Usuwanie materiałów egzogenicznych z zewnętrznej części zamrożonych rdzeni w celu zbadania starożytnych zbiorowisk biologicznych znajdujących się w środku
3 lipca 2016
Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w poprzednich warunkach środowiskowych. Przedstawiono protokół zbierania i odkażania rdzeni wiecznej zmarzliny gleb i lodu. Brak egzogennych kolonii i DNA sugeruje, że wykryte mikroorganizmy reprezentują materiał, a nie zanieczyszczenie pochodzące z wiercenia lub przetwarzania.
Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w dawnych warunkach środowiskowych. Ogólnym celem tej procedury jest odkrycie ukrytej różnorodności poprzez skuteczne zbieranie i usuwanie materiału egzogennego z zamrożonych rdzeni. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na cenne pytania historyczne dotyczące wybranych okresów poprzez identyfikację organizmów odzyskanych z lodu lodowcowego i wiecznej zmarzliny.
Zbieranie rdzenia aspetycznego w terenie jest wyzwaniem ze względu na wysokie prawdopodobieństwo wprowadzenia zanieczyszczeń. Dlatego główną zaletą tej techniki jest to, że usuwanie zanieczyszczeń odbywa się w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy skrobania i odkażania mogą być trudne do nauczenia.
To tak naprawdę praca dla dwóch osób, więc wymaga dużo cierpliwości, a zwłaszcza pracy zespołowej. Procedurę tę zademonstruje dwoje naukowców z mojego laboratorium, Karen Foley i Robert Jones. Protokół ten wymaga skrupulatnej czystości.
Użyj piekarnika ustawionego na 450 stopni Celsjusza, aby piec następujące rzeczy przez cztery godziny. Sterylne metalowe stojaki wolne od kwasów nukleinowych, szkło, metalowe kleszcze i wata szklana. Użyj owinięcia grubej folii, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu.
Następnie przefiltruj 85% etanolu i ultraczystą wodę za pomocą filtrów 0,22 mikrona. Ciecze te muszą pozostać w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub niższej, w przeciwnym razie doprowadzą do pęknięcia próbki, co ułatwi jej zanieczyszczenie. Przechowuj etanol w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
I przechowuj wodę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wysterylizuj plastikową linijkę 70% etanolem, a następnie roztworem do odkażania DNA i roztworem do odkażania RNazy. Zetrzyj każdy roztwór natychmiast po jego nałożeniu.
Następnie przechowuj linijkę w sterylnej, wolnej od kwasów nukleinowych torbie Whirl-Pak. Następnie przygotuj przestrzeń chłodni, najpierw szorując ściany, podłogi i metalowy stół roboczy za pomocą 1% wybielacza. Następnie ustaw temperaturę w pomieszczeniu na około minus 11 stopni Celsjusza.
Po przygotowaniu należy nosić lekkie kombinezony, rękawice nitrylowe i maski w chłodni, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia pomieszczenia lub próbek. Ta procedura wymaga, aby dwie osoby pracowały w tandemie. Może to być trudne, biorąc pod uwagę wiele możliwości ponownego zanieczyszczenia.
Aby zapewnić sukces, monitorujemy się nawzajem, komunikujemy się i często zmieniamy rękawice. Po przygotowaniu wszystkiego przynieś wysterylizowane materiały i próbki do chłodni i ustaw je na stole do szorowania wybielaczem. Obejmuje to przygotowane kultury S.marcescens.
Najpierw rdzeń wiecznej zmarzliny umieszcza się na przygotowanym arkuszu folii aluminiowej. Następnie zewnętrzna strona rdzenia jest lekko zaszczepiana rozcieńczoną kulturą S. marcescens za pomocą sterylnego korka piankowego. Następnie umieść rdzeń na sterylnym metalowym stojaku nad tacą.
Teraz stalowe ostrze mikrotomu jest wycierane sterylnie 70% etanolem, roztworem do dekontaminacji DNA i roztworem do odkażania RNazy. Następnie badacz A czyści rękawice nitrylowe w ten sam sposób. Następnie A trzyma rdzeń pod kątem 45 stopni nad tacą.
B delikatnie zeskrobuje około pięciu milimetrów z zewnętrznej strony całego rdzenia, w tym końców, za pomocą sterylnego ostrza, podczas gdy A obraca rdzeń po każdym zeskrobaniu. W razie potrzeby ostrze należy ponownie oczyścić trzema roztworami. Następnie B szybko i ostrożnie wylewa sterylizowany przez filtr 95% etanol na rdzeń, podczas gdy A obraca rdzeń.
Następnie rdzeń jest szybko spłukiwany wodą. Metalowy stojak nad tacą jest teraz wymieniony, a rdzeń jest umieszczany na nowym stojaku. A teraz czyści rękawice nitrylowe, a następnie umieszcza rdzeń na czystym stojaku nad tacą.
W międzyczasie B spryskuje cały rdzeń roztworem do odkażania DNA, a następnie spłukuje wodą sterylizowaną przez filtr. Następnie B spryskuje cały rdzeń roztworem odkażającym RNazy, a następnie ponownie spłukuje wodą. Na koniec rdzeń umieszcza się w sterylnej torbie Whirl-Pak.
Zacznij od umieszczenia metalowego stojaka nad szklanym naczyniem w okapie biologicznym z przepływem laminarnym. Następnie umieść rdzeń na metalowym stojaku. Pozwól, aby od dwóch do pięciu milimetrów zewnętrznej powierzchni rdzenia rozmroziło się w ciągu około 10 minut.
W tym czasie obracaj rdzeń o 90 stopni co dwie minuty. Po rozmrożeniu chwyć szczypce watę szklaną i przetrzyj całą powierzchnię rdzenia, aby zebrać bakterie. Następnie zaszczepij dwie płytki za pomocą waty szklanej.
Następnie zmierz zewnętrzne wymiary rdzenia za pomocą linijki, ale nie dotykaj rdzenia. Zaszczep również dwie dodatkowe płytki oryginalną kulturą, która była wcześniej używana do domieszkowania zewnętrznej części rdzenia, aby sprawdzić, czy inokulatory są żywotne. Następnie przenieś rdzeń do dużej sterylnej torby i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Inkubuj zaszczepione płytki w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez tydzień, a następnie zbadaj je pod kątem kolonii S.marcescens, które zmieniają kolor na czerwony w tej temperaturze. Chociaż protokół ten składa się z szeregu krytycznych kroków, jednym z najważniejszych jest sprawdzenie wzrostu Serratia Marcescens. Jeśli nie ma widocznych kolonii S.marcescens, przejdź do następnej fazy rozmrażania.
Jeśli są kolonie S.marcescens, zeskrob kolejne pięć milimetrów z rdzenia i powtórz procedurę. Sprawdź, czy S.marcescens wyrósł z pierwotnej kultury wystawionej na działanie niskich temperatur w chłodni. Próbki pobrano z lodu i wiecznej zmarzliny ze 110-metrowego tunelu znajdującego się w Fox na Alasce.
Tunel zapewniał dostęp do bogatego w lód mułu i aluwium. Próbki pobrano w trzech egzemplarzach. W placówkach w New Hampshire przeprowadzono opisane protokoły.
Gen 16S rRNA został zsekwencjonowany z bakterii wyhodowanych z rdzeni. Dominowały gatunki Pseudomonas, ale obecni byli również członkowie spokrewnieni z Planctomycetia. Szczególnie interesujący był brak gatunków Serratia, co pokazuje, że protokół dekontaminacji w wystarczającym stopniu usunął egzogenne DNA.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie odkazić rdzeń lodu i wiecznej zmarzliny. Po opanowaniu etapy obróbki w chłodni można wykonać w ciągu 30 do 45 minut, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Próbując tej procedury, bardzo ważne jest, aby zwracać uwagę na wszystko i wszędzie, czego dotykasz.
W razie wątpliwości po prostu zmień rękawiczki i ponownie wysterylizuj. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie amplikonów i metagenomika typu shotgun, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak skład gatunkowy w tym okresie lub jakie atrybuty funkcjonalne dominowały w tych warunkach środowiskowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę pobierania i dekontaminacji rdzeni zmarzliny w celu wyizolowania zachowanych organizmów z dawnych warunków środowiskowych. Technika ta ma na celu usunięcie materiału egzogennego przy jednoczesnym zachowaniu integralności próbek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Nauki o środowisku
- Kriobiologia
Wstęp
- Kriosfera zawiera zachowane organizmy, które pozwalają poznać charakterystykę dawnych ekosystemów.
- Pobieranie próbek ze środowisk zamarzniętych niesie ze sobą ryzyko kontaminacji.
- Zrozumienie dawnej różnorodności mikrobiologicznej może wspomóc współczesne badania ekologiczne.
- Kontrolowane techniki laboratoryjne są niezbędne dla zapewnienia dokładnej analizy.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody pobierania rdzeni wieloletniej zmarzliny.
- Skuteczne usuwanie zanieczyszczeń w warunkach laboratoryjnych.
- Identyfikacja i analiza mikroorganizmów pochodzących z lodu lodowcowego i wieloletniej zmarzliny.
Zastosowane metody
- Pobieranie aseptycznych rdzeni z wieloletniej zmarzliny i lodu lodowcowego.
- Procedury dekontaminacji przeprowadzane w kontrolowanym środowisku.
- Demonstracje wizualne wspomagające naukę technik skrobania i dekontaminacji.
- Analiza mikrobiologicznego DNA w celu potwierdzenia braku kontaminacji.
Główne wyniki
- Pomyślne pobranie rdzeni z wieloletniej zmarzliny bez wprowadzenia kolonii egzogennych.
- Wykryte mikroorganizmy są najprawdopodobniej rodzime dla badanych próbek.
- Wykazana skuteczność protokołu dekontaminacji.
- Uzyskanie wiedzy na temat historycznej różnorodności mikrobiologicznej.
Wnioski
- Protokół umożliwia badanie zachowanych organizmów w sposób wolny od kontaminacji.
- Pozwala on na lepsze zrozumienie warunków środowiskowych w przeszłości.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zgłębienia ewolucji mikroorganizmów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dekontaminacja zamrożonych rdzeni jest kluczowa dla dokładnej analizy dawnych społeczności biologicznych, zapewniając, że wykryte mikroorganizmy odzwierciedlają populacje rodzime, a nie zanieczyszczenia egzogenne. Niniejszy protokół wspomaga walidację celów w mikrobiologii środowiskowej, umożliwiając niezawodną ekstrakcję sygnałów endogennych z próbek krioserwowanych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w późniejszych zastosowaniach, takich jak sekwencjonowanie amplikonów i metagenomika, poprzez stworzenie wolnego od zanieczyszczeń fundamentu dla mechanistycznej minimalizacji ryzyka w rekonstrukcjach historycznych ekosystemów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację rodzimych sygnałów mikrobiologicznych z dawnej zmarzliny i rdzeni lodowych.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza ryzyko wyników fałszywie dodatnich w identyfikacji celów dzięki rygorystycznemu usuwaniu egzogennego DNA i kolonii mikrobów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych układów biologicznych do dalszych analiz przesiewowych poprzez potwierdzenie braku wzrostu zanieczyszczeń za pomocą posiewu *Serratia marcescens*.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja przygotowania próbek poprzez mierzalne punkty kontrolne dekontaminacji, co poprawia powtarzalność między partiami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób, zapewniając dostęp do starożytnych konsorcjów mikrobiologicznych w celu analizy cech funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do prac przedklinicznych poprzez zachowanie integralności próbek dzięki kontrolowanej dekontaminacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, umożliwiając wiarygodną weryfikację hipotez dotyczących starożytnej różnorodności mikroorganizmów, co bezpośrednio wspiera identyfikację wiodących kandydatów poprzez podejścia sekwencjonowania niezależnego od hodowli.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnienie szlaków i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez potwierdzenie endogennego pochodzenia wykrytych mikroorganizmów dzięki brakowi zanieczyszczonych kolonii Serratia.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie do analizy poprzez ustandaryzowane etapy dekontaminacji, które pozwalają uzyskać wolne od zanieczyszczeń rdzenie odpowiednie do ekstrakcji DNA.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych, takich jak liczba jednostek tworzących kolonie oraz wyniki sekwencjonowania 16S rRNA, w celu porównania warunków w różnych próbkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczenie systemów istotnych dla przebiegu choroby do badania adaptacji mikrobów w historycznych warunkach środowiskowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania metod przetwarzania rdzeni, która może być zastosowana w wielu projektach dotyczących rdzeni lodowych i zmarzliny.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki potwierdzonemu brakowi materiału egzogennego.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zdefiniowanym punktom kontrolnym dekontaminacji oraz protokołom dla pomieszczeń chłodniczych.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji typu go/no-go w zakresie inwestycji w sekwencjonowanie dzięki redukcji szumu biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja projektów dotyczących próbek starożytnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną skuteczność dekontaminacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach aseptycznych i biologii molekularnej, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu podczas manipulacji próbkami.
- Proces jest zależny od dostępności aparatury, w tym pomieszczeń chłodniczych utrzymywanych w temperaturze -11°C, sprzętu wolnego od kwasów nukleinowych oraz komór z laminarnym przepływem powietrza.
- Konieczna jest standaryzacja kroków dekontaminacji między zespołami, w tym płukania etanolem, traktowania DNAse/RNase oraz protokołów wymiany rękawiczek.
- Należy uwzględnić adaptację metod dla różnych typów rdzeni (lód vs. zmarzlina), przy zachowaniu spójności w usuwaniu warstwy zewnętrznej.
- Ograniczenie praktyczne: skuteczność zależy od rygorystycznego wykonania etapów skrobania i dekontaminacji chemicznej, aby uniknąć pozostałości sygnałów egzogennych.
