Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Ogólnym celem tej opartej na szablonach metody mikrowzorcowania dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych jest zapewnienie prostego i solidnego sposobu generowania przestrzennych gradientów środowiskowych, które kontrolują wzorce różnicowania komórek macierzystych. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące modelowania wzorców tkankowych przy użyciu modelu ludzkich komórek macierzystych, takie jak to, w jaki sposób gradienty przestrzenne w siłach adhezji komórka-komórka i matryca komórkowa mogą pomóc w organizacji losów różnicowania komórek macierzystych. Zaletą tej metody jest to, że nie wymaga ona dodatkowej modyfikacji powierzchni w celu wygenerowania wzorów ECM adhezji komórek, do których komórki mogą się przyłączyć.

Oznacza to, że metoda jest kompatybilna z różnymi konfiguracjami ECM i substratów, specyficznymi dla każdej linii komórkowej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy tworzenia mikrowzorów są trudne do nauczenia. Ponieważ wymaga precyzyjnego i ostrożnego obchodzenia się z szablonem i komórkami.

W przypadku tej procedury szablony PTMS muszą być już zaprojektowane i wykonane. Podobnie, ludzkie komórki EFC rosną na macierzy błony podstawnej, tak aby kolonie były gotowe do wysiewu w dalszej części procedury. Na początek załaduj naczynie 700 mikrolitrami 70% etanolu klasy analitycznej do ultraczystej wody.

Następnie umieść szablon PDMS na roztworze i umieść naczynie w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby wyschło przez noc. Następnego dnia sprawdź, czy pod szablonem nie utworzyły się bąbelki. Następnie ułóż naczynie na ziemi, aż komórki będą mogły zostać wysiane na szablonie.

Przygotuj porcję matrycy błony podstawnej o jakości ludzkiego ESC, dodając 16,7 mililitra DMF12, aby uzyskać 1,5-krotny roztwór i utrzymuj go na lodzie. Potraktuj podłoże 100 watami plazmy tlenowej przez 90 sekund. Nie otwieraj naczynia, dopóki nie znajdzie się w komorze plazmowej, a po zabiegu szybko je przykryj.

Zabieg ten zapobiegnie tworzeniu się pęcherzyków, gdy podłoże jest zanurzone w roztworze. Teraz przykryj szablon 450 mikrolitrami przygotowanego 1,5x roztworu matrycy membrany podstawnej. Następnie zamknij naczynie parafilmem i inkubuj je przez pięć godzin.

Zanim przejdziesz dalej, sprawdź sześć płytek dołkowych przygotowanych kolonii HESC. Zidentyfikuj i odessaj kolonie zróżnicowanych komórek, które utraciły swoją typową morfologię HESC. Wszystkie powinny wydawać się zaokrąglone, mieć ciasno upakowaną morfologię nabłonka i mieć wysoki stosunek jądra do cytoplazmy z wydatnymi jąderkami.

Następnie umyj każdą studzienkę platerowanych komórek dwoma mililitrami DMF12 dwa razy. Po drugim umyciu dodaj jeden mililitr enzymów trawiennych do każdego dołka, takich jak akutaza i inkubuj płytkę przez osiem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji delikatnie postukaj w płytkę, aby oderwać wszystkie kolonie od podłoża.

Następnie przepłucz każdą studzienkę co najmniej czterema mililitrami pożywki na każdy mililitr enzymu trawiennego zastosowanego do studzienki i zbierz zawiesiny komórkowe do jednej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki o masie 200 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby utworzyć osad komórkowy. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 400 mikrolitrach pożywki konserwacyjnej HESC, uzupełnionej 10 mikromolami inhibitora skały.

Delikatnie rozetrzeć komórki trzy razy, aby rozbić grudki. Następnie skoryguj gęstość zawiesin. Dobrze wymieszaj i rozcieńcz 200 mikrolitrów w stosunku 1:20 na podłożu.

Policz komórki w rozcieńczeniu za pomocą hemocytometru. Następnie w razie potrzeby rozcieńczyć główną zawiesinę, używając pożywki z inhibitorem skał. Aby kontynuować, dodaj wymaganą liczbę komórek do każdego przygotowanego szablonu.

Powinna zostać osadzona tylko jedna warstwa komórek, więc rozłóż je równomiernie. Pozostaw szablon w spokoju przez pięć minut, aby komórki mogły się uspokoić. Następnie ostrożnie przenieś załadowane szablony do inkubatora, utrzymując naczynia poziomo przez cały czas przenoszenia.

Pozwól komórkom przyczepić się do szablonów przez godzinę inkubacji. Po umożliwieniu przyczepienia się komórek zbadaj je pod mikroskopem, aby upewnić się, że zrobiły to prawidłowo. Przenieś szablon z powrotem do kaptura i odessaj nieprzymocowane komórki z szablonu.

Następnie dodaj dwa mililitry 0,5% kompatybilnego niejonowego środka powierzchniowo czynnego w DMF12 do obszaru otaczającego szablon. Zamieszaj roztwór, aby zakryć szablon. Następnie użyj pary autoklawowanych kleszczy, aby delikatnie oderwać szablon od naczynia.

Po usunięciu szablonu sprawdź komórki mikropatterendu pod mikroskopem. Niejonowy środek powierzchniowo czynny zapobiega wysychaniu tych komórek. Pozwól komórkom mikropatterendu inkubować w roztworze pożywki uzupełnionym środkiem powierzchniowo czynnym przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 10 minutach odessać roztwór i trzykrotnie umyć płytkę dwoma mililitrami normalnego podłoża DMF12. Po umyciu dodaj dwa mililitry pożywki konserwacyjnej HESC z inhibitorem skał. Jeszcze raz sprawdź komórki, aby sprawdzić, czy mikrowzory uformowały się prawidłowo.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia odessać pożywkę, przemyć komórki raz DMF12, a następnie dodać dwa mililitry uzupełnionej pożywki różnicującej, aby skłonić komórki do różnicowania mezoendodermy. Później przeanalizuj wyniki.

Wykonanie szablonu komórkowego za pomocą wycinarki laserowej zapewniło cechy 1000 mikronów. Szablon składał się z cienkiego arkusza szablonu z mikrowzorzystymi otworami przelotowymi oraz uszczelki PDMS używanej do przechowywania komórek. Za pomocą tego narzędzia badano mikropatterenowane HESC podczas różnicowania mezoendodermy.

Peryferie kolonii H9-HESC mają wyższe adhezje integrynowe niż komórki we wnętrzu kolonii. W ten sposób komórki różnicują się w T-dodatnie komórki mezoendodermy ramiennej, gdy są indukowane aktywanem, BMP4 i FGF2. Kiedy takie komórki były uformowane w monowarstwy o różnych geometriach, geometryczne i izotropijne kąty proste oraz wypukłe krzywizny doprowadziły do lokalnej koncentracji sił trakcyjnych za pośrednictwem integryny i spowodowały zwiększone różnicowanie mezoendodermy.

Intensywność ekspresji t w różnych miejscach w obrębie jednej kolonii wykazała, że zakres indukcji mezo endodermy był rzeczywiście wyższy w ostrych rogach kwadratowych i prostokątnych kolonii oraz przy wypukłych krzywiznach półkolistego łuku. Pokazuje to, że siły mechaniczne, w których pośredniczy adhezja komórek, mogą być modulowane za pomocą opisanej metody. Przed przystąpieniem do zabiegu ważne jest, aby zoptymalizować czas powlekania matrycy, trawienie komórek i czas przyłączania dla konkretnej ludzkiej pluripotencjalnej linii komórek macierzystych, z którą pracujesz.