Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza
12 czerwca 2016
Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja dynamicznych zdarzeń w mikrośrodowisku guza za pomocą wielofotonowego mirkrospyi o wysokiej rozdzielczości i funkcji przyżyciowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mikrośrodowiska guza, takie jak to, jakie dynamiczne zdarzenia są zaangażowane w przepuszczalność naczyń krwionośnych i interakcje wielokomórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że można obserwować i mierzyć kinetykę zdarzeń w mikrośrodowisku guza.
Przed rozpoczęciem zabiegu włącz wszystkie elementy mikroskopu i lasera, w tym dwa lasery fotonowe i detektory. I ustaw skrzynkę grzewczą na 30 stopni Celsjusza, aby wstępnie ogrzać scenę. Przetrzyj stolik mikroskopu i wkładkę sceniczną 70% etanolem.
Gdy stage wyschnie, umieść dużą kroplę wody na obiektywie mikroskopu 25 x 1.05 NA, aby utrzymać kontakt optyczny ze szkłem nakrywkowym i umieść szkło nakrywkowe o grubości 1.5 nad portem obrazowania wkładki. Następnie wytnij 30-centymetrowy kawałek rurki polietylenowej. Umieść gumową podkładkę na wierzchu szkła nakrowego.
Za pomocą kleszczy oderwij igłę o rozmiarze 31 od plastikowej złączki i włóż koniec piasty igły do rurki. Włóż i przymocuj igłę o rozmiarze 31 do drugiego końca rurki PE. Następnie napełnić strzykawkę o pojemności jednej cm3 sterylnym PBS i przymocować strzykawkę do igły o rozmiarze 31.
Użyj PBS, aby wypłukać całe powietrze z rurki i igły. Następnie jedna strzykawka cc z 200 mikrolitrami odpowiedniej etykiety naczyniowej, a druga z odpowiednim białkiem do wstrzykiwań. Przed przystąpieniem do zabiegu należy potwierdzić prawidłowe znieczulenie przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i nałożyć na znieczuloną mysz maści do oczu.
Następnie umieść zwierzę na platformie chirurgicznej pod lampą grzewczą, aby zwiększyć krążenie ogona. Po dwóch minutach wysterylizuj ogon 70% etanolem i włóż końcówkę cewnika o rozmiarze 31 dwa do trzech milimetrów do bocznej żyły ogonowej. Następnie umieść taśmę laboratoryjną o długości jednego centymetra na cewniku, aby utrzymać igłę równolegle do żyły wzdłuż ogona.
Po zabezpieczeniu cewnika przetrzyj powierzchnię brzuszną i guza 70% etanolem. Podnieś skórę nad brzuch i za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj około centymetrowe podskórne nacięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej brzucha, uważając, aby nie przebić otrzewnej. Delikatnie odetnij tkankę łączną łączną łączącą gruczoł sutkowy i guz z dala od otrzewnej, aby odsłonić guz.
Następnie za pomocą nożyczek i kleszczy delikatnie usuń powięź i tłuszcz z odsłoniętej powierzchni guza. Gdy guz zostanie odsłonięty, przenieś mysz do etapu wstępnie podgrzanego obrazowania. Użyj taśm laboratoryjnych, aby zabezpieczyć szkło nakrywkowe, a następnie umieść guz w otworze gumowej podkładki zakrywającej szkiełko nakrywkowe nad obiektywem mikroskopu.
Gdy zwierzę znajdzie się na swoim miejscu, należy napełnić komorę z gumową podkładką PBS, aby utrzymać nawodnienie tkanki i utrzymać kontakt optyczny ze szkiełkiem nakrywkowym. Umieść czujnik obroży sondy pulsoksymetru na szyi, aby monitorować parametry życiowe zwierzęcia i umieść pudełko grzewcze nad zwierzęciem. Następnie użyj mikroskopu IP, aby skupić się na fluorescencyjnych komórkach nowotworowych na powierzchni guza i zlokalizowanym obszarze z przepływającymi naczyniami krwionośnymi.
Po wybraniu obszaru zainteresowania przełącz mikroskop w tryb obrazowania wielofotonowego i użyj regulatora ostrości, aby przesunąć obiektyw do żądanej lokalizacji początkowej. Następnie kliknij górny przycisk w pozycji Z, aby ustawić górną granicę serii Z i zobrazować sieć włókien kolagenowych na powierzchni guza w kanale generacji drugiej harmonicznej. Następnie przesuń obiektyw na żądaną głębokość obrazowania i kliknij dolny przycisk pozycji z, aby ustawić dolną granicę serii z.
Następnie wprowadź żądaną wartość w polach rozmiaru kroku. Następnie przejdź do panelu poklatkowego i wprowadź odpowiedni czas upływu. Po ustaleniu parametrów obrazowania należy zastąpić strzykawkę dołączoną do cewnika strzykawką z barwnikiem do znakowania naczyń krwionośnych i powoli podawać maksymalnie 200 mikrolitrów roztworu barwnika, uważając, aby roztwór dostał się do żyły.
Po wstrzyknięciu należy umieścić strzykawkę PBS z powrotem w cewniku i rozpocząć obrazowanie poklatkowe krok z. Po uzyskaniu wszystkich obrazów należy zastąpić strzykawkę PBS strzykawką zawierającą białko do wstrzykiwań, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków do linii. Następnie powoli wstrzyknąć zawiesinę białkową do organizmu myszy i zastąpić strzykawkę strzykawką zawierającą PBS.
Makrofagi można śledzić za pomocą znakowanych fluorescencyjnie 70 kilodaltonów i dekstranu, które akumulują się w mikrofagach fagocytarnych. Podwójne znakowanie komórek nowotworowych i mikrofagów pozwala na wizualizację bezpośredniej interakcji z tymi dwoma typami komórek w czasie rzeczywistym. Aby uwidocznić zmiany w przepuszczalności naczyń krwionośnych guza, kropki kwantowe mogą być również używane do oznaczania przestrzeni naczyniowej.
Ponieważ są na tyle duże, że nie dyfundują łatwo przez przestrzenie międzytętnicze. Ciągłe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości ułatwia uchwycenie zdarzeń przepuszczalności naczyń krwionośnych oraz ilościowe określenie kinetyki wynaczynienia i klirensu dekstranu. W tym przykładowym polu widzenia szczyt wynaczynienia bezczynnościowego obserwuje się między 29 a 34 minutą, o czym świadczy pozanaczyniowy sygnał TMR.
Wstrzykiwanie dodatkowych barwników lub białek naczyniowych w celu indukowania przepuszczalności naczyń krwionośnych może dostarczyć informacji na temat zdarzeń sygnalizacyjnych regulujących przepuszczalność naczyń. Rzeczywiście, w ciągu pierwszych kilku sekund po wstrzyknięciu można zaobserwować 10 kilodaltonów dekstranu FITC wynaczynionych z naczyń krwionośnych, podczas gdy 155 kilodaltonów w dekstranie TMR pozostaje ograniczone do przestrzeni naczyniowej. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym usunięciu tkanki łącznej, nie uszkadzając powierzchni guza i utrzymywaniu nawilżenia powierzchni guza. Postępując zgodnie z tą procedurą dynamiki komórkowej, taką migrację komórek nowotworowych można zwizualizować, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące kierunkowości migracji komórek nowotworowych i wynaczynienia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować dynamiczne zdarzenia komórkowe w mikrośrodowisku guza za pomocą interistotnej mikroskopii wielofotonowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroskopii wielofotonowej do wizualizacji dynamicznych zdarzeń w mikrośrodowisku guza w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia długotrwałe obrazowanie time-lapse z rozdzielczością pojedynczej komórki, dostarczając informacji na temat przepuszczalności naczyniowej oraz interakcji wielokomórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Mikroskopia
Wprowadzenie
- Mikroskopia wielofotonowa umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości.
- Jest ona szczególnie użyteczna w badaniu żywych tkanek.
- Mikrośrodowisko guza jest złożone i dynamiczne.
- Zrozumienie oddziaływań komórkowych ma kluczowe znaczenie dla badań nad nowotworami.
Cel badania
- Wizualizacja dynamicznych zdarzeń w mikrośrodowisku guza.
- Pomiar kinetyki przepuszczalności naczyniowej.
- Obserwacja oddziaływań wielokomórkowych in vivo.
Zastosowane metody
- Intrawitalna mikroskopia wielofotonowa.
- Obrazowanie w trybie poklatkowym z wydłużonym czasem obserwacji.
- Techniki rozdzielczości pojedynczej komórki.
- Przygotowanie mikroskopu i stolika przedmiotowego.
Główne wyniki
- Pomyślnie zwizualizowano dynamiczne zjawiska w mikrośrodowisku guza.
- Zmiany przepuszczalności naczyniowej obserwowano w czasie rzeczywistym.
- Interakcje wielokomórkowe udokumentowano w wysokiej rozdzielczości.
- Metoda wykazała zdolność do pomiaru kinetyki zjawisk.
Wnioski
- Mikroskopia wielofotonowa jest potężnym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym dostarcza cennych informacji na temat biologii nowotworów.
- Technika ta może poszerzyć naszą wiedzę na temat dynamiki nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja dynamiki wielokomórkowej w mikrośrodowisku guza w czasie rzeczywistym umożliwia bezpośrednią obserwację zdarzeń przejściowych, takich jak przepuszczalność naczyniowa i mobilność komórek nowotworowych, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia metastazy i angiogenezy. Podejście to dostarcza danych kinetycznych, których nie są w stanie uchwycić testy punktowe, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów onkologicznych. Dzięki uchwyceniu rozdzielczości czasowej interakcji między zrębem a guzem, metoda ta zwiększa pewność predykcyjną modeli przedklinicznych i pomaga w ustalaniu priorytetów dla kandydatów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację w czasie rzeczywistym oddziaływań między zrębem a guzem, które napędzają progresję nowotworu.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację zdarzeń wielokomórkowych w żywej tkance.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na pomiar kinetyki przepuszczalności naczyniowej oraz ruchliwości komórek w celu ograniczenia ryzyka związanego ze ścieżkami sygnałowymi i selekcji projektów w portfolio.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie dynamiki bazowej w mikrośrodowisku guza.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu dzięki mierzalnym odczytom ekstrawazacji i klirensu dekstranu w czasie.
- Wartość skalowalności: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dzięki standaryzowanemu przygotowaniu chirurgicznemu i parametrom obrazowania w badaniach podłużnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zachowuje istotność w kontekście choroby poprzez oddanie przypominających ludzkie oddziaływań wielokomórkowych w żywych modelach mysich.
- Ciągłość przedkliniczna: Stanowi pomost między etapem odkrycia a walidacją przedkliniczną, dostarczając kinetycznych biomarkerów przepuszczalności naczyniowej.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie funkcjonalnych odczytów modulacji mikrośrodowiska guza w czasie rzeczywistym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, umożliwiając analizę kinetyczną przepuszczalności naczyniowej oraz ruchliwości komórkowej jako funkcjonalnych odczytów w badaniach nad mechanizmem działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez wizualizację kierunkowości migracji komórek nowotworowych oraz zdarzeń intravazacji w czasie rzeczywistym.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników rozdzielonych w czasie, takich jak piki ekstrawazacji dekstranu między 29–34 minutami, co umożliwia porównanie efektów działania związków.
- Analityka: Generuje krzywe kinetyczne przepuszczalności naczyniowej i klirensu komórkowego, ułatwiając analizę zależności dawka-odpowiedź oraz stopnia zaangażowania celu.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez mierzalne zmiany w dynamice naczyniowej następujące po modulacji farmakologicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę obrazowania intravitalnego do powtarzalnego stosowania w projektach onkologicznych przy użyciu zestandaryzowanych protokołów znakowania i chirurgicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach sygnalizacyjnych między guzem a zrębem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji znakowania naczyń, przygotowania chirurgicznego oraz parametrów akwizycji obrazów time-lapse.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrycie nieskutecznych modulatorów, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia w późnych etapach badań.
- Wpływ na portfolio: Wspiera optymalizację postępów w badaniach z uwzględnieniem ryzyka poprzez kwantyfikację zaangażowania celu za pomocą zmian przepuszczalności naczyniowej w czasie rzeczywistym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii wielofotonowej, chirurgii intravitalnej oraz strategii znakowania fluorescencyjnego.
- Zależne od dostępności mikroskopów z możliwością obrazowania wielofotonowego, laserów z regulowaną długością fali oraz czułych detektorów dla kanałów drugiego harmonicznego i fluorescencji.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów znakowania w obrębie zespołów (np. kropki kwantowe dla naczyń krwionośnych, dekstran dla makrofagów) oraz parametrów obrazowania.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych modeli nowotworowych, co wiąże się z koniecznością walidacji dostępu chirurgicznego i przydatności okna optycznego.
- Ograniczone przez ryzyko fototoksyczności podczas przedłużonego obrazowania, co wymusza optymalizację mocy oraz monitorowanie funkcji życiowych zwierząt.
