Name: Modelowanie dystrofii miotonicznej 1 w komórkach mioblastów C2C12 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metody transfekcji i transdukcji wirusowej w komórkach mioblastów C2C12 do modelowania dystrofii miotonicznej 1. Techniki te umożliwiają badanie mechanizmów patogenezy i potencjalnych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Tomowi Cooperowi z Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevanowi z University of Wisconsin-Madison i Didierowi Trono z Uniwersytetu Genewskiego za odczynniki. Praca ta jest wspierana przez fundusz startowy Uniwersytetu w Houston (YL), grant American Heart Association (YL, 11SDG5260033) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (XP, 81460047).

1. Hodowla komórkowa C2C12
<ol>
	<li>Utrzymuj mysie mioblasty C2C12 na 100 mm płytce w pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco) uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy. Pozwól, aby komórki z pasażem C2C12 stały się w około 50 - 60% zlewne.</li>
	<li>Odrzucić pożywkę wzrostową i przemyć komórki C2C12 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze pokojowej. Usuń PBS i dodaj 500 μl 0,25% trypsyny-EDTA, aby odłączyć komórki. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 3 - 5 minut.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę, dodając 3 ml pożywki wzrostowej. Odpipetuj 6 - 8 razy, aby zawiesić komórki. Dodać 1 ml zawieszonej komórki do nowej płytki o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
2. C2C12 Transfekcja/transdukcja i selekcja komórek
<ol>
	<li>Transfekcja plazmidu C2C12
	<ol>
		<li>24 godziny przed transfekcją, płytka 7,0 x 105 komórek C2C12 do jednego dołka sześciodołkowej płytki dla każdej transfekcji. 
		Uwaga: Prowadzi to do 50-60% konfluencji do czasu transfekcji.</li>
		<li>Przed użyciem odczynnik do transfekcji osiągnie temperaturę pokojową.</li>
		<li>Dodać 2 μg plazmidowego DNA (GFP-CUG5 lub GFP-CUG200) do 200 μl wstępnie podgrzanej surowicy wolnej od pożywki i krótko odwirować. Dodać 6 μl odczynnika do transfekcji do pożywki i natychmiast mieszać przez 30 sekund za pomocą wiru. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zmień pożywkę komórek C2C12 na 2,5 ml pożywki wzrostowej bez surowicy. Dodać mieszaninę transfekcji do komórek po inkubacji. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 i temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Utrzymuj komórki w mieszaninie transfekcyjnej/pożywce wzrostowej bez surowicy przez 4 godziny lub do nocy. Zmień pożywkę z powrotem na pożywkę wzrostową następnego dnia lub gdy widoczna jest cytotoksyczność. 
		Uwaga: Cytotoksyczność ocenia się za pomocą badania mikroskopowego komórek. Obserwuj zmiany w morfologii komórek i odłączaniu komórek. Dopóki nie ma jawnej cytotoksyczności, całonocna inkubacja w pożywkach wzrostowych bez surowicy zwiększa transfekcję.</li>
		<li>Wybierz komórki 48 godzin po transfekcji, dodając 1,2 - 1,6 mg / ml G418 przez ~ 10 dni, aż kultura kontrolna (transfekowana bez plazmidów) nie będzie miała żywych komórek. Zmieniaj pożywkę co dwa dni na pożywkę wzrostową uzupełnioną G418.</li>
		<li>Utrzymuj komórki odporne na G418 w pożywce wzrostowej i 5% CO2 w temperaturze 37 °C do kolejnych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat retrowirusa i transdukcja retrowirusowa C2C12
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę hodowlaną HEK 293, uzupełniając DMEM o wysokiej zawartości glukozy 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy.
		<ol>
			<li>Około 24 godziny przed transfekcją, płytka 4,0 x 106 ekotropowych komórek opakowaniowych na bazie HEK 293 na płytce 100 mm (80% konfluencji podczas transfekcji) zawierającej pożywkę do hodowli komórkowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przed użyciem odczynnik do transfekcji osiągnie temperaturę pokojową.</li>
		<li>Wymieszaj 15 μg plazmidowego DNA (pMSCV-Puro lub pMSCV-Celf1Flag-Puro) w 1 ml pożywki bez surowicy. Wiruj krótko. Dodać 30 μl odczynnika do transfekcji z kroku 2.2.2 do probówki z pożywką wzrostową wolną od DNA/surowicy i dobrze wymieszać za pomocą wiru. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Dodawać mieszaninę transfekcyjną kroplami do ekotropowych ogniw opakowaniowych na bazie HEK 293. Delikatnie zamieszać płytki i włożyć je z powrotem do inkubatora o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach zmień podłoże na 10 ml wstępnie podgrzanego świeżego podłoża wzrostowego.</li>
		<li>Zebrać supernatant (zawierający retrowirusa) 48 godzin po transfekcji za pomocą pipety i przenieść supernatant do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml nowej ciepłej pożywki do płytki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze. Przechowywać supernatant w temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Pożywkę dodaje się delikatnie z boku studzienki, aby nie zakłócić monowarstwy komórek.</li>
		<li>Zebrać drugą partię supernatantu 60 godzin po transfekcji i połączyć ją z supernatantem z ppkt 2.2.5. Wirować przy 500 x g, 4 °C przez 7 minut w celu usunięcia resztek komórkowych.</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. W tym momencie należy użyć retrowirusa do transdukcji komórek C2C12, przechodząc do kroku 2.2.9 lub podwielokrotności i przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
		<li>Rozmrozić retrowirusa z ppkt 2.2.7 w temperaturze pokojowej, jeśli użyto tu zamrożonego wywaru. 
		Uwaga: Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Płytkie komórki C2C12 w tym samym dniu transdukcji, dążąc do 30 - 40% konfluencji.
		<ol>
			<li>Odrzucić pożywkę wzrostową i przemyć komórki C2C12 3 ml PBS o temperaturze pokojowej. Usunąć PBS, dodać 500 μl 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 - 5 minut.</li>
			<li>Zneutralizuj trypsynę, dodając 3 ml pożywki wzrostowej. Odpipetuj 6 - 8 razy, aby zawiesić komórki. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dodaj 8,0 x 105 komórek C2C12 do płytki o średnicy 60 mm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 0,5 ml retrowirusa, aby zainfekować jedną 60-milimetrową płytkę komórkową w 3 ml pożywki wzrostowej. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.</li>
		<li>Zastąp 3 ml świeżej pożywki uzupełnionej wybranym antybiotykiem (puromycyna 1 - 3 μg/ml) 48 godzin po zakażeniu. Zastąp 3 ml pożywki antybiotykiem codziennie przez ~ 5 dni, aż nietransdukowana kultura kontrolna C2C12 wygaśnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat lentiwirusa i transdukcja lentiwirusa C2C12 
	Uwaga: Wykonaj wszystkie procedury związane z lentiwirusem w szafie bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 i postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Odpady płynne zawierające wirusa muszą zostać zdezynfekowane przed usunięciem.
	<ol>
		<li>Płytka 4,0 x 106 komórek 293T na płytce 100 mm (~ 80% konfluencji w dniu transfekcji) z pożywką do hodowli komórek HEK 293 (DMEM o wysokiej zawartości glukozy, uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) 24 godziny przed transfekcją.</li>
		<li>Ogrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej. Wymieszać lentiwirusowe wektory opakowaniowe (4 μg pMD2.G i 6 μg psPAX2) razem z 8 μg lentiwirusowego wektora przenoszenia (Celf1 shRNA lub zakodowane kontrolne shRNA) w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych wolnych od surowicy. Wiruj krótko.</li>
		<li>Dodać 36 μl wstępnie podgrzanego odczynnika do transfekcji do probówki DNA/DMEM i dobrze wymieszać wirowo. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Usunąć komórki 293T z inkubatora i dodać mieszaninę transfekcji do płytki. Delikatnie obrócić płytkę i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach zastąp mieszaninę transfekcji 10 ml świeżej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Zebrać sklarowany osad zawierający lentiwirusa po upływie 48 godzin od transfekcji i przenieść go do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml nowej ciepłej pożywki do płytki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze. Przechowywać supernatant w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać drugą partię supernatantu 60 godzin po transfekcji i połączyć ją z supernatantem z ppkt 2.3.5. Krótko odwirować w temperaturze 500 x g, 4 °C przez 7 min.</li>
		<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli używasz nowego wirusa, przejdź do kroku 2.3.9. Do wykorzystania w przyszłości przechowywać supernatant zawierający wirusa w temperaturze -20 °C w porcjach 10 ml.</li>
		<li>Rozmrozić wirusa z ppkt 2.3.7 w temperaturze pokojowej przed użyciem, jeżeli używany jest zamrożony wywar. 
		Uwaga: Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Płytki C2C12-CUG200 komórek (otrzymanych w sekcji 2.1) zgodnie z opisem w ppkt 2.2.9 w tym samym dniu transdukcji. 
		Uwaga: Celuj w 30 - 40% zbiegu.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml wirusa, aby zainfekować 60-milimetrową płytkę C2C12-CUG200 i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.</li>
		<li>Zastąp pożywkę hodowlaną świeżą pożywką uzupełnioną wybranym antybiotykiem (puromycyna 1 - 3 μg/ml) 72 godziny po transdukcji. Codziennie odświeżaj pożywki hodowlane za pomocą wybranego antybiotyku przez ~ 5 dni, aż wszystkie nietransdukowane kultury kontrolne C2C12-CUG200 wymrą</li>.
		<li>Użyj Western blot, aby zweryfikować knockdown Celf1 w komórkach transfekowanych GFP-CUG200.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Różnicowanie komórek C2C12
<ol>
	<li>Płytka 2 x 106 komórek w jednym dołku z płytki 6-dołkowej w 2,5 ml pożywki wzrostowej 24 godziny przed rozpoczęciem różnicowania. 
	Uwaga: Gęstość poszycia można dostosować tak, aby osiągnąć pełną konfluencję w ciągu 24 godzin.
	<ol>
		<li>Przepłukać zbiegające się komórki PBS i dodać 2,5 ml pożywki różnicującej o niskiej surowicy (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco uzupełniona 2% surowicą końską, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 1 μM insuliny). Wymieniaj pożywkę co dwa dni. 
		Uwaga: Insulinę zapasową należy przechowywać w stanie zamrożonym i dodawać ją do pożywki przy każdej zmianie pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas różnicowania C2C12 należy pobrać próbki do ilościowego RT-PCR (patrz punkt 4) w następujących punktach czasowych: Dzień 0, 1, 2, 4 i 6. Przeprowadzić hodowlę do barwienia immunologicznego w dniach 6 - 8 (patrz punkt 5).</li>
</ol>
4. Izolacja RNA i ilościowy RT-PCR
<ol>
	<li>Do izolacji RNA należy użyć protokołu producenta. Po izolacji ponownie zawiesić osad RNA w 30 μl wody wolnej od RNaz i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół. 
	Uwaga: Próbki mogą być poddawane ilościowemu RT-PCR lub mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Użyj zestawu RT qPCR do ilościowego RT-PCR10 i postępuj zgodnie z instrukcją producenta. Przygotować mieszaninę reakcyjną zgodnie z tabelą 1.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>składnik</td>
			<td>Objętość (μl)</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x bufor reakcyjny</td>
			<td>10</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podkład do przodu</td>
			<td>0,5</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrócony podkład</td>
			<td>0,5</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sondy</td>
			<td>0,5</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor odwrotnej transkryptazy i RNazy</td>
			<td>0,1</td>
			<td>0,25 j./ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>szablon</td>
			<td>1</td>
			<td>100 ng całkowitego RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od RNaz</td>
			<td>7,4</td>
			<td>nie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowity miks</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Ilościowe przygotowanie RT-PCR Master Mix
<ol start="3">
	<li>Przeprowadzić reakcję RT-qPCR o objętości 20 μl, stosując profil termiczny Tabela 2.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok odwrotnej transkrypcji</td>
			<td>30 min, 48 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aktywacja polimerazy DNA/inaktywacja odwrotnej transkryptazy</td>
			<td>10 min, 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">40 cykli</td>
			<td>15 sekund, 95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 min, 60 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Ilościowy profil termiczny RT-PCR
5. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Utrwalić jednowarstwową kulturę w 2,5 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu/PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Próbki należy przepuszczać w 2,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść próbki do wilgotnej komory. Umieścić próbki w 2,5 ml buforze blokującym (0,1% niejonowy środek powierzchniowo czynny/PBS, 10% normalna surowica kozia) na 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odrzuć bufor blokujący i nałóż 800 μl pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko ciężkiemu łańcuchowi miozyny rozcieńczonego w buforze blokującym (1:100). Inkubować w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć płytkę 3 razy (po 10 minut) 2,5 ml buforu do przemywania (0,1% polisorbatu 20/PBS) w 2 dniu.</li>
	<li>Usunąć bufor do przemywania i nałożyć 800 μl przeciwciała drugorzędowego (kozie przeciwciało anty-mysie, 1:500 rozcieńczone w PBS). Inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przemyć dwa razy (po 10 minut) 2,5 ml buforu do płukania.</li>
	<li>Inkubować z 800 μl DAPI (1 μg/ml, rozcieńczony w destylowanym dejonizowanymH2O) przez 5 minut.</li>
	<li>Przemyć ponownie 2,5 ml buforu do przemywania przez 10 minut.</li>
	<li>Zmień bufor płuczący na 2,5 ml PBS i użyj mikroskopu fluorescencyjnego do wykonania obrazów.</li>
</ol>

<ol><li>Harper, P. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarper%2C+PS+%22Myotonic+dystrophy.+3rd+edn%22">Myotonic dystrophy. 3rd edn</a>. , W. B. Saunders. (2001).</li>
<li>Timchenko, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+muscle+atrophy+in+myotonic+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).</li>
<li>Brook, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+myotonic+dystrophy%3A+expansion+of+a+trinucleotide+%28CTG%29+repeat+at+the+3%27+end+of+a+transcript+encoding+a+protein+kinase+family+member%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member.</a> Cell. 68 (4), 799-808 (1992).</li>
<li>Chau, A., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+insights+into+the+pathology+of+and+therapeutic+strategies+for+DM1%3A+Back+to+the+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics.</a> Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).</li>
<li>Ho, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind+proteins+regulate+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Muscleblind proteins regulate alternative splicing.</a> EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).</li>
<li>Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+steady-state+levels+of+CUGBP1+in+myotonic+dystrophy+1+are+due+to+PKC-mediated+hyperphosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation.</a> Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).</li>
<li>Kalsotra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mef2+transcription+network+is+disrupted+in+myotonic+dystrophy+heart+tissue%2C+dramatically+altering+miRNA+and+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression.</a> Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li>
<li>Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+stable+heterocaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons.</a> Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celf1+regulates+cell+cycle+and+is+partially+responsible+for+defective+myoblast+differentiation+in+myotonic+dystrophy+RNA+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myotonic+dystrophy+expanded+CUG+repeat+tract+is+necessary+but+not+sufficient+to+disrupt+C2C12+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation.</a> Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).</li>
<li>Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+and+trans+effects+of+the+myotonic+dystrophy+%28DM%29+mutation+in+a+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model.</a> Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).</li>
<li>Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28CTG%29n+repeats+markedly+inhibit+differentiation+of+the+C2C12+myoblast+cell+line%3A+implications+for+congenital+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">(CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy.</a> Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
<li>Emerson, C. P., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEmerson%2C+CP+%22Methods+in+muscle+biology%22">Methods in muscle biology</a>. 52, Academic Press. (1997).</li>
<li>Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUGBP1+overexpression+in+mouse+skeletal+muscle+reproduces+features+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).</li>
<li>Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Linia komórkowa C2C12 została wykorzystana jako model do badaniamiogenezy 11-14. Komórki te zachowują wygląd podobny do fibroblastów, szybko namnażają się w pożywkach zawierających 20% płodowej surowicy bydlęcej i łatwo różnicują się w pożywkach zawierających 2% surowicy koni15. Szybki wzrost i różnicowanie są korzystnymi cechami w modelu komórkowym miogenezy. Tutaj pokazujemy zastosowanie wektorów plazmidowych, retrowirusowych i lentiwirusowych do wprowadzenia cDNA, 3'-UTR i shRNA do komórek C2C12....

Dystrofia miotoniczna (DM) jest chorobą dziedziczoną autosomalnie dominująco, która dotyka wiele układów, w szczególności mięśnie sercowe i szkieletowe1. Istnieją dwa podtypy tej choroby, DM1 i DM2. DM1 występuje częściej i ma cięższą manifestację niż DM22. Mutacja genetyczna leżąca u podstaw DM1 to ekspansja powtórzeń trypletowych CUG zlokalizowanych w regionie 3' bez translacji (UTR) genu kinazy białkowej DM (DMPK)3. Liczba powtórzeń CUG u osób zdrowych waha się od 5 do 37. Natomiast wzrasta do ponad 50, a czasem do tysięcy u pacjentów z DM14. W rezultacie białka wiążące RNA, takie jak muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP i Elav-like family 1 (Celf1), są nieregulowane. Ze względu na sekwestrację na rozszerzonych powtórzeniach CUG, MBNL1 traci zdolność do regulowania alternatywnego splicingu5. Z drugiej strony Celf1 jest regulowany w górę6,7. Nadekspresja Celf1 jest związana z utratą i osłabieniem mięśni, które nie są przypisywane utracie funkcji MBNL1. Stworzono modele zwierzęce symulujące zmiany związane z DM1, w tym ekspansję DMPK 3'-UTR CUG, utratę MBNL1 i nadekspresję Celf1. Jednak modelowanie DM1 w mioblastach stanowi skuteczną alternatywę, szczególnie do analizowania zdarzeń komórkowych i molekularnych związanych z DM1.
Linia komórkowa mioblastów C2C12 została po raz pierwszy wyizolowana z uszkodzonego mięśnia myszy C3H i szeroko stosowana do badania różnicowania miogennego8,9. Komórki C2C12 szybko namnażają się w pożywce zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS) i łatwo ulegają różnicowaniu, gdy FBS jest wyczerpany. Jednak wykorzystanie tego modelu różnicowania mioblastów wiąże się z dwoma wyzwaniami: komórki C2C12 są często odporne na transfekcję genów/transdukcję wirusa; Niewielkie różnice w procedurze obsługi i różnicowania komórek mogą prowadzić do wyraźnych zmian w tworzeniu miotubek.
Nasze laboratorium rutynowo używa mioblastów C2C12 jako modelu komórkowego i opracowało protokoły, które skutecznie dostarczają geny poprzez transfekcję plazmidu, transdukcję retrowirusową i transdukcję lentiwirusową do linii komórkowej C2C1210. W filmie pokazujemy zoptymalizowane procedury transfekcji/transdukcji komórek C2C12 i utrzymania spójności różnicowania w tworzeniu modeli mioblastów DM1.

<table><tbody><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>dla pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>dla pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>dla pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Insulina z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>dla pożywka różnicująca</td></tr><tr><td>surowica koni</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>do podłoża różnicującego</td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp; Odczynnik do transfekcji HD</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>do transfekcji</td></tr><tr><td>Siarczan G418&nbsp;</td><td>Złoto Biotechnologia&nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>do selekcji lekoopornej</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>do selekcji lekoopornej</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 dołków</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>dla Western Blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>dla western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>dla western blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran Obsługiwane 0,2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE healthcare</td><td>10600015</td> nauk przyrodniczych <td>dla western blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Rozwojowy bank hybrydoma</td><td>MF 20</td><td>pierwotny Ab do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L), koniugat Texas Red-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>wtórny Ab dla barwienie immunologiczne</td></tr><tr><td>Jednoetapowy qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>do qRT-PCR</td></tr><tr><td>Odczynnik izolacyjny TriPure</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>do izolacji RNA</td></tr><tr><td>Przeciwciało CUG-BP1 (3B1)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-20003</td><td>pierwotne Ab western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało aktynowe</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>kozia poliklonalna IgG do kontroli załadunku</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Komórki 631507 Clontech</td><td></td><td>do przygotowania retrowirusa</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>pusty wektor retrowirusowy do przygotowania retrowirusa</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>skonstruowany w domu</td><td>niedostępny</td> kodowanie <td>wektora retrowirusowego Celf1Flag, używane w przygotowaniu retrowirusa</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>prezent od Didiera Trono</td><td>niedostępne</td><td>do przygotowania lentiwirusa</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>prezent od Didiera Trono</td><td>niedostępny</td><td>do przygotowania lentiwirusa</td></tr><tr><td>GFP-CUG5</td><td>prezent od M.S. Mahadevan</td><td>niedostępne</td><td>szczegóły w odnośniku 10&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP- CUG200</td><td>prezent od M.S. Mahadevan</td><td>niedostępne</td><td>szczegóły w referencji 10&nbsp;</td></tr><tr><td>Tryton&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr></tbody></table>

modelowanie dystrofii miotonicznej 1 w komórkach mioblastów c2c12

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Dystrofia miotoniczna 1 (DM1) jest powszechną formą dystrofii mięśniowej. Chociaż stworzono kilka modeli zwierzęcych dla DM1, modele komórek mioblastów są nadal ważne, ponieważ stanowią wydajną alternatywę komórkową do badania zdarzeń komórkowych i molekularnych. Chociaż komórki mioblastowe C2C12 są szeroko stosowane do badania miogenezy, oporność na transfekcję genów lub transdukcję wirusową utrudnia badania nad komórkami C2C12. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół, który obejmuje codzienne procedury konserwacji, transfekcji i transdukcji w celu wprowadzenia genów do mioblastów C2C12 i indukcji różnicowania miocytów. Łącznie procedury te umożliwiają najlepszą wydajność transfekcji/transdukcji, a także spójne wyniki różnicowania. Protokół opisany w tworzeniu modeli komórek mioblastów DM1 przyniósłby korzyści w badaniu dystrofii miotonicznej, a także innych chorób mięśni.

Komórki C2C12 zostały transfekowane GFP-CUG5 lub GFP-CUG200. Po selekcji opornością na lek utworzono stabilne pule, które można zwizualizować poprzez ekspresję GFP (Ryc. 1A). Formowanie miotub w zróżnicowanych mioblastach wykryto za pomocą immunobarwienia ciężkiego łańcucha miozyny10 (Ryc. 1B). Ilościowa ocena formowania miotub wykazała, że w przypadku nieprawidłowej ekspansji CUG w GFP-CUG200 wskaźniki fuzji spadły z 35,4 ± 4,1% do 2,6 ± 1,1%,...

W tym protokole przedstawiamy procedury tworzenia modeli mioblastów dystrofii 1 dyotonii, w tym zoptymalizowane utrzymanie komórek C2C12, transfekcję/transdukcję genów i różnicowanie miocytów.

Modelowanie dystrofii miotonicznej 1 w komórkach mioblastów C2C12

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Ogólnym celem tych procedur utrzymania, transfekcji i transdukcji mioblastów jest stworzenie jednokomórkowego modelu dystrofii miotonicznej do badania tej choroby oraz innych schorzeń mięśniowych. Metoda ta pozwala na opracowanie modeli komórkowych mioblastów M1, które będą przydatne w badaniu szczegółowego mechanizmu patogenezy M1. Ta wieloetapowa manipulacja genetyczna mioblastów C2C12 umożliwia modelowanie sekwencyjnych i genetycznych zdarzeń patologicznych w M1. Na 24 godziny przed transfekcją wysiej 7 × 10⁵ komórek C2C12 na studnię w płytce 6-dołkowej.Następnego dnia należy dodać 2 µg interesującego plazmidowego DNA do 200 µl pożywki bezsurowiczej w temperaturze pokojowej i krótko wymieszać roztwór za pomocą wortexa. Następnie do pożywki należy dodać 6 µl odczynnika do transfekcji w temperaturze pokojowej i niezwłocznie wymieszać roztwór w vortexie przez 30 sekund. Po tym czasie pożywkę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 minut.W ciągu ostatnich pięciu minut inkubacji należy zastąpić pożywkę w każdej studzience 2,5 ml świeżej bejsurowej pożywki wzrostowej i dodać 200 µl mieszaniny transfekcyjnej do każdej studzienki. Następnie należy przenieść płytkę z powrotem do i

modeling-myotonic-dystrophy-1-in-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Hodowlane komórki mięśniowe są niewystarczającym modelem do odtworzenia unerwionego mięśnia in vivo. Funkcjonalną jednostkę motoryczną można odtworzyć in vitro poprzez unerwienie zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek mięśniowych przy użyciu eksplantatów rdzenia kręgowego embrionu szczura. Niniejszy artykuł opisuje sposób tworzenia kokultur eksplantatów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych.

Funkcjonalna jednostka motoryczna w szalce hodowlanej: współhodowla eksplantów rdzenia kręgowego i komórek mięśniowych

Opisano nieinwazyjny sposób oceny sukcesu przeszczepu mioblastów. Metoda wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów, których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania. W tym przypadku wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego fluc do celowania w komórki za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej.  Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych.  Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Ten protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzania i ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek we włóknach mięśniowych myszy. Po rekonwalescencji po elektroporacji włókna są izolowane. Poszczególne włókna są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji struktury mięśni.

Elektroporacja DNA, izolacja i obrazowanie włókien mięśniowych

Komórki mięśniowe należą do najbardziej złożonych komórek eukariotycznych. Przedstawiamy protokół różnicowania in vitro wysoko dojrzałych włókien mięśniowych, który pozwala na manipulację genetyczną i wyraźne obrazowanie na wszystkich etapach rozwoju.

In vitro Różnicowanie dojrzałych włókien mięśniowych do obrazowania na żywo

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Dostarczamy protokół do stabilnego niszczenia genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w mioblastach C2C12 za pomocą małego spinki do włosów (sh) RNA. Na przykładzie ADAMTSL2 opisujemy metody walidacji skuteczności knockdown na poziomie mRNA, białka i komórki podczas różnicowania mioblastów C2C12 do miotub.

Stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów C2C12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)RNA

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół efektywnego modelowania mięśni dystrofii mięśniowej Duchenne'a przy użyciu komórek pochodzących z moczu przekształconych w MYOD1 w celu oceny przywrócenia poziomu mRNA dystrofiny i białka po pominięciu eksonu.

Przeskakiwanie eksonów w bezpośrednio przeprogramowanych miotubach uzyskanych z ludzkich komórek pochodzących z moczu

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Poznaj metody transfekcji i transdukcji wirusowej w komórkach mioblastów C2C12 do modelowania dystrofii miotonicznej 1. Techniki te umożliwiają badanie mechanizmów patogenezy i potencjalnych terapii.

Modelowanie dystrofii miotonicznej 1 w komórkach mioblastów C2C12

Przeglądaj więcej filmów