Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów
May 5th, 2016
Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie prostego zastosowania detekcji fluorescencji mikrofluidycznej kropelek przy użyciu światłowodów. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wysokoprzepustowych biologicznych badań przesiewowych, takich jak identyfikacja rzadkich fenotypów i ukierunkowana ewolucja enzymów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na proste i niedrogie zastosowanie detekcji fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej.
Na początek umieść wstępnie oczyszczoną wafel silikonowy o średnicy trzech cali na uchwycie próżniowym powlekarki wirowej. Następnie nałóż jeden mililitr SU-8 3050 na środek wafla i obróć płytkę, aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 80 mikrometrów. Wyjmij powlekaną płytkę z wirówki i umieść ją na płycie grzejnej nagrzanej do 135 stopni Celsjusza.
Po 30 minutach wyjmij wafel i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie umieść wafel na płaskiej powierzchni i wyrównaj maskę pierwszej warstwy na wafli. Wystaw wafel pod skolimowaną 190-miliwatową diodą LED o długości 365 nanometrów przez trzy minuty.
Po ekspozycji umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza na jedną minutę, a następnie pozwól mu ostygnąć z powrotem do temperatury pokojowej. Po ostygnięciu umieść wafel z powrotem na powlekarce wirowej i przymocuj go do uchwytu. Nałóż dodatkowy mililitr SU-8 3050 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund z prędkością 500 obr./min.
następnie 30 sekund przy 5 000 obr./min Następnie upiecz wafel na płycie grzejnej. Pozwól mu ostygnąć z powrotem do temperatury pokojowej, a następnie umieść go z powrotem na powierzchni wyrównującej maskę.
Użyj lunety do preparacji, aby ręcznie wyrównać maskę drugiej warstwy z wzorzystymi znacznikami wyrównania na płytce. Po prawidłowym wyrównaniu naświetl powlekaną płytkę przez 4-1/2 minuty w tych samych warunkach, co poprzednio. Po naświetleniu umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 135 stopni Celsjusza na jedną minutę, a następnie ostudź wafel i umieść go z powrotem na powlekarce wirowej.
Nałóż jeden mililitr SU-8 3050 na wafel po raz trzeci i odkręć, aby dodać dodatkowe 100 mikrometrów fotorezystu. Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie schłodzić go do temperatury pokojowej i umieścić na powierzchni wyrównowania.
Dopasuj maskę trzeciej warstwy do poprzedniej geometrii i naświetl powlekaną płytkę w poprzednich warunkach przez dziewięć minut. Po ekspozycji umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza na minutę, a następnie ostudź go do temperatury pokojowej. Po ostygnięciu rozwiń maski, zanurzając wafel w mieszanej kąpieli z wywoływaczem na 30 minut.
Na koniec umyj wafel w izopropanolu, a następnie piecz go po raz ostatni przez minutę na płycie grzewczej w temperaturze 135 stopni Celsjusza. Przechowuj opracowanego mistrza na 100-milimetrowej szalce Petriego do momentu uformowania. Przygotuj mieszaninę PDMS w proporcji 10:1, łącząc 50 gramów bazy silikonowej z pięcioma gramami utwardzacza w plastikowym kubku.
Wymieszać zawartość za pomocą narzędzia obrotowego, a następnie odgazowywać mieszaninę wewnątrz eksykatora przez 30 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza. Wlej odgazowany PDMS na przygotowany wzorzec, aby uzyskać grubość trzech milimetrów. Następnie umieścić szalkę Petriego z powrotem w eksykatorze w celu dalszego odgazowania.
Po usunięciu wszystkich bąbelków piecz urządzenie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 80 minut. Po schłodzeniu wytnij urządzenie z formy za pomocą skalpela, tak aby zarówno telegeometrie o długości 120 mikrometrów, jak i 220 mikrometrów były dostępne z boku urządzenia. Następnie przebij wloty i wyloty płynu stemplem biopsyjnym o średnicy 0,75 mm.
Urządzenie należy traktować stroną z funkcją do góry wraz z wstępnie oczyszczonym szkiełkiem podstawowym i plazmą tlenową o wartości 1 milibara przez 20 sekund w myjce plazmowej o mocy 300 W. Połącz urządzenie, mocno umieszczając wzorzystą stronę urządzenia PDMS na stronie szkła poddanego obróbce plazmowej. Następnie umieść urządzenie w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza i odstaw zmontowane urządzenie na 40 minut.
Po upieczeniu użyj strzykawki, aby przepłukać urządzenie fluorowanym płynem do obróbki powierzchni, aby kanały stały się hydrofobowe. Następnie natychmiast piecz urządzenie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby odparować rozpuszczalnik. Przygotuj dwa włókna wzbudzenia laserowego, usuwając izolację z ostatnich pięciu milimetrów światłowodów.
Przygotuj również światłowód do zbierania sygnału fluorescencyjnego, usuwając izolację z ostatnich pięciu milimetrów większego światłowodu. Sprawdź końcówki wszystkich włókien pod mikroskopem. Jeśli końcówki nie kończą się płaską powierzchnią, uzupełnij końce rysikiem z włókna.
Następnie podłącz łącznik światłowodu laserowego do 50-miliwatowego lasera 405 nanometrów i przymocuj do lasera jedno z włókien rdzeniowych o długości 105 mikrometrów. Skieruj odizolowany koniec czujnika miernika mocy lasera i użyj precyzyjnych regulacji łącznika laserowego, aby zmaksymalizować moc lasera. Wykonaj ten sam proces, aby dostroić drugie włókno za pomocą 50-miliwatowego lasera o długości 473 nanometrów.
Następnie zamontuj poczwórny filtr pasmowo-przepustowy na tubusie powielacza zdjęć za pomocą tubusów soczewek, aby zablokować światło laserowe i przepuszczać emitowaną fluorescencję. Podłącz łącznik światłowodowy, aby światło przepływało przez filtry przed uderzeniem w rurkę powielacza zdjęć. Następnie podłącz włókno zbierające do łącznika światłowodowego.
Umieść wyprodukowany chip mikroprzepływowy na stoliku odwróconego mikroskopu sprzężonego z kamerą cyfrową zdolną do co najmniej 100 mikrosekundowych czasów otwarcia migawki. Pracując ostrożnie z boków, włóż światłowód sprzężony z laserem 473 nanometrów do najdalszego kanału o długości 120 mikrometrów. Uważaj, aby nie przebić się do głównego kanału przepływowego.
Następnie włóż światłowód sprzężony z laserem 405 nanometrów do najdalszego kanału bocznego o wysokości 120 mikrometrów, zapewniając odstęp między włóknami 300 mikrometrów. Na koniec włóż większe światłowód sprzężony z rurką powielacza zdjęć do kanału o wysokości 220 mikrometrów normalnego do dwóch włókien wzbudzenia laserowego. Napełnij pięciomililitrową strzykawkę wypełnioną HFE 7500 zawierającą 2% jonowy fluorosurfaktant i zamontuj ją na wlocie oleju dystansowego urządzenia wykrywającego za pomocą rurki PE2.
Następnie napełnij strzykawkę mieszanką emulsji FITC i niebieskiego barwnika i zamontuj ją na pionowo ustawionej pompie strzykawkowej sprzężonej z urządzeniem jako wlot do ponownego wstrzykiwania kropelek za pomocą rurki PE2. Podłącz odcinek rurki PE od wyjścia urządzenia do pojemnika na odpady. Następnie zalej urządzenie, uruchamiając każdą z pomp z prędkością 1 000 mikrolitrów na godzinę, aż zobaczysz, że zarówno olej, jak i kropelki regularnie łączą się w urządzeniu i przepływają w dół.
Dostosuj natężenie przepływu tak, aby olej dystansowy działał z prędkością 6 000 mikrolitrów na godzinę, a kropelki z prędkością 100 mikrolitrów na godzinę, zapewniając znaczne odstępy między kropelkami przemieszczającymi się przez obszar wykrywania. Następnie włącz lasery i uruchom program do zbierania danych. Następnie dostosuj wzmocnienie lampy powielacza zdjęć, aby zapewnić sygnały, które są ponad 100 razy większe niż podstawowy poziom szumów.
Na koniec dostosuj moc lasera tak, aby wszystkie piki dubletu były wyraźnie widoczne na pojedynczej, liniowo wyskalowanej ścieżce czasowej. Kropla przepływająca przez kanał detekcyjny napotyka dyskretne obszary wzbudzenia przed każdym ze światłowodów sprzężonych z laserem. Światłowód detekcyjny rejestruje emitowaną fluorescencję z przesunięciem czasowym z separacją pików, która koreluje z czasem, w którym kropla przemieszcza się z jednego obszaru wzbudzenia do drugiego.
Eliminuje to potrzebę dalszego filtrowania światła i oddzielnych rurek powielacza zdjęć. Skuteczność schematu detekcji przetestowano poprzez wykrycie mieszanej emulsji kropelek zawierających barwniki, które wzbudzają się w odległości 405 nanometrów i 473 nanometrów. Ten wykres pokazuje wyraźną separację między czterema ponownie wstrzykniętymi typami kropel, gdy przepływają one z częstotliwością około 50 herców.
Zakres dynamiki i bezwzględną czułość detektora badano, mierząc tylko kropelki fluoresceiny. Dane pokazują zdolność systemu do wykrywania stężeń barwnika w zakresie od 0,1 do 100 nanomolowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wdrożyć prosty i kompaktowy system detekcji fluorescencji, wykorzystując szereg wstawionych światłowodów i pojedynczy detektor zdjęć.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Artykuł ten przedstawia kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej fluorescencji dla mikrofluidyki kroplowej. Metoda wykorzystuje macierz światłowodów do czasowego kodowania danych wielokolorowych, co upraszcza proces detekcji.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Detekcja fluorescencji
- Mikrofluidyka kroplowa
- Przesiewanie biologiczne
Tło
- Tradycyjne systemy detekcji wielokolorowej fluorescencji są duże i złożone.
- Istnieje potrzeba prostszych i bardziej opłacalnych rozwiązań w zastosowaniach biologicznych.
- Światłowody mogą zapewnić nowatorskie podejście do detekcji fluorescencji.
- Ta technika może ułatwić wysokoprzepustowe przesiewanie i badania ewolucji enzymów.
Cel Badania
- Zaprojektowanie prostego zastosowania detekcji fluorescencji w mikrofluidyce kroplowej.
- Odpowiedź na kluczowe pytania w przesiewaniu biologicznym, takie jak identyfikacja rzadkich fenotypów.
- Zapewnienie taniej metody detekcji fluorescencji.
Metody Użyte
- Przygotowanie płytki krzemowej przy użyciu spin coatera.
- Nałożenie fotorezystu SU-8 3050 w celu utworzenia warstwy.
- Podgrzewanie powlekanej płytki na płycie grzewczej w celu utwardzenia fotorezystu.
- Wykorzystanie światłowodów do zbierania danych wielokolorowych.
Główne Wyniki
- Metoda umożliwia efektywną detekcję wielokolorowej fluorescencji.
- Upraszcza proces w porównaniu z tradycyjnymi systemami.
- Technika jest opłacalna i łatwa w implementacji.
- Wspiera wysokoprzepustowe zastosowania przesiewania biologicznego.
Wnioski
- Badanie to prezentuje nowatorskie podejście do detekcji fluorescencji w mikrofluidyce kroplowej.
- Wykorzystanie światłowodów zwiększa efektywność zbierania danych.
- Metoda ma istotne implikacje dla badań biologicznych i przesiewania.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This method addresses the need for compact, cost-effective fluorescence detection in droplet microfluidics, enabling high-throughput screening for rare phenotypes and enzyme evolution. By using optical fibers to temporally encode multicolor signals, it eliminates complex optical filtering, reducing system complexity and maintenance burden. This supports early discovery workflows where scalable, reproducible assays are critical for target validation and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through multiplexed fluorescence readouts in droplet-based assays.
- Operational Value: Provides a simple, inexpensive platform for screening large libraries to identify rare functional variants.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening with quantitative, temporally resolved fluorescence data to de-risk target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated droplet assays for downstream screening by enabling detection of multiple fluorophores without spectral overlap.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through spatially encoded excitation and single-detector collection.
- Scalability: Supports platform reuse across different dye combinations and target classes due to modular fiber-optic design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables screening of enzyme variants or binding agents with relevance to preclinical target validation.
- Mechanistic De-risking: Allows detection of low-abundance signals (sub-nanomolar fluorescein) to assess sensitivity in biomarker-like readouts.
- Predictive Confidence: Generates quantitative, time-resolved fluorescence outputs that support go/no-go decisions in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from assay development to lead identification, providing a reusable detection module for droplet-based screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via multiplexed fluorescence detection in high-throughput droplet formats.
- Screening: Enables assay readiness through spatially separated excitation and temporal signal encoding, improving throughput and multiplexing capability.
- Analytics: Delivers quantitative fluorescence readouts with peak separation correlating to droplet transit time, enabling discrimination of multiple populations.
- Translational Research: Connects to preclinical work by detecting enzyme activity or binding events in clinically relevant concentration ranges.
- Enterprise Reuse: Represents a modular, fiber-based detection system adaptable to various microfluidic chips and dye sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling reliable, multiplexed signal detection in complex mixtures.
- Operational Value: Reduces complexity and cost compared to traditional microscopy-based systems, improving lab throughput and ease of use.
- Strategic Value: Accelerates screening campaigns by simplifying setup and maintenance, supporting faster iteration in enzyme evolution and phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits through reproducible, quantitative fluorescence data across multiplexed conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, optical fiber handling, and laser coupling.
- Depends on access to laser diodes, optical fibers, fiber couplers, and a single-photon detector or PMT.
- Necessitates standardization of fiber positioning and channel geometry for reproducible temporal encoding.
- Involves adaptation considerations when changing dye pairs or channel dimensions to maintain peak separation.
- Practical limitations include sensitivity to fiber alignment and potential signal crosstalk if temporal resolution is insufficient.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:34
Master Fabrication
3:42
PDMS Device Fabrication
5:24
Preparation of Optical Components
6:41
Optical Fiber Insertion
7:33
Fluorescence Detection of Mixed Emulsions
8:53
Results: Sensitive Detection of Fluorescent Droplets Using Optical Fibers
9:55
Conclusion
