Name: Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj metodę wielokolorowej detekcji fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów. To proste i tanie rozwiązanie umożliwia skuteczne badania przesiewowe w biologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant DARPA numer 84389.01.44908, nagrodę NSF CAREER (DBI-1253293), grant na badania eksploracyjne/rozwojowe NIH (CA195709) oraz NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01) oraz grant New Directions z programu alokacji zasobów UCSF.

1. Produkcja główna SU8
<ol>
	<li>Zaprojektuj struktury mikroprzepływowe do produkcji trójwarstwowej za pomocą oprogramowania do projektowania i zleć wydrukowanie projektów dostawcy na folii na płytce drukowanej o rozdzielczości 10 μm. Szczegóły konstrukcji urządzenia podano w załączonym piśmiennictwie 6, a geometrie kanałów przedstawiono na rysunku 1. Warstwy powinny zawierać znaczniki wyrównania, aby ułatwić kolokację elementów z każdej warstwy produkcyjnej 8.</li>
	<li>Umieść wstępnie oczyszczoną płytkę silikonową o średnicy 3 cali na powlekarce wirowej i włącz próżnię, aby przymocować ją do uchwytu. Nałóż 1 ml SU8-3050 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 1 750 obr./min, uzyskując grubość warstwy 80 μm.</li>
	<li>Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 30 minut. Poczekaj, aż wafel ostygnie do temperatury RT, zanim przejdziesz do następnego kroku.</li>
	<li>Wystawić powlekaną płytkę na maskę z 1warstwą pod skolimowaną diodą LED o mocy 190 mW, 365 nm przez 3 minuty. Po ekspozycji umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 1 minutę, a następnie ostudź do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Umieść wafel na powlekarce wirowej i włącz próżnię, aby przymocować go do uchwytu. Nałóż 1 ml SU8-3050 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 5,000 obr./min, uzyskując warstwę o dodatkowej grubości 40 μm.</li>
	<li>Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 30 minut, a następnie ostudź do temperatury RT przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Dopasuj maskę2-giej warstwy do geometrii wzorzystej w 1.3 i wystawij powlekaną płytkę na skolimowaną diodę LED o mocy 190 mW, 365 nm przez 3 minuty. Po naświetleniu umieść na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 4 minuty i 30 sekund, a następnie ostudź do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Umieść wafel na powlekarce wirowej i włącz próżnię, aby przymocować go do uchwytu. Nałóż 1 ml SU8-3050 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 1,000 obr./min, uzyskując warstwę o dodatkowej grubości 100 μm.</li>
	<li>Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 30 minut, a następnie ostudź do temperatury RT przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Dopasuj maskę 3. warstwy do geometrii wzorzystej w 1.3 i wystaw powlekaną płytkę na działanie skolimowanej diody LED o mocy 190 mW, 365 nm przez 3 minuty. Po ekspozycji umieść na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 9 minut, a następnie ostudź do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Opracuj maski, zanurzając się w mieszanej kąpieli octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego na 30 minut. Umyj wafel w izopropanolu i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 1 minutę. Umieść rozwinięty wzorzec na 100-milimetrowej szalce Petriego do formowania polidimetylosiloksanu (PDMS).</li>
</ol>
2. Produkcja urządzeń PDMS
<ol>
	<li>Przygotuj PDMS 10:1, łącząc 50 g bazy silikonowej z 5 g utwardzacza w plastikowym kubku. Wymieszaj zawartość za pomocą narzędzia obrotowego wyposażonego w patyczek do mieszania. Odgazowywać mieszaninę wewnątrz eksykatora przez 30 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wlać PDMS do uzyskania grubości 3 mm na urządzenie główne i umieścić z powrotem w eksykatorze w celu dalszego odgazowania. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków piecz urządzenie w temperaturze 80 °C przez 80 minut.</li>
	<li>Wytnij urządzenie z formy za pomocą skalpela i umieść na czystej powierzchni wzorzystą stroną do góry i przebij wloty i wyloty płynu dziurkaczem biopsyjnym 0,75 mm. Urządzenie musi być przycięte w taki sposób, aby geometrie o wysokości 120 μm i 220 μm były dostępne z boku urządzenia.</li>
	<li>Urządzenie należy traktować plazmowo stroną do góry wraz ze wstępnie oczyszczonym szkiełkiem o wymiarach 2 cale na 3 cale przy plazmie 1 mbar O2 przez 20 sekund w myjce plazmowej o mocy 300 W. Połącz urządzenie PDMS, umieszczając wzorzystą stronę urządzenia PDMS na stronie szkła poddanego obróbce plazmowej. Umieść urządzenie w piekarniku o temperaturze 80 °C i piecz zmontowane urządzenie przez 40 minut.</li>
	<li>Unieszkodliwić kanały jako hydrofobowe za pomocą strzykawki do przepłukania urządzenia fluorowanym płynem do obróbki powierzchni. Natychmiast piecz urządzenie w temperaturze 80 °C przez 10 minut, aby odparować rozpuszczalnik.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komponentów optycznych
<ol>
	<li>Przygotować światłowód wzbudzenia laserowego, usuwając izolację z ostatnich 5 mm rdzenia 105 μm, okładziny 125 μm, światłowód NA = 0,22.</li>
	<li>Przygotuj 2. kolorowe światłowód wzbudzenia laserowego, powtarzając 3.1 dla 2. identycznego włókna</li>.
	<li>Przygotuj światłowód do odbioru sygnału fluorescencyjnego powtarzając 3,1 dla rdzenia 200 μm, okładziny 225 μm, światłowód NA = 0,39.</li>
	<li>Sprawdź końcówki wszystkich włókien — jeśli końcówki nie kończą się płaską powierzchnią, ponownie rozetnij końce rysikiem do włókien.</li>
	<li>Podłącz sprzęgacz światłowodu laserowego do lasera o mocy 50 mW, 405 nm i podłącz do lasera jedno z włókien rdzeniowych 105 μm. Skieruj odizolowany koniec na czujnik miernika mocy lasera i użyj precyzyjnych regulacji łącznika laserowego, aby zmaksymalizować moc lasera.</li>
	<li>Powtórz 3,5 dla lasera o mocy 50 mW i długości fali 473 nm.</li>
	<li>Zamontuj poczwórne filtry pasmowoprzepustowe 446/510/581/703 nm na PMT za pomocą tubusów soczewek do blokowania światła laserowego i przesyłania emitowanej fluorescencji. Zamocuj łącznik światłowodowy tak, aby światło przepływało przez filtry przed uderzeniem w PMT.</li>
	<li>Podłącz światłowód z 3.3 do urządzenia zmontowanego w 3.7.</li>
</ol>
4. Generowanie mieszanej emulsji offline
<ol>
	<li>Zaopatrz się w mikroprzepływowy wkraplacz z ogniskiem przepływu i kryzą 60 μm x 60 μm.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml olejami HFE 7500 z 2% jonowym fluorosurfaktantem 9.</li>
	<li>Napełnić serię strzykawek o pojemności 1 ml następującymi kombinacjami fluoresceiny (FITC) i niebieskich barwników sprzężonych z dekstranem (CB) w PBS: 1 nM FITC/10 nM CB, 10 nM FITC/10 nM CB, 1 nM FITC/100 nM CB i 10 nM FITC/100 nM CB.</li>
	<li>Zamontuj urządzenie do wytwarzania kropli na stoliku mikroskopu odwróconego, a strzykawki wodne i olejowe na pompach strzykawkowych. Podłączyć strzykawki do urządzeń za pomocą rurki PE-2.</li>
	<li>Uruchamiając pompy strzykawkowe z prędkością 500 μl/h dla oleju i 250 μl/h dla roztworów wodnych, utworzyć mieszaninę kropelek o wielkości 80 μm zawierających roztwory z ppkt 4.3. Dla każdego rodzaju próbki wodnej należy użyć nowego urządzenia do wytwarzania kropli, aby wyeliminować zanieczyszczenie krzyżowe. Zebrać ~200 μl emulsji z każdej kombinacji barwników do pustej strzykawki.</li>
	<li>Po zebraniu 4 rodzajów kropel w jednej strzykawce, należy wymieszać emulsję, kilkakrotnie obracając strzykawkę.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.2-4.6 z roztworami wodnymi zawierającymi 0,1, 1, 10 i 100 nM FITC w PBS.</li>
</ol>
5. Wstawianie światłowodu
<ol>
	<li>Umieść chip mikroprzepływowy wykonany w kroku 2 na stoliku mikroskopu odwróconego sprzężonego z kamerą cyfrową zdolną do < czasów otwarcia migawki 100 μs.</li>
	<li>Pracując ostrożnie z boku, włóż światłowód sprzężony z laserem 473 nm do najdalszego kanału 120 μm, uważając, aby nie przebić się do głównego kanału przepływowego.</li>
	<li>Włóż światłowód sprzężony z laserem 405 nm do najdalszego kanału bocznego o wysokości 120 μm, zapewniając odstęp między włóknami 300 μm.</li>
	<li>Włóż światłowód sprzężony z PMT do kanału o wysokości 220 μm normalnego do dwóch światłowodów wzbudzenia laserowego.</li>
</ol>
6. Wykrywanie fluorescencji mieszanych emulsji 
<ol>
	<li>Zamontuj strzykawkę o pojemności 5 ml wypełnioną HFE 7500 z 2% jonowym fluorosurfaktantem do wlotu oleju dystansowego urządzenia detekcyjnego z rurką PE-2.</li>
	<li>Zamontować strzykawkę zawierającą zmieszaną emulsję FITC/CB na pionowo ustawionej pompie strzykawkowej i podłączyć do wlotu do wstrzykiwania kropelek urządzenia za pomocą rurki PE-2. Podłącz odcinek rurki PE-2 od wyjścia urządzenia do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Zalać urządzenie, uruchamiając każdą z pomp z prędkością 1 000 μl/h, aż zobaczysz, że zarówno olej, jak i kropelki regularnie łączą się w urządzeniu i przepływają w dół.</li>
	<li>Dostosuj natężenie przepływu tak, aby olej dystansowy działał z prędkością 6 000 μl/h, a kropelki z prędkością 100 μl/h, zapewniając znaczne odstępy między kroplami przemieszczającymi się przez obszar wykrywania.</li>
	<li>Włącz lasery, uruchom program akwizycji danych i dostosuj wzmocnienie PMT, aby zapewnić sygnały, które są ponad 100 razy większe niż podstawowy poziom szumów. Dostosuj moc lasera tak, aby wszystkie piki dubletów były wyraźnie widoczne na jednym, liniowo skalowanym śladzie czasu.</li>
	<li>Uzyskaj 60 sekund śladu czasu napięcia PMT przy co najmniej 20 kHz. Zaimportuj dane do programu komputerowego, takiego jak Matlab i zmierz wysokości szczytów zarejestrowanych dubletów za pomocą niestandardowego skryptu programu obliczeniowego. 
	UWAGA: Jest to informacja uzupełniająca.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.2-6.7, używając mieszanej emulsji tylko z FITC, utworzonej w 4.7, przy wyłączonym laserze 405 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+Enables+Digital+Detection+of+RNA+with+Droplet+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR.</a> PLOS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+and+modular+multicolour+fluorescence+detector+for+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).</li>
<li>Guo, F., Lapsley, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+droplet-based%2C+optofluidic+device+for+high-throughput%2C+quantitative+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li>
<li>Lithography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html">https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html</a> (2015).</li>
<li>DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Biocompatible+Oil-Water+Interfaces+without+Synthesis%3A+Direct+Interactions+between+Primary+Amines+and+Carboxylated+Perfluorocarbon+Surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants.</a> Anal Chem. 85 (21), (2013).</li>
<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882(2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li>
<li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li>
<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Detekcja światłowodowa wymaga wyrównania światłowodów względem kanałów płynnych. Ze względu na to, że nasze urządzenie wykorzystuje kanały prowadzące wykonane metodą fotolitografii wielowarstwowej, duże znaczenie ma rozmieszczenie masek względem siebie. Jeśli kanały prowadzące światłowód znajdują się zbyt blisko kanału płynu, istnieje możliwość wycieku płynu; Jeśli kanały prowadzące są umieszczone zbyt daleko lub niewspółosiowo, sygnał fluorescencyjny zbierany przez światłowód detekcyjny może być znacznie osłabiony. Praw...

Mikrofluidyka kropelkowa stanowi platformę dla biologii o wysokiej przepustowości poprzez dzielenie eksperymentów na dużą liczbę kropel wodnych zawieszonych w oleju nośnikowym 1. Kropelki są wykorzystywane do tak różnych zastosowań, jak analiza pojedynczych komórek 2, cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) 3 i ewolucja enzymów 4. Testy fluorescencyjne są standardowym sposobem wykrywania mikrofluidyki kropelkowej, ponieważ ich jasne sygnały i szybki czas reakcji są kompatybilne z wykrywaniem objętości kropel poniżej nanolitrów z szybkością kiloherców. Wiele aplikacji wymaga detekcji fluorescencji dla co najmniej dwóch kolorów jednocześnie. Na przykład nasze laboratorium często przeprowadza eksperymenty sortowania kropelek aktywowanych PCR, które wykorzystują jeden kanał detekcji do uzyskania wyniku testu i wykorzystują wtórny barwnik tła, aby krople ujemne w teście były policzalne 5.
Typowe stacje detekcji mikrofluidyki kropelkowej są oparte na mikroskopach epifluorescencyjnych i wymagają skomplikowanych schematów manipulacji światłem, aby wprowadzić do mikroskopu światło wzbudzające z laserów wolnej przestrzeni, aby skupić się na próbce. Po wyemitowaniu fluorescencji z kropli, emitowane światło fluorescencyjne jest filtrowane tak, aby każdy kanał detekcji wykorzystywał jedną lampę fotopowielacza (PMT) wyśrodkowaną w paśmie długości fali. Optyczne systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym stanowią barierę wejścia ze względu na ich koszt, złożoność i wymaganą konserwację. Światłowody zapewniają środki do skonstruowania uproszczonego i solidnego schematu wykrywania, ponieważ światłowody można ręcznie wstawiać do urządzeń mikroprzepływowych, eliminując potrzebę prowadzenia światła w oparciu o lustro i umożliwiając łączenie ścieżek świetlnych za pomocą złączy światłowodowych.
W tym artykule opisujemy montaż i walidację kompaktowego i modułowego schematu do przeprowadzania wielokolorowej detekcji fluorescencji za pomocą szeregu światłowodów i pojedynczego fotodetektora 6. Światłowody są sprzężone z pojedynczymi laserami i są wprowadzane normalnie do kanału przepływowego w kształcie litery L z regularnymi przesunięciami przestrzennymi. Włókno zbierające fluorescencję jest zorientowane równolegle do obszarów wzbudzenia i jest połączone z pojedynczym PMT. Ponieważ kropla przechodzi przez wiązki laserowe w różnym czasie, dane zarejestrowane przez PMT pokazują przesunięcie czasowe, które pozwala użytkownikowi rozróżnić fluorescencję emitowaną po wzbudzeniu kropli przez każdą odrębną wiązkę laserową. To przesunięcie czasowe eliminuje potrzebę rozdzielania emitowanego światła w celu oddzielenia PMT za pomocą szeregu dichroicznych luster i filtrów pasmowoprzepustowych. Aby zweryfikować skuteczność detektora, oznaczamy ilościowo fluorescencję w populacjach kropelek zawierających barwniki o różnym kolorze i stężeniu. Czułość systemu jest badana pod kątem wykrywania fluoresceiny jednokolorowej i wykazuje zdolność do wykrywania kropelek o stężeniach do 0,1 nM, co stanowi 200-krotną poprawę czułości w porównaniu z najnowszymi metodami opartymi na włóknach opisanych w literaturze 7.

<table><tbody><tr><td>Fotomaski</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-calowe wafle silikonowe, typ P, klasa dziewicza</td> Test <td>Wafle uniwersyteckie</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki 1 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>strzykawki 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 igieł gaugue</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 rurki polietylenowe</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Powszechnie znany jako HFE 7500</td></tr><tr>Instrukcje syntezy<td>surfaktantu</td><td></td><td></td> jonowego Krytox <td>w ref #10</td></tr><tr><td>Kaskadowy niebieski barwnik sprzężony z dektranem</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa fluoresceiny</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td> <td>czteropasmowoprzepustowySemrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Port światłowodowy</td><td>Tubus obiektywu Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>krosowy z 200 &#956; rdzeń M / 225 &#956; m okładzina światłowodowa z jednym odizolowanym końcem i jednym złączem FC / PC</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Patch Cable z 105 i # 956; rdzeń M / 125 &#956; m światłowód okładzinowy z jednym odizolowanym końcem i jednym złączem FC/PC</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &#956; m narzędzie do ściągania izolacji z włókien</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &#956; m narzędzie do ściągania izolacji z włókien</td> Adapter <td>światłowodowy lasera Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td></td> Adapter <td>OptoEngine</td><td>FC/PC</td> Laser <td></td></tr><tr><td>405 nm CW przy 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Dystrybutor do laserów CNI</td></tr><tr><td>Laser 473 nm CW przy 50&nbsp; </td><td>Silnik optoowy</td> mW <td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Testy fluorescencyjne są najczęściej używanymi odczytami w mikrofluidyce kropelkowej ze względu na ich jasne sygnały i szybki czas reakcji. Zastosowania takie jak testy multipleksowe, ewolucja enzymów i sortowanie komórek wspomagane biologią molekularną wymagają wykrywania dwóch lub więcej kolorów fluorescencji. Standardowe wielokolorowe systemy detekcji, które łączą lasery wolnej przestrzeni z mikroskopami epifluorescencyjnymi, są nieporęczne, drogie i trudne w utrzymaniu. W tym artykule opisujemy schemat wykonywania detekcji wielokolorowej poprzez wzbudzanie dyskretnych obszarów kanału mikroprzepływowego za pomocą laserów sprzężonych ze światłowodami. Emitowane światło jest zbierane przez światłowód sprzężony z pojedynczym fotodetektorem. Ponieważ wzbudzenie zachodzi w różnych lokalizacjach przestrzennych, tożsamość emitowanego światła może być zakodowana jako przesunięcie czasowe, eliminując potrzebę stosowania bardziej skomplikowanych schematów filtrowania światła. System został wykorzystany do wykrywania populacji kropelek zawierających cztery unikalne kombinacje barwników oraz do wykrywania subnanomolowych stężeń fluoresceiny.

Wytworzenie urządzenia z PDMS umożliwiającego wprowadzenie światłowodów wymaga wieloetapowej procedury fotolitografii w celu stworzenia kanałów o różnej wysokości (Rycina 1). Najpierw na płytkę krzemową nanosi się metodą spin-coatingu warstwę SU-8 o grubości 80 µm, a następnie formuje jej wzór za pomocą maski, aby utworzyć geometrię układu przepływowego. Następnie na płytkę nanosi się kolejną 40 µm warstwę SU-8 i formuje wzór przy użyciu drugiej maski, aby stworzyć elemen...

Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.

Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie prostego zastosowania detekcji fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w wysokoprzepustowym przesiewaniu biologicznym, takich jak identyfikacja rzadkich fenotypów oraz ukierunkowana ewolucja enzymów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość prostego i niedrogiego zastosowania detekcji fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej.Na początek należy umieścić uprzednio oczyszczony wafelek krzemowy o średnicy trzech cali na uchwycie próżniowym powlekarki rotacyjnej. Następnie należy nanieść jeden mililitr SU-8 3050 na środek wafla i zakręcić nim, aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 80 µm. Powleczony wafelek należy wyjąć z powlekarki rotacyjnej i umieścić na płycie grzewczej wstępnie rozgrzanej do 135 °C.Po 30 minutach wyjmij wafelek i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie połóż wafelek na płaskiej powierzchni i dopasuj maskę pierwszej warstwy do wafelka. Naświetlaj wafelek kolimowanym światłem LED o mocy 190 milliwatt i długości fali 365 nanometr przez trzy minuty.Po naświetlaniu umieść podłoże na płycie grzejnej o temperaturze 135°C na jedną minutę, a następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Po ochłodzeniu umieść podłoże ponownie w nanosiarce odśrodkowej i przymocuj je do uchwytu. Nanieś dodatkowy mililitr SU-8 3050 na środek podłoża i wiruj przez 20 sekund z prędkością 500 r.p.m.następnie przez 30 sekund przy 5, 000 r.p.m. Następnie wypiecz wafelek na płycie grzejnej. Pozostaw go do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie umieść go z powrotem na powierzchni wyrównywania maski.Używając stereomikroskopu, ręcznie dopasuj maskę drugiej warstwy do naniesionych znaczników wyrównania na waflu. Po prawidłowym ustawieniu, naświetl powleczony wafel przez 4,5 minuty, stosując te same warunki co poprzednio. Po naświetlaniu umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 135 °C na jedną minutę, a następnie schłodź wafel i przymocuj go z powrotem do powlekarki rotacyjnej.Nanieś jeden mililitr SU-8 3050 na podłoże krzemowe po raz trzeci i wiruj, aby dodać kolejne 100 µm fotorezystu. Wyjmij podłoże i wypiecz na płycie grzejnej w temperaturze 135 °C przez 30 minut. Następnie schłodź je do temperatury pokojowej i umieść na powierzchni wyrównawczej.Dopasuj maskę trzeciej warstwy do poprzedniej geometrii i naświetl powleczony wafelek, stosując poprzednie warunki przez dziewięć minut. Po naświetlaniu umieść wafelek na płycie grzewczej o temperaturze 135 °C na jedną minutę, a następnie schłodź go do temperatury pokojowej. Po ochłodzeniu wywołaj maski, zanurzając wafelek w mieszanym roztworze wywoływacza na 30 minut.Na koniec przemyj wafer w izopropanolu, a następnie wypiecz go po raz ostatni przez jedną minutę na płycie grzejnej w temperaturze 135 °C. Przechowuj wywołaną matrycę w 100 mm szalce Petriego do czasu formowania. Przygotuj mieszaninę PDMS w stosunku 10:1, łącząc 50 g bazy silikonowej z 5 g utwardzacza w plastikowym kubku.Wymieszaj zawartość za pomocą mieszadła rotacyjnego, a następnie odgazuj mieszaninę w eksyكاتهcie przez 30 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza. Wlej odgazowany PDMS na przygotowaną formę matrycową, aby uzyskać grubość 3 mm. Następnie umieść szalkę Petriego z powrotem w eksyكاتهcie w celu dalszego odgazowania.Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza, wypiecz urządzenie w temperaturze 80 °C przez 80 minut. Po ostygnięciu wytnij urządzenie z formy za pomocą skalpela w taki sposób, aby obie telegeometrie o rozmiarach 120 µm i 220 µm były dostępne z boku urządzenia. Następnie wykonaj otwory wlotowe i wylotowe dla płynów za pomocą biopsyjnego wycinaka o średnicy 0,75 mm. Poddaj urządzenie obróbce plazmowej stroną z elementami do góry wraz z uprzednio oczyszczonym szkiełkiem przedmiotowym, stosując plazmę tlenową o ciśnieniu 1 millibar przez 20 sekund w oczyszczaczu plazmowym o mocy 300 watt. Połącz urządzenie, mocno dociskając stronę z wzorem urządzenia PDMS do strony szkiełka przedmiotowego poddanej obróbce plazmowej. Następnie umieść urządzenie w piekarniku do urządzeń w temperaturze 80 stopni Celsjusza i wypiecz zmontowane urządzenie przez 40 minut.Po wypaleniu należy użyć strzykawki, aby przepłukać urządzenie fluoryzowanym płynem do modyfikacji powierzchni w celu nadania kanałom właściwości hydrofobowych. Następnie należy niezwłocznie wypalić urządzenie w temperaturze 80 °C przez 10 minut, aby odparować rozpuszczalnik. Przygotować dwa światłowody do wzbudzania laserowego, usuwając izolację z ostatnich pięciu milimetrów włókien optycznych.Należy również przygotować światłowód do zbierania sygnału fluorescencyjnego poprzez usunięcie izolacji z ostatnich pięciu milimetrów większego światłowodu. Końcówki wszystkich światłowodów należy sprawdzić pod mikroskopem. Jeśli końcówki nie są płaskie, należy je ponownie przyciąć za pomocą skrobaka do światłowodów.Następnie podłącz sprzęgacz światłowodowy do lasera o mocy 50 milliwatt i długości fali 405 nanometr, a następnie podłącz jeden ze światłowodów o rdzeniu 105 mikrometr do lasera. Skieruj odizolowany koniec światłowodu na czujnik miernika mocy lasera i korzystając z precyzyjnej regulacji sprzęgacza laserowego, zmaksymalizuj moc lasera. Przeprowadź ten sam proces w celu nastrojenia drugiego światłowodu, używając lasera o mocy 50 milliwatt i długości fali 473 nanometr.Następnie, za pomocą tubusów soczewkowych, zamontuj czteropasmowy filtr przepustowy na pomnożniku fotonów, aby zablokować światło lasera i przepuścić emitowaną fluorescencję. Podłącz sprzęgacz światłowodowy w taki sposób, aby światło przechodziło przez filtry przed dotarciem do pomnożnika fotonów. Następnie podłącz światłowód zbierający do sprzęgacza światłowodowego.Umieść wykonany chip mikrofluidyczny na stoliku mikroskopu odwróconego połączonego z kamerą cyfrową umożliwiającą czas naświetlania wynoszący co najmniej 100 µs. Ostrożnie, wprowadzając włókno od strony bocznych krawędzi, wsuń włókno połączone z laserem o długości fali 473 nm do najdalej położonego w górę strumienia kanału o średnicy 120 µm. Należy uważać, aby nie przebić go na wylot do głównego kanału przepływowego.Następnie włókno sprzężone z laserem 405 nanometr wstaw do najdalej położonego w dół kanału bocznego o wysokości 120 mikrometr, zachowując odstęp między włóknami wynoszący 300 mikrometrów. Na koniec włókno sprzężone z większą lampą fotopowielaczową wstaw do kanału o wysokości 220 mikrometr prostopadle do dwóch włókien wzbudzenia laserowego. Napełnij strzykawkę o pojemności pięć mililitrów cieczą HFE 7500 zawierającą 2% jonowy fluorosurfaktant i podłącz ją do wlotu oleju dystansowego urządzenia detekcyjnego za pomocą rurek PE2.Następnie należy napełnić strzykawkę emulsją z mieszanką FITC i barwnika niebieskiego, a następnie zamontować ją w ustawionej pionowo pompie strzykawkowej połączonej z urządzeniem jako wlot do ponownego wstrzykiwania kropli za pomocą rurki PE2. Od wyjścia urządzenia do pojemnika na odpady należy podłączyć odcinek rurki PE. Następnie należy przygotować urządzenie, uruchamiając każdą z pomp z przepływem 1 000 µL/h, aż do momentu, gdy zaobserwuje się regularne łączenie oleju i kropli w urządzeniu oraz ich przepływ w kierunku wylotu.Dostosuj szybkości przepływu tak, aby olej dystansowy przepływał z prędkością 6, 000 µL/h, a kropelki z prędkością 100 µL/h, co zapewni znaczny odstęp między kropelkami przemieszczającymi się przez obszar detekcji. Następnie włącz lasery i uruchom program akwizycji danych. W dalszej kolejności dostosuj wzmocnienie fotopowielacza tak, aby sygnały były ponad 100-krotnie wyższe od poziomu szumów tła.Na koniec dostosuj moc lasera w taki sposób, aby wszystkie piki dubletowe były wyraźnie widoczne na pojedynczym śladzie czasowym o skali liniowej. Kropla przepływająca przez kanał detekcyjny napotyka dyskretne obszary wzbudzenia znajdujące się przed każdym z połączonych z laserem światłowodów optycznych. Światłowód detekcyjny rejestruje emitowaną fluorescencję z przesunięciem czasowym, przy czym odstęp między pikami koreluje z czasem, w jakim kropla przemieszcza się z jednego obszaru wzbudzenia do następnego.Eliminuje to konieczność dalszego filtrowania światła oraz stosowania oddzielnych fotopowielaczy. Skuteczność schematu detekcji przetestowano poprzez wykrywanie mieszanej emulsji kropli zawierających barwniki pobudzane przy 405 nanometrach i 473 nanometrach. Wykres ten pokazuje wyraźną separację między czterema typami reinjektowanych kropli podczas przepływu z częstotliwością około 50 hertz.Zakres dynamiczny i czułość absolutna detektora zostały zbadane poprzez pomiar kropli zawierających wyłącznie fluoresceinę. Dane wykazują zdolność systemu do wykrywania stężeń barwnika w zakresie od 0,1 do 100 nanomolar. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zaimplementować prosty i kompaktowy system detekcji fluorescencji, wykorzystując macierz wstawionych światłowodów i pojedynczy fotodetektor.

multicolor-fluorescence-detection-for-droplet-microfluidics-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Zaprezentowano bezsoczewkową platformę do fluorescencyjnej mikroskopii na chipie, która umożliwia obrazowanie obiektów fluorescencyjnych w bardzo szerokim polu widzenia, np. &gt;0,6-8 cm2, z rozdzielczością &lt;4μm, przy użyciu algorytmu dekodującego opartego na próbkowaniu kompresyjnym. Taka kompaktowa modalność obrazowania fluorescencyjnego na chipie z szerokim polem widzenia może być cenna w cytometrii wysokoprzepustowej, badaniach rzadkich komórek oraz analizach mikromacierzy.

Bezosobnikowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Czujniki mikrownękowe z rdzeniem fluorescencyjnym wykorzystują powłokę z kropek kwantowych o wysokim indeksie w kanale mikrokapilar krzemionkowych. Zmiany współczynnika załamania światła płynów pompowanych do kanału kapilarnego powodują przesunięcia w widmie fluorescencji mikrownęki, które można wykorzystać do analizy ośrodka kanałowego.

Synteza i działanie mikrownęk z rdzeniem fluorescencyjnym w detekcji refraktometrycznej

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Ta praca przedstawia prostą i wizualną metodę wykrywania polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami. Dzięki proponowanej metodzie cały eksperyment, w tym manipulacja kropelkami i wykrywanie polimorfizmów wielonukleotydowych, może być przeprowadzony w temperaturze około 23 °C bez pomocy zaawansowanych urządzeń.

Wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Poznaj metodę wielokolorowej detekcji fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów. To proste i tanie rozwiązanie umożliwia skuteczne badania przesiewowe w biologii.

Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Przeglądaj więcej filmów