Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja przeciwnowotworowej odpowiedzi terapeutycznej w pojedynczych komórkach w hodowli. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, w tym heterogeniczną odpowiedź terapeutyczną i los komórki. Na początek, pod certyfikowanym sterylnym okapem z przepływem laminarnym, przygotuj komórki HT1080 w naczyniach z certyfikatem hodowli zgodnie z protokołem tekstowym i inkubuj komórki w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych.

Dwa dni przed obrazowaniem umieść 50 000 komórek HT1080 FuGENE na studzience w żądanej liczbie dołków 12-dołkowego naczynia ze szklanym dnem nr 1,5. Dostosuj liczbę posianych komórek w zależności od ich tempa wzrostu i użytego naczynia, aby osiągnąć około 60% zbieżności na początku eksperymentu.

Ustaw komorę środowiskową na około 80% wilgotności z temperaturą w pozycji próbki ustawioną na 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że zbiornik na wodę jest napełniony sterylną wodą destylowaną zgodnie ze wskazówkami producenta. Następnie włącz komorę środowiskową do żądanego ustawienia temperatury, ustaw ją w stoliku mikroskopu i ustaw.

Jeśli między górną komorą sceny a wstawką sceny jest wolna przestrzeń, przed włożeniem komory do niej należy położyć kawałki folii parafinowej na krawędziach otworu montażowego sceny, aby połączyć komorę ze sceną. Upewnij się, że żadne połączenia nie ciągną za komorę, z których oba mogą wprowadzać artefakty ruchu. Włóż atrapę naczynia z wodą do komory i pozwól, aby komora zrównoważyła się do 37 stopni Celsjusza, a następnie utrzymuj stabilną temperaturę.

Aby skonfigurować obrazowanie, włącz mikroskop, komputer i wszystkie wymagane urządzenia peryferyjne. W zależności od źródła światła poczekaj z włączeniem go, aż będzie potrzebny. Gdy wieżyczka obiektywu znajduje się w niskiej pozycji, wybierz obiektyw z aperturą numeryczną 20x 0,7.

Następnie umieść próbkę nad obiektywem, co ułatwi znalezienie komórek, gdy próbka znajduje się w komorze. Po przeniesieniu komórek, które mają być zobrazowane, do komory środowiskowej, zgodnie z protokołem tekstowym, uszczelnij komorę, aby utrzymać stabilne środowisko i włącz gaz atmosferyczny. Następnie wybierz warunki obrazowania, które zapobiegną fototoksyczności, ograniczając czas ekspozycji i używając światła o niższej intensywności.

Aby znaleźć płaszczyzny X, Y i Z oraz żądane długości fal dla każdej pozycji, która ma być obrazowana. W przypadku długotrwałego upływu czasu większości procesów komórkowych należy uzyskać jeden obraz co dziesięć do dwudziestu minut. Większa rozdzielczość czasowa zapewnia więcej punktów danych i bardziej niezawodne śledzenie komórek, ale skutkuje bardziej zintegrowaną ekspozycją na światło i większymi zestawami danych.

Ponieważ HT1080 FuGENE ma dynamiczne zielone i czerwone białka kwiatowe, należy stosować następujące czasy ekspozycji i używać pojemnika dwa na dwa. W ustawieniach zaawansowanych włącz automatyczne ustawianie ostrości sterowane przez oprogramowanie przy użyciu ustawień domyślnych. Zdefiniuj zakres autofokusa wynoszący 10 mikrometrów z zalecanym rozmiarem kroku.

W naczyniu eksperymentalnym, aby zmniejszyć dryft termiczny, zastąp połowę pożywki pożywką zawierającą pożądany lek, który został podgrzany do 37 stopni Celsjusza. Na koniec rozpocznij upływ czasu i pobierz obrazy zgodnie z protokołem tekstowym. Filmy te pokazują przykłady pary dopasowanych linii komórkowych MCF7 pochodzących z raka piersi, które różnią się tylko statusem p53, które były leczone lekiem przeciwnowotworowym, który hamuje kinezynę-5, powodując zatrzymanie mitoty.

Jak widać na tym rysunku, gdy p53 jest usuwany przez stabilny knockdown p53, zamiast zatrzymywać się po opuszczeniu mitozy, komórki przechodzą przez powtarzające się cykle, w których wchodzą w drugą rundę mitozy, a nie zatrzymują, i pozostawiają mitozę bez podziału. Pokazano tutaj komórki Hela pochodzące z raka szyjki macicy, stabilnie wyrażające marker chromatyny Histone 2b połączony z mCherry i beta tubulinę połączony z EGFP. W przypadku leczenia lekiem stabilizującym mikrotubule paklitaksolem, wyrównanie i segregacja chromosomów zostaje zakłócona podczas mitozy, co powoduje powstawanie wybrzuszeń jądrowych i mikrojąder, które są podatne na uszkodzenie DNA.

Ta linia komórkowa stabilnie koeksprymuje dwa wskaźniki cyklu komórkowego florescencyjnej ubikwityny dla CDT1, w kolorze pomarańczowym i gemininy w kolorze zielonym, i normalnie przechodzi przez cykl komórkowy. Kiedy te same komórki są traktowane inhibitorem CDK46, komórki przechodzą przez fazę G2 i dzielą się normalnie, a następnie silnie zatrzymują się w fazie G1, co wskazuje na potencjał afektywnych efektów cytostatycznych w rosnących guzach. Główną zaletą tej techniki jest to, że możesz śledzić odpowiedź pojedynczej komórki, bezpośrednio, w czasie rzeczywistym przez wiele dni, zamiast wnioskować o tych odpowiedziach.