Name: Oczyszczanie RNA z wewnątrzkomórkowych hodowanych Listeria monocytogenes w komórkach makrofagów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj metodę izolacji RNA z Listeria monocytogenes wewnątrz makrofagów mysich. Technika ta pozwala badać ekspresję genów bakterii podczas infekcji z minimalnym zanieczyszczeniem kwasami nukleinowymi gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Herskovits są wspierane przez 335400 grantów ERC i R01A/109048 NIH.

Uwaga: Podczas całego eksperymentu komórki makrofagów są inkubowane w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wymuszonym obiegiem o stężeniu 5% CO2 i wyjmowane z inkubatora wyłącznie w celu przeprowadzenia manipulacji eksperymentalnych, które są przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Praca z bakteriami L. monocytogenes jest zgodna z przepisami dotyczącymi poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
1. Przygotowanie komórek i infekcja bakteryjna (Dzień 1 i 2)
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Nasiona 2,0 x 107 komórek makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) na szalce o średnicy 145 mm w 30 ml pożywki BMDM + Pen-Strep (Tabela 2). Wysiewaj 3 płytki dla każdego szczepu bakterii, który ma być analizowany. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wymuszonym obiegiem powietrza o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Rozpocząć nocną hodowlę bakterii L. monocytogenes typu dzikiego (WT) szczepu 10403S w 10 ml pożywki do infuzji mózgowo-sercowej (BHI) w temperaturze 30 °C w standardowym inkubatorze. Umieść probówki hodowlane skośnie bez potrząsania. Uwaga: Te warunki wzrostu zwiększają ekspresję genów wici, co sprzyja skutecznej infekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Wstępnie ogrzane podłoże BMDM (bez antybiotyków Pen-Strep) (Tabela 2) i sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyj monowarstwę makrofagów dwukrotnie 25 ml wstępnie podgrzanego PBS w celu usunięcia antybiotyków. Dodać 30 ml świeżej pożywki BMDM.</li>
		<li>Przepłukać 1,5 ml nocnej kultury bakteryjnej PBS, odwirowując bakterie w temperaturze > 14 000 x g przez 1 minutę, odrzucając supernatant i delikatnie zawieszając bakterie w 1,5 ml PBS przez pipetowanie. Powtórz dwa razy.</li>
		<li>Każdą płytkę makrofagów należy zainfekować 0,5 ml przemytej przez noc kultury L. monocytogenes typu dzikiego. W przypadku używania wielu płytek, zainfekuj każdą płytkę w odstępie 15 minut. Ten przedział czasowy umożliwi zebranie każdej płytki z osobna pod koniec infekcji. 
		Uwaga: Wielokrotność infekcji (MOI) jest oznaczana przez posiew seryjnych rozcieńczeń kultury bakteryjnej używanej do infekcji na płytkach agarowych BHI i liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) po 24-godzinnej inkubacji płytek w temperaturze 37 °C. Użycie 0,5 ml szczepu WT L. monocytogenes 10403S daje MOI ~ 100 (100 bakterii CFU na komórkę makrofagową). Analizując mutanty bakteryjne wadliwe we wzroście wewnątrzkomórkowym, należy wziąć pod uwagę wyższy MOI.</li>
		<li>Po 0,5 godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C przemyć zakażone komórki dwukrotnie PBS w celu usunięcia nieprzyłączonych bakterii i dodać 30 ml wstępnie podgrzanej pożywki BMDM. Przyłączone bakterie zinternalizują się w ciągu następnych 0,5 godziny.</li>
		<li>Po 1 godzinie od zakażenia dodaj 30 μl gentamycyny (1:1000, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 μg/ml), aby zabić bakterie zewnątrzkomórkowe.</li>
		<li>Zmontuj aparat filtrujący, umieszczając głowicę filtra na kolbie zbiorczej z portem wylotowym podciśnienia. Następnie umieść filtr (0,45 μm) na głowicy filtra, a następnie lejek cylindryczny i zabezpiecz różne części metalowym zaciskiem. Przygotuj lodowatą wodę wolną od RNaz.</li>
		<li>Po 6 godzinach od infekcji zbierz bakterie z zainfekowanych komórek w następujący sposób. Traktuj każdy talerz indywidualnie. 
		Uwaga: Zwykle L. monocytogenes kończy 1 log wzrostu w ciągu 6 godzin infekcji w komórkach makrofagów. Dłuższe inkubacje mogą powodować przerost bakterii i śmierć komórek makrofagów, podczas gdy krótsze okresy inkubacji mogą skutkować znacznie niższym obciążeniem bakteryjnym. MOI i czas infekcji można modyfikować, aby osiągnąć optymalne warunki.
		<ol>
			<li>Raz przemyć zainfekowane komórki PBS. Dodaj 20 ml lodowatej wody wolnej od RNaz, aby lizować komórki makrofagów. Za pomocą skrobaka do komórek szybko, ale ostrożnie zeskrob komórki z płytki.</li>
			<li>Zebrać zlizowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wir przez 30 sek. Wirować przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Przepuścić supernatant przez aparat filtrujący za pomocą systemu próżniowego. Za pomocą pęsety zwiń filtr i szybko przenieś go do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zamroź probówki z filtrami w ciekłym azocie.</li>
			<li>Zmontować aparat filtracyjny z nowym filtrem do następnej próbki, jak opisano w ppkt 1.2.7.</li>
			<li>Zamrożone filtry należy przechowywać w temperaturze -80 °C na następny dzień. Alternatywnie przejdź bezpośrednio do ekstrakcji kwasów nukleinowych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych (Dzień 3)
Uwaga: Wszystkie manipulacje z roztworami fenolu i chloroformu należy wykonywać w dygestorium.
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę 1:1 zakwaszonego fenolu: chloroformu, 400 μl dla każdej próbki. Wymieszaj w oddzielnych probówkach, a następnie usuń powstałą warstwę wodną przez aspirację. Dodać 40 μl 10% SDS.</li>
	<li>Rozmrozić rurki zawierające filtr na lodzie, aby były zimne. Do każdej probówki zawierającej filtr dodać 650 μl buforu octanowo-EDTA (AE) (tabela 2).</li>
	<li>Wykonaj następujące kroki tak szybko, jak to możliwe.
	<ol>
		<li>Energicznie wymieszaj rurkę zawierającą filtr, tak aby filtr przesunął się na obrzeża rurki, a bufor całkowicie umył filtr. Zawsze utrzymuj rurkę w chłodzie, umieszczając ją z powrotem na lodzie. Uwaga: Może być konieczne dodatkowe wirowanie rurki w pozycji odwróconej, aby całkowicie zmyć bakterie z filtra.</li>
		<li>Powtórz dla wszystkich probówek. Przydatne może być krótkie odkręcenie zawiesiny (1 min przy 120 x g) pod koniec procesu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść bufor zawierający bakterie do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej SDS i mieszaninę fenolu/chloroformu (jak przygotowano w 2.1). Powtórz dla wszystkich probówek. Może być konieczne ponowne odkręcenie rurki filtra zawierającego filtr (1 min przy 120 x g) w celu uzyskania resztkowego buforu z filtra.</li>
	<li>Umieść wszystkie probówki o pojemności 1,5 ml w wieloprobówkowym urządzeniu wirowym i wiruj z pełną prędkością przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować probówki w bloku grzewczym o temperaturze 65 °C przez 10 minut. Wirować z maksymalną prędkością (> 14 000 x g) przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść warstwę wodną (około 400 μl) z każdej probówki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 40 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 1,0 ml 100% etanolu. Dokładnie wymieszaj każdą rurkę. 
	Uwaga: Na tym etapie można dodać glikogen, aby poprawić wizualizację wytrąconego osadu.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę. Alternatywnie próbki inkubować w temperaturze -20 °C przez noc. Następnie odwirować próbki w temperaturze 4 °C przez 20 minut z maksymalną prędkością (> 14 000 x g).</li>
	<li>Ostrożnie odessać etanol (górna warstwa) z każdej probówki. Do każdej próbki dodać 500 μl zimnego 70% etanolu i dokładnie wymieszać. Wirować w temperaturze 4 °C przez 20 minut z maksymalną prędkością (> 1 4 000 x g).</li>
	<li>Ostrożnie odessać etanol z każdej probówki. Suszyć próbki przez około 2 minuty za pomocą parownika próżniowego bez podgrzewania. Nie przesuszaj próbek.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 25 μl wody wolnej od RNaz. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Ostrożnie wiruj i wiruj.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie RNA w próbkach za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis. Spodziewaj się ekstrakcji około 0,5 - 1 μg kwasów nukleinowych na płytkę. 
	Uwaga: Na tym etapie można łączyć repliki techniczne.</li>
</ol>
3. Leczenie DNazy
<ol>
	<li>Ustawić reakcję zgodnie z tabelą 1 w probówce do mikrofugi. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Dodać 450 μl wody wolnej od RNaz i 500 μl mieszanki fenol-chloroform-IAA (Tabela 2), rozdzielić fazy przez wirowanie przez 2 minuty z maksymalną prędkością (> 14 000 x g).</li>
	<li>Przenieść warstwę wodną do nowej probówki i dodać 500 μl mieszaniny chloroformu i IAA (Tabela 2), odwirować i oddzielić fazy przez 2 minuty wirowania z maksymalną prędkością (> 14 000 x g).</li>
	<li>Przenieść warstwę wodną do nowej probówki i dodać 1 ml etanolu i 50 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2). Vortex. 
	Uwaga: Na tym etapie można dodać glikogen, aby poprawić wizualizację wytrąconego osadu.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -80 °C. Alternatywnie inkubować próbki w temperaturze -20 °C przez noc. Wirować w temperaturze 4 °C przez 20 minut z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Ostrożnie odessać etanol z każdej probówki. Do każdej próbki dodać 500 μl zimnego 70% etanolu i dokładnie wymieszać. Wirować w temperaturze 4 °C przez 20 minut z maksymalną prędkością. Ostrożnie odessać etanol z każdej probówki.</li>
	<li>Suszyć próbki przez około 2 minuty za pomocą parownika próżniowego bez podgrzewania. Nie przesuszaj próbek.</li>
	<li>Dodać 12 μl wody wolnej od RNaz, inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, odwirować i odwirować. Próbki zawierają oczyszczone RNA, przechowuj je na lodzie. Alternatywnie, rozpuść RNA w wolnym od RNazH2Oza pomocą 0,1 mM EDTA lub buforu TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Zmierz stężenia RNA za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis. Spodziewaj się ~ 100 ng RNA na próbkę (jeśli połączone są kontrpróby techniczne). 
	Uwaga: RNA wyekstrahowane zgodnie z tym protokołem nadaje się do analizy transkrypcji genów za pomocą wielu technik. Analizę RT-qPCR zwykle stosujemy do badania transkrypcji genu L. monocytogenes podczas infekcji komórek makrofagów 1-4.</li>
</ol>

<ol><li>Lobel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+regulator+CodY+links+Listeria+monocytogenes+metabolism+to+virulence+by+directly+activating+the+virulence+regulatory+gene+prfA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA.</a> Mol Microbiol. , (2014).</li>
<li>Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analysis+identifies+isoleucine+and+CodY+as+regulators+of+Listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence.</a> PLoS Genet. 8 , e1002887(2012).</li>
<li>Kaplan Zeevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+multidrug+resistance+transporters+and+cyclic+di-AMP%2C+which+contribute+to+type+I+interferon+induction%2C+play+a+role+in+cell+wall+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress.</a> J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).</li>
<li>Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophage+excision+activates+Listeria+competence+genes+that+promote+phagosomal+escape+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence.</a> Cell. 150, 792-802 (2012).</li>
<li>World Health Organization WHO. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/en/">http://www.who.int/en/</a> (2005).</li>
<li>Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+human+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of human listeriosis.</a> Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence.</a> Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).</li>
<li>Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Listeria+monocytogenes+infection%3A+the+intersection+of+bacterial+pathogenesis+and+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity.</a> J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).</li>
<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).</li>
<li>Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Mycobacterium+tuberculosis+RNAs+synthesized+in+response+to+phagocytosis+by+human+macrophages+by+selective+capture+of+transcribed+sequences+%28SCOTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J Exp Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing-based+discovery+of+the+Chlamydia+trachomatis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).</li>
<li>La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+whole+bacterial+pathogen+transcription+within+infected+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).</li>
<li>Rienksma, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+insights+into+transcriptional+adaptation+of+intracellular+mycobacteria+by+microbe-enriched+dual+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 16, 34(2015).</li>
<li>Afonso-Grunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+3%27Seq+using+deepSuperSAGE+uncovers+transcriptomes+of+interacting+Salmonella+enterica+Typhimurium+and+human+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells.</a> BMC Genomics. 16, 323(2015).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5, e00969-e900914 (2014).</li>
<li>Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+gamma-interferon+receptor+that+regulates+macrophage+tumoricidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity.</a> J Exp Med. 160, 55-74 (1984).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół stanowi zoptymalizowaną metodę izolacji bakteryjnego RNA z bakterii L. monocytogenes rosnących wewnątrzkomórkowo w komórkach makrofagów. Protokół ten opiera się na lizie różnicowej komórek i obejmuje dwa główne etapy wzbogacania bakteryjnego RNA: sedymentację jąder makrofagów za pomocą wirowania i szybkie zbieranie bakterii przez filtrację. Po tych krokach następuje standardowa procedura ekstrakcji RNA. Chociaż protokół ten opisuje oczyszczanie listerialnego RNA, można go łatwo zmodyfikowa...

Wewnątrzkomórkowe patogeny bakteryjne ─ bakterie wywołujące choroby zakaźne i zdolne do wzrostu i rozmnażania się w komórkach ludzkich gospodarzy ─ są poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie5. Aby indukować i replikować się w komórce ssaków, patogeny wewnątrzkomórkowe nabyły wyrafinowane mechanizmy i czynniki wirulencji. Chociaż mechanizmy te mają fundamentalne znaczenie dla zdolności do wywoływania choroby, niewiele wiemy o ich regulacji i dynamice. Ponieważ profile ekspresji genów bakterii hodowanych w płynnych pożywkach nie odzwierciedlają rzeczywistego środowiska w komórkach gospodarza, rośnie zapotrzebowanie na analizy transkryptomu bakterii hodowanych w ich niszach wewnątrzkomórkowych. Takie analizy umożliwią rozszyfrowanie specyficznych adaptacji bakteryjnych wywołanych przez gospodarza i pomogą zidentyfikować nowe cele dla projektu terapeutycznego. Analiza transkryptomu bakterii hodowanych wewnątrzkomórkowo jest bardzo trudna, ponieważ RNA ssaków przewyższa liczebnie RNA bakteryjne co najmniej dziesięciokrotnie. W tym manuskrypcie opisujemy eksperymentalną metodę izolowania bakteryjnego RNA z bakterii Listeria monocytogenes rosnących w mysich komórkach makrofagów. Wyekstrahowane RNA może być wykorzystane do badania adaptacji wewnątrzkomórkowych i mechanizmów wirulencji bakterii chorobotwórczych za pomocą różnych technik analizy transkrypcji, takich jak RT-PCR, RNA-Seq, mikromacierz i inne technologie oparte na hybrydyzacji.
L. monocytogenes jest czynnikiem wywołującym listeriozę u ludzi, chorobę o objawach klinicznych skierowaną głównie do osób z obniżoną odpornością, osób starszych i kobiet w ciąży6. Jest to Gram-dodatni fakultatywny patogen wewnątrzkomórkowy, który atakuje szeroką gamę komórek ssaków, które są używane od dziesięcioleci jako model w badaniach interakcji gospodarz-patogen7. Po inwazji początkowo znajduje się w wakuoli lub fagosomie (w przypadku komórek fagocytarnych), z którego musi uciec do cytozolu komórki gospodarza w celu replikacji. Wykazano, że kilka czynników wirulencji pośredniczy w procesie ucieczki, przede wszystkim hemolizyna tworząca pory, Listeriolysin O (LLO) i dwie dodatkowe fosfolipazy8. W cytozolu bakterie wykorzystują maszynerię polimeryzacji aktyny gospodarza do napędzania się na włóknach aktynowych w komórce i rozprzestrzeniania się z komórki na komórkę (ryc. 1). Wszystkie główne czynniki wirulencji L. monocytogenes biorące udział w inwazji, przeżyciu wewnątrzkomórkowym i replikacji są aktywowane przez główny regulator transkrypcji wirulencji, PrfA. Księga 8-10.
W ostatnim dziesięcioleciu, kilka badań przeprowadzonych przez nas i innych z powodzeniem zastosowało metody analizy transkryptomu wewnątrzkomórkowych bakterii hodowanych wewnątrz komórek gospodarza2,11-15. Do oddzielenia bakteryjnego RNA od RNA gospodarza stosuje się dwa główne podejścia, które opierają się na: 1) selektywnym wzbogacaniu bakteryjnego RNA i 2) izolacji RNA przez różnicową lizę komórek. Pierwsze podejście opiera się na subtraktywnej hybrydyzacji całkowitych ekstraktów RNA z cząsteczkami RNA ssaków (na przykład przy użyciu dostępnych na rynku zestawów) lub selektywnym wychwytywaniu transkrybowanych sekwencji bakteryjnych (SCOTS)11. Drugie podejście opiera się na różnicowej lizie bakterii i komórek gospodarza, w której komórki gospodarza są poddawane lizie, podczas gdy komórki bakteryjne pozostają nienaruszone. Komórki bakteryjne są następnie oddzielane od lizatu komórek gospodarza, zwykle przez wirowanie, a RNA jest ekstrahowane przy użyciu standardowych technik. Głównym problemem związanym z tym podejściem jest to, że wraz z nienaruszonymi bakteriami izolowane są również jądra komórek gospodarza, a zatem preparaty RNA nadal zawierają RNA ssaków. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tego problemu jest oddzielenie nienaruszonych bakterii od jąder komórek gospodarza za pomocą wirowania różnicowego, chociaż procedura ta zwykle wymaga czasu, co budzi obawy o zmiany w profilu ekspresji genów podczas ekstrakcji. W artykule przedstawiono ulepszony i szybki protokół ekstrakcji RNA bakterii, który opiera się na podejściu opartym na podejściu do lizy różnicowej komórek. Najpierw komórki makrofagów zakażone L. monocytogenes są poddawane lizie zimnej wody. Następnie jądra makrofagów są usuwane przez krótkie wirowanie, a nienaruszone bakterie są szybko zbierane na filtrach, z których izoluje się RNA za pomocą ekstrakcji gorącym fenolem-SDS bakteryjnych kwasów nukleinowych.

<table><tbody><tr><td>Listeria monocytogenes 10403S</td><td></td><td></td><td>20</td></tr> <tr><td>Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego przygotowane z samic myszy</td><td></td><td></td> C57B/6<td>21</td></tr><tr><td>H2O, bez RNAzy</td>, można <td>stosować wodę uzdatnioną DEPC</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Napar z mózgu (BHI)</td><td>Merckmillipore</td><td>1104930500</td><td></td></tr><tr><td>Fenol nasycony pH 4,3</td><td>Fisher</td><td>BP1751I-400</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>W302406</tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu</td><td>Merck Millipore</td><td>1070174000</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, 5% CO2 inkubator z wymuszonym obiegiem powietrza</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model 3111</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki komórkowe Uchwyt</td><td>na szkło Nunc</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Kontes do filtrów 45 mm</td><td>Filtry Fisher</td><td>K953755-0045</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore 45&nbsp; mm, 0,45&nbsp; &mikro; m</td><td>System Merck Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Scientific SPD131DDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>Model G560E</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>145 mm naczynia do hodowli komórkowych</td><td>Greiner</td><td>639 160</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml, wolne od RNaz</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>30 &stopni; Inkubator C</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65 &deg; Blok grzejny C</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; Wirówka stołowa C</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety, 25 ml</td> probówki <td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon, 50 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie rna z wewnątrzkomórkowych hodowanych listeria monocytogenes w komórkach makrofagów

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analiza transkryptomu patogenów bakteryjnych podczas infekcji ssaków jest cennym narzędziem do badania genów i czynników pośredniczących w infekcji. Jednak wyizolowanie bakteryjnego RNA z zakażonych komórek lub tkanek jest trudnym zadaniem, ponieważ RNA ssaków dominuje głównie w lizatach zakażonych komórek. W tym artykule opisano zoptymalizowaną metodę izolacji RNA bakterii Listeria monocytogenes rosnących w komórkach makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Po zakażeniu komórki są łagodnie lizowane i szybko filtrowane, aby usunąć większość białek gospodarza i RNA, zachowując nienaruszone bakterie. Następnie bakteryjne RNA izoluje się za pomocą ekstrakcji gorącym fenolem-SDS, a następnie poddaje się działaniu DNazy. Wyekstrahowane RNA nadaje się do analizy transkrypcji genów za pomocą wielu technik. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana w naszych badaniach regulacji genu Listeria monocytogenes podczas infekcji komórek makrofagów 1-4. Protokół można łatwo zmodyfikować w celu zbadania innych patogenów bakteryjnych i typów komórek.

Układ modelowy przedstawiono na Rysunku 1; obejmuje on makrofagi zainfekowane bakteriami L. monocytogenes, które replikują się w cytozolu makrofaga. Rysunek 2 przedstawia schemat doświadczenia. Rysunek 3 prezentuje typowe wyniki analizy RT-qPCR genów wirulencji podczas wzrostu WT L. monocytogenes w makrofagach w porównaniu do wzrostu w bogatym podłożu laboratoryjnym BHI. Wyniki pokazują poziomy transkrypcji dwóch głównyc...

Tutaj opisujemy metodę izolacji bakteryjnego RNA z bakterii Listeria monocytogenes rosnących wewnątrz mysich makrofagów. Technika ta może być stosowana z innymi patogenami wewnątrzkomórkowymi i komórkami gospodarza ssaków.

Oczyszczanie RNA z wewnątrzkomórkowych hodowanych Listeria monocytogenes w komórkach makrofagów

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie RNA z bakterii namnażających się wewnątrzkomórkowo w makrofagach. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy bakteryjnej, takie jak: jakie czynniki w genach są aktywowane przez bakterie w celu pośredniczenia w infekcji? Główną zaletą tej techniki jest znaczne wzbogacenie frakcji bakteryjnego RNA przy jednoczesnej minimalizacji zanieczyszczenia kwasami nukleinowymi gospodarza.Procedurę zaprezentuje Anna Pasechneck, doktorantka z mojego laboratorium. Aby przygotować komórki do infekcji bakteryjnej, pierwszego dnia należy użyć naczyń o średnicy 145 mm, aby wysiać 2×10⁷ makrofagów pochodzących z szpiku kostnego (komórek BMDM) w 30 ml pożywki BMDM z dodatkiem Pen/Strep. Inkubować w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂ w inkubatorze z wymuszonym obiegiem powietrza przez noc.Zaszczep kulturę bakterii L.monocytogenes typu dzikiego w 10 mililitrach pożywki brain heart infusion (BHI). Umieść probówki w inkubatorze w pozycji skośnej i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez wytrząsania przez noc. Następnego dnia wstępnie ogrzej pożywkę BMDM bez antybiotyków oraz PBS do 37 stopni Celsjusza.Następ

rna-purification-from-intracellularly-grown-listeria-monocytogenes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł opisuje metodę izolacji i oczyszczania nienaruszonych wakuol zawierających Legionella (LCV) z ameb i makrofagów. Dwuetapowy protokół obejmuje wzbogacanie LCV poprzez separację immunomagnetyczną z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko bakteryjnemu markerowi LCV oraz dalsze oczyszczanie za pomocą wirowania w gradiencie gęstości.

Oczyszczanie wakuol patogennych z fagocytów zainfekowanych Legionella

Źródło: Jung, A. L. et al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia wstępne traktowanie makrofagów pęcherzykami błony zewnętrznej (OMV) Legionella pneumophila w celu zbadania ich wpływu na replikację bakterii. Zmieniając sygnalizację immunologiczną gospodarza, OMV sprawiają, że makrofagi są bardziej podatne na infekcje. Wyższa liczba kolonii w leczonych komórkach, w porównaniu z...

Oznaczanie replikacji Legionella pneumophila w makrofagach poddanych działaniu pęcherzyków błony zewnętrznej

Źródło: Sigal, N. i inni. Oczyszczanie RNA z wewnątrzkomórkowo hodowanej Listeria monocytogenes w komórkach makrofagów.  J. Vis. Exp. (2016).Ten film demonstruje izolację zinternalizowanych patogennych bakterii z zakażonych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM). Bakteriom pozwala się przyczepić do komórek gospodarza, a nieprzyłączone bakterie są wypłukiwane. Po internalizacji dodaje się antybiotyk eliminujący bakterie nieinternalizowane. Komórki gospodarza są lizowane, wirowane, a...

Izolacja wewnątrzkomórkowych bakterii patogennych z zakażonych komórek gospodarza

Źródło: Sigal, N. i inni. Oczyszczanie RNA z wewnątrzkomórkowo hodowanej Listeria monocytogenes w komórkach makrofagów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje ekstrakcję RNA z Listeria monocytogenes wyizolowanej z zakażonych makrofagów myszy. Protokół ten zachowuje RNA, lizuje komórki za pomocą fenol-chloroformu i ciepła oraz rozdziela RNA przez wirowanie. Sól i etanol, połączone z zimną inkubacją, sprzyjają wytrącaniu RNA. Powstałe RNA wychwytuje ekspresję genów indukowaną przez gospodarza,...

Ekstrakcja RNA z Listeria monocytogenes pobranej z zakażonych makrofagów myszy

W tym filmie określamy ilościowo wewnątrzkomórkową i zewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes, wewnątrzkomórkową bakterię chorobotwórcze, po ich zakażeniu hodowanymi makrofagami in vitro za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowych i pojawiających się zewnątrzkomórkowych Listeria monocytogenes in vitro

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę doustnego zakażenia myszy za pomocą żywności skażonej Listeria monocytogenes. Protokół można łatwo dostosować do stosowania z innymi patogenami bakteryjnymi przenoszonymi przez żywność.

Przenoszenie Listeria monocytogenes drogą pokarmową drogą pokarmową u myszy

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Listeria monocytogenes to Gram-dodatni patogen bakteryjny, często używany jako główny model do badania pasożytnictwa wewnątrzkomórkowego. Obrazowanie późnych etapów infekcji L. monocytogenes w kontekście małych interferujących badań przesiewowych RNA pozwala na globalne badanie szlaków komórkowych wymaganych do infekcji bakteryjnej docelowych komórek gospodarza.

Obrazowanie wydzielania InlC w celu zbadania zakażenia komórkowego patogenem bakteryjnym Listeria monocytogenes

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Tutaj opisujemy oczyszczanie pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV) Legionella pneumophila (L. pneumophila) z płynnych kultur. Te oczyszczone pęcherzyki są następnie wykorzystywane do leczenia makrofagów w celu analizy ich potencjału prozapalnego.

Legionella pneumophila (Legionella pneumophila) Pęcherzyki błony zewnętrznej: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Poznaj metodę izolacji RNA z Listeria monocytogenes wewnątrz makrofagów mysich. Technika ta pozwala badać ekspresję genów bakterii podczas infekcji z minimalnym zanieczyszczeniem kwasami nukleinowymi gospodarza.

Oczyszczanie RNA z wewnątrzkomórkowych hodowanych Listeria monocytogenes w komórkach makrofagów

Przeglądaj więcej filmów