Name: Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę szablonowego mikrowzorcowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę adhezji komórkowej bez dodatkowych modyfikacji powierzchni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez grant NUS na rozpoczęcie działalności (R-397-000-192-133) i ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592). G.S. jest stypendystą NUS Research. Autorzy chcieliby podziękować dr Jiangwa Xing za jej wsparcie techniczne w zakresie mikrowzorcowania komórek.

UWAGA: Ten protokół opisuje wytwarzanie szablonu PDMS z wzorami 1,000 μm poprzez laserowe wycinanie i mikromodelowanie linii hESC, H9 przy użyciu szablonu PDMS.
1. Projektowanie i wykonanie szablonu PDMS do mikrowzorcowania
<ol>
	<li>Zaprojektuj arkusz szablonu z otworami przelotowymi o żądanej geometrii i rozmiarze (np. okręgi 1 000 μm) oraz uszczelkę szablonu za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo10.</li>
	<li>Wyciąć laserowo arkusz szablonu i uszczelkę na arkuszach polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 120-150 μm i 2 mm za pomocą wycinarki laserowej CO2 10.</li>
	<li>Połącz uszczelkę PDMS z arkuszem szablonu PDMS za pomocą płynnego, nieutwardzonego PDMS i piecz w temperaturze 60 °C przez 3-4 godziny, aby uzyskać szablon PDMS do mikromodelowania.</li>
	<li>Wysterylizuj szablon PDMS przez autoklawowanie w temperaturze 120 °C przez 30 minut i wysuszenie w piekarniku przed użyciem.</li>
</ol>
2. Konserwacja hESC
<ol>
	<li>Hodowlę linii hESC w pożywce konserwacyjnej bez podawania na 1× płytkach do hodowli komórkowych pokrytych matrycą błony podstawnej 1 hESC w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przejście przez hESC, gdy są one zlewające się w około 70%, przez 3 minuty inkubacji w temperaturze 37 °C z traktowaniem dyspazy i mechaniczną dysocjacją kolonii hESC na grudki o wielkości 100-200 μm. Płytkie grudki hESC o gęstości 30-50 grudek na 9,6cm2 powierzchni wzrostu na polistyrenie z hodowli tkankowej pokrytej matrycą błony podstawnej w stosunku podziału 1:6.</li>
</ol>
3. Szablonowe mikrowzory ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Przygotowanie przed modelowaniem komórek
	<ol>
		<li>Uszczelnij szablon PDMS na szalce Petriego o średnicy 60 mm, dozując 700 μl 70% etanolu klasy analitycznej w ultraczystej wodzie do szalki Petriego i umieszczając szablon na wierzchu.</li>
		<li>Umieść szalkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego na noc, aby etanol wyschł.</li>
		<li>Sprawdź, czy pod szablonem nie ma pęcherzyków, aby upewnić się, że szablon dobrze przylega do szalki Petriego. Zapobiega to wyciekom roztworu powłoki ECM. Zamknij szalkę Petriego i przechowuj w sterylnych warunkach, aż będzie gotowa do wysiewu komórek.</li>
		<li>Przygotować podwielokrotności matrycy membrany podstawnej z kwalifikacją hESC zgodnie z Certyfikatem Analizy. Upewnij się, że każda podwielokrotność daje 1× roztworu matrycy błony podstawnej z kwalifikacją hESC po rozcieńczeniu w 25 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium: Mieszanki składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) zgodnie z kartą produktu producenta.</li>
		<li>Przygotować roztwór do powlekania ECM, dodając jedną podwielokrotność matrycy błony podstawnej kwalifikowanej do hESC do 16,7 ml DMEM/F12 w celu uzyskania 1,5× roztworu matrycy błony podstawnej kwalifikowanej przez hESC. Utrzymuj cały roztwór powlekający ECM na lodzie, aby zapobiec żelowaniu.</li>
		<li>Uzupełnij pożywkę podtrzymującą hESC o inhibitor 10 μM ROCK (Y27632).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powłoka ECM na szablonowym podłożu
	<ol>
		<li>Potraktuj szalkę Petriego plazmą o mocy 100 WO2 przez 90 sekund. Aby zapewnić sterylność, pokrywę szalki Petriego wewnątrz komory plazmowej należy otwierać wyłącznie przed obróbką plazmową, a po zakończeniu obróbki szybko przykryć szalkę Petriego. Ułatwia to zwilżanie powierzchni i zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza w otworach przelotowych mikrowzoru podczas dodawania roztworu powłoki ECM.</li>
		<li>Dodać 450 μl 1,5× roztworu matrycy membrany podstawnej z kwalifikacją hESC, aby pokryć cały szablon. Uszczelnić szalkę Petriego samozgrzewalną folią, taką jak Parafilm, aby zapobiec wysychaniu roztworu, i inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew hESC na podłoże szablonowe
	<ol>
		<li>Zbadaj kolonie hESC w płytce 6-dołkowej, aby zidentyfikować zróżnicowane obszary komórek wykazujące utratę typowej morfologii hESC (np. utrata zaokrąglonej, ciasno upakowanej morfologii nabłonka, wysoki stosunek jądra do cytoplazmy z widocznymi jąderkami). Usuń zróżnicowane obszary za pomocą aspiratora próżniowego.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 2 ml DMEM/F12 na dołek.</li>
		<li>Dodać 1 ml enzymów trawiennych, takich jak Accutase, do dołka na płytce 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 minut. Delikatnie postukać w płytkę, aby odłączyć wszystkie kolonie od podłoża.</li>
		<li>Przepłukać każdą studzienkę co najmniej 4 ml DMEM/F12 na 1 ml enzymów trawiennych i zebrać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o masie 200 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać w celu usunięcia supernatantu i dodać 400 μl pożywki podtrzymującej hESC uzupełnionej inhibitorem ROCK (ROCKi) w celu ponownego zawieszenia komórek. Delikatnie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół 3 razy, aby rozbić grudki na pojedyncze komórki.</li>
		<li>Dobrze wymieszać zawiesinę jednokomórkową i rozcieńczyć 10 μl próbek komórek w 190 μl DMEM/F12 (rozcieńczenie 1:20). Użyj hemocytometru, aby określić gęstość komórek w zawiesinie komórek podstawowych.</li>
		<li>Oblicz wymaganą gęstość wysiewu komórek dla danego szablonu. 
		UWAGA: Na przykład eksperymentalnie określiliśmy gęstość wysiewu komórek w celu uzyskania zlewającej się monowarstwy pojedynczych komórek wynosi około 4,444 komórek/mm2. Tak więc szablon o powierzchni 450 mm2 i objętości wysiewu 400 μl będzie wymagał zawiesiny komórek o gęstości 2 milionów komórek / 400 μl.</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek podstawowych do wymaganej gęstości wysiewu (patrz krok 3.3.8 UWAGA) pożywką hodowlaną hESC uzupełnioną ROCKi.</li>
		<li>Dodać wyznaczoną objętość zawiesiny komórkowej zawierającej wymaganą liczbę komórek do każdego szablonu i pozostawić szalkę Petriego w spokoju w kapturze na 5 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić komórkom osiadanie.</li>
		<li>Przenieść szalkę Petriego do inkubatora i inkubować przez 1 godzinę, aby umożliwić przyłączenie komórek. Należy pamiętać, aby podczas procesu przenoszenia utrzymać szalkę Petriego na poziomie, tak aby komórki pozostały jako monowarstwa w szablonie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie szablonów i pasywacja podłoża bez wzoru
	<ol>
		<li>Zbadaj szalkę Petriego pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy komórki są prawidłowo przyczepione do podłoża znajdującego się poniżej.</li>
		<li>Odessać zawiesinę komórek z szablonu.</li>
		<li>Dodaj 2 ml / naczynie 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego zgodnego z kulturami komórkowymi w DMEM / F12 do obszaru otaczającego szablon.</li>
		<li>Użyj pary autoklawowanych kleszczy, aby delikatnie odkleić szablon. Obracaj niejonowy roztwór środka powierzchniowo czynnego podczas odklejania szablonu, aby zapobiec wysychaniu komórek. Obserwuj wzrokowo mikrowzorzyste komórki na szalce Petriego.</li>
		<li>Inkubować mikrowzorzyste komórki w 0,5% roztworze niejonowego środka powierzchniowo czynnego DMEM/F12 przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odessać niejonowy roztwór środka powierzchniowo czynnego DMEM/F12. Umyć 3 razy 2 ml / naczynie DMEM/F12.</li>
		<li>Dodać 2 ml pożywki podtrzymującej hESC uzupełnionej ROCKi i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji odessać pożywkę podtrzymującą hESC uzupełnioną ROCKi, przemyć raz DMEM/F12 i wywołać różnicowanie mezoendodermy poprzez dodanie 2 ml/naczynie pożywki różnicującej uzupełnionej 100 ng/ml aktywiny, 25 ng/ml BMP4 i 10 ng/ml FGF2.</li>
		<li>Oceń mikrowzorce za pomocą obrazowania z kontrastem fazowym i oblicz średnie profile intensywności Brachyury (T) dla każdego wzorca, jak opisano wcześniej8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Graf, T., Stadtfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of embryonic and adult stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).</li>
<li>Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).</li>
<li>Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stem+cell+fate+by+physical+interactions+with+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).</li>
<li>Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+nanotopography+and+integrin-matrix+interactions+to+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate.</a> Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).</li>
<li>Joddar, B., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+niche+substrates+for+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures.</a> J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).</li>
<li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li>
<li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li>
<li>Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+human+embryonic+stem+cells+dissects+the+mesoderm+and+endoderm+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages.</a> Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).</li>
<li>Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+WNT5a+and+WNT11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li>
<li>Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+integrin+and+E-cadherin-mediated+adhesions+to+spatially+control+heterogeneity+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).</li>
<li>Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+human+teratogen+detection+by+geometrically+confined+cell+differentiation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration.</a> Sci Rep. 5, 10038(2015).</li>
<li>Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+engineering+approaches+to+micropattern+surfaces+for+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays.</a> Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li>
<li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+human+embryonic+stem+cells+with+murine+embryonic+fibroblasts+on+microwell-patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates.</a> Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).</li>
<li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+microwell+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3-D microwell culture of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+microscaled+multilayered+colonies+leading+to+enhanced+homogeneity+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation.</a> Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).</li>
<li>Mei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+development+of+biomaterials+for+clonal+growth+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells.</a> Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).</li>
<li>Melkoumian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+peptide-acrylate+surfaces+for+long-term+self-renewal+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).</li>
<li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).</li>
<li>Carter, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haptotactic+islands%3A+a+method+of+confining+single+cells+to+study+individual+cell+reactions+and+clone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation.</a> Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).</li>
<li>Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+intracellular+calcium+and+electrical+activity+from+patterned+neural+networks+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).</li>
<li>Wright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reusable%2C+reversibly+sealable+parylene+membranes+for+cell+and+protein+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning.</a> J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li>
<li>Jinno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+multilayer+parylene-C+stencils+for+the+generation+of+patterned+dynamic+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures.</a> J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).</li>
<li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+elastomeric+membranes+as+dry+resists+and+for+dry+lift-off%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off.</a> Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).</li>
<li>Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+elastomeric+stencils+for+micropatterning+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures.</a> J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).</li>
<li>Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+neural+stem+cells+and+Purkinje+neurons+using+a+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29+stencil%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil.</a> Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroArray%3A+a+universal+interface+for+patterning+and+interrogating+neural+circuitry+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution.</a> Sci Rep. 4, 4784(2014).</li>
<li>Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydimethylsiloxane+Microstencils+Molded+on+3-D-Printed+Templates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microelectromech+S%22%5BJournal%5D)">Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates.</a> J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).</li>
<li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+polydimethylsiloxane+substrates+with+tunable+elastic+modulus+to+study+cell+mechanobiology+in+muscle+and+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve.</a> PLoS One. 7 (12), 51499(2012).</li>
<li>Chowdhury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+properties+of+the+cell+dictate+stress-induced+spreading+and+differentiation+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells.</a> Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).</li>
<li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).</li>
<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).</li>
<li>Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+substrate+stiffness+on+early+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation.</a> J Biol Eng. 7 (1), 7(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Produkcja szablonów do mikrowzorów
Mikrowzorce szablonowe stanowią idealną metodę generowania mikrowzorców hPSC do badania wzorców różnicowania za pośrednictwem niszy. Kluczową zaletą szablonu w porównaniu z innymi technikami mikrowzorów, takimi jak druk mikrokontaktowy i fotomodelowanie, jest to, że nie wymaga modyfikacji powierzchni i może być zaimplementowany na konwencjonalnych podłożach TCPS. W związku z tym zoptymalizowane podłoża hodowlane i powłoki ECM dla róż...

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC), w tym embrionalne komórki macierzyste (hESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), są szeroko wykorzystywane w medycynie regeneracyjnej, jak również w eksperymentalnym modelowaniu normalnej i chorej organogenezy ze względu na ich potencjał różnicowania do linii komórkowych wszystkich trzech listków zarodkowych1,2. Losy różnicowania hPSC są bardzo wrażliwe na lokalne czynniki środowiskowe, które mogą modulować sygnalizację autokrynną lub parakrynną1, a także procesy mechanotransdukcji, w których pośredniczą sygnały fizyczne3-5. Mikrowzorce komórkowe obejmują zestaw technik, które zostały opracowane w celu przestrzennego organizowania geometrii i lokalizacji populacji komórek jako środka do kontrolowania lokalnego mikrośrodowiska komórkowego, takiegojak interakcje komórka-komórka6 i interakcje komórka-macierz3. W kontekście hPSC zastosowano mikrowzorce komórkowe w celu uzyskania istotnych informacji na temat tego, w jaki sposób zależna od niszy sygnalizacja autokrynna moduluje decyzje dotyczące różnicowania pluripotencjihESC 7 i organizację we wczesnych wzorcach różnicowania embrionalnego6. Mikrowzorce 2D i 3D hPSC wykorzystano do kontrolowania wielkości kolonii wzorców wielokomórkowych, co z kolei wpłynęło na decyzje o różnicowaniu w trzech listkach rozrodczych8,9. Zastosowaliśmy wielokomórkowe mikrowzorce hPSC do modulowania zakresu interakcji komórka-komórka i komórka-macierz w kolonii hPSC, aby zbadać, w jaki sposób przesłuch integryny-E-kadheryny może powodować niejednorodność losu komórki10. Demonstracje wynikające z powyższych raportów otwierają nowe możliwości w kierunku zastosowania wielokomórkowych mikrowzorców hPSC jako modeli eksperymentalnych do badań przesiewowych toksyczności leków w chorobach rozwojowych11, do badania wpływu czynników wzrostu i hormonów podczas rozwoju tkanek lub narządów oraz do rozwikłania procesu powstawania wzorców tkankowych.
Niezliczona ilość technik mikrowzorcowania komórek została opracowana, jak zrecenzowali Falconnet i inni.12, ale tylko garstka, taka jak druk mikrokontaktowy7,8,13, hodowla mikrostudzienek14,15, fotowzorce6 i mikroszablony16 zostały z powodzeniem wdrożone z wykorzystaniem hPSC. Wyzwanie związane z mikrowzorcowaniem hPSC polega na ich podatności i rygorystycznych wymaganiach dotyczących określonych matryc zewnątrzkomórkowych (ECM) i warunków wzrostu dla przyczepienia i przeżycia komórek. W przypadku wzorów 2D hPSC druk mikrokontaktowy jest jedną z najczęstszych metod generowania mikrowzorów hPSC na kulturach tkankowych i podłożach szklanych13. Metodę tę można wykorzystać do modelowania powszechnego ECM stosowanego w hodowli hPSC, w tym lamininy i matryc błony podstawnej, takich jak Matrigel. Jednak zazwyczaj wymaga dwuetapowego procesu powlekania wspomaganego poli-D-lizyną i wymaga określonych obojętnych warunków atmosferycznych i wilgotnościowych, aby uzyskać stabilne mikrowzorce ECM, które hPSC mogą przyczepić się do6,13. Najważniejszą kwestią przy każdej metodzie mikrowzorcowania jest to, czy reżim modyfikacji powierzchni może generować wzorce ECM z klejem hPSC w pożądanej rozdzielczości geometrycznej, jednocześnie minimalizując niespecyficzne przyczepianie komórek do otaczających obszarów.
Tutaj opisujemy użycie mikrowzorów szablonowych jako prostej metody generowania mikrowzorów hPSC bez dodatkowych etapów modyfikacji powierzchni przed wygenerowaniem samoprzylepnych wzorów ECM do przyczepienia hPSC. Szablon komórki składa się z cienkiej membrany, np. arkusza polidimetylosiloksanu (PDMS), z otworami przelotowymi o rozmiarach od mikronów do milimetrów uszczelnionymi na podłożu do hodowli komórkowej, aby fizycznie zawierać powłoki ECM, a następnie wysiewane hPSC. Ponieważ tworzenie wzorów szablonowych polega na fizycznym ograniczeniu miejsca, w którym hPSC może uzyskać dostęp i przyczepić się bezpośrednio do podłoża pokrytego ECM, metoda ta jest kompatybilna z różnymi substratami, które mogą wspierać kultury hPSC. Jedynym wymogiem jest to, że wybór materiału szablonu może tworzyć odwracalne uszczelnienie z podłożem. Substraty te obejmują konwencjonalny polistyren z hodowli tkankowych (TCPS)17, substraty sprzężone z ligandami18, a także substraty elastomerowe o regulowanej sztywności (np. PDMS)19. Metoda ta umożliwia również powlekanie różnymi ECM, takimi jak witronektyna (lub białko VTN), laminina i matryce błony podstawnej (np. Matrigel i Geltrax), aby umożliwić prawidłowe przyłączanie i różnicowanie hPSC. W związku z tym możemy przenieść zoptymalizowane konfiguracje substratów ECM dla określonej linii hPSC do mikrowzorców szablonowych w celu uzyskania optymalnej adhezji, przeżycia i różnicowania macierzy komórkowej. Ostatnio doniesiono również o podobnej metodzie kierowania różnicowaniem wątroby poprzez mikromodelowanie hESC przy użyciu matryc mikroszablonowych z poli(metakrylanu metylu) (PMMA)16.
Szablony komórkowe mogą być wykonane z różnych materiałów, w tym metali20,21, polimerów poli(p-ksylilenowych)22,23, PMMA16 i najczęściej PDMS24-28. Szablony z polimerów krzemu i poli(p-ksylilenu) wymagają bezpośredniego wytrawiania otworów przelotowych specjalistycznym sprzętem20-23, co ogranicza ich dostępność dla użytkowników biologicznych. Szablony PDMS mogą być wytwarzane różnymi metodami w zależności od wymaganego rozmiaru elementu, który zwykle waha się od 3 μm do 2,000 μm11,26-29. Jeśli pożądane są małe elementy, cienkie arkusze szablonów można wyprodukować poprzez formowanie na prasie prepolimeru PDMS na mikroprefabrykowanym szablonie silikonowym zawierającym reliefy mikrowzorów28. W przypadku cech > 1,000 μm, wycinarka laserowa CO2 zapewnia łatwą i tanią metodę bezpośredniego wycinania wzorów na wstępnie odlanym arkuszu PDMS podczas produkcji szablonu. Możliwość recyklingu szablonów PDMS sprawia również, że przeprowadzanie serii eksperymentów z wystarczającą spójnością jest opłacalne.
Tutaj prezentujemy szczegółową metodologię wytwarzania szablonu PDMS o cechach 1000 μm poprzez cięcie laserowe i generowanie mikrowzorów hESC. Te mikrowzorce hESC wykorzystano do modulowania zakresu adhezji za pośrednictwem integryny i E-kadheryny w obrębie spójnej kolonii hESC, aby zbadać, w jaki sposób przestrzenna polaryzacja adhezji komórek doprowadziła do niejednorodności losu komórki10.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Arkusz PDMS o grubości 2 mm</td><td>Specialty Silicone Products Inc., USA</td><td>SSPM823-.005</td><td>Służy do tworzenia zbiornika na szablon</td></tr><tr><td>120-150 &mu; m gruby arkusz PDMS</td><td>Specialty Silicone Products Inc., USA</td><td>SSPM823-.040</td><td>Służy do tworzenia szablonu&nbsp;</td></tr><tr><td>60 mm szalka Petriego</td><td>Nunc Nunclon Delta</td><td>150326</td><td>Podłoże do mikromodelowania</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Accutase, Merck Millipore, Singapore</td><td>SCR005</td><td>Enzym do rozbijania komórek H9 na pojedyncze komórki</td></tr><tr><td>Activin&nbsp; &nbsp;</td><td>R& D Systems, Singapur</td><td>338-AC-010</td><td>Czynnik wzrostu dla różnicowania H9</td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>R& D Systems, Singapur</td><td>338-BP-010</td><td>Czynnik wzrostu do różnicowania H9</td></tr><tr><td>System plazmowy&nbsp;</td><td>Femto Science, Korea</td><td>CUTE-MP</td><td>Do plazmowego utleniania szablonu</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell&trade; Technologie, Singapur</td><td>7923</td><td>Enzym stosowany do osłabiania adhezji komórka-ECM podczas pasażowania</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO, USA</td><td>11330032</td><td>Podłoże podstawowe dla komórek H9</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems, Singapur</td><td>233&ndash; FB&ndash; 025</td><td>Czynnik wzrostu różnicowania H9</td></tr><tr><td>Linia komórkowa H9</td><td>WiCell Research Institute, Inc., USA</td><td>WA09</td><td>Ludzkie embrionalne komórki macierzyste</td></tr><tr><td>Macierz błony podstawnej z kwalifikacją hESC</td><td>Matrigel, BD Biosciences, Singapur</td><td>354277</td><td>Powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej wspomagająca wzrost komórek H9</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Leica Microsystems, Singapur</td><td>DMi1</td><td>Do rejestrowania jasnego pola zdjęcia</td></tr><tr><td>Wycinarka laserowa</td><td>Epilog Helix 24 System</td><td></td><td>laserowy Służy do generowania otworów przelotowych w arkuszu PDMS</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; 1 średni&nbsp;</td><td>StemCell&handel; Technologies, Singapore</td><td>5850</td><td>Pożywka konserwacyjna dla komórek H9</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>SYLGARD&reg; 184, Dow Corning Co., USA</td><td>3097358-1004</td><td>Służy do przyklejania szablonu i rezerwatora PDMS</td></tr><tr><td>ROCKi Y27632</td><td>Calbiochem, Merck Millipore, Singapur</td><td>688000</td><td>Utrzymuje komórki H9 jako pojedyncze komórki&nbsp;</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade; APEL&trade; średni&nbsp;</td><td>StemCell&handel; Technologies, Singapur</td><td>5210</td><td>Pożywka różnicująca dla komórek H9</td></tr><tr><td>Folia z politereftalanu etylenu</td><td>SureMark</td><td>Singapore SQ-6633</td><td>Służy do tworzenia szablonu&nbsp;</td></tr><tr><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny kompatybilny z kulturami komórkowymi</td><td>Kwas pluronowy F-127, Sigma, Singapur</td><td>P2443</td><td>Odczynnik pasywacyjny do odpychania adhezji komórek w podłożach bez mikrowzorów</td></tr></tbody></table>

szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC), w tym embrionalne komórki macierzyste i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, mają wewnętrzną zdolność do różnicowania się we wszystkie trzy listki zarodkowe. To sprawia, że są one atrakcyjnym źródłem komórek dla medycyny regeneracyjnej i eksperymentalnego modelowania prawidłowej i chorej organogenezy. Jednak różnicowanie hPSC in vitro jest niejednorodne i przestrzennie nieuporządkowane. Technologie mikromodelowania komórek potencjalnie oferują środki do przestrzennej kontroli mikrośrodowisk komórek macierzystych i organizowania wynikających z nich losów różnicowania. Mikrowzorce hPSC muszą uwzględniać rygorystyczne wymagania dotyczące przeżycia i utrzymania hPSC. W tym miejscu opisujemy mikrowzory szablonowe jako metodę, która jest wysoce kompatybilna z hPSC. Mikrowzory hPSC są określone przez geometrię otworów przelotowych szablonu komórkowego, które fizycznie ograniczają miejsca, w których hPSC mogą uzyskać dostęp i przyczepić się do leżącego pod spodem podłoża pokrytego macierzą zewnątrzkomórkową. Ze względu na ten tryb działania istnieje większa elastyczność w stosowaniu substratów, które mogą odpowiednio wspierać hPSC w porównaniu z innymi metodami mikromodelowania komórek. Zwracamy również uwagę na kluczowe etapy pomyślnego generowania mikrowzorców hPSC. Jako przykład pokazujemy, że szablonowe mikrowzorce hPSC mogą być wykorzystywane do modulowania przestrzennej polaryzacji adhezji komórka-komórka i komórka-macierz, co z kolei determinuje wzorce różnicowania mezoendodermy. Ta prosta i solidna metoda mikromodelowania hPSC poszerza perspektywy tworzenia modeli eksperymentalnych w celu zbadania organizacji i wzorców tkanek we wczesnym okresie rozwoju embrionalnego.

W niniejszej pracy opisujemy wykonanie szablonu komórkowego przy użyciu wycinarki laserowej do generowania elementów o rozmiarze 1 0 µm. Szablon składał się z 2 części: cienkiej arkusza szablonowego (o grubości około 10-200 µm) zawierającego mikroperforacje oraz uszczelki z PDMS do utrzymania roztworu powłoki ECM lub zawiesiny komórek. W tym przypadku jako arkusz szablonowy i uszczelkę zastosowano odpowiednio dostępne komercyjnie arkusze PDMS o grubości 127 µm i 2 mm. Do wykonania tych el...

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Ogólnym celem tej metody mikrowzorowania opartej na szablonie dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych jest zapewnienie prostego i niezawodnego sposobu generowania przestrzennych gradientów środowiskowych, które kontrolują wzorce różnicowania komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wzorowania tkanek z wykorzystaniem modelu ludzkich komórek macierzystych, na przykład w kwestii tego, w jaki sposób przestrzenne gradienty sił adhezji międzykomórkowej oraz adhezji komórek do macierzy mogą pomagać w organizowaniu przeznaczenia różnicowania komórek macierzystych. Zaletą tej metody jest to, że nie wymaga ona dodatkowej modyfikacji powierzchni w celu wygenerowania adhezyjnych dla komórek wzorów ECM, do których komórki mogłyby się przytwierdzić.Oznacza to, że metoda ta jest kompatybilna z różnymi konfiguracjami ECM i podłoży, specyficznymi dla każdej linii komórkowej. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy mikrowzorowania są trudne do opanowania, gdyż wymagają one precyzyjnego i ostrożnego obchodzenia się ze szablonem oraz komórkami.Przed przystąpieniem do tej procedury szablony PTMS muszą zostać zaprojektowane i wykonane. Podobnie, należy przygotować ludzkie komórki EFC hodowane na macierzy błony podstawnej w taki sposób, aby kolonie były gotowe do wysiewu w dalszej części procedury. Aby rozpocząć, do szalki należy nalać 700 µL 70% etanolu klasy analitycznej w wodzie ultra-czystej.Następnie należy położyć szablon z PDMS na roztworze i umieścić szalkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu wysuszenia przez noc. Następnego dnia należy sprawdzić, czy pod szablonem nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie należy przygotować szalkę do momentu, gdy komórki będą mogły zostać wysiane na szablonie.Przygotuj alikwot macierzy błony podstawnej o jakości odpowiedniej dla ludzkich ESC, dodając 16,7 mililitrów DMF12, aby uzyskać roztwór 1,5x, i przechowuj go w lodzie. Poddaj podłoże działaniu plazmy tlenowej o mocy 100 watów przez 90 sekund. Nie otwieraj naczynia, dopóki nie znajdzie się ono w komorze plazmowej, a po zakończeniu zabiegu szybko je przykryj.Obróbka ta zapobiegnie tworzeniu się pęcherzyków powietrza podczas zanurzania podłoża w roztworze. Teraz pokryj szablon 450 µL przygotowanego 1,5x roztworu macierzy błony podstawnej. Następnie uszczelnij płytkę parafiliem i inkubuj przez pięć godzin.Przed przejściem do kolejnego etapu należy sprawdzić sześciodołkowe płytki z przygotowanymi koloniami HESC. Należy zidentyfikować i odessać kolonie zróżnicowanych komórek, które utraciły typową morfologię HESC. Wszystkie kolonie powinny mieć zaokrąglony kształt, gęsto upakowaną morfologię nabłonkową oraz wysoki stosunek jądra do cytoplazmy z wyraźnymi jąderkami.Następnie każdą studzienkę z wysianymi komórkami należy przemyć dwukrotnie 2 mL DMF12. Po drugim przemyciu do każdej studzienki dodaje się 1 mL enzymów trawiennych, takich jak accutase, a płytkę inkubuje przez 8 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji płytkę delikatnie opukuje, aby odłączyć wszystkie kolonie od podłoża.Następnie należy przepłukać każdą studzienkę co najmniej czterema mililitrami pożywki na każdy mililitr enzymu trawiennego dodanego do studzienki, a zawiesiny komórkowe zebrać do jednej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Komórki należy wirować przy 200 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej w celu utworzenia granulatu komórkowego. Następnie odsysamy nadsącz i ponownie zawieszamy komórki w 400 µL pożywki do utrzymania HESC, uzupełnionej o 10 µM inhibitora ROCK.Krótko i delikatnie utrzyturuj komórki trzy razy, aby rozbić skupiska. Następnie skoryguj gęstość zawiesiny. Dokładnie wymieszaj i przygotuj 200 µL rozcieńczenia 1:20 w medium.Policz komórki w rozcieńczeniu za pomocą hemocytometru. Następnie, w razie potrzeby, rozcieńcz główną zawiesinę, używając pożywki z inhibitorem ROCK. Aby kontynuować, nanieś wymaganą liczbę komórek na każdy przygotowany szablon.Należy nanieść jedynie monowarstwę komórek, dlatego należy je rozprowadzić równomiernie. Pozostaw szablon w spokoju na pięć minut, aby komórki mogły osiąść. Następnie ostrożnie przenieś załadowane szablony do inkubatora, utrzymując naczynia w poziomie przez cały czas przenoszenia.Pozostaw komórki do przytwierdzenia do szablonów podczas jednogodzinnej inkubacji. Po przytwierdzeniu komórek obejrzyj je pod mikroskopem, aby upewnić się, że proces przebiegł prawidłowo. Przenieś szablon z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza i odessij nieprzytwierdzone komórki z szablonu.Następnie do obszaru wokół szablonu należy dodać dwa mililitry 0,5% kompatybilnego surfaktantu niejonowego w DMF12. Należy delikatnie zamieszać roztwór, aby pokrył on szablon. Następnie, używając autoklawowanej pęsety, należy ostrożnie odkleić szablon od szalki.Po usunięciu szablonu należy obejrzeć komórki poddane mikrowzorcowaniu pod mikroskopem. Niejonowy surfaktant zapobiega wysychaniu tych komórek. Pozostaw komórki poddane mikrowzorcowaniu do inkubacji w roztworze pożywki z dodatkiem surfaktantu przez 10 minut w temperaturze 37 °C.Po 10 minutach odessać roztwór, a następnie trzykrotnie przemyć płytkę dwiema mililitrami standardowej pożywki DMF12. Po przemyciu dodać dwa mililitry pożywki do utrzymania HESC z inhibitorem ROCK. Ponownie sprawdzić komórki, aby upewnić się, że mikrowzory uformowały się prawidłowo.Następnie inkubować komórki w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia odessać medium, wypłukać komórki raz za pomocą DMF12, a następnie dodać 2 mL uzupełnionego medium różnicującego, aby zaindukować różnicowanie komórek w kierunku mezoendodermy. W późniejszym czasie przeanalizować wyniki.Wytworzenie szablonu do hodowli komórkowej za pomocą wycinarki laserowej pozwoliło na uzyskanie elementów o rozmiarze 1000 µm. Szablon składał się z cienkiej arkuszowej folii z mikrowzorowanymi otworami przelotowymi oraz uszczelki z PDMS, służącej do utrzymania komórek. Przy użyciu tego narzędzia badano mikrowzorowane HESCs podczas różnicowania w mezoendodermę.Obrzeża kolonii H9-HESC wykazują silniejsze adhezje integrynowe niż komórki wewnątrz kolonii. W konsekwencji komórki te różnicują się w brachiary T-dodatnie komórki mezoendodermy pod wpływem aktywiny, BMP4 oraz FGF2. Gdy komórki te uformowano w monowarstwy o różnych geometriach, kąty proste (zarówno geometryczne, jak i izotropowe) oraz wypukłe krzywizny doprowadziły do lokalnej koncentracji sił trakcyjnych zależnych od integryn, co skutkowało zwiększoną różnicowaniem w kierunku mezoendodermy.Intensywność ekspresji T w różnych obszarach w obrębie jednej kolonii wykazała, że zakres indukcji mezoendodermy był rzeczywiście wyższy w ostrych narożnikach kolonii kwadratowych i prostokątnych oraz w wypukłych zakrzywieniach łuku półkolistego. Dowodzi to, że siły mechaniczne pośredniczone przez adhezję komórkową mogą być modulowane przy użyciu opisanego метода. Przed przystąpieniem do procedury ważne jest zoptymalizowanie czasu powlekania macierzą, czasu trawienia i przywierania komórek dla konkretnej linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, z którą się pracuje.

stencil-micropatterning-human-pluripotent-stem-cells-for-probing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Kierowana różnicowanie hESC w konkretne komórki wzbudziło duże zainteresowanie w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół służący do określania losów wybranych hESC in vivo, który stanowi cenne narzędzie do charakteryzacji reagentów specyficznych dla tkanek w terapiach komórkowych.

Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez tworzenie potworniaków

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiamy protokół do wydajnej, masowej i szybkiej chemicznej rewersji konwencjonalnych linii komórek ludzkich o uprzywilejowanej linii pluripotentnych komórek macierzystych (hPSC) w epigenomicznie stabilny naiwny stan pluripotentny przypominający epiblast preimplantacyjny. Metoda ta powoduje zmniejszenie ekspresji genów o uprzywilejowanej linii i znaczną poprawę kierowanej różnicowania wieloliniowego w szerokim zakresie konwencjonalnych linii hPSC.

Chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich komórek pluripotentnych do stanu naiwnego z poprawioną wieloliniową zdolnością do różnicowania

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Dostępne systemy różnicowania komórek macierzystych pluripotencjalnych (PSC) do funkcjonalnych komórek są obecnie utrudnione przez problemy związane z poważną zmiennością między liniami i między partiami. Tutaj, używając różnicowania serca jako głównego przykładu, przedstawiamy protokół inteligentnego monitorowania i modulowania procesu różnicowania PSC w oparciu o uczenie maszynowe oparte na obrazie.

Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę szablonowego mikrowzorcowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę adhezji komórkowej bez dodatkowych modyfikacji powierzchni.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania (Wideo) | JoVE Journal

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Przeglądaj więcej filmów