Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja odpowiedzi na terapię przeciwnowotworową w pojedynczych komórkach w hodowli. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, w tym w kwestii heterogenicznej odpowiedzi terapeutycznej oraz losu komórek. Na początek, w certyfikowanej sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy przygotować komórki HT1080 w naczyniach certyfikowanych do hodowli zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych.

Na dwa dni przed obrazowaniem, wysiej 50 000 komórek HT1080 FuGENE na studzienkę w odpowiedniej liczbie studzienek 12-dołkowej płytki ze szklanym dnem o grubości no. 1,5. Dostosuj liczbę wysiewanych komórek w zależności od tempa ich wzrostu i zastosowanej płytki, aby w momencie rozpoczęcia eksperymentu uzyskać około 60% konfluencji.

Przygotuj komorę środowiskową, ustawiając wilgotność na około 80% oraz temperaturę w miejscu próbki na 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że zbiornik na wodę jest wypełniony sterylną wodą destylowaną zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie włącz komorę środowiskową, ustawiając ją na pożądaną temperaturę, umieść ją na stoliku mikroskopu i odpowiednio ustaw.

Jeśli między górną komorą stolika a wkładką stolika występuje wolna przestrzeń, przed włożeniem komory należy położyć kawałki folii parafiny na krawędziach otworu wkładki stolika, aby połączyć komorę ze stolikiem. Należy upewnić się, że żadne połączenia nie wywierają nacisku na komorę, gdyż oba te czynniki mogą wprowadzić artefakty ruchowe. Do komory należy włożyć pustą szalkę z wodą i pozwolić komorze wyrównać temperaturę do 37 °C, a następnie utrzymać stabilną temperaturę.

Aby przygotować system do obrazowania, należy włączyć mikroskop, komputer oraz wszelkie niezbędne urządzenia peryferyjne. W zależności od rodzaju źródła światła, włącz je dopiero w momencie, gdy będzie ono potrzebne. Przy obrotowej głowicy z obiektywami w niskiej pozycji, wybierz obiektyw 20x o aperturze numerycznej 0,7.

Następnie ustaw próbkę nad obiektywem, co ułatwi odnalezienie komórek po umieszczeniu próbki w komorze. Po przeniesieniu komórek przeznaczonych do obrazowania do komory środowiskowej, zgodnie z protokołem tekstowym, zamknij szczelnie komorę, aby utrzymać stabilne środowisko, i włącz dopływ gazów atmosferycznych. Następnie wybierz warunki obrazowania, które zapobiegną fototoksyczności poprzez ograniczenie czasu ekspozycji i zastosowanie światła o niższej intensywności.

W celu wyznaczenia płaszczyzn X, Y i Z oraz wybrania pożądanych długości fal dla każdej pozycji do obrazowania. W przypadku długoterminowego obrazowania poklatkowego większości procesów komórkowych, należy pobierać jeden obraz co dziesięć do dwudziestu minut. Wyższa rozdzielczość czasowa dostarcza więcej punktów danych i umożliwia bardziej precyzyjne śledzenie komórek, ale skutkuje większą całkowitą ekspozycją na światło oraz większymi zbiorami danych.

Ponieważ HT1080 FuGENE posiadają dynamiczne zielone i czerwone białka fluorescencyjne, należy zastosować następujące czasy ekspozycji oraz binowanie 2x2. W ustawieniach zaawansowanych należy włączyć sterowane programowo automatyczne ustawianie ostrości (auto-focusing), korzystając z domyślnych parametrów. Zdefiniuj zakres automatycznego ustawiania ostrości na 10 micrometers przy zalecanym rozmiarze kroku.

W naczyniu eksperymentalnym, aby zredukować dryft termiczny, należy zastąpić połowę pożywki pożywką zawierającą odpowiedni lek, podgrzaną do 37 °C. Na koniec należy rozpocząć rejestrację poklatkową i pobierać obrazy zgodnie z protokołem tekstowym. Filmy te przedstawiają przykłady pary dopasowanych linii komórkowych MCF7 pochodzących z raka piersi, które różnią się jedynie statusem p53, i które zostały poddane działaniu leku przeciwnowotworowego hamującego kinezynę-5, co doprowadziło do zatrzymania mitozy.

Jak widać na tej rycinie, gdy p53 zostaje usunięte poprzez trwały knockdown p53, zamiast zatrzymać się po opuszczeniu mitozy, komórki przechodzą przez powtarzające się cykle, w których wchodzą w drugą rundę mitozy zamiast przejść w stan spoczynku i opuszczają mitozę bez podziału. Przedstawiono tutaj komórki HeLa pochodzące z raka szyjki macicy, stabilnie eksponujące marker chromatyny Histone 2b połączony z mCherry oraz beta-tubulinę połączoną z EGFP. Po podaniu paclitaxolu, leku stabilizującego mikrotubule, dochodzi do zaburzenia ustawienia i segregacji chromosomów podczas mitozy, co prowadzi do powstania wypukłości jądra oraz mikrojąder, które są podatne na uszkodzenia DNA.

Ta linia komórkowa stabilnie koekspresuje dwa fluorescencyjne wskaźniki cyklu komórkowego oparte na ubikwitynie dla CDT1, w kolorze pomarańczowym, oraz gemininy w kolorze zielonym, i przebiega przez cykl komórkowy w sposób prawidłowy. Gdy te same komórki są traktowane inhibitorem CDK46, przechodzą one przez fazę G2 i dzielą się normalnie, a następnie ulegają silnemu zatrzymaniu w fazie G1, co wskazuje na potencjał do wywołania skutecznych efektów cytostatycznych w rosnących guzach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego śledzenia odpowiedzi pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym przez wiele dni, zamiast wyciągania wniosków na temat tych reakcji.