In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie i śledzenie nieapoptotycznej aktywności kaspazy u żywych zwierząt przy użyciu Drosophila Melanogaster jako modelu. Kaspazy to proteazy, które rozszczepiają wiele składników komórkowych, powodując apoptozę śmierci komórki. Dlatego często zakłada się, że obecność aktywnych kaspaz w komórkach odzwierciedla zbliżającą się śmierć komórki.

Jednak coraz więcej dowodów wskazuje, że te same kaspazy, które powodują śmierć komórki, pełnią również normalne role w zdrowych komórkach. A te codzienne zadania kaspaz obejmują regulację aktywności neuronalnej, funkcji mitochondriów, a nawet tłumienie alternatywnych ścieżek śmierci komórki. Istnieją dwie główne trudności w badaniu codziennej pracy kaspaz.

Po pierwsze, normalne podstawowe poziomy aktywności kaspazy są zazwyczaj poniżej granic wykrywalności za pomocą dostępnych technologii. Po drugie, nawet jeśli podstawowa aktywność kaspazy jest wykrywalna, trudno jest ją odróżnić od aktywności kaspazy, która doprowadzi do śmierci komórki w najbliższej przyszłości. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy tracker kaspazy: bardziej czuły bioczujnik kaspazy, który może trwale oznaczać komórki, które przetrwały tę aktywację kaspazy.

Ten bioczujnik umożliwi nam wykrywanie i śledzenie komórek o nieapoptotycznej aktywności kaspazy oraz badanie jej funkcji u żywych zwierząt. System biosensorów do śledzenia kaspazy in vivo Drosophila składa się z dwóch elementów. Aktywowany kaspazą transkryptor drożdży Gal4 i aktywowany Gal4 fluorescencyjny reporter znany jako G-Trace.

Muchy z biosensora kaspazy są krzyżowane z muchami G-Trace w celu wygenerowania much CaspaseTracker, które zgłaszają aktywność kaspazy jako czerwoną i zieloną fluorescencję. Aktywność kaspazy jest wykrywana u much potomnych, gdy bioczujnik jest rozszczepiany przez aktywne kaspazy w sekwencji DQVD, uwalniając Gal4 z błony komórkowej. Uwolniony Gal4 przemieszcza się do jądra i indukuje ekspresję białka czerwonej fluorescencji, RFP, aż kaspazy staną się nieaktywne.

Jednak Gal4 indukuje również ekspresję rekombinazy FLP, co prowadzi do ciągłej ekspresji GFP ukierunkowanego na jądro przez całe życie komórki. Bioczujnik kontrolny ma mutację, DQVA, w miejscu rozszczepienia kaspazy. Na początek skrzyżuj transgeniczne muchy z wrażliwym na kaspazę biosensorem Gal4 z muchami przenoszącymi reporter fluorescencyjny G-Trace.

Połącz od siedmiu do 10 dziewiczych samic biosensora z siedmioma do 10 nowo zamkniętymi samcami much G-Trace w fiolce ze świeżą żywnością. Ważną kontrolą ujemną jest niewrażliwa na kaspazę wersja tego biosensora, która ma jednopunktową mutację w reszcie asparaginianu wymaganej do rozszczepienia kaspazy. Tę samą procedurę krycia należy zastosować dla tych much kontrolnych.

Po ustawieniu krzyżyków trzymaj fiolki w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Kiedy larwy się rozwijają, a przed zamknięciem się nowego potomstwa, przenieś muchy rodzicielskie do nowych fiolek, aby kontynuować produkcję nowego potomstwa. Kiedy pojawią się muchy potomne, zbierz te z prostymi, niekędzierzawymi skrzydłami.

Ten fenotyp wskazuje, że muchy te przenoszą transgeny zarówno dla biosensora kaspazy, jak i fluorescencyjnego reportera G-Trace. Następnie, zgodnie z ustalonymi protokołami, należy przeprowadzić sekcję much, aby wyizolować nienaruszone wewnętrzne tkanki miękkie zarówno od muchy śledzącej kaspazę, jak i kontrolnej. Na początek przygotuj końcówki do pipet i probówki wirówkowe, które nie będą przyklejać się do wypreparowanych tkanek.

Aby to zrobić, pokryj końcówki i probówki jednoprocentową albuminą surowicy bydlęcej rozpuszczoną w wodzie. Aby utrwalić wypreparowane tkanki, załaduj powlekane rurki o przezroczystych ściankach pięciomililitrowymi świeżymi czteroprocentowymi subformaldehydami w PBS i przenieś świeżo wypreparowane tkanki do tych probówek. Następnie umieść chusteczki w temperaturze pokojowej w ciemności, aby uniknąć fotowybielania i inkubuj przez 20 do 30 minut z delikatnym obracaniem, aby kąpać tkanki z fixem, unikając uszkodzenia tkanek.

Dłuższe fiksacje mogą prowadzić do nieoptymalnego zabarwienia tkanek. Aby usunąć paraformaldehyd i zainicjować przenikanie błony przez utrwalone tkanki, delikatnie usuń roztwór paraformaldehydu za pomocą powlekanej końcówki pipety i umyj tkanki trzykrotnie pięciomililitrowym PBST. Aby zakończyć przenikanie tkanek i zablokować niespecyficzne wiązanie w kolejnych procedurach barwienia, należy inkubować tkanki w punkcie pięciu mililitrów PBST zawierających jeden procent BSA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w ciemności z delikatnym obracaniem.

Następnego dnia usuń roztwór PBST BSA, przemłukując przepuszczalne tkanki trzykrotnie pięciomililitrowym punktem PBST. Aby pomóc w wizualizacji różnych struktur tkankowych, współbarwić jądrowe DNA i cytoplazmatyczną F-aktynę, inkubując przygotowane tkanki w punkcie pięciu mililitrów PBST zawierającym fałszywy niebieski barwnik jądrowy 33342 i barwnik F-aktyny falloidyny Alexofluor 633 przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatną rotacją. Usuń nadmiar plamy, myjąc chusteczki trzykrotnie trzema mililitrami PBST.

Inkubacja każdego prania przez pięć minut w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem. Ostrożnie usunąć cały roztwór z tkanek w probówce za pomocą cienkiej końcówki pipety. Aby zachować sygnał fluorescencyjny podczas obrazowania, dodaj 200 mikrolitrów środka mocującego przeciw wybielaniu, całkowicie pokrywając tkanki.

Inkubuj tkanki przez jedną do trzech godzin w temperaturze pokojowej lub w czterech stopniach Celsjusza przez noc. Optymalnie, tkanki, które w pełni wchłonęły środek mocujący, opadną na dno tuby. Przed zamontowaniem chusteczek należy oczyścić szkiełko wodą lub 70% etanolem.

Nanieść wazelinę na szkiełko podstawowe i na szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć zniszczenia tkanek przez nadmierną kompresję. Następnie przenieś chusteczki ze środkiem montażowym na szkiełko podstawowe. Usuń nadmiar środka montażowego za pomocą bibuły.

Na koniec uszczelnij szkiełko nakrywkowe, nakładając lakier do paznokci wzdłuż krawędzi. Aby rozpocząć, umieść szkiełko na stoliku odwróconego mikroskopu. Rejestruj obrazy komórek za pomocą obiektywu planapochromatycznego o powiększeniu 20x i aperturze ósemki.

Wykonaj kilka zdjęć testowych w niskiej rozdzielczości, aby zweryfikować plan kafelkowania obrazu, który obejmie obszar zainteresowania, którym w tym przypadku jest kompletny system narządów wewnętrznych muchy. Ustaw sekwencję obrazu, zaczynając od najdłuższej długości fali wzbudzenia, a kończąc na najkrótszej długości fali wzbudzenia. Zminimalizuje to fotowybielanie, które nasila się przy krótszych długościach fal.

Następnie wykonuj zdjęcia w odpowiednio wysokiej rozdzielczości. Każdy obraz powinien pokrywać się w 10% z następnym, aby pomyślnie ułożyć kafelki. Zbierz od dwóch do ośmiu skanów obrazowania na kafelek, aby zredukować szumy tła.

Aby wyeliminować cień między kafelkami obrazu wynikający z różnicowego kontrastu interferencyjnego, DIC, należy wykonać referencyjny obraz DIC w pustym obszarze. Następnie wykonaj korekcję cieni na obrazie kafelka za pomocą referencyjnego obrazu DIC. Jest to wypreparowana, nowo zamknięta mucha śledząca kaspazę z aparatem gębowym, jelitem przednim, plonem, jelitem środkowym, jelitem tylnym, odbytem, jajowodem i jajnikami.

Za pomocą mikroskopii konfokalnej aktywność kaspazy jest wizualizowana jako fluorescencja RFP, która wskazuje na niedawną aktywność kaspazy, oraz przez fluorescencję GFP, która wskazuje na aktywność kaspazy w przeszłości. Powiększone obrazy ujawniają aktywność biosensora RFP i GFP w płacie wzrokowym, wpdniu, jelicie środkowym, jelicie tylnym i jajowodzie. Specyficzne komórki wzdłuż kanalików Malpighiego wyraźnie wykazują zarówno RFP, jak i GFP, co wskazuje na trwałą aktywność kaspazy.

W przeciwieństwie do tego, w komorach jajowych nie wyrażono aktywności biosensora RFP ani GFP, chociaż bioczujnik był wyrażany w komórkach mięśniowych między komorami jajowymi w oparciu o współbarwienie barwnikiem F-aktyny. Jednak komórki komór jajowych są zdolne do aktywacji kaspaz, jeśli muchy są traktowane bodźcem śmierci komórki, takim jak głód lub szok zimny, który powoduje zniszczenie jądrowe i masową aktywację kaspazy w oparciu o barwienie immunologiczne. Tracker kaspazy prawdopodobnie pojawia się wcześnie, a następnie ulega zniszczeniu podczas śmierci komórki.

W płacie wzrokowym zdrowego mózgu muchy śledzącej kaspazę aktywność biosensora jest wykrywana w zdrowych komórkach, które wydają się być neuronami, w oparciu o barwienie za pomocą markera pan-neuronalnego przeciwciała anty-ELAVI. Sugeruje to rolę nieapoptotycznej aktywności kaspazy w neuronach. Inne strategie mogą być wykorzystane do wykazania długoterminowego przeżycia komórek z aktywnością kaspazy, takie jak wyłączenie ekspresji biosensorów za pomocą narzędzi genetycznych.

Na przykład GalADTS, który hamuje Gal4. Tracker kaspazy w szczególności zgłasza aktywność kaspazy jako kontrolny nietryskający biosensor, DQVA nie jest aktywowany. Jedynym sygnałem w kontrolach jest autofluorescencja z pozostałego naskórka na narządu gębowym i odbycie oraz spożyty pokarm, drożdże, w uprawie i sercu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać biosensora śledzącego kaspazę do śledzenia nieapoptotycznej aktywności kaspazy u muszek owocowych. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby uwzględnić kontrole ujemne, aby odróżnić sygnały biosensora kaspazy od autofluorescencji. Na przykład naskórek i ciała tłuszczowe wytwarzają silną autofluorescencję u muszek z biosensorem lub bez niego.

Obecna wersja biosensora śledzącego kaspazę jest przeznaczona do wykrywania aktywnej kaspazy DRICE. Inne zastosowania mogą obejmować biosensory specyficzne dla różnych kaspaz poprzez zastąpienie miejsca rozszczepienia rozpoznanego przez DRICE miejscem rozszczepienia rozpoznanym przez inne kaspazy.