Usuwanie materiałów egzogenicznych z zewnętrznej części zamrożonych rdzeni w celu zbadania starożytnych zbiorowisk biologicznych znajdujących się w środku
3 lipca 2016
Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w poprzednich warunkach środowiskowych. Przedstawiono protokół zbierania i odkażania rdzeni wiecznej zmarzliny gleb i lodu. Brak egzogennych kolonii i DNA sugeruje, że wykryte mikroorganizmy reprezentują materiał, a nie zanieczyszczenie pochodzące z wiercenia lub przetwarzania.
Kriosfera umożliwia dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w dawnych warunkach środowiskowych. Ogólnym celem niniejszej procedury jest odkrycie ukrytej różnorodności poprzez skuteczne pobieranie i usuwanie materiału egzogennego z zamrożonych rdzeni. Metoda ta może pomóc w udzieleniu cennych odpowiedzi na pytania historyczne dotyczące wybranych okresów czasowych poprzez identyfikację organizmów odzyskanych z lodu lodowcowego i wieloletniej zmarzliny.
Pobieranie aseptycznego rdzenia w terenie jest trudne ze względu na wysokie prawdopodobieństwo wprowadzenia zanieczyszczeń. Dlatego główną zaletą tej techniki jest to, że usuwanie zanieczyszczeń odbywa się w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Wizualna demonstracja tego protokołu jest kluczowa, ponieważ etapy skrobania i dekontaminacji mogą być trudne do opanowania.
Jest to w rzeczywistości zadanie dla dwóch osób, dlatego wymaga ono przede wszystkim dużej cierpliwości i współpracy zespołowej. Procedurę tę zademonstrują dwaj naukowcy wspomagający z mojego laboratorium, Karen Foley oraz Robert Jones. Protokół ten wymaga skrupulatnej czystości.
Użyć pieca ustawionego na 450 °C, aby przez cztery godziny wyprażyć następujące elementy: sterylne, wolne od kwasów nukleinowych metalowe statywy, szkło laboratoryjne, pęsety metalowe oraz watę szklaną. Użyć owinięcia z grubej folii aluminiowej, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu.
Następnie przeprowadź sterylizację przez filtrowanie 85% ethanolu oraz wody ultra-czystej, używając filtrów o rozmiarze porów 0,22 micron. Płyny te muszą być utrzymywane w temperaturze czterech stopni Celsius lub niższej, w przeciwnym razie próbka może ulec pęknięciu, co ułatwi jej kontaminację. Ethanol należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsius.
Następnie wodę należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Potem należy wysterylizować plastikową linijkę 70% etanolem, a następnie roztworem do dekontaminacji DNA oraz roztworem do dekontaminacji RNaz. Każdy roztwór należy wytrzeć natychmiast po naniesieniu.
Następnie należy przechowywać linijkę w sterylnym, wolnym od kwasów nukleinowych worku Whirl-Pak. W kolejnym kroku należy przygotować przestrzeń w pomieszczeniu chłodniczym, zaczynając od wyszorowania ścian, podłóg oraz znajdującego się tam metalowego stołu roboczego 1% roztworem wybielacza. Następnie temperaturę w pomieszczeniu należy ustawić na około -11°C.
Po przygotowaniu, podczas przebywania w chłodni, należy zakładać lekkie kombinezony ochronne, rękawice nitrylowe oraz maseczki, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia pomieszczenia lub próbek. Niniejsza procedura wymaga pracy dwóch osób w tandemie. Może to być trudne ze względu na liczne możliwości ponownej kontaminacji.
Aby zapewnić sukces, monitorujemy nawzajem swoje działania, komunikujemy się i często zmieniamy rękawiczki. Po przygotowaniu wszystkich elementów należy przenieść wysterylizowane materiały i próbki do pomieszczenia chłodniczego i rozmieścić je na stole przemytym wybielaczem. Obejmuje to przygotowane kultury S.marcescens.
Najpierw rdzeń zmarzliny umieszcza się na przygotowanym arkuszu folii aluminiowej. Następnie zewnętrzną powierzchnię rdzenia delikatnie inokuluje się rozcieńczoną kulturą S.marcescens za pomocą sterylnego zatyczki z pianki. Następnie rdzeń ustawia się na sterylnej metalowej kratce nad tacą.
Następnie stalowe ostrze mikrotomu przeciera się sterylnie 70% ethanol, roztworem do dekontaminacji DNA oraz roztworem do dekontaminacji RNaz. Następnie badacz A w ten sam sposób oczyszcza swoje rękawiczki nitrylowe. Potem A trzyma rdzeń pod kątem 45 stopni nad tacką.
Osoba B delikatnie zdrapuje około pięciu milimetrów z zewnętrznej powierzchni całego rdzenia, w tym z jego końców, używając sterylnego ostrza, podczas gdy osoba A obraca rdzeń po każdym zdrapaniu. W razie potrzeby ostrze należy ponownie oczyścić za pomocą trzech roztworów. Następnie osoba B szybko i ostrożnie wlewa przefiltrowany i wysterylizowany 95% ethanol na rdzeń, podczas gdy osoba A obraca rdzeń.
Następnie rdzeń jest szybko płukany wodą. Metalowy stojak nad tacką zostaje wymieniony, a rdzeń umieszczony na nowym stojaku. Następnie należy oczyścić rękawice nitrylowe i umieścić rdzeń na czystym stojaku nad tacką.
W międzyczasie osoba B spryskuje cały rdzeń roztworem do dekontaminacji DNA, a następnie płucze go wodą sterylizowaną filtrem. Następnie osoba B spryskuje cały rdzeń roztworem do dekontaminacji RNaz, po czym ponownie płucze go wodą. Na koniec rdzeń umieszcza się w sterylnej torebce Whirl-Pak.
Zacznij od umieszczenia metalowej podstawki nad szklaną szalką w dygestorium z przepływem laminarnym. Następnie umieść rdzeń na metalowej podstawce. Pozostaw zewnętrzną powierzchnię rdzenia do rozmrożenia w warstwie od dwóch do pięciu milimetrów przez około 10 minut.
W tym czasie należy obracać rdzeń o 90 stopni co dwie minuty. Po rozmrożeniu, za pomocą pincety należy chwycić wełnę szklaną i przetrzeć całą powierzchnię rdzenia w celu zebrania bakterii. Następnie, używając wełny szklanej, należy zaszczepić dwie płytki.
Następnie, za pomocą linijki zmierz wymiary zewnętrzne rdzenia, pamiętając, aby go nie dotykać. Dodatkowo zaszczep dwie kolejne płytki oryginalną kulturą, której wcześniej użyto do zaszczepienia zewnętrznej części rdzenia, aby potwierdzić żywotność inokulum. Następnie przenieś rdzeń do dużego sterylnego worka i przechowuj go w temperaturze -80 °C.
Inkubuj zaszczepione płytki w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez jeden tydzień, a następnie sprawdź, czy pojawiły się kolonie S.marcescens, które w tej temperaturze stają się czerwone. Choć protokół ten zawiera szereg krytycznych etapów, jednym z najważniejszych jest weryfikacja wzrostu Serratia Marcescens. W przypadku braku widocznych kolonii S.marcescens przejdź do następnej fazy rozmrażania.
JEŚLI pojawią się kolonie S.marcescens, należy zeskrobać kolejne pięć milimetrów z rdzenia i powtórzyć procedurę. Należy sprawdzić, czy S.marcescens wyrosły z oryginalnej kultury wystawionej na niskie temperatury panujące w chłodni. Próbki pobrano z lodu i zmarzliny z 110-metrowego tunelu znajdującego się w Fox na Alasce.
Tunel zapewnił dostęp do bogatych w lód mułów i aluwiów. Próbki pobrano w trzech powtórzeniach. Opisane protokoły zostały przeprowadzone w placówkach w New Hampshire.
Przeprowadzono sekwencjonowanie genu 16S rRNA bakterii wyhodowanych z rdzeni. Dominowały gatunki z rodzaju Pseudomonas, ale obecne były również organizmy spokrewnione z klasą Planctomycetia. Szczególnie istotny był brak gatunków z rodzaju Serratia, co dowodzi, że protokół dekontaminacji skutecznie usunął egzogenne DNA.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak skutecznie dekontaminować rdzenie lodu i zmarzliny. Po opanowaniu techniki, etapy przetwarzania w pomieszczeniu chłodniczym mogą zająć od 30 do 45 minut, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Podczas stosowania tej procedury krytyczne jest zachowanie szczególnej uwagi w odniesieniu do wszystkiego i każdego miejsca, którego się dotyka.
W razie wątpliwości należy po prostu zmienić rękawiczki i przeprowadzić ponowną sterylizację. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie amplikonów i metagenomika shotgun, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące składu gatunkowego w danym okresie lub dominujących cech funkcjonalnych w tych warunkach środowiskowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę pobierania i dekontaminacji rdzeni zmarzliny w celu wyizolowania zachowanych organizmów z dawnych warunków środowiskowych. Technika ta ma na celu usunięcie materiału egzogennego przy jednoczesnym zachowaniu integralności próbek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Nauki o środowisku
- Kriobiologia
Wstęp
- Kriosfera zawiera zachowane organizmy, które pozwalają poznać charakterystykę dawnych ekosystemów.
- Pobieranie próbek ze środowisk zamarzniętych niesie ze sobą ryzyko kontaminacji.
- Zrozumienie dawnej różnorodności mikrobiologicznej może wspomóc współczesne badania ekologiczne.
- Kontrolowane techniki laboratoryjne są niezbędne dla zapewnienia dokładnej analizy.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody pobierania rdzeni wieloletniej zmarzliny.
- Skuteczne usuwanie zanieczyszczeń w warunkach laboratoryjnych.
- Identyfikacja i analiza mikroorganizmów pochodzących z lodu lodowcowego i wieloletniej zmarzliny.
Zastosowane metody
- Pobieranie aseptycznych rdzeni z wieloletniej zmarzliny i lodu lodowcowego.
- Procedury dekontaminacji przeprowadzane w kontrolowanym środowisku.
- Demonstracje wizualne wspomagające naukę technik skrobania i dekontaminacji.
- Analiza mikrobiologicznego DNA w celu potwierdzenia braku kontaminacji.
Główne wyniki
- Pomyślne pobranie rdzeni z wieloletniej zmarzliny bez wprowadzenia kolonii egzogennych.
- Wykryte mikroorganizmy są najprawdopodobniej rodzime dla badanych próbek.
- Wykazana skuteczność protokołu dekontaminacji.
- Uzyskanie wiedzy na temat historycznej różnorodności mikrobiologicznej.
Wnioski
- Protokół umożliwia badanie zachowanych organizmów w sposób wolny od kontaminacji.
- Pozwala on na lepsze zrozumienie warunków środowiskowych w przeszłości.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zgłębienia ewolucji mikroorganizmów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dekontaminacja zamrożonych rdzeni jest kluczowa dla dokładnej analizy dawnych społeczności biologicznych, zapewniając, że wykryte mikroorganizmy odzwierciedlają populacje rodzime, a nie zanieczyszczenia egzogenne. Niniejszy protokół wspomaga walidację celów w mikrobiologii środowiskowej, umożliwiając niezawodną ekstrakcję sygnałów endogennych z próbek krioserwowanych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w późniejszych zastosowaniach, takich jak sekwencjonowanie amplikonów i metagenomika, poprzez stworzenie wolnego od zanieczyszczeń fundamentu dla mechanistycznej minimalizacji ryzyka w rekonstrukcjach historycznych ekosystemów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację rodzimych sygnałów mikrobiologicznych z dawnej zmarzliny i rdzeni lodowych.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza ryzyko wyników fałszywie dodatnich w identyfikacji celów dzięki rygorystycznemu usuwaniu egzogennego DNA i kolonii mikrobów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych układów biologicznych do dalszych analiz przesiewowych poprzez potwierdzenie braku wzrostu zanieczyszczeń za pomocą posiewu *Serratia marcescens*.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja przygotowania próbek poprzez mierzalne punkty kontrolne dekontaminacji, co poprawia powtarzalność między partiami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób, zapewniając dostęp do starożytnych konsorcjów mikrobiologicznych w celu analizy cech funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do prac przedklinicznych poprzez zachowanie integralności próbek dzięki kontrolowanej dekontaminacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, umożliwiając wiarygodną weryfikację hipotez dotyczących starożytnej różnorodności mikroorganizmów, co bezpośrednio wspiera identyfikację wiodących kandydatów poprzez podejścia sekwencjonowania niezależnego od hodowli.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnienie szlaków i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez potwierdzenie endogennego pochodzenia wykrytych mikroorganizmów dzięki brakowi zanieczyszczonych kolonii Serratia.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie do analizy poprzez ustandaryzowane etapy dekontaminacji, które pozwalają uzyskać wolne od zanieczyszczeń rdzenie odpowiednie do ekstrakcji DNA.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych, takich jak liczba jednostek tworzących kolonie oraz wyniki sekwencjonowania 16S rRNA, w celu porównania warunków w różnych próbkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczenie systemów istotnych dla przebiegu choroby do badania adaptacji mikrobów w historycznych warunkach środowiskowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania metod przetwarzania rdzeni, która może być zastosowana w wielu projektach dotyczących rdzeni lodowych i zmarzliny.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki potwierdzonemu brakowi materiału egzogennego.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zdefiniowanym punktom kontrolnym dekontaminacji oraz protokołom dla pomieszczeń chłodniczych.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji typu go/no-go w zakresie inwestycji w sekwencjonowanie dzięki redukcji szumu biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja projektów dotyczących próbek starożytnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną skuteczność dekontaminacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach aseptycznych i biologii molekularnej, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu podczas manipulacji próbkami.
- Proces jest zależny od dostępności aparatury, w tym pomieszczeń chłodniczych utrzymywanych w temperaturze -11°C, sprzętu wolnego od kwasów nukleinowych oraz komór z laminarnym przepływem powietrza.
- Konieczna jest standaryzacja kroków dekontaminacji między zespołami, w tym płukania etanolem, traktowania DNAse/RNase oraz protokołów wymiany rękawiczek.
- Należy uwzględnić adaptację metod dla różnych typów rdzeni (lód vs. zmarzlina), przy zachowaniu spójności w usuwaniu warstwy zewnętrznej.
- Ograniczenie praktyczne: skuteczność zależy od rygorystycznego wykonania etapów skrobania i dekontaminacji chemicznej, aby uniknąć pozostałości sygnałów egzogennych.
