Aby obrazować tkanki za pomocą kafelków, utrzymuj stabilną temperaturę pokojową, aby uniknąć dryfu ostrości i przesunięcia płaszczyzny x-y z powodu rozszerzalności cieplnej i kurczenia się składników. Systemy kontroli warunków środowiskowych i systemy kompensacji dryftu ostrości pomagają uniknąć tego problemu spowodowanego utratą równowagi termicznej systemu mikroskopu.</li>
	<li>Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Wykonaj kilka obrazów testowych w niskiej rozdzielczości (125 x 125 pikseli) i określ odpowiednią liczbę kafelków potrzebnych do pokrycia całego obszaru zainteresowania (ROI).</li>
	<li>Ustaw system skanowania mikroskopu tak, aby rejestrował obrazy o rozdzielczości skanowania, takiej jak 500 x 500 pikseli. Wybierz obiektyw, taki jak obiektyw planapochromatyczny 20X NA 0,8 lub 63X NA 1,4 do analizy tkanek przez szklane szkiełka nakrywkowe, tak aby każdy z obrazów (płytek) zachodził na siebie ze wszystkich stron na 20%.</li>
	<li>Ustaw sekwencję obrazu od najdłuższej do najkrótszej długości fali wzbudzenia, ponieważ światło o długiej długości fali powoduje mniejsze wybielanie zdjęć. Sekwencja od najdłuższej do najkrótszej długości fali wzbudzenia to: (i) 633 nm dla F-aktyny falloidyny i przeciwciał przeciwko aktywowanym kaspazom, (ii) 561 nm dla RFP, (iii) 488 nm dla GFP i (iv) 405 nm dla barwienia jądrowego Hoechsta.</li>
	<li>Podczas obrazowania zminimalizuj ekspozycję komórek na fluorescencyjne wzbudzenie laserowe podczas procesu obrazowania, aby uniknąć fotowybielania poprzez zmniejszenie intensywności lasera w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów tkanek.</li>
	<li>Po zebraniu obrazów połącz je za pomocą oprogramowania mikroskopowego.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj ilustrujemy budowę i wewnętrzne działanie CaspaseTracker, które ułatwiają wykrywanie rozległej podstawowej aktywności kaspazy w zdrowych tkankach. Kluczowymi etapami wykrywania nieapoptotycznej aktywności kaspazy in vivo są: 1) generowanie much za pomocą transgenu biosensora, 2) weryfikacja funkcji reporterowej specyficznej dla kaspazy za pomocą odpowiednich kontroli, 3) ćwiczenie technik preparacyjnych w celu obserwacji wszystkich układów narządów wewnętrznych dorosłej Drosophila oraz 4) odróżnia...

Kaspazy to proteazy cysteinowe, które pośredniczą w apoptotycznej śmierci komórki, rozszczepiając wiele białek wewnątrzkomórkowych po kluczowych resztach asparaginianu. Na przykład kaspazy inicjujące aktywują kaspazy efektorowe, depreparują nukleazy DNA, rozszczepiają składniki cytoszkieletu i zmieniają skład lipidowy błon komórkowych, aby szybko rozmontować komórki i stymulować ich rozpoznawanie i pochłanianie przez sąsiednie komórki, które pozbywają się zwłok komórkowych. 1-4 Szacuje się, że miliardy komórek umierają dziennie w ludzkim ciele, a apoptoza jest ważnym mechanizmem śmierci komórek nowotworowych wywołanej chemioterapią. 5 Inny zestaw kaspaz może powodować śmierć komórki przez różne procesy nieapoptotyczne w celu stymulacji odporności wrodzonej. 6 Dlatego większość badań nad kaspazami skupia się na ich prośmiercionośnych funkcjach.
Interesujące, wczesne dowody w tej dziedzinie ujawniły, że te same kaspazy odpowiedzialne za promowanie śmierci komórki mają również funkcje niezwiązane ze śmiercią. Pionierskie badania wykazały, że kaspazy biorą udział w różnych funkcjach komórkowych w zdrowych komórkach, w tym w regulacji proliferacji i migracji komórek podczas embriogenezy. 7-9 Kaspazy są wymagane do indywidualizacji spermatyd u Drosophila10,11, do blokowania alternatywnego szlaku nekroptotycznej śmierci komórek u myszy12,13 oraz do przetwarzania mikroRNA u C. elegans. W prawdopodobnie najdłużej żyjących komórkach neurony, kaspazy i inne mechanizmy apoptotyczne są zaangażowane w regulację aktywności neuronalnej poprzez przycinanie zakończeń synaptycznych, proces uważany za niezbędny do wzmocnienia innych synaps do uczenia się i pamięci. 16-18 Możliwe, że kaspazy ułatwiają przycinanie synaps poprzez rodzaj mini-apoptozy maleńkich wypustek neuronalnych bez śmierci całej komórki. 19 Kaspazy mogą jednak pełnić alternatywne funkcje, niezwiązane ze zdarzeniami podobnymi do apoptozy. 20,21 Podwójne role w życiu i śmierci nie są charakterystyczne wyłącznie dla kaspaz; Białka z rodziny BCL-2 i cytochrom c odgrywają rolę w energetyce komórkowej w zdrowych komórkach, ale są również częścią rdzenia szlaku apoptotycznego, który jest aktywowany przez wiele rodzajów stresu komórkowego. Chociaż nie zostało to udowodnione, wydaje się logiczne, że ewolucja powiązała pracę dzienną z pracą śmiercią w obrębie tych samych cząsteczek, aby zapewnić szybką eliminację nieodpowiednich lub niepożądanych komórek.
Obecnie nie są znane molekularne mechanizmy nieapoptotycznej aktywności kaspazy, a zakres nieapoptotycznej aktywności kaspazy podczas rozwoju embrionalnego i w tkankach dorosłych również nie jest znany. Dużym wyzwaniem jest trudność w odróżnieniu pracy dziennej od pracy na śmierć w przypadku kaspaz. W przeciwieństwie do apoptozy i pyroptozy, gdy aktywność kaspazy jest wzmacniana przez kaskadę proteolityczną, oczekuje się, że dzienne zadania kaspaz będą występować na znacznie niższych poziomach aktywności enzymatycznej, prawdopodobnie poniżej wykrytych przez wiele dostępnych technologii.
Przed prezentowaną tutaj pracą, inni opracowali różne biosensory kaspazy do różnych celów. Bioczujniki SCAT (np. ECFP-DEVD-Venus) szybko wykrywają aktywność kaspazy w czasie rzeczywistym w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych za pomocą FRET. 26,27 Po rozszczepieniu kaspazy, ugrupowanie GFP Apoliner (mCD8-RFP-DQVD-nucGFP) ulega relokalizacji subkomórkowej w ciągu kilku minut, gdy jego pęta błony komórkowej jest rozszczepiane przez kaspazy. 28 Podobnie, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) przemieszcza się z cytozolu do jądra po rozszczepieniu kaspazy. Niedawno chromofor w iCasper został sprytnie zmodyfikowany tak, aby fluoryzował po rozszczepieniu przez kaspazy, co pozwoliło na wykrycie aktywności biosensorów w czasie rzeczywistym w neuronach zarodków Drosophila, ale przede wszystkim w związku ze śmiercią komórki rozwojowej. 31 Zależna od kaspazy śmierć neuronów węchowych podczas starzenia się została wykazana przez immunodetekcję rozszczepionej przez kaspazę formy biosensorów CPV (np. mCD8-PARP-Venus). 32,33 Co ważne, aktywowana forma kaspazy-3 została wykryta przy braku śmierci komórki przez wrażliwe barwienie immunologiczne w kolcach hodowanych neuronów oraz w somie przy użyciu zależnej od kaspazy fluorescencji jądrowego barwnika reporterowego CellEvent, ale napotkano trudności z powodu fototoksyczności, chociaż śmierć komórki była opóźniona do czasu po eliminacji kręgosłupa. 19 W związku z tym potrzebne są nowe biosensory kaspazy do wykrywania i śledzenia komórek o podstawowej aktywności kaspazy in vivo.
Aby przezwyciężyć te trudności, stworzyliśmy nowatorski dwukolorowy biosensor kaspazy, nazwany CaspaseTracker. Strategia ta łączy zmodyfikowaną wersję wrażliwego na kaspazę biosensora Apoliner28 z systemem rekombinazy Drosophila G-TRACE FRT 34 w celu trwałego znakowania i śledzenia komórek in vivo. 35 System G-TRACE aktywowany przez Gal4 pozwala na bardzo niskie poziomy kaspaz do aktywacji CaspaseTracker, co skutkuje ekspresją RFP w cytoplazmie i stałą ekspresją GFP ukierunkowaną jądrowo w każdej komórce, która kiedykolwiek doświadczyła aktywności kaspazy. 35 System ten może oznaczać komórki przez całe życie u całych zwierząt za pomocą Drosophila melanogaster, łatwego w obsłudze i szeroko stosowanego systemu modelowego do badania kaspaz i śmierci komórek. 36-38 Rozdział 36-38

<table><tr><tbody><td colspan="4">Materiały eksploatacyjne i odczynniki</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Produkty wektorowe</td><td>H-1000</td><td>Kleszcze montażowe</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Pęseta Dumont klasa biologiczna, stal nierdzewna</td></tr><tr><td>Wiszące prowadnice upuszczane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Szkiełka szklane</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td></td> <td>Hoechst 33342H1399</td><td>Barwienie DNA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633</td><td>Sondy molekularne</td> falloidyny <td>A22284</td><td>Barwienie aktyny</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 przeciwciało anty-elav</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>Identyfikator rejestru przeciwciał:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>Barwnik do Drosophla pan-neuronal ELAV</td></tr><tr><td>Rozszczepione przeciwciało kaspazy-3 (Asp175)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td>#<td>9661</td><td>Barwnik do aktywnego fragmentu kaspazy-3</td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>w celu zachowania fluoroforów&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>w celu zachowania fluoroforów&nbsp;</td></tr><tr><td>SylGard 182 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>Kod produktu: 0001023934</td><td>do płytek</td></tr><tr> sekcyjnych<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LSM780 mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomikroskop Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila preparacja</td></tr><tr><td>AmScope Światłowodowy podwójny oświetlacz mikroskopu na gęsiej szyi, 150&nbsp; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Źródło światła</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Kaspazy są kluczowymi mediatorami apoptotycznej śmierci komórek poprzez ich aktywność proteolityczną. Kiedy kaspazy są aktywowane w komórkach do poziomów wykrywalnych przez dostępne technologie, ogólnie zakłada się, że apoptoza następuje wkrótce potem. Kaspazy mogą rozszczepiać wiele składników funkcjonalnych i strukturalnych, powodując szybkie i całkowite zniszczenie komórek w ciągu kilku minut. Jednak coraz więcej dowodów wskazuje, że w normalnych zdrowych komórkach te same kaspazy pełnią inne funkcje, przypuszczalnie na niższych poziomach enzymatycznych. Badania nad nieapoptotyczną aktywnością kaspazy były utrudnione przez trudności z wykryciem niskich poziomów aktywności kaspazy i śledzeniem ostatecznego losu komórek in vivo. Tutaj ilustrujemy użycie ultraczułego reportera kaspazy, CaspaseTracker, który trwale oznacza komórki, które doświadczyły aktywności kaspazy u całych zwierząt. Ten dwukolorowy bioczujnik CaspaseTracker in vivo dla Drosophila melanogaster przejściowo wyraża czerwone białko fluorescencyjne (RFP), aby wskazać niedawną lub trwającą aktywność kaspazy, i trwale wyraża zielone białko fluorescencyjne (GFP) w komórkach, które doświadczyły aktywności kaspazy w dowolnym momencie w przeszłości, ale nie umarły. Co ważne, ten zależny od kaspazy bioczujnik in vivo z łatwością ujawnia obecność nieapoptotycznej aktywności kaspazy w tkankach układów narządowych u dorosłej muchy. Wykazano to za pomocą całych sekcji poszczególnych muszek w celu wykrycia aktywności biosensorów w zdrowych komórkach w mózgu, jelitach, kanalikach malpighiego, wpustie, przewodach jajnikowych i innych tkankach. CaspaseTracker wykrywa nieapoptotyczną aktywność kaspazy w długowiecznych komórkach, ponieważ aktywność biosensora jest wykrywana w dorosłych neuronach i innych tkankach co najmniej 10 dni po aktywacji kaspazy. Ten bioczujnik służy jako ważne narzędzie do odkrywania ról i mechanizmów molekularnych nieapoptotycznej aktywności kaspazy u żywych zwierząt.

Istnieją dwa kluczowe komponenty, które pozwalają CaspaseTracker wykrywać aktywność kaspazy w normalnych, zdrowych komórkach (Rycina 1a). Pierwszym z nich jest 146-aminokwasowy polipeptyd podatny na cięcie przez kaspazy, opracowany na wzór biosensora kaspaz Apoliner (Rycina 1b).28 Polipeptyd ten pochodzi z DIAP1 (Drosophila inhibitor of apoptosis) i zawiera pojedynczą, naturalnie występującą sekwencję rozpoznawania kaspazy, która jest ...

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wykrywanie i śledzenie nieapoptotycznej aktywności kaspaz w żywych zwierzętach z wykorzystaniem *Drosophila melanogaster* jako modelu. Kaspazy są proteazami, które rozszczepiają wiele komponentów komórkowych, wywołując apoptotyczną śmierć komórek. W związku z tym przyjmuje się często, że obecność aktywnych kaspaz w komórkach odzwierciedla nadchodzącą śmierć komórkową.Jednak coraz więcej dowodów wskazuje na to, że te same kaspazy, które wywołują śmierć komórki, pełnią również normalne role w zdrowych komórkach. Do tych codziennych funkcji kaspaz należy regulacja aktywności neuronalnej, funkcji mitochondriów, a nawet tłumienie alternatywnych szlaków śmierci komórkowej. Badanie tych codziennych funkcji kaspaz wiąże się z dwiema głównymi trudnościami.Po pierwsze, normalne podstawowe poziomy aktywności kaspaz zazwyczaj znajdują się poniżej granic wykrywalności dostępnych technologii. Po drugie, nawet gdy podstawowa aktywność kaspaz jest wykrywalna, trudno ją odróżnić od aktywności kaspaz, która doprowadzi do śmierci komórki w najbliższej przyszłości. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy tracker kaspaz: bardziej czuły biosensor kaspaz, który może trwale znakować komórki, które przeżyły aktywację kaspaz.Ten biosensor pozwoli nam wykrywać i śledzić komórki o nieapoptotycznej aktywności kaspaz oraz badać ich funkcje w żywych zwierzętach. System biosensora do śledzenia kaspaz in vivo u muszki owocówki składa się z dwóch komponentów: aktywnego pod wpływem kaspaz drożdżowego transkrypcyjnego czynnika Gal4 oraz aktywowanego przez Gal4 reportera fluorescencyjnego znanego jako G-Trace.Muchy z biosensorem kaspazy są krzyżowane z muchami G-Trace w celu uzyskania much CaspaseTracker, które sygnalizują aktywność kaspazy poprzez fluorescencję czerwoną i zieloną. Aktywność kaspazy jest wykrywana w potomstwie much, gdy biosensor zostaje rozcięty przez aktywne kaspazy w sekwencji DQVD, co uwalnia Gal4 z błony plazmatycznej. Uwolniony Gal4 przemieszcza się do jądra komórkowego i indukuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego, RFP, dopóki kaspazy nie staną się nieaktywne.Jednak Gal4 indukuje również ekspresję rekombinazy FLP, co prowadzi do ciągłej ekspresji GFP skierowanego do jądra przez cały okres życia komórki. Biosensor kontrolny posiada mutację DQVA w miejscu cięcia kaspazy. Na początek skrzyżuj muszki transgeniczne niosące biosensor Gal4 wrażliwy na kaspazę z muszkami niosącymi reporter fluorescencyjny G-Trace.Sparuj od siedmiu do dziesięciu dziewiczych samic biosensora z siedmioma do dziesięciu nowo wyklutych samców much G-Trace w świeżej fiolce z pożywką. Ważną kontrolą negatywną jest wersja tego biosensora niewrażliwa na kaspazę, która posiada pojedynczą mutację punktową w reszcie asparaginianu niezbędnej do rozszczepienia przez kaspazę. Dla tych much kontrolnych zastosuj tę samą procedurę kojarzenia.Po przeprowadzeniu krzyżówek należy przechowywać probówki w temperaturze 18 stopni Celsjusza. W czasie rozwoju larw, przed wykluciem się nowego pokolenia much, należy przenieść muchy rodzicielskie do nowych probówek w celu dalszej produkcji potomstwa. Po wykluciu się much potomnych należy zebrać osobniki z prostymi, niezakręconymi skrzydłami.Ten fenotyp wskazuje, że muchy te są nosicielami transgenów zarówno dla biosensora kaspazy, jak i fluorescencyjnego reportera G-Trace. Następnie, zgodnie z ustalonymi protokołami, przeprowadź sekcję much w celu wyizolowania nienaruszonych wewnętrznych tkanek miękkich zarówno z much z trackerem kaspazy, jak i z much kontrolnych. Na początek przygotuj końcówki do pipet oraz probówki do wirowania, które nie będą przylegać do wysekcjonowanych tkanek.Aby to zrobić, należy pokryć końcówki i probówki roztworem jednej procentowej albuminy surowicy bydlęcej rozpuszczonej w wodzie. W celu utrwalenia wypreparowanych tkanek, do pokrytych probówek z przezroczystymi ściankami należy wprowadzić 0,5 ml świeżego czteroprocentowego paraformaldehydu w PBS, a następnie przenieść świeżo wypreparowane tkanki do tych probówek. Następnie tkanki należy umieścić w temperaturze pokojowej w ciemności, aby uniknąć fotowyblaknięcia, i inkubować przez 20 do 30 minut przy delikatnym obracaniu, aby tkanki były stale obmywane utrwalaczem, unikając jednocześnie ich uszkodzenia.Zbyt długie utrwalanie może prowadzić do nieoptymalnego barwienia tkanek. Aby usunąć paraformaldehyd i rozpocząć permeabilizację błon utrwalonych tkanek, delikatnie odessać roztwór paraformaldehydu za pomocą powlekanej końcówki pipety i przemyć tkanki trzy razy 0,5 ml PBST. W celu całkowitej permeabilizacji tkanek oraz zablokowania niespecyficznego wiązania w kolejnych procedurach barwienia, inkubować tkanki w 0,5 ml PBST zawierającego 1% BSA w temperaturze 4 °C przez noc w ciemności, przy delikatnym obracaniu.Następnego dnia usuń roztwór PBST BSA, przemywając trzy razy permeabilizowane tkanki 0,5 ml PBST. Aby pomóc w wizualizacji różnych struktur tkankowych, przeprowadź równoczesne barwienie DNA jądrowego i cytoplazmatycznej F-aktyny, inkubując przygotowane tkanki w 0,5 ml PBST zawierającego niebieski barwnik jądrowy Hoechst 33342 oraz barwnik F-aktyny Alexa Fluor 633 phalloidin przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym obracaniu. Usuń nadmiar barwnika, przemywając tkanki trzy razy 0,3 ml PBST.Inkubować każde przemycie przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym obracaniu. Ostrożnie usunąć cały roztwór z tkanek w probówce za pomocą końcówki pipety o małej średnicy. Aby zachować sygnał fluorescencyjny podczas obrazowania, dodać 200 µL środka do montowania przeciwko blaknięciu, całkowicie pokrywając tkanki.Inkubuj tkanki od jednej do trzech godzin w temperaturze pokojowej lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Optymalnie tkanki, które całkowicie wchłonęły środek montażowy, opadną na dno probówki. Przed montowaniem tkanek oczyść szkiełko przedmiotowe wodą lub 70% etanolem.Nanieś wazelinę na szkiełko przedmiotowe oraz szkiełko nakrywkę, aby zapobiec zniszczeniu tkanek w wyniku nadmiernego ucisku. Następnie przenieś tkanki wraz z medium montażowym na szkiełko przedmiotowe. Usuń nadmiar medium montażowego za pomocą chłonnej ręcznika papierowego.Na koniec uszczelnij szkiełko nakrywką, nakładając lakier do paznokci wzdłuż wszystkich krawędzi. Następnie umieść preparat na stole mikroskopu odwróconego. Wykonaj obrazy komórek, używając obiektywu 20x Plan-Apochromat z aperturą 0,8.Wykonaj kilka obrazów próbnych w niskiej rozdzielczości, aby zweryfikować plan układania kafelków obrazu, który obejmie obszar zainteresowania, którym w tym przypadku jest cały wewnętrzny układ narządowy muchy. Ustaw sekwencję obrazowania, zaczynając od najdłuższej długości fali wzbudzenia, a kończąc na najkrótszej. Zminimalizuje to fotobleaching, który nasila się przy krótszych długościach fal.Następnie należy wykonać obrazy z odpowiednio wysoką rozdzielczością. Każdy obraz powinien nakładać się na kolejny w 10%, aby umożliwić prawidłowe zestawienie kafelków. Należy zebrać od dwóch do ośmiu skanów obrazowania na kafelek w celu zredukowania szumu tła.Aby wyeliminować cienie pomiędzy kafelkami obrazu uzyskanymi za pomocą kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC), należy wykonać obraz referencyjny DIC pustego obszaru. Następnie należy przeprowadzić korekcję cieni obrazu kafelkowego przy użyciu obrazu referencyjnego DIC. Przedstawiona jest preparowana, nowo wykluta mucha z markerem kaspazy, z widocznymi aparatami gębowymi, przedjelitem, wolem, jelitem środkowym, jelitem końcowym, odbytem, jajowodem i jajnikami.Za pomocą mikroskopii konfokalnej aktywność kaspazy wizualizowana jest poprzez fluorescencję RFP, która wskazuje na niedawną aktywność kaspazy, oraz fluorescencję GFP, która wskazuje na aktywność kaspazy w przeszłości. Powiększone obrazy ujawniają aktywność biosensorów RFP i GFP w płacie optycznym, sercu, jelicie środkowym, jelicie tylnym i jajowodzie. Konkretne komórki wzdłuż cewek Malpighiego wyraźnie wykazują zarówno RFP, jak i GFP, co wskazuje na trwałą aktywność kaspazy.W przeciwieństwie do tego, w komorach jajowych nie stwierdzono aktywności biosensora RFP ani GFP, choć na podstawie wspólnego barwienia z F-aktyną wykazano ekspresję biosensora w komórkach mięśniowych pomiędzy komorami jajowymi. Jednakże komórki komór jajowych są zdolne do aktywacji kaspaz, jeśli muchy zostaną poddane bodźcowi śmierci komórkowej, takiemu jak głodzenie lub szok termiczny (zimno), co na podstawie immunobarwienia powoduje destrukcję jąder i masową aktywację kaspaz. Marker kaspaz prawdopodobnie pojawia się wczesnym etapie, a następnie ulega zniszczeniu podczas śmierci komórki.W płacie optycznym mózgu zdrowej muchy wyposażonej w marker kaspazy wykryto aktywność biosensora w zdrowych komórkach, które na podstawie barwienia współistniejącego z pan-neuronalnym markerem przeciwciałem anty-ELAVI wydają się być neuronami. Sugeruje to rolę nieapoptotycznej aktywności kaspazy w neuronach. Do wykazania długoterminowego przeżycia komórek z aktywnością kaspazy można zastosować inne strategie, takie jak wyłączenie ekspresji biosensora przy użyciu narzędzi genetycznych.Na przykład GalADTS, który hamuje Gal4. Detektor kaspazy specyficznie raportuje aktywność kaspazy; w przypadku kontrolnego, niepodatnego na cięcie biosensora DQVA, nie następuje aktywacja. Jedyny sygnał w próbkach kontrolnych wynika z autofluorescencji pozostałej kutykuli na częściach gębowych i odbycie oraz spożytego pokarmu, drożdży, w wole i żołądku.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać biosensor caspase tracker do śledzenia nieapoptotycznej aktywności kaspaz u muszek owocówek. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest uwzględnienie kontroli negatywnych, aby odróżnić sygnały biosensora kaspazy od autofluorescencji. Na przykład kutykula i ciała tłuszczowe wykazują silną autofluorescencję u much z biosensorem lub bez niego.Obecna wersja biosensora do śledzenia kaspaz została zaprojektowana do wykrywania aktywnej kaspazy DRICE. Inne zastosowania mogą obejmować biosensory specyficzne dla różnych kaspaz, poprzez zastąpienie miejsca cięcia rozpoznawanego przez DRICE miejscem cięcia rozpoznawanym przez inne kaspazy.

in-vivo-biosensor-tracks-non-apoptotic-caspase-activity-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Embrionalny naskórek zarodków Drosophila w bardzo późnym stadium dostarcza systemu in vivo do szybkiej analizy reakcji na nakłucie rany i może być łączony z manipulacjami genetycznymi lub chemicznymi zabiegami mikroiniekcji w celu przyspieszenia badań nad gojeniem się ran w celu translacji na modele ssaków.

Test mikroiniekcji rany i lokalizacja in vivo reporterów odpowiedzi naskórka na ranę w zarodkach Drosophila.

Pewne zaburzenia genetyczne lub narażenie na toksyny mogą zakłócić normalne procesy rozwojowe, prowadząc do śmierci określonych typów komórek. Analiza aktywowanej kaspazy 3 metodą immunofluorescencji całej góry w zarodkach danio pręgowanego ujawnia specyficzną dla etapu i tkanki lokalizację komórek specyficznie ulegających apoptozie.

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania ran na żywo i związanej z tym reakcji zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej in vivo. Metoda ta wykorzystuje stadium poczwarki rozwoju Drosophila, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie i śledzenie określonych populacji komórek w czasie i jest kompatybilna z wydajną inaktywacją genów za pośrednictwem RNAi.

Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania i oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila Dronc i Drice oraz ich zastosowanie w testach rozszczepienia in vitro.

In vitro Testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz Drosophila do badań przesiewowych substratów

Poznaj metodę wykrywania nieapoptozowej aktywności kaspaz w zdrowych komórkach Drosophila za pomocą biosensora CaspaseTracker. To narzędzie pozwala śledzić aktywność enzymów w żywych organizmach.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów