Name: Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj mikroskopię poklatkową do długoterminowego śledzenia pojedynczych komórek w odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe. Ta metoda umożliwia obserwację heterogenicznych reakcji terapeutycznych komórek HT1080 i HeLa w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Joshua Marcus za wsparcie techniczne i Jolien Tyler, Ph.D., Dyrektor Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, za porady techniczne. Praca ta była wspierana przez fundusze z University of Colorado Boulder i University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. jest częściowo wspierana przez grant na szkolenie przeddoktoranckie z NIH (T32 GM008759). Dziękujemy firmie Karyopharm Therapeutics, Inc. za selinexor i Merck Serono za inhibitor Kinesin-5. Plazmidy FUCCI pochodzą od Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japonia) za pośrednictwem MTA. mCherry-BP1-2 pochodził z firmy Addgene. HeLa wykazujące ekspresję H2b-mCherry i β-tubuliny-EGFP pochodzą od Daniela Gerlicha (IMBA, Austriacka Akademia Nauk, Austria).

Poniższy protokół wykorzystuje parametry zdefiniowane przez eksperymenty na rysunkach 4 i 6 dotyczące ustawień akwizycji i warunków eksperymentalnych. Wiele z tych parametrów można modyfikować w celu dopasowania do innych eksperymentów (np. czasy ekspozycji, binning, kanały fluorescencyjne itp.). Wszystkie procedury muszą być zgodne z wytycznymi i przepisami instytucjonalnymi oraz muszą zostać zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego. Strony internetowe producentów mikroskopów zawierają doskonałe informacje na temat obrazowania żywych komórek.
1. Mikroskopy i oprogramowanie do obrazowania
<ol>
	<li>Wykonuj obrazowanie żywych komórek na szerokiej gamie mikroskopów odwróconych. Najczęściej stosowanymi mikroskopami są mikroskopy szerokopolowe, epifluorescencyjne i konfokalne z wirującym dyskiem. W tym przypadku użyj zautomatyzowanego i zmotoryzowanego mikroskopu epifluorescencyjnego o szerokim polu z 200-watowym źródłem światła metalohalogenkowego.</li>
	<li>Zaopatrz się w komorę środowiskową typu stage-top lub mikroskopową. W tym przypadku należy użyć komory środowiskowej typu stage top.</li>
	<li>Korzystaj z komercyjnego oprogramowania do obsługi mikroskopów z narzędziami do wykonywania mikroskopii poklatkowej.</li>
	<li>Do analizy obrazu należy używać dostępnego na rynku oprogramowania lub ImageJ. Wiele innych narzędzi analitycznych jest dostępnych na rynku, a także programy na zamówienie, z których wiele zostało opublikowanych8,18.</li>
</ol>
2. Wizualizacja procesów komórkowych i reakcji fenotypowych
<ol>
	<li>Wizualizacja komórek za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Sam kontrast interferencyjny różnicowy i kontrast fazowy mogą być bardzo pouczające w badaniu odpowiedzi na odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe. Procesy te mogą obejmować mitozę, ruchliwość komórek i apoptozę.</li>
	<li>Wizualizacja struktur komórkowych, organelli i procesów za pomocą biosensorów fluorescencyjnych. Sondy fluorescencyjne są przydatne w śledzeniu określonych procesów subkomórkowych. Mogą one obejmować dynamikę mikrotubul, dynamikę retikulum mitochondrialnego i endoplazmatycznego, akumulację i lokalizację białek oraz sygnalizację molekularną (np. fosforylację, wapń).</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Hoduj komórki w certyfikowanych naczyniach do hodowli komórkowych w standardowym, wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych (np. 37 oC, 5% CO2, 80% wilgotności względnej).
	<ol>
		<li>Hoduj komórki HT1080 w MEM za pomocą EBSS. Uzupełnij pożywkę o 10% v/v FBS, 1% v/v Pen/Strep, 1% v/v pirogronianu sodu i 1% v/v aminokwasów endogennych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dwa dni przed obrazowaniem umieść 50 000 komórek HT1080 FUCCI w 3 dołkach 12-dołkowego naczynia ze szklanym dnem #1,5 w certyfikowanym sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Dostosuj liczbę posianych komórek, aby osiągnąć ~60% konfluencji na początku eksperymentu. W zależności od linii komórkowej i charakteru eksperymentu gęstość komórek może być mniejsza. 
	Uwaga: Gęstość komórek może mieć głęboki wpływ na wzrost linii komórkowej i na wyniki eksperymentalne. Policz komórki, aby zminimalizować zmienność między eksperymentami wynikającą z gęstości.
	<ol>
		<li>W zależności od komory środowiskowej i warunków niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu, płytki w jednodołkowych szalkach (zwykle 35 lub 60 mm), 4-dołkowych szalkach 35-milimetrowych, 6-, 12- lub 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych lub szkiełkach nakrywkowych w różnych formatach. Używaj płytek ze szklanym dnem ze szkłem #1.5, ponieważ większość soczewek obiektywowych jest zoptymalizowana pod kątem tej grubości szkła, a obrazowanie za pomocą plastiku do hodowli komórkowych jest bardzo słabe. 
		Uwaga: Niektóre linie komórkowe nie rosną i nie przetrwają na szkle. W takich przypadkach szkło może być powlekane w celu zwiększenia przylegania komórek (np. polilizyna lub kolagen). Niektóre firmy produkują plastik do optycznych hodowli komórkowych, należy określić empirycznie, czy jest to realna opcja.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konfiguracja komory środowiskowej
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do jakichkolwiek eksperymentów należy ustawić komorę środowiskową tak, aby działała przy wilgotności ~80%, a temperatura w pozycji próbki wynosiła 37 oC. Większość hodowanych komórek rośnie w atmosferze 5% CO2 / zrównoważonej atmosfery powietrznej ze względu na bufor wodorowęglanu sodu w pożywce. W zależności od konfiguracji, ustaw regulator środowiskowy na 5% CO2 i zmiesza 100% CO2 z powietrzem lub użyj wstępnie zmieszanego, certyfikowanego 5% CO2 / równoważącego gazu powietrznego. Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dotyczącymi natężeń przepływu gazu. 
	Uwaga: Niektóre linie komórkowe rosną w pożywce niezależnej od CO2 , w którym to przypadku mogą być utrzymywane bez CO2 . Dostępne są również specjalnie zaprojektowane nośniki do obrazowania, które ograniczają dodawanie związków autofluorescencyjnych. Wzrost w tych pożywkach dla pożądanego typu komórki musi być wcześniej określony empirycznie.</li>
	<li>Przed obrazowaniem upewnij się, że zbiornik na wodę jest napełniony (zgodnie ze wskazówkami producenta) sterylną wodą destylowaną. Włącz komorę środowiskową do żądanego ustawienia temperatury i umieść ją we wstawce stolika mikroskopu. Aby oszczędzać gaz, nie rozpoczynaj przepływu w tym momencie. 
	Uwaga: Jeśli między komorą sceniczną a wstawką sceniczną jest jakakolwiek wolna przestrzeń i/lub jakiekolwiek napięcie przewodów łączących z komorą, może to wprowadzić do eksperymentu artefakty ruchu.
	<ol>
		<li>Połóż kawałki folii parafinowej na krawędziach otworu wstawnego stolika przed włożeniem do niego komory, aby połączyć komorę ze stolikiem i upewnij się, że żadne połączenia nie ciągną się za komorę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwól, aby komora zrównoważyła się do 37 oC. Utrzymuj stabilną temperaturę, aby zapobiec wahaniom temperatury podczas obrazowania, które mogą wpływać na fizjologię komórki i powodować dryft. Osiągnięcie równowagi temperaturowej zwykle wymaga od 30 minut do 1 godziny, w zależności od środowiska.
	<ol>
		<li>Włóż "atrapę" naczynia z wodą z dołków do komory podczas podgrzewania. Naczynie do obrazowania wypełnione wodą naśladuje próbkę, pomagając zapewnić, że komora jest wystarczająco ogrzana i ustabilizowana. Napełnianie komory wstępnie podgrzaną sterylną wodą skraca czas potrzebny do stabilizacji temperatury i minimalizuje spadek temperatury po dodaniu próbki doświadczalnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ustawienie mikroskopu
<ol>
	<li>Włącz mikroskop, powiązany komputer i wszystkie wymagane urządzenia peryferyjne.
	<ol>
		<li>W zależności od źródła światła poczekaj z włączeniem go, aż będzie potrzebne (np. dioda LED).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy wieżyczka obiektywu znajduje się nisko, wybierz obiektyw 20X 0,7 NA, który ma być używany.</li>
	<li>Umieść próbkę nad obiektywem - ułatwi to odnalezienie komórek, gdy próbka znajduje się w komorze.</li>
	<li>Zdefiniuj parametry obrazowania w tym momencie, jeśli są znane z poprzednich eksperymentów.</li>
</ol>
6. Transport komórek do mikroskopu i do komory
<ol>
	<li>Komórki, które mają być zobrazowane, należy przetransportować z inkubatora do komory środowiskowej. Upewnij się, że zostanie to zrobione szybko, aby ograniczyć wpływ atmosfery o stosunkowo niskiej zawartości CO2 i obniżonej temperatury na ogniwa. Postępuj zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego dotyczącymi transportu próbek i sprzątania w przypadku wycieku.
	<ol>
		<li>Umieść komórki w szczelnie zamkniętym pojemniku styropianowym lub izolowanej torbie, aby uniknąć dużych zmian środowiskowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż próbkę naczynia do obrazowania do komory zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
	<li>Po zabezpieczeniu ogniw w komorze środowiskowej należy uszczelnić komorę, aby utrzymać stabilne środowisko i natychmiast włączyć źródło (źródła) gazu atmosferycznego.
	<ol>
		<li>Ponieważ niektóre komory środowiskowe nie wykorzystują szczelnej, szczelnej pokrywy, aby opóźnić parowanie, na pożywkę wzrostową należy nałożyć sterylny, certyfikowany przez zarodki olej mineralny. Owinąć przepuszczaną gazem folię parafinową wokół krawędzi obwodowych naczynia na próbkę, uważając, aby nie zasłaniać szklanego obszaru obrazowania. Można zastosować miejscowe, wtórne metody nawilżania. Kondensacja na pokrywie naczynia na próbkę może zmniejszyć wydajność mikroskopii w jasnym polu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zminimalizować skutki dryfu termicznego na wczesnym etapie eksperymentu, należy odczekać 30 minut przed rozpoczęciem filmu poklatkowego. Wymagany czas różni się w zależności od wielkości naczynia do obrazowania i innych czynników. Określ empirycznie.</li>
</ol>
7. Konfiguracja obrazowania
<ol>
	<li>Wybierz warunki obrazowania, które będą najlepiej reprezentować dane. Podejmij środki ostrożności, aby uniknąć fototoksyczności, ograniczając czas ekspozycji, używając światła o mniejszej intensywności i wybierając sondy, które są wzbudzane przez dłuższe fale światła.</li>
	<li>Zdefiniuj płaszczyznę x, y i z oraz żądane długości fal dla każdej pozycji, która ma być obrazowana. Rozdzielczość czasowa jest ograniczona liczbą pozycji i długościami fal. W przypadku długotrwałego upływu czasu większości procesów komórkowych należy uzyskać jeden obraz co 10 - 20 minut; Wyższa rozdzielczość czasowa (krótkie interwały, np. 1 min) zapewnia więcej punktów danych, a tym samym bardziej niezawodne śledzenie komórek, ale także skutkuje bardziej zintegrowaną ekspozycją na światło i większymi zestawami danych.
	<ol>
		<li>Ponieważ HT1080 FUCCI mają dynamiczne zielone i czerwone białka fluorescencyjne (patrz reprezentatywne wyniki), należy stosować następujące czasy ekspozycji: FITC/GFP - 50 ms, Texas Red/TRITC - 40 ms, Brightfield - 20 ms. Użyj pojemnika 2 x 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz autofokus sterowany programowo przy użyciu parametrów domyślnych w ustawieniach zaawansowanych. Zdefiniuj zakres autofokusa 10 μm z zalecanym rozmiarem kroku. Pamiętaj, aby zrobić to przed rozpoczęciem filmu poklatkowego. Autofokus przy obrazach w jasnym polu i nigdy z fluorescencją w celu zmniejszenia fototoksyczności i fotowybielania.
	<ol>
		<li>Korzystaj z systemów automatycznego ustawiania ostrości sterowanych programowo w dowolnym mikroskopie z zmotoryzowanym stolikiem i bezpośrednio skoncentruj się na próbce. Mogą jednak ograniczyć szybkość akwizycji eksperymentu. Sterowane sprzętowo systemy ciągłego ustawiania ostrości dobrze sprawdzają się w mikroskopii poklatkowej i poprawiają szybkość, umożliwiając obrazowanie większej liczby pozycji lub większą szybkość akwizycji. Polegają one jednak na wykrywaniu granicy faz powietrze-szkło i mogą stracić ostrość próbki przy różnicach w grubości szkła w całym odwiercie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąp połowę pożywki pożywką zawierającą pożądane stężenie leku, które zostało podgrzane do 37 oC. Częściowa wymiana pożywki pomaga zmniejszyć dryft termiczny. Warunki w tym eksperymencie to nośnik (DMSO), 1 μM selinexor i 10 μM PD0332991, 
	Uwaga: Ten krok można również wykonać po rozpoczęciu pobierania, wstrzymując i ponownie uruchamiając eksperyment. Pozwala to na podłużne śledzenie odpowiedzi pojedynczych komórek przed i po leku. Jeśli stabilność leku lub metabolizm jest problemem, wstrzymanie i wymianę nośnika można wykonać tą samą metodą. Aby przetestować degradację lub metabolizm leku, pożywki z leczonych komórek można również umieścić na komórkach naiwnych w celu zbadania działania leku.</li>
	<li>Rozpocznij film poklatkowy.</li>
	<li>W trakcie trwania filmu poklatkowego upewnij się, że obrazowane pola pozostają ostre, a komora utrzymuje wilgotność 37 oC.
	<ol>
		<li>Dostosuj ostrość zgodnie z potrzebami, wstrzymując akwizycję w odstępie czasu między punktami czasu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby dolajcie wody do komory podczas dłuższych eksperymentów. Unikać chłodzenia komory poprzez dodawanie wstępnie podgrzanej, sterylnej wody destylowanej o temperaturze 37 oC.</li>
</ol>
8. Zakończenie filmu poklatkowego
<ol>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu zatrzymaj akwizycję, jeśli nie została ustawiona na automatyczne zatrzymanie.</li>
	<li>Upewnij się, że film poklatkowy został poprawnie zapisany na dysku twardym, chociaż większość pakietów oprogramowania automatycznie zapisuje się podczas akwizycji, jeśli nie zostanie prawidłowo zakończona, dane mogą zostać utracone.</li>
	<li>Wyjąć komorę z mikroskopu i wyrzucić komórki do odpadów niebezpiecznych biologicznie zgodnie z zatwierdzonymi instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego.</li>
</ol>
9. Śledzenie podłużne i analiza danych poklatkowych
<ol>
	<li>Wybierz metodologię analizy, która jest odpowiednia dla procesów biologicznych, które Cię interesują. Dla konkretnych zastosowań wyprodukowano wiele wtyczek do ImageJ, programów korzystających z MatLab i niestandardowych platform. Poniższa metodologia obejmuje śledzenie jąder i analizę jądrowych sond fluorescencyjnych, jak pokazano na rysunkach 4 i 5.</li>
	<li>Otwórz stosy obrazów .tif dla używanych kanałów w ImageJ. Alternatywnie, otwórz pliki natywne z programu akwizycyjnego bezpośrednio w ImageJ za pomocą wtyczki Bioformats.</li>
	<li>Narysuj obszar zainteresowania (ROI) w jądrze jednej komórki, korzystając z obrazu jasnego pola lub kanału etykiety jądrowej (jeśli jest używany) i dodaj go do menedżera ROI. Uwaga: Jeśli zobrazowane komórki mają etykietę jądrową (np. histon H2B-EGFP), wówczas automatyczne śledzenie komórek może być wykorzystane do stworzenia obszarów zainteresowania (ROI) reprezentujących poszczególne jądra w czasie.</li>
	<li>Przejdź do następnego punktu czasowego i umieść ROI w tym samym jądrze. Dodaj zwrot z inwestycji do menedżera zwrotu z inwestycji.</li>
	<li>Kontynuuj śledzenie i tworzenie ROI dla pojedynczej komórki, dopóki nie wystąpi zdarzenie komórkowe (mitoza, apoptoza itp.) lub komórka nie będzie już mogła być śledzona (tj. wyjdzie poza kadr lub eksperyment się zakończy).</li>
	<li>Po ustaleniu ROI dla komórek w czasie, gdy znajdują się w terenie, nałóż je na interesujące kanały fluorescencyjne. Zmierz średnią intensywność fluorescencji w każdym kanale dla każdego punktu czasowego. Zapisz listę ROI do późniejszego wykorzystania.
	<ol>
		<li>W ramach ROI można dokonywać różnych pomiarów dla zastosowań w różnych eksperymentach. Kliknij przycisk Analysis (Analiza→ Ustaw pomiary..., aby wyświetlić menu umożliwiające wybór metody analitycznej (np. średnia intensywność w ramach ROI, zintegrowana intensywność itp.).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odnotowuj losy poszczególnych komórek (np. apoptoza, podział, przeżycie) podczas śledzenia. Pozwala to na tworzenie krzywych przeżycia i dalszą analizę populacji.</li>
	<li>Mając średnią intensywność dla obu kanałów, utwórz wykres punktowy, aby wyświetlić dynamikę cyklu komórkowego w odpowiedzi na terapie (Figura 5B, C). 
	Uwaga: Wykresy mogą być tworzone dla poszczególnych komórek w czasie lub uśredniane dla populacji śledzonych komórek. Obrazowanie ilościowe może mieć kluczowe znaczenie dla ustalenia złożonych odpowiedzi i relacji komórkowych w odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe. Długoterminowa mikroskopia poklatkowa, śledzenie podłużne i analiza danych to proces wieloetapowy, z wieloma opcjami rodzaju mikroskopii i narzędzi analitycznych, i jest zgodny z ogólnym zarysem przedstawionym na rysunku 1.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zalety mikroskopii poklatkowej i śledzenia podłużnego
Mikroskop jest idealnym instrumentem do badań podłużnych reakcji leków, ponieważ pozwala badaczom śledzić pojedyncze komórki i ich losy, a także całą populację. Zmienność odpowiedzi na lek w obrębie populacji komórek jest głównym problemem dla projektowania terapii przeciwnowotworowych. Śledzenie podłużne pojedynczych komórek pozwala badaczom obserwować tę zmienność i zacząć rozumieć podstawowe mechanizmy i konsekwencje w o...

Mikroskopia żywych komórek i podłużne śledzenie pojedynczych komórek nie jest nową techniką. Od najwcześniejszych mikroskopów entuzjaści i naukowcy obserwowali i badali pojedyncze komórki i organizmy, ich zachowania i rozwój1-3. Słynny przykład z nieżyjącego już Davida Rogersa z Vanderbilt University w latach pięćdziesiątych XX wieku pokazuje ludzki neutrofil w rozmazie krwi goniący za bakterią Staphylococcus aureus i ostatecznie proces fagocytozy4. Ten film z żywymi komórkami jest doskonałą ilustracją tego, jak wiele procesów można zaobserwować i skorelować w jednym eksperymencie: wykrywanie gradientu chemicznego, mechanika i szybkość ruchliwości komórek, dynamika kształtów komórek, adhezja i fagocytoza patogenu.
Pojawienie się w pełni zautomatyzowanych mikroskopów i bardzo czułych kamer cyfrowych spowodowało, że coraz więcej badaczy używa mikroskopii do zadawania fundamentalnych pytań w biologii komórki, począwszy od tego, jak komórki poruszają się5,6 i dzielą7,8, po dynamikę organelli i transport błonowy9-11. Niefluorescencyjna mikroskopia jasnego pola, w tym kontrast fazowy (PC), która przyniosła Nagrodę Nobla dla Fritsa Zernike'a w 1953 roku, oraz różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) pozwalają na obserwację komórek i jąder, ale także struktur subkomórkowych, w tym wiązek mikrotubul, chromosomów, jąderek, dynamiki organelli i grubych włókien aktynowych12. Genetycznie kodowane białka fluorescencyjne i rozwój barwników fluorescencyjnych przeciwko organellom dramatycznie wpłynęły na mikroskopię poklatkową13-15. Chociaż nie jest to przedmiotem tego artykułu, obrazowanie w sferoidach komórkowych i in situ (mikroskopia przyżyciowa) przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej stanowi kolejne rozszerzenie tego podejścia, a istnieją znakomite artykuły, które wykorzystują i omawiają te podejścia16-19.
Reakcje komórek na leki przeciwnowotworowe lub produkty naturalne są determinowane na skali molekularnej i komórkowej. Zrozumienie reakcji i losów komórek po leczeniu często wymaga testów uśredniania populacji (np. immunoblotting, pomiary całej studzienki) lub ustalonych punktów czasowych z detekcją immunofluorescencyjną i cytometrią przepływową, które mierzą pojedyncze komórki. Niejednorodność odpowiedzi pojedynczych komórek na leki w populacji, w szczególności w nowotworach, może wyjaśniać pewną zmienność odpowiedzi obserwowaną w liniach komórkowych i guzach, które są leczone tym samym lekiem w momencie saturacji. Długoterminowe podejścia podłużne do śledzenia danej pojedynczej komórki lub populacji komórek są mniej powszechnym, ale bardzo skutecznym podejściem, które pozwala na bezpośrednie badanie szlaków odpowiedzi molekularnej, różnych fenotypów (np. śmierci komórki lub podziału komórki), obserwacji zmienności między komórkami w populacji oraz tego, jak te czynniki przyczyniają się do dynamiki odpowiedzi populacji20-22. Optymistycznie rzecz ujmując, możliwość obserwowania i ilościowego określania odpowiedzi pojedynczych komórek pomoże nam lepiej zrozumieć, jak działają leki, dlaczego czasami zawodzą i jak najlepiej je stosować.
Technika długotrwałej mikroskopii poklatkowej, śledzenia podłużnego i analizy reakcji na leki jest dostępna dla wielu badaczy i może być prosta, wykorzystując tylko światło przechodzące do obserwacji reakcji fenotypowych20,21. Do głównych elementów tego podejścia należą: odpowiednie przygotowanie komórek będących przedmiotem zainteresowania, zautomatyzowany mikroskop z komorą środowiskową, kamera zintegrowana z komputerem do pozyskiwania i przechowywania obrazów oraz oprogramowanie do przeglądania filmów poklatkowych oraz pomiaru i analizy komórek i wszelkich biosensorów fluorescencyjnych. Udostępniamy szczegółowy protokół z wieloma wskazówkami dotyczącymi prowadzenia mikroskopii poklatkowej hodowanych komórek nawet przez kilka dni przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej jasnego pola i/lub szerokokątnego. Protokół ten może być stosowany dla dowolnej linii komórkowej, która może być hodowana w kulturze, w celu zbadania ich reakcji na terapie przeciwnowotworowe. Podajemy przykłady danych pozyskanych i przeanalizowanych przy użyciu wielu różnych genetycznie kodowanych biosensorów fluorescencyjnych oraz przykład mikroskopii z kontrastem fazowym, pokrótce omawiamy różne typy sond, zalety i wady długoterminowego śledzenia poklatkowego i podłużnego, czego można się nauczyć dla tego podejścia, które jest trudne do zrozumienia z podejść niebezpośrednich, oraz niektóre odmiany, które, mamy nadzieję, będą interesujące i wartościowe dla niedoświadczonych badaczy, którzy tego nie zrobili z wykorzystaniem tego podejścia, a także doświadczonym badaczom.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paklitaksel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>lek stabilizujący mikrotubule</td></tr><tr><td>Etopozyd</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>inhibitor topoizomerazy II</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>inhibitor XPO1/CRM1, prezent</td></tr><tr><td>Inhibitor Kinesin-5</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>prezent, dostępny również w American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek</td><td>HyClone (Fisher) lub Mediatech</td><td></td><td>dostępnych jest wiele firm</td></tr><tr><td>5% CO2 / powietrze równoważące, certyfikowane</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Miska, szklane dno 20 mm</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td> dostępnych <td>wiele firm</td></tr><tr><td>35 mm 4-dołkowa miska, szklane dno 20 mm</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>dostępnych jest wiele firm</td></tr><tr><td>35 mm Talerz z siatką szklane dno</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>dostępnych jest wiele firm</td></tr><tr><td>Multi-well, szklane dno</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N dostępnych</td><td>jest wiele firm</td></tr><tr><td>Mikroskop odwróconej epifluorescencji Olympus IX81</td><td>Sterownik Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td>Stopień zmotoryzowany <td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III Komora</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik środowiskowy</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD ze sterownikiem</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laserowe uruchomienie Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA lekki silnik</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora klubowa TOKAI HIT</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Odpowiedź pojedynczych komórek na leki przeciwnowotworowe znacząco przyczynia się do określenia odpowiedzi populacji, a zatem jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do ogólnego wyniku. Immunoblotting, cytometria przepływowa i eksperymenty z komórkami stałymi są często wykorzystywane do badania, jak komórki reagują na leki przeciwnowotworowe. Te metody są ważne, ale mają kilka wad. Zmienność odpowiedzi na leki między komórkami nowotworowymi a normalnymi komórkami oraz między komórkami różnego pochodzenia nowotworowego, a także reakcje przejściowe i rzadkie są trudne do zrozumienia przy użyciu testów uśredniania populacji i bez możliwości bezpośredniego śledzenia i analizowania ich podłużnie. Mikroskop szczególnie dobrze nadaje się do obrazowania żywych komórek. Postęp technologiczny umożliwia nam rutynowe obrazowanie komórek w rozdzielczości, która umożliwia nie tylko śledzenie komórek, ale także obserwację różnych odpowiedzi komórkowych. Szczegółowo opisujemy podejście, które pozwala na ciągłe obrazowanie poklatkowe komórek podczas odpowiedzi na lek zasadniczo tak długo, jak jest to pożądane, zwykle do 96 godzin. Korzystając z różnych wariantów tego podejścia, komórki mogą być monitorowane przez tygodnie. Dzięki zastosowaniu genetycznie kodowanych bioczujników fluorescencyjnych można śledzić liczne procesy, szlaki i reakcje. Pokazujemy przykłady, które obejmują śledzenie i kwantyfikację wzrostu komórek i progresji cyklu komórkowego, dynamiki chromosomów, uszkodzeń DNA i śmierci komórki. Omawiamy również różne warianty tej techniki i jej elastyczność oraz zwracamy uwagę na niektóre typowe pułapki.

Długoterminowa mikroskopia poklatkowa oraz bezpośrednie śledzenie podłużne umożliwiają badanie wielu przeciwnowotworowych efektów w odpowiedzi na działanie leków. Zgodnie z ogólnym schematem przedstawionym na Rysunku 1, zaprezentowano wiele przykładów komórek wykazujących ekspresję zwalidowanych reporterów fluorescencyjnych, które zostały poddane działaniu leków przeciwnowotworowych, śledzone i analizowane przy użyciu różnych podejść.
<p class="jove_content" fo:keep-t...

Tutaj opisujemy metodę długoterminowej mikroskopii poklatkowej do długotrwałego śledzenia pojedynczych komórek w odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe.

Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja odpowiedzi na terapię przeciwnowotworową w pojedynczych komórkach w hodowli. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, w tym w kwestii heterogenicznej odpowiedzi terapeutycznej oraz losu komórek. Na początek, w certyfikowanej sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy przygotować komórki HT1080 w naczyniach certyfikowanych do hodowli zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych.Na dwa dni przed obrazowaniem, wysiej 50 000 komórek HT1080 FuGENE na studzienkę w odpowiedniej liczbie studzienek 12-dołkowej płytki ze szklanym dnem o grubości no. 1,5. Dostosuj liczbę wysiewanych komórek w zależności od tempa ich wzrostu i zastosowanej płytki, aby w momencie rozpoczęcia eksperymentu uzyskać około 60% konfluencji.Przygotuj komorę środowiskową, ustawiając wilgotność na około 80% oraz temperaturę w miejscu próbki na 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że zbiornik na wodę jest wypełniony sterylną wodą destylowaną zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie włącz komorę środowiskową, ustawiając ją na pożądaną temperaturę, umieść ją na stoliku mikroskopu i odpowiednio ustaw.Jeśli między górną komorą stolika a wkładką stolika występuje wolna przestrzeń, przed włożeniem komory należy położyć kawałki folii parafiny na krawędziach otworu wkładki stolika, aby połączyć komorę ze stolikiem. Należy upewnić się, że żadne połączenia nie wywierają nacisku na komorę, gdyż oba te czynniki mogą wprowadzić artefakty ruchowe. Do komory należy włożyć pustą szalkę z wodą i pozwolić komorze wyrównać temperaturę do 37 °C, a następnie utrzymać stabilną temperaturę.Aby przygotować system do obrazowania, należy włączyć mikroskop, komputer oraz wszelkie niezbędne urządzenia peryferyjne. W zależności od rodzaju źródła światła, włącz je dopiero w momencie, gdy będzie ono potrzebne. Przy obrotowej głowicy z obiektywami w niskiej pozycji, wybierz obiektyw 20x o aperturze numerycznej 0,7.Następnie ustaw próbkę nad obiektywem, co ułatwi odnalezienie komórek po umieszczeniu próbki w komorze. Po przeniesieniu komórek przeznaczonych do obrazowania do komory środowiskowej, zgodnie z protokołem tekstowym, zamknij szczelnie komorę, aby utrzymać stabilne środowisko, i włącz dopływ gazów atmosferycznych. Następnie wybierz warunki obrazowania, które zapobiegną fototoksyczności poprzez ograniczenie czasu ekspozycji i zastosowanie światła o niższej intensywności.W celu wyznaczenia płaszczyzn X, Y i Z oraz wybrania pożądanych długości fal dla każdej pozycji do obrazowania. W przypadku długoterminowego obrazowania poklatkowego większości procesów komórkowych, należy pobierać jeden obraz co dziesięć do dwudziestu minut. Wyższa rozdzielczość czasowa dostarcza więcej punktów danych i umożliwia bardziej precyzyjne śledzenie komórek, ale skutkuje większą całkowitą ekspozycją na światło oraz większymi zbiorami danych.Ponieważ HT1080 FuGENE posiadają dynamiczne zielone i czerwone białka fluorescencyjne, należy zastosować następujące czasy ekspozycji oraz binowanie 2x2. W ustawieniach zaawansowanych należy włączyć sterowane programowo automatyczne ustawianie ostrości (auto-focusing), korzystając z domyślnych parametrów. Zdefiniuj zakres automatycznego ustawiania ostrości na 10 micrometers przy zalecanym rozmiarze kroku.W naczyniu eksperymentalnym, aby zredukować dryft termiczny, należy zastąpić połowę pożywki pożywką zawierającą odpowiedni lek, podgrzaną do 37 °C. Na koniec należy rozpocząć rejestrację poklatkową i pobierać obrazy zgodnie z protokołem tekstowym. Filmy te przedstawiają przykłady pary dopasowanych linii komórkowych MCF7 pochodzących z raka piersi, które różnią się jedynie statusem p53, i które zostały poddane działaniu leku przeciwnowotworowego hamującego kinezynę-5, co doprowadziło do zatrzymania mitozy.Jak widać na tej rycinie, gdy p53 zostaje usunięte poprzez trwały knockdown p53, zamiast zatrzymać się po opuszczeniu mitozy, komórki przechodzą przez powtarzające się cykle, w których wchodzą w drugą rundę mitozy zamiast przejść w stan spoczynku i opuszczają mitozę bez podziału. Przedstawiono tutaj komórki HeLa pochodzące z raka szyjki macicy, stabilnie eksponujące marker chromatyny Histone 2b połączony z mCherry oraz beta-tubulinę połączoną z EGFP. Po podaniu paclitaxolu, leku stabilizującego mikrotubule, dochodzi do zaburzenia ustawienia i segregacji chromosomów podczas mitozy, co prowadzi do powstania wypukłości jądra oraz mikrojąder, które są podatne na uszkodzenia DNA.Ta linia komórkowa stabilnie koekspresuje dwa fluorescencyjne wskaźniki cyklu komórkowego oparte na ubikwitynie dla CDT1, w kolorze pomarańczowym, oraz gemininy w kolorze zielonym, i przebiega przez cykl komórkowy w sposób prawidłowy. Gdy te same komórki są traktowane inhibitorem CDK46, przechodzą one przez fazę G2 i dzielą się normalnie, a następnie ulegają silnemu zatrzymaniu w fazie G1, co wskazuje na potencjał do wywołania skutecznych efektów cytostatycznych w rosnących guzach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego śledzenia odpowiedzi pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym przez wiele dni, zamiast wyciągania wniosków na temat tych reakcji.

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje metodę śledzenia transportu limfocytów T wywołanych bispecyficznymi przeciwciałami do nowotworów w modelu mysim. Limfocyty T efektorowe transdukowane lucyferazy wstrzykuje się myszy z podskórnym ksenoprzeszczepem komórek nowotworowych. Następnie wprowadzane są przeciwciała bispecyficzne, wiążące się z limfocytami T i komórkami nowotworowymi. Lokalizacja limfocytów T jest śledzona za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, przy czym wielkość sygnału wskazuje na zakres...

Technika in vivo do śledzenia transportu limfocytów T indukowanych przez bispecyficzne przeciwciała do nowotworów

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) może być użyta do badania in vivo biodystrybucji przeciwciał i koniugatów przeciwciał do celów onkologicznych w organizmach żywych przy użyciu kombinacji metod celowania w nowotwory in vivo i barwienia immunologicznego ex vivo.

Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Tutaj opisujemy metodę transdukcji ludzkich limfocytów T za pomocą lucyferazy, aby ułatwić śledzenie in vivo transportu limfocytów T wywołanego przez bispecyficzne przeciwciała do nowotworów w badaniach oceniających skuteczność przeciwnowotworową i mechanizm bispecyficznych przeciwciał angażujących limfocyty T.

Śledzenie transportu limfocytów T indukowanych przez bispecyficzne przeciwciała przy użyciu ludzkich limfocytów T transdukowanych lucyferazą

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Poznaj mikroskopię poklatkową do długoterminowego śledzenia pojedynczych komórek w odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe. Ta metoda umożliwia obserwację heterogenicznych reakcji terapeutycznych komórek HT1080 i HeLa w czasie rzeczywistym.

Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych (Wideo) | JoVE Journal

Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych

Przeglądaj więcej filmów