Rozwarstwienie i płaskie ułożenie szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego
May 7th, 2016
Szkielet rozgałęziony, w tym grabie skrzelowe, zęby gardłowe i kości skrzelowe, służy jako główne miejsce przetwarzania żywności u większości ryb. Tutaj opisujemy protokół preparowania i płaskiego montażu tego wewnętrznego szkieletu u cierników trójgrzbietowych. Ta metoda ma również zastosowanie do wielu innych gatunków ryb.
Ogólnym celem tej procedury jest wypreparowanie i płaskie zamontowanie szkieletu skrzelowego ciernika. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju, genetyki i ewolucji. Na przykład to, jak zwierzęta przystosowują się do nowych środowisk i jak podczas rozwoju powstają różnice w morfologii osobników dorosłych.
Główną zaletą tej techniki jest to, że poprzez wypreparowanie i płaski montaż szkieletu rozgałęzionego, można uwidocznić różne cechy troficzne, których nie można badać w całym dosiadaniu. W ramach przygotowań należy zapoznać się z odpowiednią morfologią szkieletu głowy ciernika trójkolcowego. Po przygotowaniu ryby do sekcji zacznij od wbicia ostrych kleszczy numer pięć w bok oka, pod kątem 45 stopni, aby przebić błonę zakrywającą oko.
Następnie odklej błonę oka, taką jak pokrywkę pojemnika na jogurt. Następnie włóż otwarte kleszcze za oko, chwyć nerw wzrokowy i usuń oko. Uważaj, aby nie przebić oka, w przeciwnym razie wycieknie z niego melanina.
Powtórz ten proces z okiem po przeciwnej stronie. Następnie umieść ostrze małych nożyczek pod tylną stroną płata wieczka i przetnij tkankę miękką grzbietowo nad wieczkiem, w kierunku oczodołu. Następnie przeciąć kość czołową, która jest grzbietowa do oczodołu.
Następnie przetnij kość przyklinową w linii środkowej, wokół środka oczodołu. Powtórz cięcie wieczko po przeciwnej stronie. W kolejnych krokach kolce miednicy mogą służyć jako uchwyty.
Rozkłada się, delikatnie odciągając je bezpośrednio od ciała. Teraz włóż kleszcze pod wieczko i powoli oderwij twarz od ciała. Przycinanie wszelkich tkanek miękkich, które są nadal przyczepione w procesie.
Zachowaj ostrożność wokół grabi skrzelowych i uważaj, aby ich nie zakłócić. Łatwo jest przypadkowo złapać pierwszą kość ceratobranchialną wraz z percollem podczas usuwania szkieletu twarzy. Zajrzyj pod ich percoll, gdy odklejasz go do przodu, aby upewnić się, że nie masz niczego dodatkowego.
Teraz za pomocą kleszczy odłącz ceratohyals z obu stron podstawy linii środkowej, jednocześnie odklejając i usuwając przedni szkielet twarzoczaszki. Powtórz po przeciwnej stronie. Przedni szkielet twarzoczaszki obejmuje całą szczękę, cały szkielet gnykowy, leżące poniżej elementy grzbietowe i śródchrzęstne oraz przednią część czaszki.
Następnie włóż zamknięte kleszcze tuż pod rurką jelitową i przeciągnij je do przodu. Rozsuwając przy tym pozostałe mięśnie i więzadła przyczepione do szkieletu skrzelowego. Następnie użyj końcówki zamkniętych kleszczy, aby zeskrobać mięśnie, które przyczepiają grzbietowy szkielet rozgałęziony do brzusznej części mózgu.
Zeskrobać ruchem od tyłu do przodu. Powtórz proces usuwania mięśni po przeciwnej stronie ciernika. Następnie usuń szkielet rozgałęziony, chwytając podstawę rurki jelitowej i ciągnąc do przodu.
Oddziel rurkę jelitową za pomocą prostopadłego cięcia, z tyłu do piątego odcinka ceratobranchial. Częstym błędem jest chwytanie rurki jelitowej zbyt do przodu, co pozostawia brzuszną rurkę czołową daleko w tyle. Pamiętaj, aby chwycić głęboko w tylnej części klatki piersiowej i zawsze możesz później usunąć nadmiar rurki jelitowej.
Po usunięciu wszelkich pozostałych fragmentów kości z obudowy mózgowia po grzbietowej stronie szkieletu skrzelowego. Włóż nożyczki do kosza rozgałęzionego i wykonaj cięcie grzbietowe między obustronnymi zestawami grzbietowych blaszek zębowych. Utrzymuj to cięcie wyśrodkowane, aby uniknąć uszkodzenia grzbietowych płytek zębowych.
Następnie wykonaj dwa płytkie boczne nacięcia w gumowatym świetle jelita na tylnym końcu szkieletu skrzelowego. Na antyerorowym końcu rurki jelitowej. Aby pomóc w otwieraniu szkieletu skrzelowego.
Teraz przenieś szkielet do probówki z mikrosentrifużem wypełnionej 50 procentami glicerolu, punktem zerowym dwoma pięcioprocentowym wodorotlenkiem potasu w celu delikatnego oczyszczenia. Lub zamiast tego przenieś go do czystego glicerolu, jeśli nie jest wymagane dalsze oczyszczanie. Jeśli konieczne jest ponowne barwienie, szczegóły są podane w protokole tekstowym.
Aby przygotować się do montażu, zmień roztwór na czysty glicerol i potrząsaj probówką przez co najmniej pięć minut. Następnie usuń szkielet rozgałęziony i umieść go w pobliżu dna szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 na 60 milimetrów stroną grzbietową do góry. Teraz przenieś kilka kropli glicerolu na szkielet.
Następnie rozwałkuj dwie małe kulki plasteliny i zagraj po jednej na każdym końcu szkiełka nakrywkowego, pełnią one funkcję przekładek. Następnie luźno umieść drugi szkiełko nakrywkowe na preparacie, wywierając wystarczający nacisk, aby spłaszczyć przedni szkielet rozgałęziony. Teraz otwórz lewą klapę grzbietową, w tym grzbietowe płytki zębowe, i wsuń klapkę między szkiełka nakrywkowe.
Następnie zrób to samo z prawą klapą grzbietową. I odepchnij cały szkielet rozgałęziony od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Aby zakończyć procedurę, lekko naciśnij górną szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć gliniane kulki.
Tylko na tyle, aby utrzymać szkielet rozgałęziony płasko zamontowany. Ale nie na tyle, żeby został zmiażdżony. Jeśli podczas procesu rząd grabi jest zasłonięty, wsuń kleszcze między szkiełka nakrywkowe i zmień orientację ceratobranchialu lub całego preparatu.
Po zamontowaniu na płasko w czystym glicerolu preparat może być przechowywany płasko w temperaturze pokojowej przez co najmniej dekadę. Wynikiem tego protokołu jest wypreparowany i płasko zamontowany szkielet rozgałęziony. Gdzie można udokumentować wiele ważnych cech troficznych.
Z widoku grzbietowego wszystkie rzędy grabi skrzelowych, wszystkie płytki zębowe gardła i prawie wszystkie kości skrzelowe można łatwo uwidocznić i utrwalić. Czerwień alizarynowa S, również fluorezuje na czerwonym filtrze rodaminy lub podobnym, co pozwala na podwójne znakowanie innymi markerami i alternatywnymi metodami wizualizacji. Na tym zdjęciu grabie skrzelowe są oznaczone karatami.
Zęby są oznaczone grotami strzał, a kości są oznaczone gwiazdkami. Po opanowaniu sekcja może zostać wykonana w ciągu kilku minut i stosunkowo szybko może być wykonana na setkach zwierząt. I chociaż zademonstrowaliśmy sekcję szkieletu skrzelowego ciernika, mamy nadzieję, że ta procedura może być wykorzystana jako przewodnik dla różnych gatunków ryb.
Analizując szkielet rozgałęziony, możemy szybko i łatwo zobrazować sobie szereg ważnych cech troficznych, niewidocznych u całych wierzchowców. Pozwala to na lepsze zrozumienie rozwoju i ewolucji twarzoczaszki twarzoczaszki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół dotyczący sekcjonowania i przygotowania płaskiego preparatu szkieletu skrzelowego trzykręgowców, co jest kluczowy dla przetwarzania pokarmu u ryb. Metoda ta ma zastosowanie do różnych gatunków ryb i pomaga w zrozumieniu biologii rozwojowej i ewolucyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwojowa
- Biologia ewolucyjna
Tło
- Szkielet skrzelowy obejmuje szczecinki skrzelowe, zęby gardłowe i kości skrzelowe.
- Służy jako główne miejsce przetwarzania pokarmu u większości ryb.
- Zrozumienie tej struktury może dostarczyć wglądu w adaptację zwierząt i zmienność morfologiczną.
- Przegląd morfologii szkieletu głowy jest niezbędny przed sekcjowaniem.
Cel badania
- Zsekcjonować i przygotować płaski preparat szkieletu skrzelowego trzykręgowców.
- Wizualizować cechy troficzne, które nie są widoczne w preparatach całych organizmów.
- Zbadać kluczowe pytania dotyczące rozwoju, genetyki i ewolucji.
Stosowane metody
- Przygotowanie ryby do sekcji.
- Włożenie ostrych kleszczy do przekłucia błony pokrywającej oko.
- Sekcja szkieletu skrzelowego.
- Przygotowanie płaskiego preparatu sekcji do wizualizowania.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia szczegółową wizualizację szkieletu skrzelowego.
- Ułatwia badanie cech troficznych u ryb.
- Dostarcza metody stosowanej do różnych gatunków ryb.
- Zwiększa zrozumienie procesów rozwojowych i ewolucyjnych.
Wnioski
- Metoda sekcji i przygotowania płaskiego preparatu jest skuteczna w badaniu szkieletu skrzelowego.
- To podejście może pomóc w odpowiedzi na istotne pytania biologiczne.
- Przyczynia się do szerszej wiedzy o morfologii i adaptacji ryb.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise morphological analysis of the branchial skeleton, a key determinant of feeding efficiency and dietary adaptation in fish. By allowing quantification of trophic traits such as gill raker number and pharyngeal tooth density, it supports target validation in studies of evolutionary developmental biology. The method provides a scalable, reproducible system for linking genotype to phenotype in vertebrate craniofacial patterning.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic variants affecting craniofacial morphology through quantitative trait analysis.
- Operational Value: Provides a standardized, high-throughput compatible dissection workflow for phenotypic screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, two-dimensional preparations suitable for imaging-based assay readouts.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through consistent flat-mount morphology and glycerol-based clearing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing developmental changes in skeletal patterning relevant to human congenital disorders.
- Operational Value: Enables cross-species applicability, enhancing translational continuity in vertebrate model systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening of genetic mutants or natural variants requires detailed anatomical readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genomic variation to measurable skeletal phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative morphological outputs essential for assay development.
- Analytics: Enables measurement of trait distributions such as bone length and tooth number for statistical comparison.
- Translational Research: Connects fish craniofacial evolution to conserved developmental pathways in higher vertebrates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for skeletal phenotyping across diverse fish species and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genotype-phenotype maps by reducing observational ambiguity in complex 3D structures.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissection and mounting steps applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing clear, quantifiable phenotypic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic loci based on effect size and penetrance of craniofacial traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vertebrate anatomy and microsurgical dissection techniques.
- Dependent on fine forceps, micro-scissors, and glycerol-based clearing solutions.
- Necessitates standardized training to ensure consistent flat-mount quality and avoid tissue damage.
- Adaptation to larger or more heavily mineralized fish may require adjusted clearing times or enzymatic treatments.
- Practical limitations include potential obscuration of posterior elements if mounting pressure is uneven.
