Name: Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj mikroskopię wielofotonową do obrazowania dynamiki mikrośrodowiska guza z rozdzielczością pojedynczych komórek. Ta metoda pozwala mierzyć kinetykę przepuszczalności naczyń krwionośnych i interakcji wielokomórkowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Program Badań nad Rakiem Piersi Departamentu Obrony pod numerem nagrody (A.S.H, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324, oraz Integrated Imaging Program.

Wszystkie opisane procedury muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi wykorzystywania kręgowców, w tym z uprzednią zgodą Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Albert Einstein College of Medicine.
1. Generowanie fluorescencyjnie znakowanych guzów i makrofagów związanych z nowotworem
<ol>
	<li>Wygeneruj znakowane fluorescencyjnie komórki nowotworowe poprzez skrzyżowanie spontanicznego, autochtonicznego, genetycznie zmodyfikowanego modelu raka sutka myszy, w którym długie końcowe powtórzenie wirusa guza sutka myszy napędza antygen środkowego T polioma (MMTV-PyMT) z transgenicznymi myszami z fluorescencyjnymi reporterami [tj. Wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP), wzmocnione białko fluorescencyjne cyjanu (ECFP) lub Dendra2]8,9.</li>
	<li>Znakuj fluorescencyjnie makrofagi u zwierząt PyMT z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami nowotworowymi, krzyżując genetycznie zmodyfikowane modele myszy z fluorescencyjnymi reporterami specyficznymi dla mieloidu i makrofagów [tj. Myszami MacGreen15 lub MacBlue Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP16] .</li>
	<li>Alternatywnie, generuj fluorescencyjnie znakowane guzy poprzez ortotopowy przeszczep fluorescencyjnie znakowanych komórek nowotworowych PyMT (syngenicznych), linii komórkowych ludzkiego raka piersi lub pierwotnych guzów pochodzących od ludzkiego pacjenta (ksenoprzeszczepy)11,17.
	<ol>
		<li>Wszczepić fluorescencyjnie znakowane komórki nowotworowe PyMT do myszy syngenicznych z komórkami szpikowymi znakowanymi białkiem fluorescencyjnym w celu wygenerowania zwierząt z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami nowotworowymi i komórkami szpikowymi13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl fluorescencyjnego dekstranu o stężeniu 10 mg/kg o stężeniu 70 kDa przez żyłę ogonową dożylnie (dożylnie) myszom z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID) z guzami ksenoprzeszczepu ludzkich linii komórkowych lub guzami pierwotnymi pochodzącymi od pacjenta w celu fluorescencyjnego znakowania makrofagów na 2 godziny przed rozpoczęciem obrazowania przyżyciowego.</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu i przygotowanie do obrazowania
Uwaga: Ta procedura opisuje konfigurację do obrazowania przyżyciowego w mikroskopie wielofotonowym8.
<ol>
	<li>Włącz wszystkie elementy mikroskopu i lasera, w tym lasery dwufotonowe i detektory.</li>
	<li>Włącz skrzynkę grzewczą do 30 °C, aby wstępnie ogrzać scenę. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla utrzymania fizjologicznej temperatury zwierzęcia.</li>
	<li>Do użytku na mikroskopie odwróconym umieść wykonaną na zamówienie wkładkę stolika na stoliku mikroskopu. Wkładka niestandardowa to arkusz aluminium o grubości 1/8 "obrobiony tak, aby zmieścił się w przestrzeni wkładki scenicznej i z otworem przelotowym o średnicy 1" pośrodku do obrazowania.
	<ol>
		<li>Wytrzyj stolik mikroskopu i wkładkę sceniczną 70% etanolem i wysusz na powietrzu.</li>
		<li>Umieść dużą kroplę wody na obiektywie mikroskopu 20X, 1.05 NA, aby utrzymać kontakt optyczny ze szkłem nakrywkowym.</li>
		<li>Umieść szkło nakrywkowe (grubość #1.5) nad portem obrazowania we wkładzie stolika mikroskopu. Zabezpiecz na miejscu taśmą laboratoryjną.</li>
		<li>Użyj dziurkacza, aby przebić otwór o wymiarach 2 cm x 2 cm w elastycznej gumowej podkładce i umieść gumową podkładkę na stoliku mikroskopu tak, aby otwór w podkładce był wyrównany z otworem w niestandardowej wkładce stolika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie cewnika do żyły ogonowej i odczynników do wstrzykiwań podczas obrazowania
<ol>
	<li>Wytnij rurkę z polietylenu (PE) o długości 30 cm.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przesuwaj metalową igłę igły 31 G do przodu iz powrotem, aż oderwie się od plastikowej złączki.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy włóż koniec odłączonej igły do rurki PE.</li>
	<li>Włóż igłę 31 G do drugiego końca rurki PE.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) i włóż ją do igły 31 G i wypłucz całe powietrze z rurki i igły za pomocą PBS. PBS służy do utrzymania nawodnienia i osmolarności krwi9,18, jednak można również stosować sól fizjologiczną.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 cm3 200 μl 3 mg/kg 155 kDa dektran-tetrametylorodaminy (TMR) lub kropek kwantowych do znakowania naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Przygotować wszelkie inne białka do wstrzykiwań, takie jak izoforma 165 aminokwasów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGFA165) w strzykawce o pojemności 1 cm3 i umieścić na lodzie. Wstrzyknąć 0,2 mg/kg mc. VEGFA16519 w stężeniu 0,05 mg/ml.</li>
</ol>
4. Wprowadzenie cewnika do żyły ogonowej
<ol>
	<li>Umieścić zwierzę pod narkozą za pomocą komory indukcyjnej z 5% izofluranem zO2 jako gazem nośnym.</li>
	<li>Przenieś mysz na platformę chirurgiczną, gdy jest w pełni znieczulona i nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Otwórz linię anestezjoterapeutyczną izofluranu do platformy operacyjnej, zamknij linię anestezjologiczną do komory indukcyjnej i umieść stożek nosowy nad pyskiem zwierzęcia. Zmniejszyć stężenie izofluranu z 5% do 2,5%.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Podgrzej zwierzę pod lampą grzewczą przez dodatkowe 2 minuty, aby zwiększyć krążenie w ogonie, gdy krążenie zwalnia w głębokim znieczuleniu.</li>
	<li>Wysterylizuj żyłę ogona myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Wprowadzić końcówkę igły 31 G z cewnika skonstruowanego w sekcji 3 do bocznej żyły ogonowej zwierzęcia i wcisnąć igłę na 2-3 mm.</li>
	<li>Pociągnij strzykawkę, aby zobaczyć krew, upewniając się, że cewnik jest umieszczony w żyle ogonowej.</li>
	<li>Użyj taśmy laboratoryjnej o długości 1 cm umieszczonej na igle, aby utrzymać igłę na miejscu równolegle do żyły wzdłuż ogona.</li>
</ol>
5. Zabieg chirurgiczny płata skórnego w celu odsłonięcia guza sutka
<ol>
	<li>Gdy zwierzę znajduje się na platformie operacyjnej, należy pobrać wymaz z guza i powierzchni brzusznej za pomocą 70% etanolu. Uwaga: Zgodnie z opisem, procedura ta nie jest wykonywana całkowicie aseptycznie. W przypadku długich sesji obrazowania, w których infekcja może stać się czynnikiem zakłócającym, zaleca się stosowanie odpowiedniej techniki aseptycznej.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy podnieś skórę brzuszną i sterylnymi nożyczkami wykonaj podskórne nacięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej o długości około 1 cm. Unikaj nakłuwania otrzewnej podczas nacięcia.</li>
	<li>Delikatnie odetnij tkankę łączną łączącą gruczoł sutkowy i guz z dala od otrzewnej, aby odsłonić guz sutka.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek i kleszczy delikatnie usuń i odetnij powięź i tłuszcz z odsłoniętej powierzchni guza, zachowując integralność naczynia krwionośnego guza i minimalizując krwawienie. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla utrzymania architektury guza i zaopatrzenia w naczynia krwionośne guza.</li>
</ol>
6. Przygotowanie zwierząt do mikroskopii
<ol>
	<li>Przenieś zwierzę do wstępnie ogrzanego etapu obrazowania z odsłoniętym guzem umieszczonym na szkiełku nakrywkowym na wkładce etapowej nad obiektywem mikroskopu do obrazowania. Należy uważać, aby delikatnie przenieść cewnik do żyły ogonowej wraz ze zwierzęciem, aby nie przesunąć igły.</li>
	<li>Umieść stożek nosowy do znieczulenia nad pyskiem zwierzęcia, aby utrzymać znieczulenie ustawione na 3% izofluranu.</li>
	<li>Ustaw zwierzę tak, aby guz spoczywał w otworze gumowej podkładki i stykał się ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Użyj dwóch gumowych podkładek, aby delikatnie przytrzymać guz na miejscu i przymocuj je do stolika mikroskopu za pomocą taśmy laboratoryjnej, aby zmniejszyć ruch podczas akwizycji obrazu.</li>
	<li>Napełnij komorę z gumowej podkładki PBS, aby utrzymać nawodnienie tkanki i utrzymać kontakt optyczny ze szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Rozpocznij monitorowanie parametrów życiowych zwierzęcia za pomocą sondy pulsoksymetru. Przymocuj czujnik klipsa do uda zwierzęcia. Alternatywnie można użyć obroży, która jest skonfigurowana tak, aby pasowała do szyi.</li>
	<li>Umieść pudełko grzewcze nad zwierzęciem, aby utrzymać temperaturę 30 °C 20.</li>
	<li>Powoli zmniejszaj poziom izofluranu do 0,5-1%, aby utrzymać znieczulenie i utrzymać przepływ krwi.</li>
</ol>
7. Akwizycja obrazu i wstrzykiwanie barwników fluorescencyjnych i białek iniekcyjnych
<ol>
	<li>Za pomocą okularu mikroskopu skup się na fluorescencyjnych komórkach nowotworowych na powierzchni guza.</li>
	<li>Wybierz obszar zainteresowania, znajdując obszary z przepływającymi naczyniami krwionośnymi. Wybór obszaru zainteresowania z przepływającymi naczyniami krwionośnymi ma kluczowe znaczenie dla oceny unaczynienia guza.</li>
	<li>Po wybraniu obszaru zainteresowania przełącz mikroskop w tryb obrazowania wielofotonowego.</li>
	<li>Ustawianie górnego i dolnego limitu serii z. Ustaw górną granicę serii Z, używając regulatora ostrości, aby przesunąć obiektyw do żądanej pozycji początkowej i klikając przycisk "Góra" w pozycji Z. Określ górną granicę serii z, wizualizując sieć włókien kolagenowych na powierzchni guza w kanale generacji drugiej harmonicznej (SHG) i obserwując, kiedy nie są widoczne żadne komórki, a tylko włókna kolagenowe.
	<ol>
		<li>Ustaw dolną granicę serii Z, przesuwając obiektyw na żądaną głębokość obrazowania (zwykle 50 - 150 μm) i klikając przycisk "Dół" w pozycji Z.</li>
		<li>Ustaw rozmiar kroku, wpisując żądaną wartość w polu rozmiaru kroku. Określ rozmiar kroku na podstawie rozważań dotyczących rozdzielczości i czasu akwizycji (zwykle 2 μm jest używane do rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości, a 5 μm w przeciwnym razie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw interwał poklatkowy, przełączając się na panel Poklatkowy i wprowadzając żądany czas upływu w polu Poklatkowy. Aby uzyskać optymalną rozdzielczość czasową, ustaw przedział czasu na 0 sekund dla ciągłego obrazowania. Uwaga: W przypadku długiego obrazowania poklatkowego zaleca się ustawienie odstępu czasu między akwizycjami na 10 sekund, aby uzupełnić płyn zanurzeniowy obiektywu.</li>
	<li>Po określeniu parametrów obrazowania należy powoli wstrzyknąć 155 kDa dekstran-TMR.
	<ol>
		<li>Wyjąć strzykawkę z PBS w cewniku do żyły ogonowej i zastąpić strzykawką zawierającą 155 kDa dekstran-TMR, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków do linii.</li>
		<li>Powoli wstrzyknąć 155 kDa dextran-TMR do myszy, o maksymalnej objętości 200 μl, i zastąpić strzykawkę strzykawką zawierającą PBS. KRYTYCZNY KROK: Wstrzyknięcie należy wykonywać powoli i podjąć środki ostrożności, aby uniknąć wydostania się roztworu poza żyłę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję obrazowania poklatkowego Z-stack, klikając przyciski Z-Stack i Time-Lapse, aby je wcisnąć, a następnie klikając przycisk nagrywania.</li>
	<li>Jeżeli wcześniej przygotowano inne dekstrans fluorescencyjne, tj. izotiocyjanian dekstranu fluoresceiny 10 kDa (FITC) lub białka, np. VEGFA165, należy je wstrzyknąć po rozpoczęciu akwizycji obrazu na początek t = 0 min.
	<ol>
		<li>Wyjąć strzykawkę z PBS w cewniku do żyły ogonowej i zastąpić strzykawką zawierającą 10 kDa dextran-FITC lub VEGFA165, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków do linii.</li>
		<li>Powoli wstrzykiwać wstrzykiwacze do myszy przez cewnik do żyły ogonowej i zastąpić strzykawkę strzykawką zawierającą PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Co 30-45 minut powoli wstrzykiwaj 50 μl PBS lub soli fizjologicznej, aby utrzymać nawodnienie zwierzęcia.</li>
</ol>
8. Eutanazja
<ol>
	<li>Po zakończeniu pozyskiwania obrazu należy poddać zwierzę eutanazji.
	<ol>
		<li>Zwiększyć stężenie izofluranu do 5%.</li>
		<li>Utrzymać zwierzę w ilości poniżej 5% izofluranu do 30 sekund po zaprzestaniu oddychania i usunąć zwierzę ze sceny.</li>
		<li>Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić całkowitą eutanazję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Pobieraj obrazy w 16-bitowych plikach TIFF dla każdego kanału w każdym punkcie czasowym i zapisuj je sekwencyjnie.</li>
	<li>Wykonaj separację nakładania się widmowego (tj. GFP i CFP), eliminację dryfu x-y i generowanie filmów z sekwencji poklatkowych przy użyciu metod ustalonych w ImageJ9. Wykonywanie rekonstrukcji powierzchni 3D obrazów o wysokiej rozdzielczości13.</li>
</ol>

<ol><li>Gerlowski, L. E., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+permeability+of+normal+and+neoplastic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues.</a> Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).</li>
<li>Wang, H. -L., Lai, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Evans+blue+quantitation+in+limited+rat+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples.</a> Sci Rep. 4, (2014).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rous-Whipple+Award+Lecture.+How+tumors+make+bad+blood+vessels+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma.</a> Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).</li>
<li>Nagy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+properties+of+tumor+surrogate+blood+vessels+induced+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A.</a> Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).</li>
<li>Egawa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+analysis+of+vascular+permeability+in+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 3, (2013).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumor+xenograft%3A+molecular+size+dependence+and+cutoff+size%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size.</a> Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).</li>
<li>Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumour+xenograft%3A+molecular+charge+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence.</a> Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor+cell+movement+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor cell movement in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).</li>
<li>Patsialou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+reveals+multicellular+streaming+as+a+crucial+component+of+in+vivo.+cell+migration+in+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors.</a> Intravital. 2 (2), e25294(2013).</li>
<li>Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+classification+links+tumor+microenvironments+with+tumor+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype.</a> PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).</li>
<li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mena+invasive+%28MenaINV%29+promotes+multicellular+streaming+motility+and+transendothelial+migration+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer.</a> J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).</li>
<li>Harney, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+Reveals+Local%2C+Transient+Vascular+Permeability%2C+and+Tumor+Cell+Intravasation+Stimulated+by+TIE2hi+Macrophage-Derived+VEGFA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA).</a> Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).</li>
<li>Robinson, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+of+metastasis+in+human+breast+carcinoma%3A+a+potential+prognostic+marker+linked+to+hematogenous+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination.</a> Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).</li>
<li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li>
<li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukcocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+barrier+disruption+by+VEGF-mediated+Src+activity+potentiates+tumor+cell+extravasation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis.</a> J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).</li>
<li>Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Multiphoton+Imaging+of+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo.+Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors.</a> In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).</li>
<li>Lathia, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo.+evidence+for+tumor+propagation+by+glioblastoma+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells.</a> PLoS One. 6 (9), e24807(2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability%2C+accumulation%2C+and+penetration+of+macromolecular+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers.</a> J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).</li>
<li>Chittajallu, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+cell-cycle+profiling+in+xenograft+tumors+by+quantitative+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Yano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+FUCCI+imaging+of+each+cell+in+a+tumor+demonstrates+locational+dependence+of+cell+cycle+dynamics+and+chemoresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness.</a> Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).</li>
<li>Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+subcellular+multicolor+imaging+of+tumor-host+interaction+and+drug+response+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time.</a> Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).</li>
<li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+conversion+between+distinct+tumor+vascular+morphologies+and+localized+vascular+response+to+Sunitinib%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib.</a> Intravital. 2 (1), 24790(2013).</li>
<li>Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cancer+growth+and+invasion%3A+a+modified+skin-fold+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model.</a> Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Interakcje komórkowe, które zachodzą spontanicznie w mikrośrodowisku guza, mogą prowadzić do zmian w ruchliwości komórek nowotworowych i wynaczynieniu. Obrazowanie przyżyciowe żywej tkanki nowotworowej w wysokiej rozdzielczości pozwala na wizualizację dynamiki wielokomórkowej, która może być wysoce przejściowa10,13,24. Testy punktu końcowego in vivo lub obrazy poklatkowe uzyskane za pomocą dyskretnych punktów czasowych mogą dostarczyć istotnych informacji na temat molekularnych mechanizmów procesów za...

Wykazano, że rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych z pierwotnego guza sutka obejmuje nie tylko komórki nowotworowe, ale także komórki zrębu gospodarza, w tym makrofagi i komórki śródbłonka. Ponadto unaczynienie guza jest nieprawidłowe ze zwiększoną przepuszczalnością1. Dlatego określenie, w jaki sposób komórki nowotworowe, makrofagi i komórki śródbłonka oddziałują na siebie, pośrednicząc w przepuszczalności naczyń krwionośnych i wynaczynieniu komórek nowotworowych w pierwotnym mikrośrodowisku guza, jest ważne dla zrozumienia przerzutów. Zrozumienie kinetyki przepuszczalności naczyń krwionośnych, wewnątrznaczynienia komórek nowotworowych i mechanizmu sygnalizacji leżącego u podstaw interakcji wielokomórkowych w mikrośrodowisku guza może dostarczyć kluczowych informacji w opracowywaniu i podawaniu terapii przeciwnowotworowych.
Podstawowym sposobem badania przepuszczalności naczyń krwionośnych guza in vivo był pomiar barwników pozanaczyniowych, takich jak błękit Evansa2, dektrans o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa)3 i fluoroforowe lub radioznacznikowe białka (w tym albuminy)4 w ustalonych punktach czasowych po wstrzyknięciu barwnika. Postępy w mikroskopii, modelach zwierzęcych i barwnikach fluorescencyjnych umożliwiły wizualizację procesów komórkowych i przepuszczalności naczyń krwionośnych u żywych zwierząt za pomocą mikroskopii przyżyciowej5.
Obrazowanie żywych zwierząt z akwizycją statycznych obrazów lub krótkich sekwencji poklatkowych w kilku punktach czasowych nie pozwala na pełne zrozumienie dynamicznych zdarzeń w mikrośrodowisku guza6,7. Rzeczywiście, statyczna akwizycja obrazu w ciągu 24 godzin wykazała, że unaczynienie guza jest nieszczelne, jednak nie zaobserwowano dynamiki przepuszczalności naczyń6. W ten sposób rozszerzone ciągłe obrazowanie poklatkowe do 12 godzin pozwala uchwycić kinetykę dynamicznych zdarzeń w mikrośrodowisku guza.
Ten protokół opisuje użycie rozszerzonej poklatkowej wielofotonowej mikroskopii przyżyciowej do badania dynamicznych zdarzeń wielokomórkowych w mikrośrodowisku guza. Wiele typów komórek w mikrośrodowisku guza jest znakowanych barwnikami do wstrzykiwań lub przy użyciu transgenicznych zwierząt eksprymujących białka fluorescencyjne. Za pomocą cewnika do żyły ogonowej można wstrzykiwać barwniki lub białka naczyniowe po rozpoczęciu obrazowania w celu uzyskania danych kinetycznych zdarzeń wielokomórkowych w mikrośrodowisku guza. W przypadku obrazowania żywych komórek guz sutka jest odsłaniany poprzez chirurgiczne przygotowanie płata skórnego. Obrazy są rejestrowane przez okres do 12 godzin za pomocą mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w detektory z wieloma fotopowielaczami (PMT)8. Dzięki zastosowaniu odpowiednich filtrów, algorytm odejmowania umożliwia 4 detektorom PMT jednoczesne pozyskanie 5 sygnałów fluorescencyjnych w mikrośrodowisku guza9. Wielofotonowa mikroskopia przyżyteczna o wysokiej rozdzielczości rejestruje obrazowanie interakcji guz-zrąb w rozdzielczości pojedynczej komórki w mikrośrodowisku guza, co prowadzi do lepszego zrozumienia przepuszczalności naczyń krwionośnych i wynaczynienia komórek nowotworowych10-13. W szczególności rozszerzone obrazowanie przyżyciowe ujawniło wysoce zlokalizowane, przejściowe zdarzenia przepuszczalności naczyń, które występują selektywnie w miejscach interakcji między komórką nowotworową, makrofagiem i komórką śródbłonka (zdefiniowaną jako mikrośrodowisko guza z przerzutami, TMEM14)13. Co więcej, wynaczynienie komórek nowotworowych występuje tylko w TMEM i jest przestrzennie i czasowo skorelowane z przepuszczalnością naczyńkrwionośnych 13. Rozdzielczość dynamiki tych zdarzeń w pojedynczych komórkach była możliwa dzięki zastosowaniu rozszerzonej poklatkowej mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych fluorescencyjnie w mikrośrodowisku guza.

<table><tbody><tr><td>155 kDa dekstran-tetrametylodaminy, izotiocyjanian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td>rozpuścić w 20 mg/ml w 1x PBS</td></tr><tr><td>70 kDa dextran-Texas Red</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td>rozpuścić w 10 mg/ml w 1x PBS</td></tr><tr><td>10 kDa izotyocyjanian dekstranu-fluoresceiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD10S</td><td>rozpuścić w 20 mg/ml w 1x PBS</td></tr><tr><td>Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Life Technologie</td><td>Q21561MP</td><td>Rozcieńczać 25 i #956; l w 175 i #956; l z 1x PBS do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Myszy MMTV-PyMT</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>2374</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Csf1r-ECFP (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>26051</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Csf1r-EGFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoethesia (izofluran)</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>50033</td><td>Strzykawka 250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>AirTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml, końcówka tuberkulinowa</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1 (0,3 mm x 25&nbsp; mm) igła</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurki medyczne z polietylenu&nbsp;</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td>0,28 mm średnicy wewnętrznej x 0,64 mm średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>mikroskopu Corning</td><td>2980-225</td><td>grubość 1,5, 22 x 50&nbsp; mm</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT pulsoksymetr, oprogramowanie i czujniki</td> Taśma laboratoryjna <td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>miękka gumowa podkładka</td><td>McMaster-Carr</td><td>8514K62</td><td>Ultramiękka folia poliuretanowa, 3/16" Gruby, 12 "x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back Twarda</td></tr><tr><td>gumowa podkładka</td><td>McMaster-Carr</td><td>8568K615</td><td>Arkusz gumy neoprenowej o wysokiej wytrzymałości 1/4" Gruby, 12" x 12", 50&nbsp; Mikroskop twardości</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td>Mikroskop to specjalnie zbudowany dwulaserowy mikroskop wielofotonowy oparty na statywie Olympus IX-71 wykorzystującym soczewkę obiektywową 20X 1,05NA.</td></tr><tr><td>Zestaw 7 dziurkaczy</td><td>McMaster-Carr</td><td>3429A12</td> o <td>średnicy otworów od 1/4" do 1", do dziurkacza z młotkiem</td></tr></tbody></table>

rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

W mikrośrodowisku guza, komórki zrębu gospodarza oddziałują z komórkami nowotworowymi, aby promować progresję guza, angiogenezę, rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych i przerzuty. Interakcje wielokomórkowe w mikrośrodowisku guza mogą prowadzić do zdarzeń przejściowych, w tym kierunkowej ruchliwości komórek nowotworowych i przepuszczalności naczyń. Kwantyfikacja przepuszczalności naczyń krwionośnych guza często wykorzystywała eksperymenty z punktami końcowymi do pomiaru wynaczynienia barwników naczyniowych. Jednak ze względu na przejściowy charakter interakcji wielokomórkowych i przepuszczalność naczyń krwionośnych, kinetyka tych dynamicznych zdarzeń nie może być dostrzeżenie. Znakując komórki i naczynia krwionośne barwnikami do wstrzykiwań lub białkami fluorescencyjnymi, mikroskopia przyżyteczna o wysokiej rozdzielczości umożliwiła bezpośrednią wizualizację w czasie rzeczywistym przejściowych zdarzeń w mikrośrodowisku guza. Tutaj opisujemy metodę wykorzystania mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania przyżyciowego u żywych myszy w celu bezpośredniej wizualizacji dynamiki wielokomórkowej w mikrośrodowisku guza. Metoda ta szczegółowo opisuje strategie znakowania komórkowego, chirurgiczne przygotowanie płata skóry sutka, podawanie barwników lub białek do wstrzykiwań przez cewnik do żyły ogonowej oraz pozyskiwanie obrazów poklatkowych. Sekwencje poklatkowe uzyskane tą metodą ułatwiają wizualizację i ilościowe określenie kinetyki zdarzeń komórkowych dotyczących ruchliwości i przepuszczalności naczyń krwionośnych w mikrośrodowisku guza.

Przedłużona mikroskopia intravitalna w trybie time-lapse umożliwia obrazowanie procesów wielokomórkowych w mikrośrodowisku guza z rozdzielczością pojedynczych komórek. Poprzez fluorescencyjne znakowanie komórek nowotworowych, makrofagów i przestrzeni naczyniowej oraz wizualizację sieci włókien kolagenowych przy użyciu sygnału generowania drugiej harmoniki, podczas obrazowania jednocześnie śledzone są wiele przedziałów w mikrośrodowisku guza. Komórki nowotworowe znakowane białkami fluoresc...

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja dynamicznych zdarzeń w mikrośrodowisku guza za pomocą wysokorozdzielczej, intravitalnej mikroskopii wielofotonowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące mikrośrodowiska guza, takie jak to, które zdarzenia dynamiczne są zaangażowane w przepuszczalność naczyniową i interakcje wielokomórkowe. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji i pomiaru kinetyki zdarzeń w mikrośrodowisku guza.Przed rozpoczęciem procedury należy włączyć wszystkie komponenty mikroskopu i lasera, w tym lasery dwufotonowe oraz detektory. Następnie należy ustawić temperaturę w komorze grzewczej na 30 °C, aby wstępnie podgrzać stolik. Przetrzeć stolik mikroskopu oraz wkład stolika 70% ethanolem.Gdy stolik będzie suchy, nanieś dużą kroplę wody na obiektyw mikroskopowy 25 x 1,05 NA, aby utrzymać kontakt optyczny ze szkiełkiem podstawowym, a następnie umieść szkiełko podstawowe o grubości nr 1,5 nad otworem obrazującym wkładu. Następnie odetnij 30 centymetrowy odcinek rurki polietylenowej. Umieść gumową podkładkę na wierzchu szkiełka podstawowego.Za pomocą pęsety odłam igłę o rozmiarze 31 G od jej plastikowego mocowania i wprowadź stępiony koniec nasady igły do rurki. W drugi koniec rurki z PE wprowadź i przymocuj igłę o rozmiarze 31 G. Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 cc sterylnym roztworem PBS i podłącz strzykawkę do igły o rozmiarze 31 G.Użyj PBS do wypłukania całego powietrza z rurek i igły. Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 cc 200 µL odpowiedniego znacznika naczyniowego oraz drugą strzykawkę odpowiednim białkiem do wstrzyknięcia. Przed rozpoczęciem operacji potwierdź prawidłowe znieczulenie, sprawdzając brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy, a następnie zastosuj maści do oczu u znieczulonej myszy.Następnie umieść zwierzę na platformie chirurgicznej pod lampą grzewczą, aby zwiększyć ukrwienie ogona. Po dwóch minutach zdezynfekuj ogon 70% etanolem i wprowadź końcówkę kaniuli o rozmiarze 31 G na dwa do trzech milimetrów do bocznej żyły ogonowej. Następnie naklej jeden centymetr taśmy laboratoryjnej na kaniulę, aby utrzymać igłę równolegle do żyły wzdłuż ogona.Po zabezpieczeniu cewnika przemyj powierzchnię brzuszna oraz obszar guza 70% ethanol. Następnie odchyl skórę nad brzuchem i za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj około jednocentymetrowe nacięcie podskórne wzdłuż linii środkowej brzucha, uważając, aby nie przebić otrzewnej. Delikatnie przetnij tkankę łączną łączącą gruczał mleczną i guz z otrzewną, aby odsłonić guz.Następnie, używając nożyczek i pęsety, delikatnie usuń powięź i tkankę tłuszczową z odsłoniętej powierzchni guza. Po odsłonięciu guza przenieś mysz na podgrzany stolik obrazujący. Użyj taśm laboratoryjnych do zabezpieczenia szkiełka podstawowego, a następnie umieść guz w otworze gumowej podkładki pokrywającej szkiełko nad obiektywem mikroskopu.Gdy zwierzę znajduje się w odpowiedniej pozycji, należy napełnić komorę z gumową podkładką roztworem PBS, aby nawodnić tkankę i utrzymać kontakt optyczny z szkiełkiem nakrywką. Wokół szyi należy umieścić czujnik kołnierza pulsoksymetrycznego w celu monitorowania funkcji życiowych zwierzęcia, a następnie nałożyć na zwierzę pudełko grzewcze. Następnie, przy użyciu mikroskopu, należy ustawić ostrość na fluorescencyjne komórki nowotworowe na powierzchni guza oraz na obszarze z przepływającymi naczyniami krwionośnymi.Po wybraniu obszaru zainteresowania przełącz mikroskop w tryb obrazowania wielofotonowego i za pomocą pokrętła ostrości przesuń obiektyw do pożądanego punktu startowego. Następnie kliknij przycisk górnej pozycji Z, aby ustawić górną granicę serii z i zwizualizować sieć włókien kolagenowych na powierzchni guza w kanale generowania drugiej harmonicznej. Następnie przesuń obiektyw na pożądaną głębokość obrazowania i kliknij przycisk dolnej pozycji Z, aby ustawić dolną granicę serii z.Następnie wprowadź żądaną wartość w polach wielkości kroku. Potem przejdź do panelu Time Lapse i wprowadź odpowiedni czas odstępu między obrazami. Po ustaleniu parametrów obrazowania zastąp strzykawkę podłączoną do cewnika strzykawką z barwnikiem do znakowania naczyń i powoli podaj maksymalnie 200 µl roztworu barwnika, dbając o to, aby roztwór dostał się do żyły.Po wstrzyknięciu ponownie podłącz strzykawkę z PBS do cewnika i rozpocznij obrazowanie poklatkowe w kroku z. Po uzyskaniu wszystkich obrazów zastąp strzykawkę z PBS strzykawką zawierającą białko do wstrzyknięcia, dbając o to, aby do przewodu nie dostały się pęcherzyki powietrza. Następnie powoli wstrzyknij zawiesinę białka do myszy i ponownie zastąp strzykawkę strzykawką zawierającą PBS.Makrofagi można śledzić za pomocą znakowanego fluorescencyjnie dekstranu o masie 70 kilodalton, który gromadzi się w fagocytujących makrofagach. Podwójne znakowanie komórek nowotworowych i makrofagów pozwala na wizualizację bezpośrednich interakcji między tymi dwoma typami komórek w czasie rzeczywistym. Aby zwizualizować zmiany w przepuszczalności naczyniowej guza, do znakowania przestrzeni naczyniowej można również wykorzystać kropki kwantowe.Ponieważ są one wystarczająco duże, aby nie dyfundować łatwo przez przestrzenie międzytętnicze. Ciągłe obrazowanie o wysokiej rozdzielczości umożliwia uchwycenie zdarzeń związanych z przepuszczalnością naczyniową oraz kwantyfikację kinetyki ekstrawazacji i usuwania dekstranu. W tym przykładzie pola widzenia szczyt ekstrawazacji naczyniowej obserwuje się między 29 a 34 minutą, co potwierdza pozanaczyniowy sygnał TMR.Wstrzykiwanie dodatkowych barwników naczyniowych lub białek w celu wywołania przepuszczalności naczyniowej może dostarczyć informacji na temat zdarzeń sygnalizacyjnych regulujących tę przepuszczalność. W rzeczywistości w ciągu pierwszych kilku sekund po wstrzyknięciu można zaobserwować przenikanie dekstranu FITC o masie 10 kilodalton poza naczynia krwionośne, podczas gdy dekstran TMR o masie 155 kilodalton pozostaje ograniczony do przestrzeni naczyniowej. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu jednej godziny, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o delikatnym usuwaniu tkanki łącznej, aby nie uszkodzić powierzchni guza, oraz o utrzymywaniu nawilżenia tej powierzchni. Po zastosowaniu tej procedury badania dynamiki komórkowej można wizualizować migrację komórek nowotworowych, co pozwala odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące kierunkowości migracji komórek guza oraz intrawasacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat wizualizacji dynamicznych zdarzeń komórkowych w mikrośrodowisku guza za pomocą interwitalnej mikroskopii wielofotonowej.

extended-time-lapse-intravital-imaging-real-time-multicellular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Tutaj opisujemy metodę wielofotonowego obrazowania poklatkowego komórek mózgu w wysokiej rozdzielczości przed i po inwazyjnej interwencji chirurgicznej (np. biopsji) u tego samego żywego zwierzęcia. Metoda ta pozwala na badanie wpływu tych inwazyjnych zabiegów chirurgicznych na zachowanie migracyjne, inwazyjne i proliferacyjne komórek nowotworowych na poziomie pojedynczej komórki.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe zachowania komórek guza mózgu w odpowiedzi na inwazyjną biopsję chirurgiczną

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Poznaj mikroskopię wielofotonową do obrazowania dynamiki mikrośrodowiska guza z rozdzielczością pojedynczych komórek. Ta metoda pozwala mierzyć kinetykę przepuszczalności naczyń krwionośnych i interakcji wielokomórkowych in vivo.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Przeglądaj więcej filmów