Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów
5 maja 2016
Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie prostego zastosowania detekcji fluorescencji mikrofluidycznej kropelek przy użyciu światłowodów. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wysokoprzepustowych biologicznych badań przesiewowych, takich jak identyfikacja rzadkich fenotypów i ukierunkowana ewolucja enzymów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na proste i niedrogie zastosowanie detekcji fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej.
Na początek umieść wstępnie oczyszczoną wafel silikonowy o średnicy trzech cali na uchwycie próżniowym powlekarki wirowej. Następnie nałóż jeden mililitr SU-8 3050 na środek wafla i obróć płytkę, aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 80 mikrometrów. Wyjmij powlekaną płytkę z wirówki i umieść ją na płycie grzejnej nagrzanej do 135 stopni Celsjusza.
Po 30 minutach wyjmij wafel i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie umieść wafel na płaskiej powierzchni i wyrównaj maskę pierwszej warstwy na wafli. Wystaw wafel pod skolimowaną 190-miliwatową diodą LED o długości 365 nanometrów przez trzy minuty.
Po ekspozycji umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza na jedną minutę, a następnie pozwól mu ostygnąć z powrotem do temperatury pokojowej. Po ostygnięciu umieść wafel z powrotem na powlekarce wirowej i przymocuj go do uchwytu. Nałóż dodatkowy mililitr SU-8 3050 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund z prędkością 500 obr./min.
następnie 30 sekund przy 5 000 obr./min Następnie upiecz wafel na płycie grzejnej. Pozwól mu ostygnąć z powrotem do temperatury pokojowej, a następnie umieść go z powrotem na powierzchni wyrównującej maskę.
Użyj lunety do preparacji, aby ręcznie wyrównać maskę drugiej warstwy z wzorzystymi znacznikami wyrównania na płytce. Po prawidłowym wyrównaniu naświetl powlekaną płytkę przez 4-1/2 minuty w tych samych warunkach, co poprzednio. Po naświetleniu umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 135 stopni Celsjusza na jedną minutę, a następnie ostudź wafel i umieść go z powrotem na powlekarce wirowej.
Nałóż jeden mililitr SU-8 3050 na wafel po raz trzeci i odkręć, aby dodać dodatkowe 100 mikrometrów fotorezystu. Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie schłodzić go do temperatury pokojowej i umieścić na powierzchni wyrównowania.
Dopasuj maskę trzeciej warstwy do poprzedniej geometrii i naświetl powlekaną płytkę w poprzednich warunkach przez dziewięć minut. Po ekspozycji umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 135 stopni Celsjusza na minutę, a następnie ostudź go do temperatury pokojowej. Po ostygnięciu rozwiń maski, zanurzając wafel w mieszanej kąpieli z wywoływaczem na 30 minut.
Na koniec umyj wafel w izopropanolu, a następnie piecz go po raz ostatni przez minutę na płycie grzewczej w temperaturze 135 stopni Celsjusza. Przechowuj opracowanego mistrza na 100-milimetrowej szalce Petriego do momentu uformowania. Przygotuj mieszaninę PDMS w proporcji 10:1, łącząc 50 gramów bazy silikonowej z pięcioma gramami utwardzacza w plastikowym kubku.
Wymieszać zawartość za pomocą narzędzia obrotowego, a następnie odgazowywać mieszaninę wewnątrz eksykatora przez 30 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza. Wlej odgazowany PDMS na przygotowany wzorzec, aby uzyskać grubość trzech milimetrów. Następnie umieścić szalkę Petriego z powrotem w eksykatorze w celu dalszego odgazowania.
Po usunięciu wszystkich bąbelków piecz urządzenie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 80 minut. Po schłodzeniu wytnij urządzenie z formy za pomocą skalpela, tak aby zarówno telegeometrie o długości 120 mikrometrów, jak i 220 mikrometrów były dostępne z boku urządzenia. Następnie przebij wloty i wyloty płynu stemplem biopsyjnym o średnicy 0,75 mm.
Urządzenie należy traktować stroną z funkcją do góry wraz z wstępnie oczyszczonym szkiełkiem podstawowym i plazmą tlenową o wartości 1 milibara przez 20 sekund w myjce plazmowej o mocy 300 W. Połącz urządzenie, mocno umieszczając wzorzystą stronę urządzenia PDMS na stronie szkła poddanego obróbce plazmowej. Następnie umieść urządzenie w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza i odstaw zmontowane urządzenie na 40 minut.
Po upieczeniu użyj strzykawki, aby przepłukać urządzenie fluorowanym płynem do obróbki powierzchni, aby kanały stały się hydrofobowe. Następnie natychmiast piecz urządzenie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby odparować rozpuszczalnik. Przygotuj dwa włókna wzbudzenia laserowego, usuwając izolację z ostatnich pięciu milimetrów światłowodów.
Przygotuj również światłowód do zbierania sygnału fluorescencyjnego, usuwając izolację z ostatnich pięciu milimetrów większego światłowodu. Sprawdź końcówki wszystkich włókien pod mikroskopem. Jeśli końcówki nie kończą się płaską powierzchnią, uzupełnij końce rysikiem z włókna.
Następnie podłącz łącznik światłowodu laserowego do 50-miliwatowego lasera 405 nanometrów i przymocuj do lasera jedno z włókien rdzeniowych o długości 105 mikrometrów. Skieruj odizolowany koniec czujnika miernika mocy lasera i użyj precyzyjnych regulacji łącznika laserowego, aby zmaksymalizować moc lasera. Wykonaj ten sam proces, aby dostroić drugie włókno za pomocą 50-miliwatowego lasera o długości 473 nanometrów.
Następnie zamontuj poczwórny filtr pasmowo-przepustowy na tubusie powielacza zdjęć za pomocą tubusów soczewek, aby zablokować światło laserowe i przepuszczać emitowaną fluorescencję. Podłącz łącznik światłowodowy, aby światło przepływało przez filtry przed uderzeniem w rurkę powielacza zdjęć. Następnie podłącz włókno zbierające do łącznika światłowodowego.
Umieść wyprodukowany chip mikroprzepływowy na stoliku odwróconego mikroskopu sprzężonego z kamerą cyfrową zdolną do co najmniej 100 mikrosekundowych czasów otwarcia migawki. Pracując ostrożnie z boków, włóż światłowód sprzężony z laserem 473 nanometrów do najdalszego kanału o długości 120 mikrometrów. Uważaj, aby nie przebić się do głównego kanału przepływowego.
Następnie włóż światłowód sprzężony z laserem 405 nanometrów do najdalszego kanału bocznego o wysokości 120 mikrometrów, zapewniając odstęp między włóknami 300 mikrometrów. Na koniec włóż większe światłowód sprzężony z rurką powielacza zdjęć do kanału o wysokości 220 mikrometrów normalnego do dwóch włókien wzbudzenia laserowego. Napełnij pięciomililitrową strzykawkę wypełnioną HFE 7500 zawierającą 2% jonowy fluorosurfaktant i zamontuj ją na wlocie oleju dystansowego urządzenia wykrywającego za pomocą rurki PE2.
Następnie napełnij strzykawkę mieszanką emulsji FITC i niebieskiego barwnika i zamontuj ją na pionowo ustawionej pompie strzykawkowej sprzężonej z urządzeniem jako wlot do ponownego wstrzykiwania kropelek za pomocą rurki PE2. Podłącz odcinek rurki PE od wyjścia urządzenia do pojemnika na odpady. Następnie zalej urządzenie, uruchamiając każdą z pomp z prędkością 1 000 mikrolitrów na godzinę, aż zobaczysz, że zarówno olej, jak i kropelki regularnie łączą się w urządzeniu i przepływają w dół.
Dostosuj natężenie przepływu tak, aby olej dystansowy działał z prędkością 6 000 mikrolitrów na godzinę, a kropelki z prędkością 100 mikrolitrów na godzinę, zapewniając znaczne odstępy między kropelkami przemieszczającymi się przez obszar wykrywania. Następnie włącz lasery i uruchom program do zbierania danych. Następnie dostosuj wzmocnienie lampy powielacza zdjęć, aby zapewnić sygnały, które są ponad 100 razy większe niż podstawowy poziom szumów.
Na koniec dostosuj moc lasera tak, aby wszystkie piki dubletu były wyraźnie widoczne na pojedynczej, liniowo wyskalowanej ścieżce czasowej. Kropla przepływająca przez kanał detekcyjny napotyka dyskretne obszary wzbudzenia przed każdym ze światłowodów sprzężonych z laserem. Światłowód detekcyjny rejestruje emitowaną fluorescencję z przesunięciem czasowym z separacją pików, która koreluje z czasem, w którym kropla przemieszcza się z jednego obszaru wzbudzenia do drugiego.
Eliminuje to potrzebę dalszego filtrowania światła i oddzielnych rurek powielacza zdjęć. Skuteczność schematu detekcji przetestowano poprzez wykrycie mieszanej emulsji kropelek zawierających barwniki, które wzbudzają się w odległości 405 nanometrów i 473 nanometrów. Ten wykres pokazuje wyraźną separację między czterema ponownie wstrzykniętymi typami kropel, gdy przepływają one z częstotliwością około 50 herców.
Zakres dynamiki i bezwzględną czułość detektora badano, mierząc tylko kropelki fluoresceiny. Dane pokazują zdolność systemu do wykrywania stężeń barwnika w zakresie od 0,1 do 100 nanomolowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wdrożyć prosty i kompaktowy system detekcji fluorescencji, wykorzystując szereg wstawionych światłowodów i pojedynczy detektor zdjęć.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia kompaktowy i modułowy schemat wielokolorowej detekcji fluorescencji dla mikroprzepływów kropelkowych. Metoda ta wykorzystuje macierz światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych, co upraszcza proces detekcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Detekcja fluorescencyjna
- Mikroprzepływy kropelkowe
- Przesiewy biologiczne
Wstęp
- Tradycyjne wielobarwne systemy detekcji fluorescencji są nieporęczne i skomplikowane.
- W zastosowaniach biologicznych istnieje zapotrzebowanie na prostsze i bardziej opłacalne rozwiązania.
- Włókna optyczne mogą zapewnić nowatorskie podejście do detekcji fluorescencji.
- Technika ta może ułatwić wysokoprzepustowe przesiewanie oraz badania nad ewolucją enzymów.
Cel badania
- W celu zademonstrowania prostego zastosowania detekcji fluorescencji w mikroprzepływach kropelkowych.
- W celu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach przesiewowych w biologii, takie jak identyfikacja rzadkich fenotypów.
- W celu przedstawienia niedrogiej metody detekcji fluorescencji.
Zastosowane metody
- Przygotowanie płytki krzemowej za pomocą powłokowania wirowego.
- Naniesienie fotorezystu SU-8 3050 w celu utworzenia warstwy.
- Ogrzewanie pokrytej płytki na płycie grzejnej w celu utwardzenia fotorezystu.
- Wykorzystanie światłowodów do wielokolorowego zbierania danych.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia efektywną detekcję wielobarwnej fluorescencji.
- Upraszcza ona proces w porównaniu z tradycyjnymi systemami.
- Technika ta jest kosztowo efektywna i łatwa w implementacji.
- Wspiera ona zastosowania w wysokoprzepustowym przesiewaniu biologicznym.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście do detekcji fluorescencji w mikroprzepływach kropelkowych.
- Zastosowanie światłowodów zwiększa wydajność gromadzenia danych.
- Metoda ta ma istotne znaczenie dla badań biologicznych oraz screeningu.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda odpowiada na potrzebę stworzenia kompaktowego i kosztowo efektywnego układu detekcji fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej, umożliwiając wysokoprzepustowe przesiewanie rzadkich fenotypów oraz ewolucję enzymów. Dzięki zastosowaniu światłowodów do czasowego kodowania sygnałów wielobarwnych, eliminuje ona konieczność stosowania złożonego filtrowania optycznego, co redukuje stopień skomplikowania systemu oraz obciążenia związane z jego konserwacją. Wspiera to przepływy pracy w ramach wczesnych etapów odkryć, gdzie skalowalne i powtarzalne analizy są kluczowe dla walidacji celów oraz identyfikacji wiodących związków.
Strategiczne Zastosowania w Badaniach i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez multipleksowe odczyty fluorescencyjne w analizach opartych na kropelkach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia prostą i niedrogą platformę do przesiewania dużych bibliotek w celu identyfikacji rzadkich wariantów funkcjonalnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera przesiewy fenotypowe dzięki ilościowym, rozdzielonym czasowo danym fluorescencyjnym w celu zminimalizowania ryzyka związanego z oddziaływaniem na cel.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych testów kropelkowych do dalszego przesiewania poprzez umożliwienie detekcji wielu fluoroforów bez nakładania się widm.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność testów dzięki przestrzennym kodom wzbudzenia i wykorzystaniu jednego detektora do zbierania sygnału.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla różnych kombinacji barwników i klas celów dzięki modułowej konstrukcji światłowodowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia screening wariantów enzymów lub czynników wiążących istotnych dla przedklinicznej walidacji celu.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Pozwala na wykrywanie sygnałów o niskiej intensywności (sub-nanomolarna fluoresceina) w celu oceny czułości w odczytach typu biomarkera.
- Przewidywalna pewność: Generuje ilościowe, rozdzielone w czasie wyniki fluorescencji, które wspierają decyzje go/no-go w procesie optymalizacji wiodących związków.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od opracowania testu po identyfikację związków wiodących – zapewniając możliwość ponownego wykorzystania modułu detekcyjnego w kampaniach przesiewowych opartych na kropelkach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez za pomocą multipleksowej detekcji fluorescencji w wysokoprzepustowych formatach kropelkowych.
- Screening: Umożliwia przygotowanie analiz dzięki przestrzennemu rozdzieleniu wzbudzenia i czasowemu kodowaniu sygnału, co zwiększa przepustowość i możliwości multipleksowania.
- Analityka: Dostarcza ilościowe odczyty fluorescencji z separacją pików skorelowaną z czasem przejścia kropelki, umożliwiając rozróżnienie wielu populacji.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez wykrywanie aktywności enzymatycznej lub zdarzeń wiązania w klinicznie istotnych zakresach stężeń.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi modularny system detekcji oparty na światłowodach, który można dostosować do różnych chipów mikroprzepływowych i zestawów barwników.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną walidacji celu poprzez umożliwienie niezawodnej, multipleksowej detekcji sygnału w złożonych mieszaninach.
- Wartość operacyjna: Redukuje stopień skomplikowania i koszty w porównaniu z tradycyjnymi systemami opartymi na mikroskopii, zwiększając przepustowość laboratorium oraz łatwość obsługi.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza kampanie przesiewowe dzięki uproszczeniu konfiguracji i konserwacji, wspierając szybszą iterację w ewolucji enzymów i przesiewaniu fenotypowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację trafień z uwzględnieniem ryzyka dzięki powtarzalnym, ilościowym danym fluorescencyjnym w warunkach multipleksowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, operowania włóknami optycznymi oraz sprzęgania laserowego.
- Metoda zależy od dostępu do diod laserowych, włókien optycznych, sprzęgaczy światłowodowych oraz detektora pojedynczych fotonów lub PMT.
- Niezbędna jest standaryzacja pozycjonowania włókien i geometrii kanałów w celu uzyskania powtarzalnego kodowania czasowego.
- Wymagane są dostosowania przy zmianie par barwników lub wymiarów kanałów, aby zachować separację pików.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na wyrównanie włókien oraz możliwość wystąpienia przechyłów sygnału (crosstalk), jeśli rozdzielczość czasowa jest niewystarczająca.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:34
Master Fabrication
3:42
PDMS Device Fabrication
5:24
Preparation of Optical Components
6:41
Optical Fiber Insertion
7:33
Fluorescence Detection of Mixed Emulsions
8:53
Results: Sensitive Detection of Fluorescent Droplets Using Optical Fibers
9:55
Conclusion
