Name: Rozwarstwienie i płaskie ułożenie szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Naucz się rozwarstwiania i płaskiego ułożenia szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego. Ta metoda pozwala wizualizować cechy troficzne niewidoczne w preparatach całych okazów, wspierając badania z zakresu biologii rozwoju i ewolucji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez NIH R01 #DE021475 dla CTM i NSF Graduate Research Fellowship dla NAE. Podziękowania dla Milesa Johnsona za pomoc w obrazowaniu i Priscilli Erickson za krytyczną lekturę rękopisu.

Wszystkie prace z rybami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley (numer protokołu R30). Eutanazję przeprowadzono poprzez zanurzenie w 0,025% Tricaine-S buforowanym 0,1% wodorowęglanem sodu39. Wszystkie etapy są wykonywane w temperaturze pokojowej.
1. Przygotowanie
Uwaga: Kroki 1.1-1.5 należy przeprowadzić w probówkach stożkowych lub fiolkach scyntylacyjnych, które można szczelnie zamknąć i ułożyć poziomo. Ryby nie wymagają ciągłego wstrząsania, jednak należy starać się mieszać roztwór tak często, jak to możliwe, delikatnie odwracając lub potrząsając statywem z probówkami lub fiolkami, aby wszystkie strony ryb miały kontakt z roztworem barwiącym i aby barwnik mógł równomiernie wniknąć w tkankę. Nie należy umieszczać dużych partii ryb na wstrząsarce platformowej, ponieważ duża masa cieczy może doprowadzić do uszkodzenia urządzenia.
<ol>
	<li>Utrwal świeżo uśpione ryby lub ryby przechowywane w etanolu w 10% neutralnej buforowanej formalinie (NBF) przez noc. Alternatywnie, zamiast 10% NBF można zastosować 4% paraformaldehyd w roztworze 1x PBS. 
	Uwaga: W przypadku ekstrakcji DNA należy przed utrwaleniem odciąć niewielki fragment płetwy ogonowej lub piersiowej i przechowywać go w etanolu.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz w odpowiedni sposób w dygestorium chemicznym i zastąpić go wodą z kranu (o pH ~7,0) na 2 h. Należy unikać stosowania wody dejonizowanej, ponieważ często jest ona kwasowa i może doprowadzić do dekalcyfikacji kości.</li>
	<li>Odlać wodę i barwić ryby 0,08% roztworem Alizarin Red S w 1% KOH w wodzie przez 24 h. Dla ryb o długości standardowej poniżej 20 mm należy zastosować 0,04% Alizarin Red S. (Należy przygotować 10-krotny (0,8%) roztwór zapasowy Alizarin Red S, który można następnie rozcieńczyć).</li>
	<li>Usunąć barwnik (przelewając go do odpowiedniego pojemnika na odpady w dygestorium) i umieścić ryby w wodzie z kranu na kilka godzin. Wymieniać wodę w razie potrzeby, aż do momentu, gdy woda z płukania będzie prawie przejrzysta.</li>
	<li>Odlać wodę i umieścić ryby w 50% glicerolu z 0,25% KOH w celu lekkiego przejaśnienia i późniejszej sekcji. 
	Uwaga: Niniejszy protokół barwienia jest modyfikacją metod opisanych wcześniej40,41.</li>
</ol>
2. Disekcja
Uwaga: Patrz Rycina 1 w celu przeanalizowania odpowiedniej morfologii szkieletu głowy.
<img alt="Schemat anatomiczny czaszki ryby; opisane kości: Fron, Nas, Max; narzędzie do analizy strukturalnej." src="/files/ftp_upload/54056/54056fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Morfologia szkieletu głowy kolca. Głowa kolca dwuzybowego barwiona alizaryną czerwoną, obrazowana z wykorzystaniem fluorescencji przy użyciu zestawu filtrów dla rhodaminy B. Oznaczono istotne elementy morfologiczne: Op = operculum (pokrywa skrzelowa), Subop = suboperculum (podpokrywa skrzelowa), BSRs = promienie skrzelowe, Preop = preoperculum (przedszyba skrzelowa), Infraorb 1-3 = kości podoczodołowe 1-3 (zwane również okołoczodołowymi lub podoczodołowymi), Dent = kość żuchwy dolnej, Premax = kość przedmaxylarna, Max = kość maxylarna, Nas = kość nosowa, Lat. ethm = kość sitowa boczna, Psph = kość parasfenoidalna, Fron = kość czołowa. Bardziej szczegółowy opis szkieletu głowy kolca dwuzybowego znajduje się w pracy Anker (1974)31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Połóż rybę płasko (Rycina 2A) i wprowadź ostre pęsety zegarmistrzowskie nr 5 do boku oka pod kątem ~45°, aby przebić błonę pokrywającą oko.</li>
	<li>Oddziel błonę od oka, podobnie jak przy odrywaniu wieczka od jogurtu (Rycina 2B).</li>
	<li>Wprowadź otwartą pęsetę za oko, chwyć nerw wzrokowy za oczem i usuń oko (Rycina 2C). Nie przebijaj oka, ponieważ wycieknie z niego melanina. W przypadku przebicia, melaninę można wypłukać podczas późniejszych etapów.</li>
	<li>Powtórz czynność po drugiej stronie.</li>
	<li>Zaczynając od strony tylnej, umieść jedno ostrze małych nożyczek sekcyjnych pod pokrywą skrzeli, przesuń ostrze grzbietowo nad pokrywą, a następnie przetnij tkankę miękką aż do oczodołu (Rycina 2D). Przetnij tkankę grzbietowo względem kości pokrywy.</li>
	<li>Przetnij kość czołową (grzbietowo względem oczodołu) (Rycina 2E).</li>
	<li>Przetnij w linii środkowej kość parasfenoidalną w okolicy centrum oczodołów (Rycina 2F).</li>
	<li>Powtórz cięcie pokrywy po przeciwnej stronie.</li>
	<li>Wprowadź pęsetę pod pokrywę i powoli odrywaj twarz od ciała, przycinając wszelkie wciąż przytwierdzone tkanki miękkie (Rycina 2G-H). Należy uważać, aby nie uszkodzić pierwszego rzędu tyczek skrzelowych.
	<ol>
		<li>Za pomocą pęsety oddziel cerato-hyale po obu stronach od basihyalu w linii środkowej, jednocześnie odrywając i usuwając przedni szkielet czaszowo-twarzowy (całą szczękę, w tym kostkę żuchwowe, przedmaxillę i maxillę; cały szkielet hyoidalny, w tym zewnętrzną dermalną pokrywę, przedpokrywę, podpokrywę i promienie branchiostegalne oraz leżące pod nimi grzbietowe i brzuszne elementy endochondralne; oraz przednią część czaszki, w tym kości nosowe, boczny etmoid i kości podoczodołowe, patrz Ryciny 1 i 2I).</li>
		<li>Kolce miedniczne można odchylić od ciała, co w przypadku ich obecności może służyć jako uchwyt dla pęsety. Kolce blokują się w jednej pozycji. Aby je odblokować, delikatnie pociągnij kolca pęsetą bezpośrednio od ciała ryby, a następnie delikatnie zegnij go w stronę tylną, aby docisnąć go płasko do ryby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadź zamkniętą pęsetę tylnie i brzusznie względem szkieletu skrzelowego (tuż poniżej przewodu pokarmowego) i przesuń pęsetę przednio, rozdzielając pozostałe mięśnie i więzadła przytwierdzone do szkieletu skrzelowego (Rycina 2J-K).</li>
	<li>Używając końcówek zamkniętej pęsety, zeskrob mięśnie łączące grzbietowy szkielet skrzelowy z brzuszną częścią skrzyni mózgowej w kierunku od tyłu do przodu (Rycina 2L).</li>
	<li>Powtórz kroki 2.9 i 2.10 po przeciwnej stronie.</li>
	<li>Chwyć podstawę przewodu pokarmowego i pociągnij do przodu, aby usunąć szkielet skrzelowy i przewód pokarmowy (Rycina 2M-N).</li>
	<li>Oddziel przewód pokarmowy, wykonując cięcie prostopadłe tylnie względem końca piątego ceratobranchialu (Rycina 2O).</li>
	<li>Po usunięciu wszelkich pozostałych fragmentów kości ze skrzyni mózgowej na grzbietowej stronie szkieletu skrzelowego, wprowadź nożyczki do koszyka skrzelowego, aby wykonać cięcie grzbietowe (od przodu do tyłu) między obustronnymi zestawami grzbietowych płytek zębowych (Rycina 3A-D). Upewnij się, że cięcie jest wycentrowane, aby uniknąć uszkodzenia grzbietowych płytek zębowych.</li>
	<li>Wykonaj dwa płytkie cięcia boczne w gumowatym świetle przewodu pokarmowego na tylnym końcu szkieletu skrzelowego (przednim końcu przewodu pokarmowego), aby ułatwić otwarcie szkieletu skrzelowego (Rycina 3E).</li>
	<li>Umieść rybę i wszystkie fragmenty tkanek w słoiku, a szkielet skrzelowy przełóż do probówki do mikrocentryfugi z 50% glicerolem i 0,25% KOH w celu kontynuowania delikatnego przejaśniania lub do 100% glicerolu, jeśli dalsze przejaśnianie nie jest wymagane. Oznacz słoiki i probówki unikalnym identyfikatorem w celu ich śledzenia. Wymagana ilość przejaśniania zależy głównie od rozmiaru ryby; duże dorosłe ryby (o długości standardowej powyżej 40 mm) zazwyczaj wymagają dodatkowego przejaśniania.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu sekcji; kroki z wykorzystaniem narzędzi do oddzielania, cięcia i skrobania tkanek preparatu." src="/files/ftp_upload/54056/54056fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Disekcja szkieletu skrzelowego kolca. Ryby z gatunku kolczuch trójcierniowy barwione alizaryną czerwoną, przygotowane do sekcji. Oko jest odbarwione w wyniku rozległego przejaśniania. Niebieskie strzałki wskazują kierunek ruchu.AWidok boczny głowy kłobuka, przód znajduje się po prawej stronie.B) Usunięcie błony pokrywającej oko. (C) Usunięcie oka. (D) Cięcie grzbietowe powyżej pokrywy skrzeli. (E) Przecięcie kości czołowej. (F) Przecięcie kości rozdzielnej. (G-I) Usunięcie szkieletu twarzy. (J) Usunięcie połączeń tkanek miękkich z brzusznym szkieletem skrzelowym. (K-L) Usunięcie połączeń grzbietowego szkieletu skrzelowego. (M-N) Usunięcie szkieletu skrzelowego. (O) Oddzielić przewód pokarmowy od szkieletu skrzelowego. Szczegóły znajdują się w krokach od 2.1 do 2.16. Pasek skali = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Ponowne barwienie szkieletu skrzelowego (w razie potrzeby)
<ol>
	<li>Aby silniej zabarwić szkielet skrzelowy lub bardziej przejaśnić tkankę, usunąć 50% glicerol i roztwór 0,25% KOH, a następnie dwukrotnie przemyć 1% KOH (pierwsze płukanie przez pięć minut, a następnie drugie przez 24 h przy poziomym wstrząsaniu na wytrząsalce platformowej).</li>
	<li>Usunąć 1% KOH i ponownie zabarwić 0,008% Alizarin Red S w 1% KOH przez 24 h.</li>
	<li>Usunąć barwnik i zastąpić go 1% KOH na 24 h.</li>
	<li>Usunąć roztwór KOH i zastąpić go 50% glicerolem i 0,25% KOH.</li>
</ol>
4. Montaż szkieletu skrzelowego
<ol>
	<li>Wyjąć szkielet skrzelowy z 50% glicerolu, 0,25% KOH lub 10% glicerolu i umieścić go w pobliżu dolnej krawędzi szklanego szkiełka przedmiotowego o wymiarach 2 mm x 60 mm, stroną grzbietową do góry (Rysunek 3F). Na szkielet skrzelowy nanieś kilka kropli 50% glicerolu, 0,25% KOH lub 100% glicerolu. W przypadku przejścia z 50% glicerolu lub 0,25% KOH na 100% glicerol, wymień roztwór w probówce do mikrocentryfugi i wstrząsaj przez &gt;5 min przed montowaniem w celu równowagi tkanki.</li>
	<li>Uformuj dwie małe kulki z plasteliny i umieść je po obu końcach szkiełka nakrywki, aby służyły jako dystanse.</li>
	<li>Luźno nałóż drugie szkiełko nakrywką, wywierając nacisk wystarczający do spłaszczenia przedniego szkieletu skrzelowego (Rycina 3G).</li>
	<li>Odsłoń lewą płat grzbietowy wraz z grzbietowymi płytkami zębowymi, rozpłaszcz go i wsuń pomiędzy szkiełka nakrywkowe (Rysunek 3H).</li>
	<li>Powtórz technikę w odniesieniu do prawego płata grzbietowego i odsunie cały szkielet skrzelowy od krawędzi szkiełka nakrywkowe (Rysunek 3I).
	<ol>
		<li>Alternatywnie należy rozsunąć obie klapy grzbietowe za pomocą pęsety i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywką, spłaszczając szkielet skrzelowy jednym płynnym ruchem.</li>
		<li>Alternatywnie, przymocuj szkielet skrzelowy odwróconą stroną do góry do jednego szkiełka nakrywkowego, rozkładając każdą stronę grzbietową na boki, aby grawitacja nie doprowadziła do ponownego zamknięcia się szkieletu skrzelowego. Następnie przykryj go drugim szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 60 mm i odwróć preparat. 
		Uwaga: Różne techniki montażu mogą sprawdzać się w różnym stopniu u każdego użytkownika. Należy wypróbować każdą z nich i sprawdzić, która jest najwygodniejsza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lekko naciśnij górne szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć kulki gliny w stopniu umożliwiającym utrzymanie szkieletu skrzelowego w pozycji płaskiej, dbając jednocześnie o to, by nie zmiażdżyć preparatu.
	<ol>
		<li>Podczas procesu montażu ceratobranchiale mogą się obrócić i zasłonić rząd rastek. Aby to naprawić, należy wsunąć pęsetę między szkiełka nakrywki i ponownie zorientować ceratobranchiale lub cały szkielet skrzeli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki należy przechowywać na płasko w tackach na szkiełka w temperaturze pokojowej. Po zamontowaniu w 10% glicerolu próbki mogą być przechowywane między mostkowanymi szkiełkami nakrywkowymi przez co najmniej dekadę. Pincety i nożyczki należy oczyścić izopropanolem lub etanolem, a następnie zabezpieczyć końcówki.</li>
</ol>
<img alt="Sekwencja dyssekcji tkanki roślinnej, proces krok po kroku, przygotowanie do mikroskopii, metoda eksperymentalna." src="/files/ftp_upload/54056/54056fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Preparat płaski szkieletu skrzelowego. Przedstawiono manipulację i montaż szkieletu skrzelowego. Niebieskie strzałki wskazują kierunek ruchu. (A) Szkielet skrzelowy stroną grzbietową do góry. (B-D) Rotacja i nacięcie pomiędzy grzbietowymi płytkami zębowymi. (E) Cięcie boczne w tkance miękkiej w celu dalszego otwarcia podstawy przewodu pokarmowego. (F) Szkielet skrzelowy umieszczony na spodzie szkiełka nakrywkowego, gotowy do montażu. (G) Drugą szkiełkiem nakrywościankowym umieszczono na przedniej połowie szkieletu skrzelowego (powyżej grzbietowych płytek zębowych). (H-I) Montaż płaski szkieletu skrzelowego poprzez otwarcie płatów kostnych płyt zębowych grzbietowych i wsunięcie pomiędzy dwa szkiełka nakrywkowe. Szczegóły znajdują się w krokach 4.1–4.6. Pasek skali = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Cooper, W. J., Westneat, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+and+function+of+damselfish+skulls%3A+rapid+and+repeated+evolution+into+a+limited+number+of+trophic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Form and function of damselfish skulls: rapid and repeated evolution into a limited number of trophic niches.</a> BMC Evol. Biol. 9 (24), (2009).</li>
<li>Albertson, R. C., Kocher, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+basis+of+cichlid+trophic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental basis of cichlid trophic diversity.</a> Heredity. 97 (3), 211-221 (2006).</li>
<li>Martin, C. H., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+novelty+is+linked+to+exceptional+rates+of+morphological+diversification+in+two+adaptive+radiations+of+cyprinodon+pupfish%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Trophic novelty is linked to exceptional rates of morphological diversification in two adaptive radiations of cyprinodon pupfish.</a> Evolution. 65 (8), 2197-2212 (2011).</li>
<li>Wainwright, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+pharyngognathy%3A+A+phylogenetic+and+functional+appraisal+of+the+pharyngeal+jaw+key+innovation+in+labroid+fishes+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">The evolution of pharyngognathy: A phylogenetic and functional appraisal of the pharyngeal jaw key innovation in labroid fishes and beyond.</a> Syst. Biol. 61 (6), 1001-1027 (2012).</li>
<li>Sibbing, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+capture+and+oral+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cyprinid+Fishes%22%5BJournal%5D)">Food capture and oral processing.</a> Cyprinid Fishes. , 377-412 (1991).</li>
<li>Bell, M., Foster, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+M+%22The+Evolutionary+Biology+of+the+Threespine+Stickleback%22">The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback</a>. , Oxford University Press. New York. (1994).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+facial+bone+morphology+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of facial bone morphology in threespine sticklebacks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (16), 5791-5796 (2005).</li>
<li>Mcgee, M. D., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+evolution+as+a+generator+of+phenotypic+diversity+in+threespine+stickleback%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Convergent evolution as a generator of phenotypic diversity in threespine stickleback.</a> Evolution. 67 (4), 1204-1208 (2013).</li>
<li>McGee, M. D., Schluter, D., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+basis+of+ecological+divergence+in+sympatric+stickleback%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional basis of ecological divergence in sympatric stickleback.</a> BMC Evol. Biol. 13, 277(2013).</li>
<li>McGuigan, K., Nishimura, N., Currey, M., Hurwit, D., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+variation+in+static+allometry+in+the+threespine+stickleback%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Comp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic variation in static allometry in the threespine stickleback.</a> Integr. Comp. Biol. 50 (6), 1067-1080 (2010).</li>
<li>Caldecutt, W. J., Bell, M. A., Buckland-Nicks, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+and+geographic+variation+in+dentition+of+threespine+stickleback%2C+Gasterosteus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Copeia%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism and geographic variation in dentition of threespine stickleback, Gasterosteus aculeatus.</a> Copeia. 2001 (4), 936-944 (2001).</li>
<li>Berner, D., Moser, D., Roesti, M., Buescher, H., Salzburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+architecture+of+skeletal+evolution+in+european+lake+and+stream+stickleback%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic architecture of skeletal evolution in european lake and stream stickleback.</a> Evolution. 68 (6), 1792-1805 (2014).</li>
<li>Jamniczky, H. a, Barry, T. N., Rogers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eco-evo-devo+in+the+study+of+adaptive+divergence%3A+examples+from+threespine+stickleback+%28Gasterosteus+aculeatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Comp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Eco-evo-devo in the study of adaptive divergence: examples from threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus).</a> Integr. Comp. Biol. 55 (1), 166-178 (2015).</li>
<li>Magnuson, J., Heitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gill+raker+apparatus+and+food+selectivity+among+mackerels%2C+tunas%2C+and+dolphins%5BTitle%5D)+AND+%22Fish.+Bull%22%5BJournal%5D)">Gill raker apparatus and food selectivity among mackerels, tunas, and dolphins.</a> Fish. Bull. 69 (2), 361-370 (1971).</li>
<li>Kahilainen, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+gill+raker+number+variability+in+adaptive+radiation+of+coregonid+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">The role of gill raker number variability in adaptive radiation of coregonid fish.</a> Evol. Ecol. 25 (3), 573-588 (2011).</li>
<li>Arnegard, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+ecological+divergence+during+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics of ecological divergence during speciation.</a> Nature. 511 (7509), 307-311 (2014).</li>
<li>Gross, H. P., Anderson, J. M., Gross, H. P., Anderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+variation+in+the+gillrakers+and+diet+of+European+threespine+sticklebacks%2C+Gasterosteus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Copeia%22%5BJournal%5D)">Geographic variation in the gillrakers and diet of European threespine sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Copeia. 1984 (1), 87-97 (1984).</li>
<li>Hagen, D., Gilbertson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+variation+and+environmental+selection+in+Gasterosteus+aculeatus+L+in+the+Pacific+Northwest%2C+America%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Geographic variation and environmental selection in Gasterosteus aculeatus L in the Pacific Northwest, America.</a> Evolution. 26 (1), 32-51 (1972).</li>
<li>McPhail, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+evolution+of+sympatric+sticklebacks+%28Gasterosteus%29%3A+morphological+and+genetic+evidence+for+a+species+pair+in+Enos+Lake%2C+British+Columbia%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">Ecology and evolution of sympatric sticklebacks (Gasterosteus): morphological and genetic evidence for a species pair in Enos Lake, British Columbia.</a> Can. J. Zool. 62 (7), 1402-1408 (1984).</li>
<li>Schluter, D., McPhail, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+character+displacement+and+speciation+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">Ecological character displacement and speciation in sticklebacks.</a> Am. Nat. 140 (1), 85-108 (1992).</li>
<li>Robinson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trade+offs+in+Habitat-specific+foraging+efficiency+and+the+nascent+adaptive+divergence+of+sticklebacks+in+lakes%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">Trade offs in Habitat-specific foraging efficiency and the nascent adaptive divergence of sticklebacks in lakes.</a> Behaviour. 137 (7), 865-888 (2000).</li>
<li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> Evodevo. 5 (1), (2014).</li>
<li>Miller, C. T., Glazer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li>
<li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5, 1463-1472 (2015).</li>
<li>Wainwright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+pharyngeal+jaw+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Physiol.+Fish+Biomech%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the pharyngeal jaw apparatus.</a> Fish Physiol. Fish Biomech. , 77-102 (2006).</li>
<li>Hulsey, C. D., Fraser, G. J., Streelman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+complex+biomechanical+systems%3A+300+million+years+of+fish+jaws%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of complex biomechanical systems: 300 million years of fish jaws.</a> Zebrafish. 2 (4), 243-257 (2005).</li>
<li>Lauder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+design+and+evolution+of+the+pharyngeal+jaw+apparatus+in+euteleostean+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool.+J.+Linn.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional design and evolution of the pharyngeal jaw apparatus in euteleostean fishes.</a> Zool. J. Linn. Soc. 77, 1-38 (1983).</li>
<li>Fraser, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+gene+network+is+co-opted+for+teeth+on+old+and+new+jaws%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient gene network is co-opted for teeth on old and new jaws.</a> PLoS Biol. 7 (2), e1000031(2009).</li>
<li>Stock, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dentition+in+comparative+context%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B.+Mol.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dentition in comparative context.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 523-549 (2007).</li>
<li>Liem, K., Greenwood, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+approach+to+the+phylogeny+of+the+pharyngognath+teleosts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Zool%22%5BJournal%5D)">A functional approach to the phylogeny of the pharyngognath teleosts.</a> Am. Zool. 21 (1), 83-101 (1981).</li>
<li>Anker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+kinetics+of+the+head+of+the+stickleback%2C+Gasterosteus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Zool.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">Morphology and kinetics of the head of the stickleback, Gasterosteus aculeatus.</a> Trans. Zool. Soc. London. 32 (5), 311-416 (1974).</li>
<li>Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometrics+and+allometry+in+the+trophically+polymorphic+cichlid+fish%2C+Cichlusomu+citrinelfum%3A+Alternative+adaptations+and+ontogenetic+changes+in+shape%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.%2C+Lond%22%5BJournal%5D)">Morphometrics and allometry in the trophically polymorphic cichlid fish, Cichlusomu citrinelfum: Alternative adaptations and ontogenetic changes in shape.</a> J. Zool., Lond. 221, 237-260 (1990).</li>
<li>Huysseune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+plasticity+in+the+lower+pharyngeal+jaw+dentition+of+Astatoreochromis+alluaudi+%28Teleostei%3A+Cichlidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic plasticity in the lower pharyngeal jaw dentition of Astatoreochromis alluaudi (Teleostei: Cichlidae).</a> Arch. Oral Biol. 40 (11), 1005-1014 (1995).</li>
<li>Muschick, M., Indermaur, A., Salzburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+Evolution+within+an+adaptive+radiation+of+cichlid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Convergent Evolution within an adaptive radiation of cichlid fishes.</a> Curr. Biol. 22 (24), 2362-2368 (2012).</li>
<li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li>
<li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. (142), 2442-2451 (2015).</li>
<li>Tucker, A. S., Fraser, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+developmental+diversity+of+tooth+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution and developmental diversity of tooth regeneration.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 25-26, 71-80 (2014).</li>
<li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. B. 281, (2014).</li>
<li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeary%2C+S+%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL. (2013).</li>
<li>Bell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+phenetics+and+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Genet.+Fishes%22%5BJournal%5D)">Evolutionary phenetics and genetics.</a> Evol. Genet. Fishes. , 431-528 (1984).</li>
<li>Taylor, W. R., Van Dyke, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+procedures+for+staining+and+clearing+small+fishes+and+other+vertebrates+for+bone+and+cartilage+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cybium%22%5BJournal%5D)">Revised procedures for staining and clearing small fishes and other vertebrates for bone and cartilage study.</a> Cybium. 9 (2), 107-119 (1985).</li>
<li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+190+base+pair%2C+TGF-%CE%B2+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li>
<li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Regulatory+changes+in+Kit+ligand+expression+and+parallel+evolution+of+pigmentation+in+sticklebacks+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">cis-Regulatory changes in Kit ligand expression and parallel evolution of pigmentation in sticklebacks and humans.</a> Cell. 131 (6), 1179-1189 (2007).</li>
<li>Aigler, S. R., Jandzik, D., Hatta, K., Uesugi, K., Stock, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+constraint+underlie+irreversibility+of+tooth+loss+in+cypriniform+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Selection and constraint underlie irreversibility of tooth loss in cypriniform fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (21), 7707-7712 (2014).</li>
<li>Pasco-Viel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+trends+of+the+pharyngeal+dentition+in+Cypriniformes+%28Actinopterygii+Ostariophysi%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evolutionary trends of the pharyngeal dentition in Cypriniformes (Actinopterygii Ostariophysi).</a> PLoS One. 5 (6), e11293(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szkielet skrzelowy to złożony zestaw kości w gardle ryby, który manipuluje, filtruje i przeżuwa produkty spożywcze w drodze do przełyku. Wiele interesujących cech troficznych, w tym wzór grabi skrzelowych, zęby gardłowe i kości skrzelowe, różni się w zależności od gatunku i w jego obrębie. Większość tych cech jest trudna lub prawie niemożliwa do dokładnego zmierzenia za pomocą szkieletu skrzelowego in situ (np. długość skrzeli, długość kości skrzelowej). Ten płaski protokół montażu umieszcza wszystkie r...

Niesamowita różnorodność występuje w szkielecie głowy wśród kręgowców, zwłaszcza wśród ryb. W wielu przypadkach ta różnorodność ułatwia różne strategie żywieniowe 1-4 i może wiązać się z poważnymi zmianami zarówno w zewnętrznym, jak i wewnętrznym wzorcu twarzoczaszki. Szkielet skrzelowy znajduje się wewnętrznie w gardle ryby i otacza większość jamy policzkowej. Szkielet rozgałęziony składa się z 5 szeregowo homologicznych segmentów, z których przedni cztery podtrzymują skrzela. Razem te pięć segmentów funkcjonuje jako interfejs między rybami a ich pokarmem5. Różnorodność wielu cech, w tym grabie skrzelowe, zęby gardłowe i kości skrzelowe, przyczynia się do wydajnego żerowania na różnych rodzajach pokarmu.
Cierniki przeszły adaptacyjną radiację po tym, jak przodkowie formy oceaniczne skolonizowały słodkowodne jeziora i potoki na całej półkuli północnej. Zmiana diety z małego zooplanktonu w oceanie na większą zdobycz w wodach słodkich spowodowała dramatyczną zmienność troficzną kilku cech twarzoczaszki6. Podczas gdy wiele badań koncentrowało się na zewnętrznych różnicach w twarzorośli u cierników 7-13, ważne zmiany twarzoczaszki ewoluują wielokrotnie w wewnętrznym szkielecie skrzelowym. Zdolność do tworzenia płodnych hybryd między morfologicznie odrębnymi populacjami ciernika stanowi doskonałą okazję do zmapowania genetycznych podstaw wyewoluowanych zmian w szkielecie skrzelowym.
Jedną z cech troficznych o znaczeniu ekologicznym jest wzór grabi skrzelowych, okresowych kości skórnych, które wyściełają przednią i tylną powierzchnię kości skrzelowych i są używane do filtrowania zdobyczy. Ryby, które zazwyczaj żywią się małymi zdobyczami, mają zwykle dłuższe i gęściej rozmieszczone grabie skrzelowe w porównaniu z rybami, które żywią się większą zdobyczą14,15. Zmienność grabiarek skrzelowych odnotowano zarówno w obrębie gatunków14-19, jak i między nimi, a aspekty wzoru grabienia skrzeli przyczyniają się do nisz troficznych i sprawności16. Dziesięciolecia badań obszernie udokumentowały zmienność liczby i długości cierników skrzelowych wwieku 17-21 lat; Jednak badania te zazwyczaj koncentrują się na pierwszym rzędzie zgrabiarek skrzelowych. Niedawne prace wykazały modułowość w genetycznej kontroli liczby zgrabiarek skrzelowych w całym szkielecie skrzelowym22,23 oraz w pojedynczym rzędzie w odstępach między zgrabiarkamiskrzelowymi 23 i długości24, podkreślając znaczenie badania więcej niż pierwszego rzędu lub pojedynczego zgrabiarki skrzelowej w celu zrozumienia rozwojowych podstaw genetycznych redukcji zgrabiarek skrzelowych.
Drugą cechą troficzną, zarówno ekologiczną, jak i biomedyczną, jest wzór zębów gardłowych. Zęby u ryb mogą znajdować się zarówno w szczęce ustnej, jak iw szkielecie skrzelowym, znanym jako zęby gardłowe. Zęby jamy ustnej służą przede wszystkim do chwytania zdobyczy, podczas gdy zęby gardłowe służą do żucia i manipulacji zdobyczą25-27. Oba zestawy powstają poprzez wspólne mechanizmy rozwojowe i są uważane za rozwojowo homologiczne28. Interesująca modularność występuje w sytuacji, gdy niektóre gatunki, takie jak danio pręgowany, nie mają zębów gardła ustnego i grzbietowego29, podczas gdy inne gatunki mają wiele ząbkowanych ceratobranchiów, gardłowych, a czasem ząbkowanych podstawnych i hiposkrzeli30. U cierników zęby gardłowe znajdują się brzusznie na piątym odcinku ceratobranchialnym i grzbietowo na przednim i tylnym gardle31. Kinematyka karmienia ciernika pokazuje, że szczęka ustna jest używana głównie do chwytania zdobyczy i ułatwiania karmienia ssącego9, pozostawiając żucie do szczęki gardłowej. U pielęgnic morfologia żuchwy dolnego gardła różni się znacznie32,33 i wykazano, że jest adaptacyjna i skorelowana z niszą troficzną34. Wiele populacji ciernika słodkowodnego wyewoluowało dramatyczny wzrost liczby zębów brzusznych gardła23,35,36. Niedawne prace wykazały, że genetyczna podstawa rozwojowa tego wyewoluowanego przyrostu zębów jest w dużej mierze odmienna w dwóch niezależnie pochodzących populacjach cierników słodkowodnych36. W przeciwieństwie do zębów ssaków, ryby regenerują zęby w sposób ciągły przez całe dorosłe życie37. Obie te wcześniej opisane populacje słodkowodne o wysokim ząbkowaniu wyewoluowały przyspieszone tempo wymiany zębów, zapewniając rzadki system kręgowców do badania genetycznych podstaw regeneracji.
Trzecią cechą troficzną, która wielokrotnie ewoluowała u cierników słodkowodnych, są dłuższe kości epibranchialne i ceratobranchialne, segmentowe homologi górnej i dolnej szczęki, odpowiednio38. Dłuższe kości skrzelowe nadają większą jamę policzkową i prawdopodobnie są adaptacyjne, aby umożliwić spożywanie większych zdobyczy. Ponadto u innych ryb kości nadgałęzione są ważne dla zagłębienia grzbietowych płytek zębowych gardła25. Podobnie jak skrzela i zęby gardłowe, kości skrzelowe są wewnętrzne, a zatem trudne do łatwej wizualizacji lub określenia ilościowego.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół do preparowania i płaskiego montażu szkieletu rozgałęzionego, co pozwala na łatwą wizualizację i kwantyfikację różnych ważnych cech twarzoczaszki. Podczas gdy ten protokół opisuje sekcję ciernika, ta sama metoda działa na wielu innych rybach.

<table><tbody><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>EMD</td><td>PX1480-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893-4L</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina (NBF)</td><td>Azer Scientific</td><td>NBF-4-G</td><td></td></tr><tr><td>Alizaryn Red S</td><td>EMD</td><td>AX0485-3</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopu 22 mm x 60 mm</td><td>VWR</td><td>16004-350</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 10 mm Szkło Petri Naczynie</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10010</td><td>Do preparowania próbek na</td></tr><tr><td>zestawie elastomerów silikonowych Sylgard 184</td><td>Kleje Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td>Można wlać do szklanych lub plastikowych szalek Petriego w celu wykonania płytek preparacyjnych</td></tr><tr><td>Modelina</td><td>Sargent Art</td><td>22-4000</td><td>1 funt kremu</td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne (opakowanie 500 sztuk)</td><td>Szkło borokrzemianowe</td> <td>Wheaton</td><td>986586</td> z zakrętką</tr><tr><td>Kleszcze-Dumont #5 Inox (wskazówka Biologie)</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Dumostars to alternatywne</td></tr><tr><td>nożyczki preparacyjne&nbsp;</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td>Dostępne są różne rozmiary w zależności od wielkości próbki</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>S6E z KL300 LED</td><td>Wiele innych modeli działa ładnie, pomaga płaska podstawa</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Kartonowa taca na suwaki</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie i płaskie ułożenie szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

Tylne segmenty gardłowe głowy kręgowca dają początek szkieletowi rozgałęzionemu, głównemu miejscu przetwarzania żywności u ryb. Morfologia szkieletu skrzelowego ryby jest dopasowana do diety gatunku. Ciernik trójkolczasty (Gasterosteus aculeatus) pojawił się jako system modelowy do badania genetycznych i rozwojowych podstaw wyewoluowanych różnic w różnych cechach. Morskie populacje cierników wielokrotnie kolonizowały niezliczone nowe słodkowodne jeziora i potoki. Adaptacja do nowej diety w tych słodkowodnych środowiskach prawdopodobnie leży u podstaw serii zmian twarzoczaszki, które wielokrotnie ewoluowały w niezależnie wyprowadzonych populacjach słodkowodnych. Należą do nich trzy główne zmiany w szkielecie skrzelowym: zmniejszenie liczby i długości kości skrzeli, zwiększenie liczby zębów gardłowych i zwiększenie długości kości skrzelowych. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół preparowania i płaskiego montażu wewnętrznego szkieletu rozgałęzionego u cierników trójgrzbietowych. Rozwarstwienie całego trójwymiarowego szkieletu rozgałęzionego i zamontowanie go płasko w dużej mierze dwuwymiarowym preparacji pozwala na łatwą wizualizację i kwantyfikację morfologii szkieletu skrzelowego. Ta metoda preparacji jest niedroga, szybka, stosunkowo łatwa i ma zastosowanie do wielu różnych gatunków ryb. W przypadku cierników ta skuteczna metoda umożliwia ilościowe określenie morfologii szkieletu w krzyżówkach genetycznych w celu zmapowania regionów genomu kontrolujących wzorzec twarzoczaszki.

Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie wypreparowanego i płasko zamontowanego szkieletu skrzelowego (Rycina 4), w którym można określić ilość różnorodnych, istotnych cech troficznych. W widoku grzbietowym można łatwo zwizualizować i zmierzyć wszystkie rzędy sit szkrzelowych, wszystkie płytki zębowe gardzielowe oraz niemal wszystkie kości skrzelowe2-24,35,36,38,42. Alizaryna czerwona S fluoreskuje również przy zastosowaniu filtra rhodamino...

Szkielet rozgałęziony, w tym grabie skrzelowe, zęby gardłowe i kości skrzelowe, służy jako główne miejsce przetwarzania żywności u większości ryb. Tutaj opisujemy protokół preparowania i płaskiego montażu tego wewnętrznego szkieletu u cierników trójgrzbietowych. Ta metoda ma również zastosowanie do wielu innych gatunków ryb.

Rozwarstwienie i płaskie ułożenie szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest preparowanie i montaż na płasko szkieletu skrzelowego kolcolasa. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju, genetyki i ewolucji, takie jak to, w jaki sposób zwierzęta adaptują się do nowych środowisk oraz jak podczas rozwoju powstaje zmienność morfologii osobników dorosłych.Główną zaletą tej techniki jest to, że poprzez wypreparowanie i montaż na płasko szkieletu skrzelowego można zwizualizować szereg cech troficznych, których nie da się badać w preparatach całych. Przed przystąpieniem do pracy należy zapoznać się z odpowiednią morfologią szkieletu głowy kolcolawa trójcierniowego. Po przygotowaniu ryby do sekcji, należy rozpocząć od wprowadzenia ostrych pęsety numer pięć w bok oka, pod kątem 45 stopni, aby przebić błonę pokrywającą oko.Następnie odwarstw błonę oka, podobnie jak wieczko pojemnika z jogurtem. Potem wprowadź otwartą pęsetę za oko, chwyć nerw wzrokowy i usuń gałkę oczną. Należy uważać, aby nie przebić oka, w przeciwnym razie wycieknie z niego melanina.Powtórz ten proces w odniesieniu do oka po przeciwnej stronie. Następnie wsuń ostrze małych nożyczek pod tylną krawędź płata pokrywy skrzelowej i przetnij tkankę miękką grzbietowo nad pokrywą, kierując się w stronę oczodołu. Następnie przetnij kość czołową, która znajduje się grzbietowo względem oczodołu.Następnie należy przeciąć kość parasfenoidalną wzdłuż linii środkowej, w okolicy centrum oczodołu. Powtórz nacięcie opercularne po przeciwnej stronie. W kolejnych krokach kolce miedniczne mogą służyć jako uchwyty.Rozkłada się je, delikatnie odciągając bezpośrednio od ciała. Następnie należy wprowadzić pęsetę pod operculum i powoli oddzielić twarz od ciała, odcinając w tym procesie wszelkie tkanki miękkie, które nadal są przytwierdzone.Należy zachować ostrożność w obrębie łuseczek skrzelowych i uważać, aby ich nie uszkodzić. Podczas usuwania szkieletu twarzowego łatwo jest przypadkowo chwycić pierwszą kość skrzelową (ceratobranchial) wraz z percoll. Podczas odsuwania percoll do przodu należy zaglądać pod nią, aby upewnić się, że nie chwycono żadnych dodatkowych elementów.Następnie, za pomocą pęsety, oddziel kości ceratohyalne od obu stron środkowej linii kości basihyalnej, jednocześnie odwarstwiając i usuwając przedni szkielet czaszkowo-twarzowy. Powtórz czynność po przeciwnej stronie. Przedni szkielet czaszkowo-twarzowy obejmuje całą szczękę, cały szkielet gnykowy, leżące pod nimi elementy grzbietowe i chondralne oraz przednią część czaszki.Następnie wprowadź zamkniętą pęsetę tuż poniżej przewodu pokarmowego i przesuń ją w kierunku przednim, rozdzielając przy tym pozostałe mięśnie i więzadła przytwierdzone do szkieletu skrzelowego. Następnie, używając końcówki zamkniętej pęsety, zeskrob mięśnie łączące grzbietową część szkieletu skrzelowego z brzuszną częścią torebki mózgowej.Zeskrobcie tkankę, wykonując ruchy od strony tylnej do przedniej. Powtórzcie proces usuwania mięśni po przeciwnej stronie kolcolawa. Następnie usuńcie szkielet skrzelowy, chwytając za podstawę przewodu pokarmowego i pociągając go w kierunku przednim.Oddziel przewód pokarmowy, wykonując cięcie prostopadłe za piątym łukiem skrzelowym (ceratobranchialem). Częstym błędem jest chwycenie przewodu pokarmowego zbyt przednio, co powoduje pozostawienie przedniego odcinka przewodu brzusznego zbyt daleko z tyłu. Należy upewnić się, że chwyt następuje głęboko w tylnej części jamy klatki piersiowej; nadmiar przewodu pokarmowego zawsze można usunąć później.Po usunięciu wszelkich pozostałych fragmentów kości z puszki mózgowej po stronie grzbietowej szkieletu skrzelowego, wprowadź nożyczki do koszyka skrzelowego i wykonaj cięcie grzbietowe pomiędzy obustronnymi zestawami płyt zębowych grzbietowych. Prowadź cięcie centralnie, aby uniknąć uszkodzenia płyt zębowych grzbietowych.Następnie wykonaj dwa płytkie nacięcia boczne w gumowatym świetle jelita na tylnym końcu szkieletu skrzelowego. Na przednim końcu rurki jelita. Aby ułatwić otwarcie szkieletu skrzelowego.Następnie przenieś szkielet do probówki do mikrowirówki wypełnionej 50% glicerolem i 0,25% wodorotlenkiem potasu w celu łagodnego przejaśniania. Alternatywnie, jeśli dalsze przejaśnianie nie jest wymagane, przenieś go do czystego glicerolu. W przypadku konieczności ponownego barwienia, szczegółowe informacje znajdują się w protokole tekstowym.Aby przygotować próbkę do montowania, należy wymienić roztwór na czysty glicerol i potrząsać probówką przez co najmniej pięć minut. Następnie należy wyjąć szkielet skrzelowy i umieścić go w pobliżu dolnej krawędzi szklanego szkiełka podstawowego o wymiarach 22 by 60 milimetrów stroną grzbietową do góry. Następnie należy nanieść kilka kropli glicerolu na szkielet.Następnie uformuj dwie małe kulki z plasteliny i umieść jedną na każdym z końców szkiełka nakrywkowe; będą one pełnić funkcję dystansów. Następnie luźno połóż drugie szkiełko nakrywkowe na preparacie, wywierając nacisk wystarczający do spłaszczenia przedniej części szkieletu skrzelowego. Teraz odchyl lewą klapkę grzbietową, w tym grzbietowe płytki zębne, i wsuń klapkę pomiędzy szkiełka nakrywkowe.Następnie wykonaj tę samą czynność z prawym płatem grzbietowym. Odsuń cały szkielet skrzelowy od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Aby zakończyć procedurę, lekko naciśnij górne szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć kulki z gliny.Wystarczy tyle, aby szkielet skrzelowy pozostał rozłożony płasko, ale nie na tyle dużo, by został zmiażdżony. Jeśli w trakcie procesu rząd grabików zostanie przesłonięty, należy wsunąć pęsetę między szkiełka podstawowe i ponownie ustawić ceratobranchial lub cały preparat.Po zamontowaniu na płasko w czystym glicerynie, preparat może być przechowywany w pozycji poziomej w temperaturie pokojowej przez co najmniej dekadę. Protokół ten pozwala na uzyskanie wypreparowanego i zamontowanego na płasko szkieletu skrzelowego, co umożliwia chronifikację szeregu ważnych cech troficznych.W widoku grzbietowym wszystkie rzędy sit żebrowych, wszystkie płytki zębowe gardłowe oraz niemal wszystkie kości skrzelowe można łatwo zwizualizować i poddać chronifikacji. Alizaryna czerwona S fluoreskuje również przy użyciu filtra rhodaminowego lub podobnego filtra czerwonego, co umożliwia podwójne znakowanie innymi markerami oraz stosowanie alternatywnych metod wizualizacji. Na tym obrazie sit żebrowe zostały oznaczone znakami caret.Zęby zaznaczono grotami strzałek, a kości gwiazdkami. Po opanowaniu techniki, sekcja może zostać przeprowadzona w ciągu kilku minut i wykonana na setkach zwierząt w stosunkowo krótkim czasie. Chociaż zaprezentowaliśmy sekcję szkieletu skrzelowego kolcolawa, mamy nadzieję, że procedura ta posłuży jako wskazówka dla wielu gatunków ryb.Poprzez wypreparowanie szkieletu skrzelowego możemy szybko i łatwo zwizualizować szereg ważnych cech troficznych, niewidocznych w preparatach całych organizmów. Pozwala to na lepsze zrozumienie rozwoju i ewolucji szkieletu czaszkowo-twarzowego.

dissection-flat-mounting-threespine-stickleback-branchial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja pojedynczych komórek w gęsto upakowanych tkankach, takich jak terminalne komórki Schwanna (SCs) w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jest trudna. „Sekwencyjne fotoblaknięcie” pozwala na wyodrębnienie pojedynczych terminalnych SCs, na przykład w eksplantacie mięśnia triangularis sterni — wygodnej preparacji nerwowo-mięśniowej, w której sekwencyjne blaknięcie można połączyć z obrazowaniem poklatkowym i post-hoc immunobarwieniem.

Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

Ten film opisuje technikę izolowania serca od danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju w celu zbadania rozwoju, dojrzewania i starzenia się serca.

Sekcja serca: metoda obserwacji rozwoju serca danio pręgowanego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

Ten artykuł przedstawia metody używane do badania przestrzennie skorelowanych właściwości chemicznych, strukturalnych i mechanicznych wielowarstwowej skali szpatułki Atractosteus (A. szpatułka) za pomocą nanowgłębienia, spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i rentgenowskiej tomografii komputerowej (X-ray CT). Wyniki eksperymentów wykorzystano do zbadania zasad projektowania ochronnych materiałów biologicznych.

Charakterystyka wielowarstwowych łusek ryb (szpatułka Atractosteus) za pomocą nanoindentacji, rentgenowskiej tomografii komputerowej, FTIR i SEM

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Analiza metodą elementów skończonych jest często używanym narzędziem do badania właściwości mechanicznych konstrukcji pod obciążeniem. Tutaj zastosujemy jego zastosowanie do modelowania biomechaniki szczęki danio pręgowanego.

Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół 3-D hodowli tkankowej tylnej osi ciała danio pręgowanego, umożliwiający badanie segmentacji kręgowców na żywo. Ten model eksplantatu zapewnia kontrolę nad wydłużaniem osi, zmianą źródeł morfogenu i obrazowaniem na żywo na poziomie tkankowym w rozdzielczości subkomórkowej.

Trójwymiarowa hodowla eksplantatów ogonowych w celu zbadania segmentacji kręgowców u danio pręgowanego

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Naucz się rozwarstwiania i płaskiego ułożenia szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego. Ta metoda pozwala wizualizować cechy troficzne niewidoczne w preparatach całych okazów, wspierając badania z zakresu biologii rozwoju i ewolucji.

Rozwarstwienie i płaskie ułożenie szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego

Przeglądaj więcej filmów