Name: Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny tworzenia rurek śródbłonkowych przy użyciu macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy z czynnikiem wzrostu. Technika ta pozwala badać angiogenezę i rozwój nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została sfinansowana przez Fundusz Badań Medycznych i Edukacji, Wayne State University, Detroit, MI.

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Wysiew 3x105 komórek HUVEC w 10 ml kompletnej pożywki10 w kolbie o średnicy 75 cm.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w konfluencji od 5% CO2 do 70-80%.</li>
</ol>
2. Test tworzenia kanalików
<ol>
	<li>Rozmrozić macierz zewnątrzkomórkową o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) lub normalną macierz zewnątrzkomórkową przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Dla zwięzłości termin "macierz zewnątrzkomórkowa" będzie odtąd używany w odniesieniu zarówno do GFR, jak i normalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Proces ich przygotowania jest identyczny.</li>
	<li>Trzymaj 96-dołkowe płytki hodowlane na lodzie i dodaj 50 μl schłodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej do dołka za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek. Przygotuj trzy egzemplarze 5 studzienek zawierających tylko normalną macierz zewnątrzkomórkową. Przygotuj kolejną potrójną porcję 5 studzienek zawierających tylko macierz zewnątrzkomórkową GFR.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj HUVEC raz roztworem buforowanym fosforanem bez wapnia i magnezu (PBS) i dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 1-5 minut, sprawdzając komórki co minutę, aż większość komórek się zaokrągli. Usuń komórki, stukając raz w kolbę.
	<ol>
		<li>Dodać 5 ml pożywki podstawowej (tj. pożywki do wzrostu komórek śródbłonka bez dodatku czegokolwiek (np. suplementów)) z 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Zebrać komórki w kolbie przez pipetowanie i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy sile 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić za pomocą 2 ml podłoża podstawowego, policzyć komórki za pomocą hemocytometru i dostosować stężenie komórek do 2-3 x 105 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 100 μl następujących 10-krotnych stężeń inhibitora CXCR2 SB225002 w podłożu podstawowym: 11 μM, 5,6 μM, 1,1 μM, 0,56 μM i 0 μM (kontrola).</li>
	<li>Odpipetować 300 μl zawiesiny HUVEC do każdych 5 probówek do mikrowirówki. Dodać 33 μl stężeń inhibitora (11 μM, 5,6 μM, 1,1 μM, 0,56 μM i 0 μM) do jednej probówki zawierającej HUVEC i odwirować.</li>
	<li>Pobrać pipetą 50 μl każdej z zawiesin komórek (1-1,5 x 104 komórek) do poszczególnych studzienek macierzy zewnątrzkomórkowej. Każdą zawiesinę rozłożyć na trzy płytki i inkubować przez 4-16 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Po 4-16 godzinach zrób 4 zdjęcia probówek uformowanych na studzienkę za pomocą odwróconej kamery mikroskopowej11 (oryginalne powiększenie x 100).</li>
</ol>
3. Test rozerwania kanalików
<ol>
	<li>Przygotować macierz zewnątrzkomórkową i płytki zgodnie z tymi samymi specyfikacjami, co test tworzenia probówek (kroki 2.1 do 2.3).</li>
	<li>Przygotować zawiesinę HUVEC zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.4.2 testu tworzenia probówek i podwielokrotnić do 96-dołkowej płytki zawierającej macierz zewnątrzkomórkową w ilości 50 μl na basenik. 
	Uwaga: Płytkować wystarczająco dużo dołków, aby były 3 dołki na leczenie farmakologiczne.</li>
	<li>Hoduj komórki na macierzy zewnątrzkomórkowej przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zrób zdjęcia przed rozpoczęciem leczenia odwykowego.</li>
	<li>Przygotować 2x stężenia inhibitora CXCR2 SB225002 zgodnie z opisem w kroku 2.5 testu tworzenia probówek i dodać 50 μl każdego stężenia na studzienkę z 96-dołkowej płytki zawierającej HUVEC. Każdą koncentrację należy podać w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez kolejne 2-12 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wykonaj 4 zdjęcia probówek uformowanych w każdej studzience za pomocą odwróconej kamery mikroskopowej (oryginalne powiększenie × 100) 11.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja danych
<ol>
	<li>Oceń formowanie się probówek uchwycone na obrazach, mierząc całkowitą długość probówek w czterech losowych polach mikroskopowych za pomocą oprogramowania kamery mikroskopowej.</li>
	<li>Otwórz obraz w oprogramowaniu kamery mikroskopowej i kliknij "Adnotacje i pomiary". W sekcji "długość" wybierz narzędzie "prosta linia". Kliknij na obrazek, a następnie narysuj linię wzdłuż rury, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy. 
	Uwaga: Oprogramowanie automatycznie obliczy długość linii w pikselach i umieści dane w pliku.</li>
	<li>Powtórz procedurę dla wszystkich linii rur na obrazie, wybierając narzędzie "prosta linia". Kliknij na obrazek, a następnie narysuj linię wzdłuż rury, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy. 
	Uwaga: Oprogramowanie zarejestruje długość każdej linii i wyświetli dane na ekranie.</li>
	<li>Po zmierzeniu każdej rurki na zdjęciu kliknij "Eksportuj", a następnie wybierz "Długość do arkusza kalkulacyjnego". 
	Uwaga: Dane dotyczące długości zostaną wyeksportowane do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Dodaj wszystkie długości rur z arkusza kalkulacyjnego, aby uzyskać całkowitą długość rury. Oblicz i zapisz średnią długość rur. 
	Uwaga: Zalecane są cztery powtórzenia z wyznaczoną średnią i odchyleniem standardowym.</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie komórek z hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej
<ol>
	<li>Hodowla i przeprowadzenie testu tworzenia probówek (patrz sekcja 2) na większą skalę, ponieważ płytka 96-dołkowa nie zapewni wystarczającej liczby komórek. W przypadku płytek 12-dołkowych należy użyć 500 μl macierzy zewnątrzkomórkowej i 500 μl zawiesiny komórkowej HUVEC (1,5x105 komórek).</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 4-16 godzin, aby uformować probówki. Następnie odessać pożywkę do hodowli komórkowej. Wypłucz komórki 1 ml zimnego 1x PBS bez wapnia i magnezu.</li>
	<li>Dodać 1 ml lodowatego buforu PBS-2,5 mM EDTA do kultury i trzymać na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć komórki i mieszaninę macierzy zewnątrzkomórkowej z naczynia za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl z odciętą końcówką, a następnie przenieść do zimnej probówki o pojemności 15 ml, przemyć studzienkę 4 ml lodowatego PBS-2,5 mM EDTA i włożyć do probówki.</li>
	<li>Umieść probówki na lodzie na 1-4 godziny i odwróć probówkę kilka razy, aż cała macierz zewnątrzkomórkowa się rozpuści.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 1 620 x g w temperaturze 0 °C</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulki komórek z 1 ml zimnego PBS w 1.ml probówce na lodzie.</li>
	<li>Ponownie odwirować przez 5 minut przy 3 000 x g w temperaturze 0 °C, a następnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CXCR2+enhances+chemotherapeutic+response%2C+inhibits+mammary+tumor+growth%2C+angiogenesis%2C+and+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis.</a> Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-2+pericytes+participate+in+normal+and+tumoral+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).</li>
<li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li>
<li>Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptor-1+as+a+novel+target+for+the+antiangiogenic+treatment+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer.</a> PLoS One. 9 (3), 88830(2014).</li>
<li>Gu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Apurinic%2FApyrimidinic+Endonuclease+siRNA+Inhibits+the+Angiogenesis+Induced+by+X-Ray+Irradiation+in+Lung+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).</li>
<li>Manjunathan, R., Ragunathan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+chorioallantoic+membrane+as+a+reliable+model+to+evaluate+osteosarcoma-an+experimental+approach+using+SaOS2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line.</a> Biol Proced Online. 17, 10(2015).</li>
<li>Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphodiesterase+inhibitor%2C+pentoxifylline+enhances+anticancer+activity+of+histone+deacetylase+inhibitor%2C+MS-275+in+human+breast+cancer+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo.</a> Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+improves+the+anti-angiogenic+activity+of+disulfiram+through+the+EGFR%2Fsrc%2FVEGF+pathway+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett.+Aug%22%5BJournal%5D)">Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas.</a> Cancer Lett. Aug. , (2015).</li>
<li>Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+offer+new+insights+into+the+relationship+between+lipid+metabolism+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis.</a> Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).</li>
<li>Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf">http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf</a> (2015).</li>
<li>The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf">http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf</a> (2008).</li>
<li>de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+PCR+for+retrovirus-like+particle+quantification+in+CHO+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture.</a> Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).</li>
<li>50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/">http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/</a> (2015).</li>
<li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+endothelial+cells+for+derived+from+umbililcal+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podczas przeprowadzania tego testu ważne jest, aby macierz zewnątrzkomórkowa była zawsze utrzymywana na lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że określono inaczej. Jeśli macierz zewnątrzkomórkowa ogrzeje się powyżej 4 °C, ulegnie polimeryzacji, a test zostanie zrujnowany. Ważne jest również, aby upewnić się, że wszystko, co ma kontakt (np. końcówki pipet, płytka) z macierzą zewnątrzkomórkową, jest wstępnie schłodzone z wyżej wymienionego powodu. Liczba komórek wysianych w każdym dołku jest krytyczna, zbyt mała liczba komórek nie da oczekiwanej wstęgi w próbce kontrolnej, zbyt wiele komórek utworzy duże skupiska komórek lub monowarstwę, a test nie będzie ważny. Innym ważnym czynnikiem decydującym o powodzeniu tego testu jest liczba pasaży komórkowych HUVEC. Liczba przejścia powinna być zawsze mniejsza niż dziesięć, w przeciwnym razie może nie dojść do solidnego tworzenia się rurki. Ponadto należy upewnić się, że używana pożywka do hodowli komórkowych nie straciła ważności, w przeciwnym razie komórki nie będą zdolne do życia. Alternatywnie można podzielić pożywkę i jej składniki na porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C w celu zachowania przez pewien czas po upływie daty ważności. Oczywiście nadal lepiej jest użyć nośnika przed upływem daty ważności
Podobnie jak w przypadku wszystkich procedur, istnieją pewne wady przeprowadzania testu tworzenia komórek śródbłonka. Jednym z głównych problemów jest to, że ponieważ istnieją różne typy komórek śródbłonka i matryc podporowych, wyniki testu mogą się znacznie różnić w zależności od tego, jaki typ komórki i macierzy jest używany. Stosowane komórki śródbłonka (HUVEC, HAEC lub HMVEC) są komórkami pierwotnymi, są kosztowne w uzyskaniu i mają zmienność w porównaniu z komórkami unieśmiertelnionymi. Komórki pierwotne mają ograniczone pasaże do wykorzystania i dlatego nie nadają się do długoterminowych eksperymentów angiogenezy14. Aby uzyskać wiarygodne dane, należy zawsze używać tych samych typów do testu. Podobnie jak w przypadku innych testów in vitro , wyniki testu tworzenia probówki powinny być potwierdzone in vivo, ponieważ wyniki z kontrolowanych i sztucznych warunków dwuwymiarowej hodowli tkankowej nie zawsze muszą być odzwierciedlone w złożonym biosystemie żywego organizmu. Ważne jest również, aby pamiętać, że ten rodzaj testu może być używany tylko do wykazania tworzenia rurki komórek śródbłonka i nie powinien być używany do testowania innych, nieśródbłonkowych komórek tworzących rurki.
Test ten jest dość prostą i szybką metodą ilościowego określenia potencjału angiogennego związku. Stanowi również platformę do dalszych eksperymentów, ponieważ sama w sobie nie dostarcza informacji na temat konkretnego mechanizmu, za pomocą którego związek faktycznie wpływa na proces tworzenia się naczyń. Jednak wykorzystanie różnych macierzy zewnątrzkomórkowych jest przykładem tego, jak dalej tworzyć ramy dla pytań badawczych, które nie są powszechnie stosowane. Istnieją podejścia do badania specyficznych mechanizmów biochemicznych związku, w tym specyficznych inhibitorów, które celują w składniki szlaku angiogenezy. Innym podejściem może być ekstrakcja RNA z komórek śródbłonka i użycie RT-PCR (Real Time PCR)12 do analizy zmian w ekspresji genów, które mogą powodować zachowanie wzrostu obserwowane w teście. Przyszłe zastosowania tej metody obejmują transfekowane HUVEC w celu stworzenia testów knock-down dla określonych etapów szlaku angiogenezy. Istnieje potencjał zastosowania tego podejścia do badania szlaku limfangiogenezy. Zmieniając składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, można dokładniej wyjaśnić interakcję macierzy i procesu komórkowego wspierającego angiogenezę w raku. Ekstrakcja RNA i białek z komórek śródbłonka w tych specyficznych warunkach dostarcza dodatkowych danych wymiernych odpowiadających danym obrazowym.

Aby uzyskać składniki odżywcze niezbędne do przeżycia, nowotwory złośliwe wymagają dostępu do krwiobiegu pacjenta. Aby uzyskać ten dostęp, komórki nowotworowe uwalniają sygnały chemiczne, które stymulują wzrost nowych naczyń krwionośnych guza, przejmując w ten sposób normalny proces fizjologiczny znany jako angiogeneza2. To również przez naczynia krwionośne utworzone w procesie angiogenezy może dojść do przerzutów (tj. rozprzestrzenienia się raka na inne narządy). Ponieważ proces angiogenezy jest tak istotny dla progresji tak szerokiej gamy nowotworów, jest on atrakcyjnym celem w badaniach nad terapią przeciwnowotworową3.
Jedną z metod używanych do ilościowego określenia angiogenezy jest zmierzenie zdolności komórki progenitorowej śródbłonka do tworzenia rurek po umieszczeniu na macierzy zewnątrzkomórkowej. Ponieważ tworzenie tych rurek jest krytycznym wczesnym krokiem w angiogenezie, testowanie warunków środowiskowych (np. obecności lub braku danego związku), które mogą stymulować lub hamować tworzenie się jajowodów, zapewnia wgląd w konkretne etapy, które można ukierunkować na zahamowanie angiogenezy. Test tworzenia cewek śródbłonkowych jest jedną znajczęściej stosowanych 4 metod in vitro, która mierzy zdolność komórek do tworzenia rurek. Jest to prosty test, wymagający stosunkowo niewielu składników i krótkiego okresu hodowli5. Być może najważniejsze jest jednak to, że dane uzyskane z tego typu testów są wymierne.
Przykładem użycia testu tworzenia probówek jest porównanie rozwoju rurek z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych wyhodowanych na macierzy zewnątrzkomórkowej z macierzą zewnątrzkomórkową o obniżonym czynniku wzrostu (GFR). Macierz zewnątrzkomórkowa jest materiałem przypominającym błonę podstawną wyizolowanym z komórek mięsaka, a jej głównymi składnikami są laminina, kolagen typu IV, czynniki wzrostu i proteoglikany. Niektóre związki mają różny wpływ na zdolność komórki do tworzenia rurek w środowisku o obniżonych czynnikach wzrostu i obniżonej zawartości proteoglikanów siarczanu heparanu (HSPG). HSPG są składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest znacznie zmniejszona w macierzy zewnątrzkomórkowej GFR. Na przykład, jeśli hipoteza jest taka, że inhibitory angiogenezy, takie jak SB225002, która blokuje receptor CXCR2, mają znacznie słabszą zdolność do przerywania tworzenia rurek, gdy HSPG są obfite, to porównanie aktywności tworzenia rurki w macierzy zewnątrzkomórkowej i macierzy zewnątrzkomórkowej GFR jest ważne dla zbadania możliwości hamowania angiogenezy poprzez kontrolę HSPG.
Inne testy, które są powszechnie używane do określania wpływu związków na angiogenezę, to metody in vivo. Godnymi uwagi przykładami są test błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM)piskląt 6 z użyciem jaj kurzych oraz test angiogenezy in vivo czopa Matrigel7 z udziałem myszy. Chociaż metody in vivo mierzą angiogenezę w trzech wymiarach i są bardziej reprezentatywne dla organizmu ludzkiego w porównaniu z testem tworzenia probówek in vitro, mają wadę polegającą na tym, że wymagają znacznie więcej czasu i są znacznie trudniejsze do wykonania. Zarówno test CAM, jak i test czopa zewnątrzkomórkowego zajmują co najmniej tydzień8, podczas gdy dla porównania, test tworzenia probówek można wykonać w ciągu jednego dnia i nie wymaga użycia na zwierzętach.
Ważne jest, aby zauważyć, że komórki śródbłonka użyte w tym raporcie to ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Komórki te odgrywają kluczową rolę w kiełkowaniu naczyń krwionośnych i wzroście naczyń krwionośnych i są wystarczająco analogiczne do komórek śródbłonka w nowotworach, aby można je było wykorzystać do oceny aktywności antyangiogenezy zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo 9. Można również wykorzystać inne komórki, takie jak pierwotne komórki śródbłonka mikronaczyniowego.
Ważne jest również, aby zauważyć, że oprócz niższych poziomów HSPG, matryca zewnątrzkomórkowa GFR ma również obniżony poziom wielu składników w porównaniu do normalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Obejmuje to między innymi: EGF, IGF-1, PDGF i TGF-beta. Osoby wykonujące eksperymenty badające znaczenie tych związków w odniesieniu do angiogenezy mogą być zainteresowane wykorzystaniem macierzy zewnątrzkomórkowej GFR.

<table><tbody><tr><td>Kompletna pożywka wzrostowa EGM-2 (zestaw pocisków EGM-2 CC-3162 )</td> <td>Fisher</td><td>NC9525043</td><td>HUVEC kompletna pożywka wzrostowa: pożywka bazowa EGM-2 zmieszana z BBE (ekstraktem z mózgu bydlęcego), hEGF (ludzkim naskórkowym czynnikiem wzrostu), hydrokortyzonem, GA-1000 (gentamycyna, amfoterycyna-B), 2% FBS (płodowa surowica bydlęca), VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego), hFGF-&beta; (ludzki czynnik wzrostu fibroblastów beta), R3-IGF-1 (długi insulinopodobny czynnik wzrostu R jeden), kwas askorbinowy i heparyna. Podwielokrotnić pożywkę i jej składniki i przechowywać je w temperaturze -20&nbsp; &deg; C, ciepły w 37&nbsp; &deg; C przed użyciem.</td></tr><tr><td>MATRIGEL MATRIX 10ML Obniżony współczynnik wzrostu (GFR); 10&nbsp; Ml; Wolna od LDEV</td><td>macierz</td> zewnątrzkomórkowa <td>Fisher CB-40230</td><td>o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR), przechowywać w -20&nbsp; &deg; C, ciepły w 4&nbsp; &deg; C przed użyciem.</td></tr><tr><td>MATRIGEL MATRIX 10ML; 10&nbsp; Ml; Macierz</td> zewnątrzkomórkowa <td>Fisher</td><td>CB-40234</td> bez LDEV<td>, przechowywać w -20&nbsp; &deg; C, ciepły w 4&nbsp; &deg; C przed użyciem.</td></tr><tr><td>SB225002</td><td>Fisher</td><td>559405</td><td>inhibitora CXCR2, przechowywać w temperaturze -20&nbsp; &deg; C, podgrzać w temperaturze pokojowej przed użyciem.</td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)&nbsp;</td><td>Laboratoria Badawcze ScienCell&nbsp;</td><td>8000</td><td>kultura to zgodnie z odniesieniem&nbsp; 10.</td></tr> <tr><td>Trypsyna 0,05%-EDTA fenol czerwony</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>przechowywać w 4&nbsp; &deg; C, ciepły w 37&nbsp; &deg; C przed użyciem.</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti</td><td>Odwrócony mikroskop badawczy</td> <td>firmy Nikon</td><td></td>.&nbsp;</tr><tr><td>NIS-Elements AR 4.20.02 64-bitowy</td> mikroskop badawczy <td>Nikon</td><td></td><td>Oprogramowanie do odwróconego mikroskopu badawczego</td></tr><tr><td>Graph-pad Prism 5</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>naukowe oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk 2D, do obliczania IC50.</td></tr></tbody></table>

strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Nowotwory złośliwe wymagają dopływu krwi, aby przetrwać i rozprzestrzeniać się. Guzy te uzyskują potrzebną krew z krwiobiegu pacjenta, przejmując proces angiogenezy, w którym z istniejących naczyń krwionośnych powstają nowe naczynia krwionośne. Receptor CXCR2 (receptor chemokiny (motyw C-X-C) 2) jest transbłonową cząsteczką połączoną z białkiem G występującą w wielu komórkach, która jest ściśle związana z angiogenezą1. Specyficzna blokada receptora CXCR2 hamuje angiogenezę, co mierzy się za pomocą kilku testów, takich jak test tworzenia rurki śródbłonkowej. Test tworzenia rurki jest przydatny do badania angiogenezy, ponieważ jest to doskonała metoda badania wpływu, jaki dany związek lub warunki środowiskowe mogą mieć na angiogenezę. Jest to prosty i szybki test in vitro, który generuje wymierne dane i wymaga stosunkowo niewielu składników. W przeciwieństwie do testów in vivo, nie wymaga udziału zwierząt i można je przeprowadzić w czasie krótszym niż dwa dni. Protokół ten opisuje odmianę macierzy zewnątrzkomórkowej wspomagającej test tworzenia rurki śródbłonka, który testuje receptor CXCR2.

Na obrazach mikroskopowych można łatwo odróżnić znaczące, prawidłowe tworzenie sieci cewek śródbłonkowych od tworzenia zahamowanego. Prawidłowe tworzenie cewek objawia się jako zorganizowana sieć struktur przypominających kapilary (Rysunek 1). W przeciwieństwie do tego, zahamowane tworzenie cewek przejawia się pod postacią rozproszonych komórek (Rysunek 2). Dane z testu tworzenia cewek są kwantyfikowane poprzez pomiar całkowitej długości cewek kapilarnych (Tabela 1). Oprócz całkowitej długości cewek można zmierzyć średnią długość cewki, całkowitą liczbę cewek lub całkowitą liczbę punktów rozgałęzień. Ustrukturyzowane tworzenie cewek daje większą całkowitą długość sieci niż rozproszony, zahamowany wzrost cewek. Na Rysunku 3 krzywa zależności dawka-odpowiedź umożliwia obliczenie IC50 w warunkach eksperymentalnych z wykorzystaniem HUVECs na macierzy zewnątrzkomórkowej GFR i inhibitora CXCR2 SB225002.
<img alt="Rycina 1" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig1.jpg" /> 
Rycina 1. Tworzenie cewek śródbłonkowych na macierzy zewnątrzkomórkowej oraz na macierzy zewnątrzkomórkowej z ograniczoną zawartością czynników wzrostu (GFR). Dwa obrazy przedstawiają prawidłowe tworzenie cewek na macierzy zewnątrzkomórkowej (A) oraz na macierzy zewnątrzkomórkowej GFR (B). Połączona sieć cewek wyraźnie wskazuje, że wzrost cewek w tych komórkach HUVEC przebiega prawidłowo. Pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> 
Rysunek 2. Hamowanie tworzenia naczyń na macierzy zewnątrzkomórkowej oraz macierzy zredukowanej pod względem czynników wzrostu (GFR) przez inhibitor CXCR2 SB225002 (5,6 µM). Dwa obrazy przedstawiają tworzenie naczyń, które zostało zahamowane przez inhibitor CXCR2 SB225002 (5,6 µM) na macierzy zewnątrzkomórkowej (A) oraz macierzy zewnątrzkomórkowej GFR (B). Widoczne na obrazach izolowane skupiska komórek HUVEC wskazują, że komórki nie były w stanie utworzyć rurek niezbędnych do połączenia ze sobą. Pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> 
Rysunek 3. Krzywa zależności dawka-odpowiedź na macierzy zewnątrzkomórkowej o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (GFR). Oś X przedstawia długość rurek, a oś Y stężenie inhibitora CXCR2. Krzywa zależności odpowiedzi od dawki wykazuje, że odpowiedź komórek HUVEC na inhibitor CXCR2 na macierzy zewnątrzkomórkowej GFR jest zależna od dawki. IC50 (półmaksymalna stężenie hamujące) obliczono przy użyciu oprogramowania13 i można je porównać na przykład z krzywą zależności odpowiedzi od dawki dla macierzy pozakomórkowej. IC50 jest to stężenie inhibitora, które zmniejsza odpowiedź do 50%. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>macierz zewnątrzkomórkowa o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (GFR)&#160; i inhibitor (po 4 powtórzeniach dla każdej próbki)</td>
			<td>Średnia całkowita długość rurki (piksele) (1 piksel=0.34 &#181;m)</td>
			<td>Odchylenie standardowe</td>
			<td>&#160;P Wartość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola macierzy zewnątrzkomórkowej GFR</td>
			<td>2447</td>
			<td>168.174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macierz zewnątrzkomórkowa GFR + 0.56 &#181;M SB225002</td>
			<td>1422.5</td>
			<td>185.4218</td>
			<td>0.000395</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macierz zewnątrzkomórkowa GFR + 1.1 &#181;M SB225002</td>
			<td>1004</td>
			<td>126.1784</td>
			<td>2,14 x 10-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macierz zewnątrzkomórkowa GFR + 5.6 &#181;M SB225002</td>
			<td>519.25</td>
			<td>129.6368</td>
			<td>4,19 x 10-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macierz pozakomórkowa GFR + 11 &#181;M SB225002</td>
			<td>393.75</td>
			<td>212.6857</td>
			<td>1,21 x 10-5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Ilościowe oznaczenie całkowitej długości cewek na macierzy zewnątrzkomórkowej z obniżoną zawartością czynników wzrostu (GFR) w różnych warunkach.Fragment tabeli zawierającej całkowite długości cewek zarejestrowane w próbkach hodowanych na macierzy zewnątrzkomórkowej GFR z zastosowaniem różnych stężeń inhibitora CXCR2. Dane wskazują, że inhibitor CXCR2 hamuje tworzenie cewek. Uwzględniono wartości powiązane, takie jak średnia z czterech powtórzeń, odchylenie standardowe oraz wartość P . Pomiary wykonano w pikselach, aby przedstawić dane eksportowane. Wartość IC50 można obliczyć za pomocą oprogramowania statystycznego13. (1 pixel = 0,34 µm)

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ilościowe określenie zależności tworzenia rurek przez komórki śródbłonka od chemokin angiogennych przy użyciu dwóch różnych macierzy zewnątrzkomórkowych zawierających składniki wiążące różnorodne cząsteczki angiogenne. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny angiogenezy nowotworowej, takie jak: dlaczego angiogeneza jest wspierana przez alternatywne szlaki przy wykorzystaniu zmian w macierzy zewnątrzkomórkowej? Głównymi zaletami tej techniki są możliwość ilościowego pomiaru oraz zastosowanie mniejszej liczby zmiennych.Procedurę zaprezentuje pani Donghong Ju, adiunkt w laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić macierz zewnątrzkomórkową GFR lub normalną macierz zewnątrzkomórkową przez noc w temperaturze 4 °C. Płytkę hodowlaną z 96 dołkami przechowywać w lodzie, a następnie do każdego dołka dodać 50 µL schłodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej, używając wcześniej schłodzonych końcówek do pipet.Przygotuj pięć studzienek w trzech powtórzeniach zawierających wyłącznie normalną macierz zewnątrzkomórkową, a następnie pięć studzienek w trzech powtórzeniach zawierających wyłącznie macierz zewnątrzkomórkową GFR. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po 30 minutach wypłucz HUVEC raz za pomocą PBS bez wapnia i magnezu, a następnie dodaj 1 mL 0,5% Trypsyny EDTA.Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C od jednej do pięciu minut, sprawdzając je co minutę, aż większość komórek przybierze okrągły kształt. Następnie oddziel komórki, stukając w kolbę. Po tym dodaj do kolby 5 mL pożywki podstawowej z 1% FBS.Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml. Następnie odwiruj komórki przy 200 ×g przez pięć minut. Po pięciu minutach odlej supernatant i ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach pożywki podstawowej.Policz komórki za pomocą cytometru hemocytometrycznego i dostosuj ich stężenie do wartości od 2 do 3 × 10⁵ komórek na mililitr. Następnie przygotuj 100 µL pięciu różnych stężeń 10X inhibitora CXCR2 w medium podstawowym. Pipetuj 300 µL zawiesiny HUVEC do każdej z pięciu oddzielnych probówek do mikrocentryfugi.Następnie do probówek zawierających HUVEC należy dodać 33 µL inhibitora 10X każdego z użytych stężeń i wymieszać je w wirówce wortexowej. Następnie do poszczególnych studzienek macierzy zewnątrzkomórkowej należy pipetą przenieść 50 µL każdej z zawiesin komórkowych. Każdą zawiesinę należy wysiać w trzech powtórzeniach i inkubować od 4 do 16 godzin w temperaturze 37 °C.Następnie należy wykonać cztery zdjęcia z każdej studzienki za pomocą kamery mikroskopu odwróconego. W tej procedurze macierz zewnątrzkomórkową oraz płytki należy przygotować zgodnie z tymi samymi specyfikacjami, co w teście tworzenia cewek. Następnie należy przygotować zawiesinę HUVEC i przelać ją do płytki 96-dołkowej zawierającej macierz zewnątrzkomórkową w ilości 50 µL na studzienkę.Następnie hoduj komórki na macierzy pozakomórkowej przez cztery godziny w temperaturze 37 °C. Następnie wykonaj zdjęcia przed rozpoczęciem leczenia lekiem. W dalszej kolejności przygotuj pięć różnych dwukrotnych stężeń inhibitora CXCR2 w podłożu podstawowym.Do każdej z 96 studni zawierających HUVEC dodaj 50 µL inhibitora CXCR2 o każdym z określonych stężeń. Następnie inkubuj płytkę przez kolejne dwie do 12 godzin w temperaturze 37 °C. Po tym czasie wykonaj cztery zdjęcia każdej studni za pomocą kamery mikroskopu odwróconego.Aby ocenić tworzenie rurek zarejestrowane na obrazach, zmierz całkowitą długość rurek w czterech losowych polach mikroskopowych, korzystając z oprogramowania kamery mikroskopu. W tym celu otwórz obraz w oprogramowaniu kamery mikroskopu i kliknij Annotations and Measurements. W sekcji Length wybierz narzędzie prostej linii.Kliknij obraz, następnie narysuj linię wzdłuż długości probówki, a potem kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wykonać obliczenia. Następnie powtórz tę procedurę dla wszystkich linii probówek na obrazie, wybierając narzędzie prostej linii. Kliknij obraz, narysuj linię wzdłuż długości probówki, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy.Oprogramowanie zarejestruje długość każdej linii i wyświetli dane na ekranie. Po zmierzeniu wszystkich probówek na zdjęciu kliknij Eksportuj, a następnie wybierz Eksportuj długość do arkusza, aby przenieść dane o długości do arkusza kalkulacyjnego. Zsumuj wszystkie długości probówek z arkusza, aby otrzymać całkowitą długość probówek.Następnie obliczyć i zapisać średnią długość rurek. W tej procedurze należy hodować komórki i przeprowadzić test tworzenia rurek w płytce 12-dołkowej. Inkubować komórki od 4 do 16 godzin, aby umożliwić utworzenie rurek.Następnie odessaj pożywkę hodowlaną i wypłucz komórki jednym mililitrem zimnego 1XPBS bez wapnia i magnezu. Po tym dodaj do hodowli jeden mililitr lodowatego buforu PBS z 2,5 milimol EDTA i pozostaw na lodzie na 10 minut. Po 10 minutach oddziel mieszaninę komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej z naczynia, używając końcówki pipety o pojemności 1 000 µL z odciętym wierzchołkiem.Następnie przenieś komórki do schłodzonej probówki o pojemności 15 ml. Przemyj dołek czterema mililitrami lodowatego PBS i przelej zawartość do tej samej probówki. Następnie umieść probówkę w lodzie na okres od jednej do czterech godzin i kilka razy ją odwróć, aż macierz zewnątrzkomórkowa zostanie rozpuszczona.Następnie wiruj próbkę przez 10 minut w temperaturze 0 °C. Potem zawieś ponownie osad komórkowy w 1 ml zimnego PBS w probówce 1,5 ml na lodzie. Ponownie wiruj przez pięć minut w temperaturze 0 °C.Następnie usunąć supernatant i przechowywać komórki w temperaturze 80 °C. Te dwa obrazy przedstawiają prawidłowe tworzenie rurek śródbłonka na normalnej macierzy zewnątrzkomórkowej oraz macierzy zewnątrzkomórkowej GFR. Połączona sieć rurek wyraźnie pokazuje, że wzrost rurek w tych komórkach HUVEC przebiega prawidłowo.Te dwa obrazy przedstawiają hamowanie tworzenia cewek przez inhibitor CXCR2, SB225002, w stężeniu 5,6 micromolar na prawidłowej macierzy zewnątrzkomórkowej oraz macierzy zewnątrzkomórkowej GFR. Izolowane skupiska HUVEC widoczne na tym obrazie wskazują, że komórki nie były w stanie utworzyć cewek niezbędnych do połączenia ze sobą. Wykres ten pokazuje, że odpowiedź HUVEC na inhibitor CXCR2 na macierzy zewnątrzkomórkowej GFR jest zależna od dawki.Po przeprowadzeniu procedury, z przygotowanych komórek można wykonać inne analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencjonowanie RNA. W celu scharakteryzowania procesu angiogenezy w warunkach eksperymentalnych, na podstawie obrazów można uzyskać dane takie jak średnia długość rurki, całkowita liczba rurek lub całkowita liczba punktów rozgałęzień.

strategic-endothelial-cell-tube-formation-assay-comparing

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test tworzenia cewek stosuje się do oceny aktywności naczyniowej komórek nowotworowych.

Test tworzenia rurek na Matrigelu do oceny aktywności waskulogennej komórek nowotworowych

Test tworzenia probówek jest szybką, mierzalną metodą pomiaru angiogenezy in vitro. Komórki śródbłonka łączy się z kondycjonowanymi pożywkami i plateruje ekstraktem z błony podstawnej. Tworzenie się rurki następuje w ciągu kilku godzin, a nowo utworzone kanaliki można łatwo określić ilościowo.

Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Opisujemy prosty test biologiczny oparty na komórkach do wykrywania, ilościowego określania i monitorowania aktywności członków rodziny ligandów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Test wykorzystuje receptory chimeryczne ulegające ekspresji w linii komórkowej zależnej od czynnika, aby zapewnić półilościową lub ilościową ocenę wiązania receptora i sieciowania przez ligand.

Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Tutaj oceniamy wpływ ekstraktu wodnego z Ruta graveolens na tworzenie sieci naczyń krwionośnych, używając testu formowania probówek na zżelowanej matrycy podstawowej.

Test tworzenia rurki HUVEC w celu oceny wpływu produktów naturalnych na angiogenezę

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Prezentowany tutaj jest protokół do analizy hybrydyzacji RNA in situ u ryb danio pręgowanych oraz testu tworzenia probówek w indukowanych pluripotencjalnych komórkach śródbłonka pochodzących od pacjenta w celu zbadania roli endoglinu w tworzeniu naczyń krwionośnych.

Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym

Obecny protokół pozwala na odzyskanie struktur przypominających rurki powstałych w klasycznym teście angiogenezy in vitro, gdzie komórki, takie jak komórki trofoblastu, organizują się w struktury podobne do naczyń włosowatych na warstwie zewnątrzkomórkowej macierzy błony podstawnej. Odzyskane struktury są wykorzystywane do izolacji RNA i białek do różnych analiz biochemicznych.

Odzyskiwanie komórek trofoblastu z testu tworzenia rurki angiogenezy do analizy ekspresji markerów różnicowania

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj metodę ilościowej oceny tworzenia rurek śródbłonkowych przy użyciu macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy z czynnikiem wzrostu. Technika ta pozwala badać angiogenezę i rozwój nowotworów.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu (Wideo) | JoVE Journal

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Przeglądaj więcej filmów