Name: In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych trzustki myszy dorosłej. Metoda wykorzystuje metylocelulozowy półstały podłoże do hodowli kolonii in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Lucy Brown i Alexandrowi Spalla z Analitycznego Rdzenia Cytometrii w City of Hope za pomoc w sortowaniu. Praca ta jest częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R01DK081587 i R01DK099734 dla H.T.K. oraz U01DK089533 dla A.D.R., a także przez grant National Science Foundation NSF-DMR-1206121 i grant California Institute for Regenerative Medicine RB5-07398 dla D.A.T. Wsparcie z Instytutu Inżynierii Molekularnej Josepha J. Jacobsa dla Medycyny w Caltech dla D.A.T., a te od Oxnard Foundation i Ella Fitzgerald Foundation do H.T.K. są również wdzięczne.
Finansowanie: Ta praca jest częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R01DK081587 i R01DK099734 dla H.T.K., a U01DK089533 dla A.D.R., oraz przez grant National Science Foundation NSF-DMR-1206121 i grant California Institute for Regenerative Medicine RB5-07398 dla D.A.T. Wsparcie od Joseph J. Jacobs Institute for Molecular Engineering for Medicine w Caltech dla D.A.T., a te od Oxnard Foundation i Ella Fitzgerald Foundation do H.T.K. są również wdzięczne. Badania opisane w tej publikacji obejmowały prace wykonane w Analytical Cytometry Core and Light Microscopy Digital Imaging Core, wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA33572.
Sponsor badania: Sponsor nie brał udziału w projektowaniu, zbieraniu, analizie lub interpretacji danych w badaniu.

<ol><li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9%2B+ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li>
<li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li>
<li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct%2C+Acinar%2C+and+Endocrine+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940(2013).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li>
<li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin%2C+the+ligand+for+the+Mpl+receptor%2C+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li>
<li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
<li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148(2011).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li>
<li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem%2Fprogenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li>
<li>Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fluidigm.com/documents">http://www.fluidigm.com/documents</a> (2015).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li>
<li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li>
<li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li>
<li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj testy kolonii trzustki i analizy pojedynczych kolonii zostały zainspirowane testami kolonii krwiotwórczych zawierających metylocelulozę, które odegrały główną rolę w rozszyfrowaniu biologii hematopoetycznych komórek progenitorowych w ciągu ostatnich dziesięcioleci 23. W tych testach (ryc. 5) zdysocjowane komórki trzustki są posiewane w półstałe podłoża zawierające metylocelulozę z odpowiednimi czynnikami wzrostu i białkami ECM, które wspierają tworzenie kolonii pierścieniowych, g...

Trzustka składa się z trzech głównych linii komórkowych; komórki groniaste wydzielają enzymy trawienne, przewody wydzielają mucynę do odpierania patogenów i transportu enzymów trawiennych do jelit, a komórki endokrynne wydzielają hormony, w tym insulinę i glukagon, które utrzymują homeostazę glukozy. Podczas embrionalnego rozwoju trzustki wczesne komórki przewodowe są źródłem trójpotencjałowych komórek progenitorowych, które mogą dać początek trzem liniom w trzustce dorosłych zwierząt 1,2. Ponieważ dorosłe komórki macierzyste i progenitorowe, takie jak komórki macierzyste szpiku kostnego, są już z powodzeniem stosowane w leczeniu różnych chorób 3, istnieje duże zainteresowanie znalezieniem komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłej trzustce. Gdyby możliwa była izolacja i manipulacja dorosłymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi trzustki, komórki te mogłyby być stosowane w leczeniu chorób takich jak cukrzyca typu 1, w której komórki wydzielające insulinę są niszczone przez autoimmunizację.
Czy trójsilne komórki progenitorowe nadal istnieją w przewodach trzustkowych dorosłych po zakończeniu rozwoju embrionalnego, jest kwestią intensywnie dyskutowaną w społeczności naukowej. W tej debacie i przy użyciu technik śledzenia linii in vivo cre-lox, Inada i współpracownicy wykazali, że dorosłe mysie komórki przewodowe znakowane markerem, anhydrazą węglanową II, mogą dać początek wszystkim trzem liniom trzustki. Jednak przy użyciu innych markerów przewodowych, takich jak HNF1b 5 i Sox9 2, stwierdzono, że komórki przewodowe nie są głównym źródłem komórek beta u dorosłych myszy.
Kilka lat temu zasugerowaliśmy, że przyczyną wspomnianej debaty może być brak w dziedzinie 6,7 odpowiednich narzędzi analitycznych, które można by użyć do pomiaru samoodnawiania się i różnicowania wieloliniowego - dwóch kryteriów niezbędnych do zdefiniowania komórki macierzystej. Wspomniana powyżej technika śledzenia linii produkcyjnej cre-lox in vivo może dostarczyć dowodów na pokrewieństwo między przodkiem a potomstwem na poziomie populacji. Jednak ta technika śledzenia linii ma ograniczoną moc rozpoznania, czy pojedyncze komórki progenitorowe mogą się samoodnawiać i różnicować w wiele linii. Analiza pojedynczych komórek jest ważna, ponieważ jeśli kilka monosilnych komórek progenitorowych, z których każdy ma inny potencjał liniowy, zostanie przeanalizowanych razem, może się wydawać, że mają one zdolność do różnicowania wieloliniowego. Ponadto komórki macierzyste stanowią zwykle niewielką populację dorosłego narządu. Aktywność mniejszej populacji komórek może być maskowana przez dużą populację. W związku z tym negatywny wynik badania populacyjnego niekoniecznie wskazuje na brak komórek macierzystych. Wreszcie, śledzenie linii cre-lox nie pozwala obecnie na pomiar samoodnawiania się.
Aby rozpocząć wypełnianie luki technicznej w dziedzinie biologii komórek progenitorowych trzustki, opracowano testy kolonii 7-11 lub organoidów 12-15 przy użyciu systemów hodowli 3D. W naszym laboratorium opracowano dwa testy kolonii dla komórek progenitorowych trzustki: jeden zawiera komercyjny preparat mysich białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (patrz tabela metod i sprzętu), a drugi zawiera hydrożel z lamininą, zdefiniowane sztuczne białko ECM 7-11. Komórki progenitorowe miesza się w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Metyloceluloza jest biologicznie obojętnym i lepkim materiałem przygotowanym z włókien drzewnych i jest rutynowo stosowana w testach kolonii krwiotwórczych 16. Półstałe podłoże zawierające metylocelulozę ogranicza ruch pojedynczych komórek progenitorowych, tak że nie mogą one ponownie agregować. Jednak podłoże jest wystarczająco miękkie, aby umożliwić komórce progenitorowej wzrost i różnicowanie się w kolonię komórek w przestrzeni 3D. Zgodnie z tradycją hematologów, komórka progenitorowa trzustki, która była zdolna do powstania kolonii komórek, została nazwana jednostką tworzącą kolonię trzustki (PCFU). PCFU, gdy są hodowane w mysim teście kolonii zawierającym ECM, dają początek koloniom torbielowatym, które są nazywane koloniami "pierścieniowymi" 7. Po dodaniu agonisty Wnt, R-spondyny1, do mysiej kultury zawierającej ECM, niektóre kolonie pierścieniowe przekształcają się w "gęste" kolonie 7. W tym artykule te dwa typy kolonii hodowanych w mysiej kulturze ECM są zbiorczo określane jako kolonie "pierścieniowe/gęste". Kiedy kolonie pierścieniowe / gęste są dysocjowane na zawiesinę pojedynczej komórki i ponownie posiewane do kultur zawierających hydrożel lamininy, powstają kolonie "endokrynne / acinarne" 7.
Korzystając z analiz pojedynczych kolonii, stwierdzono, że większość kolonii pierścieniowych/gęstych i endokrynologicznych/groniastych, zarówno z dorosłej (2-4 miesiące) 7,11, jak i młodej (1 tydzień) 9 mysich trzustek, wykazuje wszystkie trzy markery linii. Sugeruje to, że większość pochodzących PCFU jest trójsilna. W teście kolonii zawierającym mysie ECM, dorosłe mysie PCFU silnie samoodnawiają się i rozszerzają około 500 000 razy w ciągu 11 tygodni w hodowli 7. Mysi ECM preferencyjnie wspiera różnicowanie komórek przewodowych w stosunku do linii endokrynnych i zrazikowych, podczas gdy w obecności hydrożelu z lamininą mysie PCFU są zachęcane do preferencyjnego różnicowania się w komórki endokrynne i groniaste, a w mniejszym stopniu w linię przewodową 7,9,11. Co ważne, w hodowli hydrożelu z lamininą powstają komórki monohormonalne Insulina+Glukagon- które wydzielają insulinę w odpowiedzi na stymulację glukozą in vitro 7,9, co sugeruje dojrzałość funkcjonalną. Trójliniowy potencjał różnicowania 7,9 i samoodnawiania się 11 poszczególnych PCFU potwierdza się za pomocą mikromanipulacji pojedynczej komórki, tj. hodowli jednej komórki na studzienkę w celu utworzenia kolonii. Łącznie wyniki te dostarczają dowodów na to, że w poporodowej mysiej trzustce znajdują się samoodnawiające się, trójpotencjałowe, progenitorowe komórki, które wykazują aktywność w hodowli 3D.
Testy PCFU na myszach opisane w tym artykule pochodzą z wcześniejszego testu kolonijnego zaprojektowanego dla komórek progenitorowych zróżnicowanych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) 17. Protokół ten został szczegółowo udokumentowany w innej publikacji JoVE 18. Składniki i techniki hodowli wymagane do przeprowadzenia mysiego testu kolonii zawierającego ECM dla dorosłych PCFU są takie same, jak w przypadku progenitorów pochodzących z mESC 17,18. Dlatego te aspekty testu nie będą tutaj powtarzane; Zamiast tego omówione zostaną następujące procedury: 1) dysocjacja dorosłej trzustki i sortowanie komórek przewodowych CD133 + Sox9 / EGFP +, które wzbogacają PCFU od dorosłych myszy 7, 2) manipulacja pojedynczymi komórkami posortowanych komórek, 3) analizy pojedynczej kolonii za pomocą mikroprzepływowego qRT-PCR i barwienia immunologicznego całego wierzchowania oraz 4) dysocjacja kolonii do zawiesiny pojedynczej komórki i ponowne posiew do mysich testów kolonii ECM lub lamininy.

<table><tbody><tr><td>Mysie białka ECM (Matrigel)</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>354230</td><td>Zapasy utrzymywane na poziomie -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Laminin Hydrogel</td><td>dostarczony przez Davida Tirrella (Pasadena, CA, USA)</td><td></td><td>Zapasy utrzymywane na poziomie -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Shinetsu Chemical (Tokio, Japonia)</td><td></td><td>1,500 centypuazów (dynamiczna jednostka lepkości równa 15 g/cm/s) (wysoka lepkość)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Flacon Fiolka stożkowa</td><td>Corning Inc. (Corning, Nowy Jork, USA)</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Naczynie do hodowli zawiesinowych</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem (Darmstadt, Niemcy)</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>Roche (CH-4070, Bazylea, Szwajcaria),</td> <td>11088831001</td><td>Stan magazynowy na poziomie -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>101310</td><td>niska endotoksyna, bez azydków</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Rat IgG2a i kappa; Isotype Control</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>400522</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG1 &kappa; Kontrola izotypu</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD133-Biotyna</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD71-PE-Cy7</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-Allofikocyjanina</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenyloindol</td><td>Invitrogen ( Waltham, Massachusetts,&nbsp; USA)</td><td>3571</td><td>Stan magazynowy utrzymywany na poziomie -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Antymucyna 1</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 Koza anty-ormiańska chomik</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td> <td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane orło Dulbecco: mieszanka składników odżywczych F-12</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td> <td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla płodowej surowicy bydlęcej</td><td>Tissure Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td><td>101</td><td>Stan magazynowy utrzymywany na poziomie -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Tris Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Micro Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiTec</td><td>Qiagen (Venlo, Holandia)</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR</td><td>Kit Ambion/Invitrogen (Grand Island, NY, USA)</td> <td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>005-000-121</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -20 i #176; C</td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>0017-000-121</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -20 i #176; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; USA)</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15230-147</td><td>Pipeta Pasteura klasy biologii molekularnej</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Siatka filtracyjna</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m siatka filtracyjna</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 96 Well Suspension</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924 (poprzednio 83.1835)</td><td></td></tr>1 <tr><td>cc Strzykawka</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 cc Strzykawka</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>48.48 Dyanmic Array Chip</td><td>Fluidigm (San Francisco, Kalifornia, Kalifornia, USA)</td> <td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 Próbka dynamicznej tablicy & Zestaw odczynników do ładowania testu</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) 4304437</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Monolaurynian glikolu polietylenowego sorbitanu</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Szalka Petriego 35 mm ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>Ustnik/rurka gumowa</td><td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>N0636</td><td>Zapasy utrzymywane na poziomie -20 i #176; C</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego R</td><td>& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>293-VE</td><td>Zapasy utrzymywane na poziomie -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Activin B</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>659-AB</td><td>Stan magazynowy utrzymywany na poziomie -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Extendin 4</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>E7144</td><td>Zapasy utrzymywane na poziomie -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Rspondin-1</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>3474-RS</td><td>Stan magazynowy utrzymywany na poziomie -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml polistyrenowa tubka z okrągłym dnem</td><td>Corning Inc. (Corning, Nowy Jork, Stany Zjednoczone)</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Igła PrecisionGlide 18 G x1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone)</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Igła PrecisionGlide 16 G x 1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone)</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-niska powierzchnia mocowania Costar 24-dołkowa płaska płyta denna&nbsp;</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, Stany Zjednoczone)</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 płyta studzienkowa</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, Stany Zjednoczone)</td><td>3603</td><td>Płaskie, przezroczyste dno z pokrywką. polistyren Mikropłytki pokryte TC</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Mikroskop odwrócony</td><td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD&nbsp;</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aria Special Order Research Product Cell Sorter</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/BSA</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0,1% (wag./obj.) BSA 
PenStrep (49 jednostek/ml penicyliny, 49 &mu; g/ml Streptomycyny)</td></tr><tr><td>PBS/BSA/Dnaza1</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0,1% (wag./obj.) BSA 
PenStrep (49 jednostek/ml penicyliny, 49 &mu; g/ml Streptomycyny) 
Dnaza 1 (2,400 jednostek/ml na trzustkę)</td></tr></tbody></table>

in vitro testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Komórki macierzyste i progenitorowe z dorosłej trzustki mogą być potencjalnym źródłem terapeutycznych komórek beta-podobnych do leczenia pacjentów z cukrzycą typu 1. Jednak nadal nie wiadomo, czy komórki macierzyste i progenitorowe istnieją w dorosłej trzustce. Strategie badawcze wykorzystujące śledzenie linii cre-lox u dorosłych myszy przyniosły wyniki, które albo potwierdzają, albo obalają ideę, że komórki beta mogą być generowane z przewodów, przypuszczalnego miejsca, w którym mogą znajdować się dorośli przodkowie trzustki. Te metody śledzenia linii in vivo cre-lox nie są jednak w stanie odpowiedzieć na pytania o samoodnawianie i różnicowanie wielu linii – dwa kryteria niezbędne do zdefiniowania komórki macierzystej. Aby rozpocząć wypełnianie tej luki technicznej, opracowaliśmy trójwymiarowe testy kolonii dla komórek progenitorowych trzustki. Wkrótce po naszej pierwszej publikacji inne laboratoria niezależnie opracowały podobną, ale nie identyczną metodę zwaną testem organoidowym. W porównaniu z testem organoidowym, nasza metoda wykorzystuje metylocelulozę, która tworzy lepkie roztwory, które umożliwiają włączenie białek macierzy zewnątrzkomórkowej w niskich stężeniach. Testy zawierające metylocelulozę umożliwiają łatwiejsze wykrywanie i analizę komórek progenitorowych na poziomie pojedynczej komórki, co ma kluczowe znaczenie, gdy komórki progenitorowe stanowią niewielką subpopulację, jak ma to miejsce w przypadku wielu dorosłych komórek macierzystych narządów. Łącznie, wyniki z kilku laboratoriów wskazują na samoodnawianie się in vitro i wieloliniowe różnicowanie komórek progenitorowych trzustki u myszy. Obecne protokoły opisują dwa testy kolonii na bazie metylocelulozy w celu scharakteryzowania przodków trzustki myszy; Jeden zawiera komercyjny preparat mysich białek macierzy zewnątrzkomórkowej, a drugi sztuczne białko macierzy zewnątrzkomórkowej znane jako hydrożel lamininy. Przedstawione tutaj techniki to: 1) dysocjacja trzustki i sortowanie komórek przewodowych CD133 + Sox9 / EGFP+ od dorosłych myszy, 2) manipulacja pojedynczymi komórkami posortowanych komórek, 3) analizy pojedynczej kolonii za pomocą mikroprzepływowego qRT-PCR i barwienia immunologicznego całego wierzchowania oraz 4) dysocjacja pierwotnych kolonii na zawiesiny jednokomórkowe i ponowne posiewy w drugorzędowe testy kolonii w celu oceny samoodnowy lub różnicowania.

Dorosłe komórki progenitorowe trzustki można wzbogacić za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (Rysunek 1). Linia myszy transgenicznych Sox9/EGFP użyta w tej pracy została po raz pierwszy stworzona w ramach projektu GENSAT Brain Atlas Project 19, a reporter EGFP znajduje się pod kontrolą bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego sekwencje około 75 kb powyżej i około 150 kb poniżej genu Sox9 20. U tych myszy EGFP wydajnie i specyficznie ...

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Ogólnym celem tych protokołów jest charakterystyka kolonii komórkowych wyhodowanych z komórek progenitorowych trzustki wyizolowanych z dorosłych myszy, przy użyciu testów hodowli z zastosowaniem półpłynnego podłoża zawierającego metylocelulozę. Nasze metody mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek progenitorowych trzustki, takie jak: jakie są zdolności do samoodnowy i różnicowania komórek progenitorowych w trzustce dorosłego osobnika? Główną zaletą tych technik jest to, że umożliwiają one badanie pojedynczych komórek progenitorowych, co jest istotne dla rozpoznania ich rzeczywistego potencjału biologicznego.Pomysł na te metody pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że testy kolonii stosowane w badaniach nad hematopoetycznymi komórkami macierzystymi można zastosować również do populacji komórek trzustki. Procedury zaprezentują Jacob Tremblay, doktorant, dr Janine Quijano, stażystka podoktorska oraz panna Angela Luo, technik, wszyscy z mojego laboratorium. Jak najszybciej po uśmierceniu zwierzęcia, za pomocą nożyczek należy wykonać pionowe nacięcie w linii środkowej ściany brzusznej i otworzyć jamę brzuszną.Za pomocą pincety delikatnie unieś śledzion

in-vitro-colony-assays-for-characterizing-tri-potent-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Komórki macierzyste nowotworu (CSCs) zidentyfikowano w wielu typach zmian złośliwych. W niniejszym protokole opisujemy metodę cytometrii przepływowej wykorzystującą aktywność dehydrogenazy aldehydowej oraz ekspresję CD44 i CD24 do izolacji CSCs z ksenoprzeszczepów gruczolakoprzewodowego raka trzustki człowieka. Te żywe komórki mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych i analitycznych.

Izolacja komórek macierzystych z ksenoprzeszczepów raka trzustki człowieka

Opisano trójwymiarowy test kolonogenny, który pozwala progenitorom o fenotypie trzustkowym na różnicowanie się w kolonie wykazujące ekspresję insuliny. Metoda ta wykorzystuje półstałe podłoża zawierające metylocelulozę, Matrigel oraz czynniki wzrostu, w których pojedyncze komórki progenitorowe proliferują i różnicują się in vitro, co umożliwia ilościowe określenie liczby funkcjonalnych progenitorów w populacji.

Ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji, hodowli i manipulacji embrionalną trzustką myszy. Stanowi ona doskonały system ex vivo do badania różnych aspektów rozwoju trzustki, w tym morfogenezy, różnicowania i wzrostu. Eksplanty pąka trzustki mogą być hodowane przez kilka dni i wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, w tym w immunofluorescencji całych preparatów oraz obrazowaniu na żywo.

System do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

Metoda hodowli trójwymiarowej opisana w tym protokole podsumowuje rozwój trzustki z rozproszonych embrionalnych przodków trzustki myszy, włączając ich znaczną ekspansję, różnicowanie i morfogenezę do rozgałęzionego organu. Ta metoda jest podatna na obrazowanie, funkcjonalną ingerencję i manipulację niszą.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Ten protokół przedstawia porównanie dwóch różnych protokołów indukcji różnicowania ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSC) w kierunku linii trzustki in vitro: protokół integracyjny i protokół nieintegracyjny. Protokół integracyjny generuje więcej komórek produkujących insulinę (IPC).

Metody in vitro Indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych trzustki myszy dorosłej. Metoda wykorzystuje metylocelulozowy półstały podłoże do hodowli kolonii in vitro.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Przeglądaj więcej filmów