Name: Izolacja chromosomów gigantycznej szczotki lampowej z żywych oocytów żab i salamander (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę izolacji chromosomów lampbrush z oocytów płazów. Technika ta umożliwia obserwację struktury chromosomów i aktywności transkrypcyjnej przy użyciu mikroskopii świetlnej oraz hybrydyzacji in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem R01 GM33397. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. J.G.G. jest profesorem genetyki rozwojowej w American Cancer Society.

<ol><li>Purkinje, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPurkinje%2C+JE+%22Symbolae+ad+ovi+avium+historiam+ante+incubationem%22">Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem</a>. , Leopold Vossi. (1830).</li>
<li>Rückert, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Entwickelungsgeschichte+des+Ovarialeies+bei+Selachiern%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Anz%22%5BJournal%5D)">Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern.</a> Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).</li>
<li>Callan, H. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCallan%2C+HG+%22Lampbrush+Chromosomes%22">Lampbrush Chromosomes</a>. 36, Springer-Verlag. (1986).</li>
<li>Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGall%2C+JG+%22Xenopus+laevis%3A+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology%22">Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology</a>. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).</li>
<li>Gall, J. G., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+contents+of+isolated+Xenopus+germinal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles.</a> Methods. 51, 45-51 (2010).</li>
<li>Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tips+and+tricks+for+preparing+lampbrush+chromosome+spreads+from+Xenopus+tropicalis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes.</a> Methods. 51, 37-44 (2010).</li>
<li>Morgan, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+oocyte+nuclei%3A+cytological+preparations+of+active+chromatin+and+nuclear+bodies+from+amphibian+germinal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles.</a> Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).</li>
<li>Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oocyte+nucleus+isolated+in+oil+retains+in+vivo+structure+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions.</a> Biotechniques. 13, 238-246 (1992).</li>
<li>Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies%2C+nucleoli%2C+and+speckles+in+the+Xenopus+oocyte+nucleus+have+a+low-density%2C+sponge-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure.</a> Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).</li>
<li>Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+images+of+RNA+polymerase+II+transcription+units%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Live images of RNA polymerase II transcription units.</a> Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octagonal+nuclear+pores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Octagonal nuclear pores.</a> J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).</li>
<li>Löschberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+visualizes+the+eightfold+symmetry+of+gp210+proteins+around+the+nuclear+pore+complex+and+resolves+the+central+channel+with+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution.</a> J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).</li>
<li>Gottfert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coaligned+dual-channel+STED+nanoscopy+and+molecular+diffusion+analysis+at+20+nm+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution.</a> Biophys J. 105, L01-L03 (2013).</li>
<li>Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+incorporation+by+isolated+amphibian+oocytes%3A+III.+Optimum+incubation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions.</a> J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).</li>
<li>Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+J+%22Cells%3A+A+Laboratory+Manual%22">Cells: A Laboratory Manual</a>. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).</li>
<li>Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSinger%2C+RH+%22Cells%3A+A+Laboratory+Manual%22">Cells: A Laboratory Manual</a>. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).</li>
<li>Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+intronic+sequence+RNA+%28sisRNA%29%2C+a+new+class+of+noncoding+RNA+from+the+oocyte+nucleus+of+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis.</a> Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).</li>
<li>Talhouarne, G. J., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lariat+intronic+RNAs+in+the+cytoplasm+of+Xenopus+tropicalis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes.</a> RNA. 20, 1476-1487 (2014).</li>
<li>Duryee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+and+non-mitotic+chromosome+pairs+from+frog+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Exp.+Zellforsch%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs.</a> Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwsze obserwacje "żywych" LBC z ręcznie izolowanych GV żab i salamander zostały wykonane prawie 80 lat temu przez amerykańskiego biologa Williama Duryee, przed wprowadzeniem kontrastu fazowego i mikroskopii DIC, przed fluorescencyjnym barwieniem immunologicznym i przed FISH. Zalety LBC w badaniu szczegółów struktury chromosomów i transkrypcji na poziomie poszczególnych genów wymagały opracowania technik mocowania LBC do szkiełek szkiełkowych, utrwalania ich w realistyczny sposób oraz stosowania technik mole...

Większość kręgowców, z wyjątkiem torbaczy i ssaków łożyskowych, produkuje duże jaja żółtkowe. Pomimo swoich czasami ogromnych rozmiarów, jaja te są pojedynczymi komórkami, które osiągają swój ostateczny wymiar jeszcze w jajniku samicy. Jaja jajnikowe nazywane są oocytami i każda z nich zazwyczaj zawiera pojedyncze gigantyczne jądro, znane od początkuXIX wieku jako pęcherzyk zarodkowy lub po prostu GV. 1 Oocyty pospolitych żab laboratoryjnych, Xenopus laevis i Xenopus tropicalis, osiągają maksymalną średnicę odpowiednio 1,2 mm i 0,8 mm (ryc. 1). GV z dojrzałych oocytów tych dwóch żab mają średnicę 0,3 - 0,4 mm (ryc. 2, 3). Salamandry mają zazwyczaj jeszcze większe oocyty i GV. W pełni dojrzałe oocyty meksykańskiego aksolotla Ambystoma mexicanum mają średnicę ponad 2 mm, a GV wynosi około 0,5 mm. Jądra te są więc łatwo widoczne gołym okiem i można nimi manipulować na wiele sposobów, co jest niemożliwe w przypadku jąder typowych komórek somatycznych.
Równie niezwykły jest gigantyczny rozmiar chromosomów w GV, fakt rozpoznany już pod koniecXIX wieku. Poszczególne chromosomy Ambystomy i innych salamander mogą mieć do 1 mm długości (ryc. 4, 5). Te z Xenopus są znacznie mniejsze, chociaż przy długości do 100 μm lub większej przyćmiewają typowe chromosomy somatyczne większości organizmów. Ważną cechą chromosomów oocytów jest ich niezwykła aktywność transkrypcyjna, która prowadzi do jednej z ich najbardziej charakterystycznych cech morfologicznych - setek sparowanych pętli bocznych (ryc. 5). Każda pętla składa się z jednej lub kilku jednostek transkrypcyjnych, które aktywnie syntetyzują RNA. Pętle nadają chromosomom oocytów rozmyty wygląd, co doprowadziło do nazwy chromosom "lampbrush" ze względu na ich powierzchowne podobieństwo do szczotek używanych we wcześniejszych czasach do czyszczenia kominów lamp naftowych. cyfra arabska
Tematem tego artykułu jest wykorzystanie izolowanych GV do badania LBC i organelli jądrowych (jąderka, ciała locus histonów i plamki). Zostaną opisane dwie dość różne techniki. W pierwszej, bardziej powszechnej technice, GV są izolowane w roztworze soli za pomocą kleszczy jubilerskich, krótko płukane w celu usunięcia przylegającego żółtka, a następnie usuwa się otoczkę jądrową, ponownie za pomocą kleszczy jubilerskich. Galaretowatą zawartość, zawierającą LBC i organelle jądrowe, pozostawia się do osadzenia na szklanym szkiełku mikroskopowym lub szkiełku nakrywkowym. Takie preparaty można badać bezpośrednio za pomocą kontrastu fazowego lub mikroskopii DIC. Alternatywnie, preparaty można odwirować w celu przyłączenia LBC i organelli do szkiełka podstawowego lub szkiełka nakrywkowego. Takie preparaty można następnie przetworzyć do szczegółowej analizy molekularnej kwasów nukleinowych i białek, głównie za pomocą immunofluorescencji i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). 3-7
Druga technika polega na izolacji GV w oleju mineralnym. 8 Izolowane olejem GV pozostają aktywne transkrypcyjnie przez wiele godzin i są potencjalnie przydatne w badaniach, w których chce, aby zawartość jądrowa była jak najbardziej realistyczna. 9,10 Ponieważ współczynnik załamania światła jądrowego "soku" jest zbliżony do współczynnika LBC i innych organelli jądrowych (ryc. 3), techniki mikroskopowe mogą stanowić wyzwanie w przypadku izolowanych olejem GV.
Na koniec, ze względu na ich rozmiar i łatwość manipulacji, GV są idealnym materiałem do badań nad powłoką jądrową. Kompleks porów jądrowych został po raz pierwszy opisany na podstawie badań mikroskopem elektronowym na otoczkach GV11, a nowsze obserwacje nadrozdzielcze wykorzystały ten sam materiał. 12,13

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd (klasa odczynnika, krystaliczny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Pomimo ostrzeżeń w wielu protokołach, stężony roztwór może być przechowywany w nieskończoność w RT</td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td><td>Czasami określany jako MS-222</td></tr><tr><td>Ethicon RB-1 1/2 okrągły punkt stożkowy 3-0</td><td>szwy VWR&nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast (wosk parafinowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><tr><td>p-Fenylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sklep</td><td></td> spożywczy <td>Komercyjna żelatyna Knox działa dobrze</td></tr><tr><td>Antyblakowy uchwyt przeciwblakowy ProLong Gold</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Szkło pokrywowe Gold Seal&nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2 (grubość 0,16 - 0,19 mm)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>63786-01</td><td>Te szkiełka nakrywkowe mają zalecaną grubość do mikroskopii nadrozdzielczej</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumonta #5</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72700-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td></tr><tr><td>Olej parafinowy (lekki)&nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>Do izolowania GV w</td></tr><tr><td>kleju olejowym in situ komorach PCR i hybrydyzacyjnych (25 &mikro; L)</td><td></td> <td>Komory ślizgowe BioRad Frame-Seal #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>Izolatory silikonowe</td><td>Grace-Biolabs</td><td>wybierz z linku do katalogu</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>Słoiki z kopliny i naczynia do barwienia</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>wybierz z linku</td> <td>do kataloguhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

izolacja chromosomów gigantycznej szczotki lampowej z żywych oocytów żab i salamander

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Opisujemy metody badania gigantycznych transkrypcyjnie aktywnych chromosomów lampbrush (LBC) znajdujących się w oocycie, czyli niezłożonym jaju żab i salamander. Pojedyncze LBC mogą mieć do 1 mm długości i znajdują się w gigantycznym jądrze, które samo ma średnicę do 0,5 mm. Duży rozmiar chromosomów pozwala na niezrównane obserwacje aktywnych genów za pomocą lekkiej mikroskopii optycznej, ale jednocześnie wymagane są specjalne techniki izolowania jądra, usuwania otoczki jądrowej i rozprzestrzeniania chromosomów na szkiełku mikroskopowym. Jądro oocytu, zwane również pęcherzykiem rozrodczym (GV), jest izolowane w pożywce, która umożliwia częściowe żelowanie aktyny jądrowej i zachowuje delikatną strukturę LBC. Ten etap jest wykonywany ręcznie pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą kleszczy jubilerskich. Następnie usuwa się otoczkę jądrową, ponownie ręcznie za pomocą kleszczy jubilerskich. Zawartość jądrowa jest szybko przenoszona do pożywki, która rozprasza żel aktynowy i pozwala nieuszkodzonym LBC osiąść na szkiełku mikroskopowym. W tym momencie LBC i inne organelle jądrowe można oglądać za pomocą kontrastu fazowego lub mikroskopii kontrastu interferencyjnego, chociaż drobniejsze szczegóły są przesłonięte przez ruchy Browna. W przypadku obserwacji mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości lub analizy molekularnej cały preparat jest odwirowywany w celu mocnego przymocowania delikatnych LBC do szkiełka. Po krótkim utrwaleniu w paraformaldehydzie następuje barwienie immunofluorescencyjne lub hybrydyzacja in situ. LBC są w stanie aktywnym transkrypcyjnie, a ich ogromny rozmiar pozwala na analizę molekularną na poziomie poszczególnych genów przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub superrozdzielczej.

Aby zbadać gigantyczne chromosomy lampbrush, należy rozpocząć od izolacji oocytów z żaby lub salamandry. Rycina 1 przedstawia grupę dojrzałych oocytów w buforowanym roztworze soli fizjologicznej po usunięciu ich z jajnika żaby Xenopus. Takie oocyty pozostają w dobrym stanie przez kilka dni w temperaturze pokojowej. Następnie z oocytu usuwa się jądro (lub pęcherzyk zarodkowy) za pomocą pęsety jubilerskiej, albo w roztworze soli fizjologicznej (Rycina 2</st...

Prezentujemy proste techniki izolowania gigantycznych transkrypcyjnie aktywnych chromosomów lampbrush z żywych oocytów żab i salamander. Opisujemy, jak obserwować te chromosomy "na żywo" za pomocą kontrastu fazowego lub kontrastu interferencji różnicowej oraz jak naprawić je do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ lub barwienia immunofluorescencyjnego.

Izolacja chromosomów gigantycznej szczotki lampowej z żywych oocytów żab i salamander

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie gigantycznego jądra, czyli pęcherzyka zarodkowego, z oocytu płaza oraz rozprzestrzeniecie chromosomów typu lampbrush i innych organelli jądrowych na płytce mikroskopowej w celu przeprowadzenia immunobarwienia, hybrydyzacji in situ oraz innych technik molekularnych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące podstawowej budowy chromosomów, jąderek i innych organelli jądrowych, a także molekularnych szczegółów transkrypcji, splicingu i eksportu RNA. Główną zaletą tej techniki jest łatwość, z jaką można badać strukturę chromosomów i transkrypcję za pomocą konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, stosując immunofluorescencję, hybrydyzację in situ oraz inne techniki molekularne.Procedurę zaprezentuje dr Zehra Nizami, pracownik postdoc z mojego laboratorium. Po przygotowaniu wszystkich wymaganych roztworów należy przygotować preparaty do badania, składające się z podłoży szklanych, do których za pomocą parafiny przytwierdzono plastikowe studzienki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie należy pobrać tkankę jajnika wcześniej pozyskaną od dorosłej samicy żaby lub salamandry oraz napełnić małą sza

isolation-giant-lampbrush-chromosomes-from-living-oocytes-frogs

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Procedura zapłodnienia oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza.

Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Ten film demonstruje procedury używane do hodowli pierwotnych kultur embrionalnych komórek nerwowych i mięśniowych Xenopus oraz przydatność tego preparatu do jednoczesnego wykonywania nagrań pre- i post-synaptycznych klamerów.

Jednoczesny pre- i postsynaptyczny zapis elektrofizjologiczny z kokultur nerwowo-mięśniowych Xenopus

Opisujemy zbieranie niezapłodnionych jaj Xenopus tropicalis i produkcję ekstraktu z jaj zatrzymanego przez mejozę II. Ten ekstrakt z jaj może być stosowany do oczyszczania mikrotubul i RNA związanych z mikrotubulami.

Produkcja ekstraktów jajowych Xenopus tropicalis w celu identyfikacji RNA związanych z mikrotubulami

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Prezentujemy metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki poprzez kapsułkowanie ekstraktów jajecznych Xenopus laevis w mikroemulsjach typu woda w oleju.

Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Poznaj metodę izolacji chromosomów lampbrush z oocytów płazów. Technika ta umożliwia obserwację struktury chromosomów i aktywności transkrypcyjnej przy użyciu mikroskopii świetlnej oraz hybrydyzacji in situ.

Izolacja chromosomów gigantycznej szczotki lampowej z żywych oocytów żab i salamander

Przeglądaj więcej filmów