Name: Kowalencyjne wiązanie przeciwciał z krążkami papieru celulozowego i ich zastosowania w kolorymetrycznych testach immunologicznych gołym okiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę kowalentnej immobilizacji przeciwciał na krążkach celulozowych przy użyciu utleniania okresowego i retikulacji glutaraldehydem. Technika ta umożliwia rozwój tanich testów immunologicznych do diagnostyki point-of-care.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana finansowo przez Ministerstwo Edukacji Singapuru poprzez Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).

1. Szczepienie grup funkcyjnych aminowych na papierowych krążkach celulozowych
<ol>
	<li>Przygotować jeden kwadratowy kawałek papieru o wymiarach 1 cm × 1 cm oraz 100 papierowych dysków o średnicy 6,0 mm, wykonanych z papieru celulozowego klasy nr 1 (papier filtrujący o średniej przepuszczalności), używając dziurkacza.</li>
	<li>Aby wprowadzić grupy -NH2 na papierowe dyski, wymieszać 1 ml APS i 10 ml acetonu w 50 ml szklanej butelce w dygestorium. Dodać papierowe dyski do świeżo przygotowanej mieszaniny odczynników APS i inkubować przez 5 hr przy mieszaniu orbitalnym (200 rpm) w temperaturze pokojowej32. 
	Uwaga: APS i aceton należy obsługiwać w dygestorium.</li>
	<li>Odlać nadmiar roztworu z 50 ml szklanej butelki do pojemnika na odpady organiczne.</li>
	<li>Dodać 10 ml acetonu do szklanej butelki, dobrze wymieszać i całkowicie odlać, aby usunąć nieprzereagowany APS oraz inne zanieczyszczenia. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Rozłożyć papierowe dyski na ręczniku papierowym i umieścić w piekarniku w temperaturze 110 °C na 3 hr. Pozostawić papierowe dyski do ostygnięcia. Przechowywać dyski w 50 ml probówce wirówkowej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Użyć spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), aby sprawdzić szczepienie grup aminowych na kwadratowym papierze celulozowym, zgodnie z poniższym opisem (Rycina 3A).
	<ol>
		<li>Włączyć komputer i uruchomić instrument do spektroskopii FTIR.</li>
		<li>Otworzyć oprogramowanie do spektroskopii FTIR.</li>
		<li>Przejść do „Measurement → Initialize”. Prostokąty dla „BS: KBr”, „Lamp: Infrared” oraz „Laser” zmienią kolor na zielony po zakończeniu inicjalizacji.</li>
		<li>Wybrać „Data” pod prostokątami i ustawić odpowiednio „%Transmittance”, „Happ-Genzel”, „45”, „4.0” oraz „Min: 400, Max: 4000” dla parametrów „Measurement Mode”, „Apodization”, „No. of Scans”, „Resolution” oraz „Range (cm-1)”.</li>
		<li>Kliknąć „Measure”.</li>
		<li>Wybrać „Data file” dla danych tła. Wpisać komentarze.</li>
		<li>Kliknąć „BKG”, aby uzyskać linię bazową dla tła.</li>
		<li>Zamocować kwadratowy papier w uchwycie na próbki foliowe.</li>
		<li>Wybrać „Data file” dla danych próbki. Wpisać komentarze.</li>
		<li>Kliknąć „Sample”, aby uzyskać widma dla próbki.</li>
		<li>Zamknąć aplikację do spektroskopii FTIR i wyłączyć komputer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć powyższe etapy (kroki 1.1 do 1.6), aby przygotować funkcjonalizowany grupami aminowymi kwadratowy papier celulozowy i dyski klasy nr 113 (papier filtrujący o szybkiej przepuszczalności), a następnie uzyskać widma FTIR dla papieru kwadratowego klasy nr 113 (Rycina 3B).</li>
</ol>
2. Kowalencyjna immobilizacja przeciwciał na dyskach z papieru celulozowego funkcjonalizowanego grupami aminowymi
<img alt="Schemat immobilizacji przeciwciał; procedury z użyciem NaIO4 i APS; słowa kluczowe z zakresu chemii: aldehyd, silan." src="/files/ftp_upload/54111/54111fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 1. Kowalencyjna immobilizacja przeciwciał za pomocą dwóch różnych metod. A. Przeciwciała immobilizowane na dyskach z papieru celulozowego z funkcjonalizacją aminową poprzez utlenianie periodanem. Pozostałości węglowodanowe zostały utlenione za pomocą periodanu sodu w celu wytworzenia grup funkcyjnych aldehydowych. Następnie utlenione przeciwciała naniesiono na dyski z papieru celulozowego z funkcjonalizacją aminową. B. Przeciwciała zostały następnie immobilizowane na dyskach z papieru celulozowego z funkcjonalizacją aminową przy użyciu glutaraldehydu. Dyski z papieru celulozowego z funkcjonalizacją aminową zanurzono w 0,05% roztworze glutaraldehydu, aby wprowadzić grupy aldehydowe do dysków papierowych. Po przemyciu przeciwciała naniesiono na dyski papierowe z funkcjonalizacją aldehydową. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Immobilizacja przeciwciał na dyskach z papieru celulozowego z funkcjonalizacją aminową poprzez utlenianie periodem (Rycina 1A).
	<ol>
		<li>W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszać 1 µl 2,5 mM nadtlenianu sodu z 2 µl 0,1 mg/ml królika anty-ludzkiego IgG-FITC oraz 7 µl 100 mM buforu octanowego o pH 5,5, a następnie inkubować mieszaninę w ciemności przez 30 min. 
		UWAGA: Należy zachować ten stosunek objętości, aby w razie potrzeby przygotować więcej utlenionych przeciwciał. Można zmienić stosunek objętości w celu optymalizacji stężenia nadtlenianu sodu i królika anty-ludzkiego IgG-FITC.</li>
		<li>Rozcieńczyć powyższy roztwór przeciwciał 30 µl 50 mM soli buforu fosforanowego (PBS; pH 7,4) do końcowej objętości 40 µl.</li>
		<li>Przygotować trzy dyski z papieru filtracyjnego o średnim przepływie z funkcjonalizacją aminową oraz trzy dyski z papieru o szybkim przepływie z funkcjonalizacją aminową (zgodnie z opisem w Sekcji 1).
		<ol>
			<li>Nanieść 5 µl utlenionego nadtlenianem sodu królika anty-ludzkiego IgG-FITC na każdy dysk z papieru filtracyjnego o średnim przepływie oraz 8 µl na każdy dysk z papieru o szybkim przepływie. Przechowywać te dyski w ciemności przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przemyć każdy dysk 0,2 ml buforu do mycia (bufor Tris 50 mM z 0,15 M NaCl i 0,05% surfaktantu, pH 7,4). Powtórzyć płukanie trzy razy.</li>
		<li>Wykonać zdjęcia fluorescencyjne za pomocą fluorescencyjnego obrazera molekularnego, aby potwierdzić obecność przeciwciał na każdym dysku z papieru celulozowego32. Jako kontrolę wykorzystać puste dyski papierowe (potraktowane tym samym stężeniem przeciwciał w obecności nadtlenianu sodu) (Rycina S1 do Rycina S3). 
		UWAGA: W celu optymalizacji eksperymentalnej należy zmienić stężenie jednego parametru wymagającego optymalizacji i utrzymać stałe stężenia wszystkich pozostałych parametrów. Wysoka intensywność fluorescencji wskazuje na większą ilość unieruchomionych przeciwciał wychwytujących na dyskach z papieru celulozowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immobilizacja przeciwciał na dyskach z papieru celulozowego z funkcjonalizacją aminową za pomocą glutaraldehydu (Rycina 1B).
	<ol>
		<li>Trzy potraktowane APS dyski z papieru filtracyjnego o średnim przepływie oraz trzy dyski z papieru o szybkim przepływie (opisane w Sekcji 1) umieścić w 2 ml 50 mM PBS (pH 7,4) zawierającego 0,05% glutaraldehydu na 1 h, przy mieszaniu orbitalnym w temperaturze pokojowej. 
		Uwaga: Glutaraldehyd należy obsługiwać w dygestorium.</li>
		<li>Umieścić po trzy dyski w dwóch probówkach odwirku o pojemności 1,5 ml. Do każdej probówki dodać 1 ml wodyy dejonizowanej (DI) i wstrząsać probówkami przez 10 s. Usunąć wodę za pomocą pipety. Powtórzyć czynność jeszcze dwukrotnie, aby usunąć nieprzereagowany glutaraldehyd.</li>
		<li>Nanieść 5 µl 25 µg/ml królika anty-ludzkiego IgG-FITC (przeciwciało wychwytujące) na każdy dysk z papieru filtracyjnego o średnim przepływie z funkcjonalizacją aldehydową oraz 8 µl na każdy dysk z papieru o szybkim przepływie z funkcjonalizacją aldehydową. Inkubować w ciemności przez około 20 min w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 10 µl 50 mM PBS (pH 7,4) do każdego dysku bez usuwania przeciwciał i inkubować przez 40 min w celu przeprowadzenia reakcji amino-aldehydowej.</li>
		<li>Przemyć dyski papierowe 0,2 ml buforu do mycia, kładąc je na ręczniku papierowym. Powtórzyć płukanie dwa razy.</li>
		<li>Wykonać zdjęcia fluorescencyjne za pomocą fluorescencyjnego obrazera molekularnego, aby sprawdzić obecność przeciwciał na każdym dysku z papieru celulozowego33. Jako kontrolę wykorzystać puste dyski papierowe. 
		UWAGA: Na Rycynie 4 oznaczenie '0' oznacza pusty dysk papierowy potraktowany tym samym stężeniem przeciwciała FITC w obecności glutaraldehydu; na Rycynie 5A puste dyski papierowe zostały potraktowane glutaraldehydem, ale nie naniesiono na nie przeciwciał FITC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysuszyć dyski papierowe (z Sekcji 2.1 i 2.2) w temperaturze 37 °C przez 10 min.</li>
	<li>Zablokować dyski papierowe 15 µl buforu blokującego (10% odtłuszczonego mleka w proszku w buforze Tris 50 mM, pH 7,4, z 0,15 M NaCl) przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nanieść odpowiednio 5 µl i 8 µl koniugatu IgG przeciwko królikowi z peroksydazą w PBS (1:10 000) na dyski z papieru filtracyjnego o średnim i szybkim przepływie. Inkubować przez 30 min w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć dyski papierowe 0,2 ml buforu do mycia, kładąc je na ręczniku papierowym. Powtórzyć płukanie trzy razy. 
		UWAGA: Nie ma potrzeby usuwania buforu do mycia, ponieważ nie wpływa on na wyniki.</li>
	<li>Nanieść na każdy dysk 10 µl mieszaniny 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) i roztworu nadtlenku wodoru.</li>
	<li>Wykonać zdjęcia dysków papierowych cyfrowym aparatem fotograficznym lub smartfonem po 5 min inkubacji. 
	UWAGA: Na Rycynie 5B oznaczenie '0' oznacza dyski papierowe, które zostały potraktowane glutaraldehydem, a następnie naniesiono na nie koniugat przeciwciała z HRP (peroksydazą chrzanową) w obecności przeciwciała FITC.</li>
</ol>
3. Papierowy test ELISA do wykrywania IgG
<img alt="Schemat metody ELISA przedstawiający przeciwciała, blokowanie, wiązanie antygenu, sygnał HRP, utlenianie TMB." src="/files/ftp_upload/54111/54111fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schematyczny przedstawienie papierowego testu ELISA do detekcji IgG. Przeciwciała wychwytujące zostały kowalencyjnie unieruchomione na dyskach z papieru celulozowego funkcjonalizowanego grupami aldehydowymi za pomocą glutaraldehydu. Dyski z papieru celulozowego zablokowano buforem blokującym. Następnie na dyski naniesiono docelowe IgG, a w kolejnym kroku przeciwciała sygnałowe sprzężone z HRP. Na koniec, w celu odczytu kolorymetrycznego, na każdy dysk papierowy naniesiono roztwór mieszaniny TMB i nadtlenku wodoru. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Do szklanej butelki o pojemności 20 ml dodać 5 ml 0,05% roztworu glutaraldehydu (przygotowanego w buforze PBS 50 mM, pH 7,4). Zanurzyć w tym roztworze 15 krążków z papieru filtrującego o średnim przepływie, funkcjonalizowanych grupami aminowymi, i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej przy wytrząsaniu.
	<ol>
		<li>Równolegle powtórzyć krok 3.1 w celu przygotowania kolejnych 15 krążków z papieru filtrującego o szybkim przepływie, funkcjonalizowanych grupami aldehydowymi. 
		Uwaga: Glutaraldehydem należy operować w dygestorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby usunąć niezreagowany glutaraldehyd z krążków papierowych, umieścić 15 krążków z papieru filtrującego o średnim przepływie w probówce wirówkowej 15 ml, a 15 krążków z papieru filtrującego o szybkim przepływie w drugiej probówce wirówkowej 15 ml. Do każdej probówki dodać 5 ml wody DI i wytrząsać probówki przez 10 s. Usunąć wodę, odsysając ją pipetą. Powtórzyć czynność dwukrotnie, aby usunąć cały niezreagowany glutaraldehyd.</li>
	<li>Wysuszyć krążki papierowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Na każdy krążek z papieru filtrującego o średnim i szybkim przepływie, odpowiednio, nanieść 5 µl i 8 µl przeciwciał z fragmentem IgG-Fc mysiego o stężeniu 0,025 mg/ml i inkubować przez 20 min.</li>
	<li>Do każdego krążka papierowego, bez usuwania przeciwciał, dodać 10 µl PBS 50 mM (pH 7,4) i inkubować przez 40 min w celu przeprowadzenia reakcji amino-aldehydowej.</li>
	<li>Przemyć krążki papierowe 0,2 ml buforu płuczącego, kładąc je na ręczniku papierowym. Powtórzyć płukanie trzykrotnie.</li>
	<li>Wysuszyć krążki papierowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zablokować krążki papierowe, stosując 15 µl buforu blokującego przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć każdy krążek papierowy 0,2 ml buforu płuczącego na ręczniku papierowym. Powtórzyć płukanie trzykrotnie.</li>
	<li>Przeprowadzić pomiary standardów IgG.
	<ol>
		<li>Nanieść na każdy krążek w trzech powtórzeniach 10 µl różnych stężeń IgG (np. 0, 10, 125, 250 i 500 ng/ml w PBS). Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć krążki papierowe 0,2 ml buforu płuczącego na ręczniku papierowym. Powtórzyć płukanie trzykrotnie.</li>
	<li>Nanieść 10 µl przeciwciał z fragmentem IgG-Fc mysiego sprzężonych z HRP (1:10 000, PBS 10 mM, pH 7,4) i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć krążki papierowe 0,2 ml buforu płuczącego na ręczniku papierowym. Powtórzyć płukanie trzykrotnie. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby usuwania buforu płuczącego, ponieważ jego obecność nie wpływa na wyniki.</li>
	<li>Nanieść na każdy krążek 10 µl mieszaniny TMB i nadtlenku wodoru.</li>
	<li>Wykonać zdjęcia wszystkich krążków papierowych za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona po 5 min inkubacji. 
	UWAGA: Na Rysunku 6A wartość „0” oznacza krążki papierowe poddane unieruchomieniu przeciwciał wychwytujących oraz dodaniu roztworu przeciwciało-HRP/TMB bez surowicy IgG.</li>
	<li>Przeanalizować intensywność każdego krążka papierowego na zdjęciu za pomocą programu Image J.
	<ol>
		<li>Konwertować zdjęcia wykonane w kroku 3.15 do formatu „.tif”.</li>
		<li>Otworzyć oprogramowanie „Image J”.</li>
		<li>Wybrać „File → Open” i wskazać obraz do analizy.</li>
		<li>Wybrać przycisk kształtu „Oval”.</li>
		<li>Wybrać „Image → Type → 32 bit”.</li>
		<li>Wybrać „Edit → Invert”.</li>
		<li>Wybrać „Analyze → Measure”.</li>
		<li>Skopiować dane i przeanalizować je w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+HIV-1+by+reverse-transcription%2C+loop-mediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP).</a> J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+telemedicine+for+developing+regions%3A+camera+phones+and+paper-based+microfluidic+devices+for+real-time%2C+off-site+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis.</a> Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).</li>
<li>Lode, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+immunotesting%3A+approaching+the+analytical+performance+of+central+laboratory+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods.</a> Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).</li>
<li>Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+for+on-site+monitoring+of+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Perspectives for on-site monitoring of progesterone.</a> Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).</li>
<li>Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+developing+technologies+for+monitoring+agents+of+bioterrorism+and+biowarfare%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare.</a> Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).</li>
<li>Li, X., Tian, J., Shen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+patterned+paper+sizing+for+fabrication+of+paperbased+microfluidic+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose%22%5BJournal%5D)">Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors.</a> Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).</li>
<li>Nie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+sensing+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices.</a> Lab Chip. 10, 477-483 (2010).</li>
<li>Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenerated+chemiluminescence+detection+in+paper-based+microfluidic+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors.</a> Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).</li>
<li>Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+flow+immunoassay+%28VFA%29+biosensor+for+a+rapid+one-step+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay.</a> Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Paper-based ELISA.</a> Angew. Chem. 122 (28), 4881-4884 (2010).</li>
<li>Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+red+blood+cells+agglutination+in+antibody-treated+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper.</a> Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).</li>
<li>Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+and+biocompatible+cellulose+functionalization+for+covalent+antibody+immobilization+on+immunoassay+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes.</a> J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).</li>
<li>Kong, F., Hu, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecule+immobilization+techniques+for+bioactive+paper+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication.</a> Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).</li>
<li>Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMC-modified+cellulose+biointerface+for+antibody+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation.</a> Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).</li>
<li>Yu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctional+paper+via+covalent+modification+of+cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Biofunctional paper via covalent modification of cellulose.</a> Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).</li>
<li>Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cellulose+membranes+with+1%2C1%E2%80%B2-carbonyldiimidazole+or+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+as+a+basis+for+the+development+of+immunosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors.</a> Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).</li>
<li>Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreactive+cellulose+membrane+-+a+novel+matrix+for+covalent+immobilization+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules.</a> J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).</li>
<li>Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmobilization+of+unmodified+carbohydrates+on+activated+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface.</a> J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).</li>
<li>Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+crystalline+cellulose+surfaces+through+the+chemoenzymatic+modification+of+xyloglucan%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).</li>
<li>Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+paper+surfaces+for+the+rapid+hybridization+of+DNA+through+capillary+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport.</a> Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).</li>
<li>Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemo-enzymatic+Assembly+of+Clickable+Cellulose+Surfaces+via+Multivalent+Polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22ChemSusChem%22%5BJournal%5D)">Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides.</a> ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).</li>
<li>Filpponen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+method+for+modular+surface+modification+of+cellulosic+materials+in+aqueous+medium+by+sequential+%26%2334%3Bclick%26%2334%3B+reaction+and+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential &#34;click&#34; reaction and adsorption.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).</li>
<li>Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobactericidal+porphyrin-cellulose+nanocrystals%3A+synthesis%2C+characterization%2C+and+antimicrobial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties.</a> Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).</li>
<li>Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+immunoassay+on+a+3D+microfluidic+paper-based+device%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device.</a> Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).</li>
<li>Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+paper-based+electrochemiluminescence+immunodevice+for+multiplexed+measurement+of+biomarkers+and+point-of-care+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing.</a> Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+chemiluminescence+ELISA%3A+lab-on-paper+based+on+chitosan+modified+paper+device+and+wax-screen-printing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing.</a> Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).</li>
<li>Koev, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%3A+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li>
<li>Wang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+covalent+fabrication+of+a+paper+device+and+its+application+in+sensitive+chemiluminescence+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay.</a> Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).</li>
<li>Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+based+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+C-reactive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein.</a> Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).</li>
<li>Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+modification+of+cellulose+paper+with+amino+groups+for+catalytic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications.</a> J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).</li>
<li>Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose%3A+fascinating+biopolymer+and+sustainable+raw+material%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).</li>
<li>Fernandes, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+antimicrobial+and+biocompatible+bacterial+cellulose+membranes+obtained+by+surface+functionalization+with+aminoalkyl+groups%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pharos+FX+plus+molecular+imager+instructions%2C+Catalog+Number+170-9460%22">Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460</a>. , (2005).</li>
<li>Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminosilane-grafted+cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22BioResourses%22%5BJournal%5D)">Aminosilane-grafted cellulose.</a> BioResourses. 8 (3), 4468-4483 (2013).</li>
<li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugated+quantum+dots+for+multiplexed+and+quantitative+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry.</a> Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).</li>
<li>Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+conventional+immunoassay+%28ELISA%29+with+a+surface+plasmon+resonance-based+biosensor+for+IGF-1+detection+in+cows%27+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk.</a> Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).</li>
<li>Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+chemical+and+biological+sensors%3A+Engineering+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects.</a> Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeprowadzono bezpośrednie powlekanie oczyszczonym kozim przeciwciałem wychwytującym mysie IgG-Fc na niemodyfikowanych krążkach z papieru celulozowego w celu wykrycia stężeń IgG. Wyniki wskazują, że w celu zapewnienia odtwarzalności konieczne jest dalsze utrwalanie przeciwciał wychwytujących. Technika silanowa została z powodzeniem wykorzystana do wprowadzenia aminowych grup funkcyjnych do celulozowych krążków papierowych34. Stężenie APS wpływa na unieruchomienie przeciwciał. W związku z tym zoptymalizowano r...

Badanie diagnostyczne POCT (point-of-care testing) jest ważne dla rozwoju nowych strategii terapeutycznych, medycyny spersonalizowanej i opieki domowej1. Bibułki celulozowe są szeroko stosowane jako platformy w testach immunologicznych, ponieważ są tanie, dostępne i znane użytkownikom2. Ponadto porowata struktura papieru celulozowego ma moc napędzania przepływu cieczy bez dodatkowego wpływu na energię. Zapisy dotyczące bioanalizy na papierze można znaleźć już wXX wieku, kiedy to po raz pierwszy wynaleziono chromatografię bibułową w 1952 roku. Najbardziej rozpowszechnionym przykładem są testy immunochromatograficzne3, takie jak paski testowe na ciążę i cukrzycę. Testy te zapewniają stosunkowo krótki czas oznaczania i niedrogą analizę4. Ze względu na swoją prostotę, te konwencjonalne papierowe testy paskowe są szeroko stosowane w diagnostyce POCT5.
Metody wykrywania, w tym metody kolorymetryczne6, elektrochemiczne7 i elektrochemiluminescencyjne8, zostały zgłoszone do pomiaru celów w próbkach biologicznych. Oprócz tych metod ilościowych, dla rozwoju urządzeń diagnostycznych ważna jest również niezawodna metoda unieruchamiania przeciwciał na bibule celulozowej. Adsorpcja nieswoista jest główną strategią modyfikacji przeciwciał na powierzchni wyrobów papierowych9, 10 w celu zapewnienia maksymalnej zdolności wiązania z ich celami po unieruchomieniu. Jednak poprzednie badanie wykazało, że przeciwciała zaadsorbowane na bibule celulozowym mogą desorbować się z włókien11 o 40%. W związku z tym bezpośrednia adsorpcja przeciwciał na celulozie może nie zapewnić powtarzalnych wyników12. Kowalencyjna immobilizacja przeciwciał, które są szczepione na powierzchniach papieru, jest alternatywną metodą opracowywania skutecznych testów biologicznych opartych na papierze13. Opisano różne metody modyfikacji celulozy14, 15. Idealnie byłoby, gdyby przeciwciała zachowały swoją pierwotną funkcjonalność po unieruchomieniu12. karbonylodimidazol w połączeniu z tetrafluoroboranem 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny16; 1-fluoro-2-nitro-4-azydobenzen poprzez strategię aktywacji opartą na promieniowaniu UV17, 18; strategia chemoenzymatyczna oparta na modyfikacji ksylolukanu19; czynnik łączący 1,4-fenylenodiizotiocyjanian20; utlenianie heteropolisacharydów21 kliknij chemia22; i kationowe porfiryny23 zostały użyte do kowalencyjnego unieruchomienia biomolekuł na bibułze celulozowym. Papier modyfikowany chitozanem został wykorzystany do opracowania papierowych urządzeń immunologicznych24-26, ponieważ jest on obfity i biokompatybilny27. Chitozan jest kationowy i silnie przylega do celulozy anionowej27. Wychwytywane przeciwciała są unieruchamiane na papierze poprzez powlekanie chitozanem i sieciowanie aldehydem glutarowym. Utlenianie periodyczne to kolejna metoda szczepienia przeciwciał wychwytujących na bibułce celulozowej28. W tej metodzie periodynian sodu jest nakrapiany na papierze w celu przekształcenia grup 1,2-dihydroksylowych (glikolowych) w celulozie bezpośrednio w grupy aldehydowe. Grupy aldehydowe są następnie wykorzystywane do tworzenia wiązań kowalencyjnych między polisacharydami a przeciwciałami28. Chociaż produkcja jest prosta, trudno jest całkowicie wypłukać periodynian sodu. Niemyty periodynian sodu może powodować dalsze utlenianie przeciwciał, które są unieruchomione na bibule celulozowej, wpływając na aktywność i stabilność przeciwciał. Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N-etylokarbodimidu i środki sieciujące N-hydroksysukcynimidu są również stosowane do kowalencyjnego unieruchamiania przeciwciał na elektroprzędzonych nanowłóknach kwasu poli-L-mlekowego i octanu celulozy w celu opracowania testów opartych na nanowłóknach29.
W tym badaniu, technika sprzężenia silanów została użyta do szczepienia grup funkcyjnych aminy na krążkach z papieru celulozowego. Technika ta pomaga zachować pierwotną wielkość porów, przepuszczalność i szybkość filtracji celulozowych bibuł filtracyjnych, umożliwiając maksymalny przepływ pionowy w testach immunologicznych. Technika sprzęgania silanów jest szeroko stosowana w bioczujnikach do funkcjonalizacji powierzchni substratów za pomocą drugorzędowych grup aminowych, a następnie do dalszej modyfikacji przy użyciu biomolekuł. Szczepienie grup aminowych na powierzchni matrycy obejmuje reakcję kondensacji między grupami -OH organofunkcjonalnych środków silanowych a substratemmatrycy 30. Krążki z papieru celulozowego funkcjonalizowano grupami aminowymi przez sprzężenie silanowe przez 3-aminopropylotrimetoksysilan (APS)31. Następnie kowalencyjnie unieruchamiano przeciwciała wychwytujące przy użyciu dwóch różnych metod. Pierwsza metoda polegała na wiązaniu periodycznie utlenionych przeciwciał wychwytujących z krążkami papierowymi z celulozy funkcjonalizowanej aminami. W drugiej metodzie wykorzystano aldehyd glutarowy jako środek sieciujący do przyłączenia przeciwciał wychwytujących do funkcjonalizowanych grupami aminowymi krążków papierowych z celulozy. Obecność przeciwciał wychwytujących potwierdzono za pomocą króliczego anty-ludzkiego izotiocyjanianu IgG-fluoresceiny (FITC) przy użyciu fluorescencyjnego obrazowania molekularnego. Aktywność wiązania króliczej anty-ludzkiej IgG-FITC z kozim anty-króliczą IgG oceniano również za pomocą substratu peroksydazy. Badano wpływ różnych stężeń periodynianu sodu, aldehydu glutarowego i przeciwciał wychwytujących. Test aplikacyjny unieruchomionego przeciwciała wychwytującego został pomyślnie przeprowadzony poprzez wykrycie surowicy IgG.

<table><tbody><tr><td>Bibuła filtracyjna z celulozy, klasa 1 (bibuła filtracyjna o średnim przepływie)</td><td>GE Healthcare Pte Ltd Singapur&nbsp;</td><td>1001 110</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna z celulozy, klasa 113 (bibuła filtracyjna o szybkim przepływie)</td><td>Sigma-Aldrich, Singapur</td><td>1113-320</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma-Aldrich, Singapur</td><td>G6257</td><td>Klasa II, 25% w H2O</td></tr><tr><td>Surfaktant</td><td>Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapur</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Album surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Singapur</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Louis Fran&ccedil; Ois&nbsp;</td><td></td><td>Pakowane przez Kitchen Capers, Singapore</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>Periodynian sodu</td><td>Merck</td><td>106597</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>106585</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>CALBIOCHEM</td><td></td><td></td>567441</tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>bukrem fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS, zawierający 137&nbsp; mmol/L NaCl, 2.7&nbsp; mmol/L KCl, 8.0&nbsp; mmol&#8288;/&#8288; L Na2HPO4 oraz 1.5&nbsp; mmol/L KH2PO4, przygotowuje się wodą i dostosowuje do pH 7,4 z 0,1&nbsp; mol/L NaOH lub 0,1&nbsp; mol/L HCl</td></tr><tr><td></td><td>Aceton Tee Hai Chem Pte Ltd Singapur</td><td>9005-68</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina TMB i roztworu nadtlenku wodoru&nbsp;</td><td>1-stopniowy roztwór ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific Pierce</td><td>34029</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki IgG-FITC</td><td>TWC/Bio Pte Ltd Singapur</td><td>sc-2278</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza sprzężona z kozią anty-króliczą IgG</td><td>TWC / Bio Pte Ltd Singapur</td><td>sc-2030</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało przeciw mysim przeciwciałom przeciwko mysim IgG-Fc dla kóz</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131A</td><td></td></tr><tr><td>Odniesienie do myszy surowica</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>RS10-101-5</td><td>9,5 mg / ml</td></tr><tr><td>HRP sprzężone kozie przeciwciało anty-mysie IgG-Fc</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131P</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fourier transform spektrofotometr podczerwieni</td><td>Shimadzu IR Prestige-21&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny obrazownik molekularny</td><td>Pharos FXTM plus obrazowanie molekularne, Bio-Rad, Singapur</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>NUVE FN500</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikser turbo VM-2000</td><td>MYC LTD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>RGB, do pobrania za darmo</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kowalencyjne wiązanie przeciwciał z krążkami papieru celulozowego i ich zastosowania w kolorymetrycznych testach immunologicznych gołym okiem

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Ten raport przedstawia dwie metody kowalencyjnego unieruchomienia przeciwciał wychwytujących na krążkach z celulozowej bibuły filtracyjnej klasy nr 1 (bibuła filtracyjna o średnim przepływie) i klasy nr 113 (bibuła filtracyjna o szybkim przepływie). Te celulozowe krążki papierowe zostały przeszczepione aminowymi grupami funkcyjnymi za pomocą techniki sprzęgania silanów, zanim przeciwciała zostały na nich unieruchomione. Metody utleniania periodycznego i sieciowania aldehydu glutarowego zastosowano do szczepienia przeciwciał wychwytujących na krążkach z papieru celulozowego. W celu zapewnienia maksymalnej zdolności wiązania przeciwciał wychwytujących z ich celami po unieruchomieniu, zbadano wpływ różnych stężeń periodianu sodu, aldehydu glutarowego i przeciwciał wychwytujących na powierzchni krążków papierowych. Przeciwciała, które zostały pokryte na funkcjonalizowanych aminami krążkach papieru celulozowego za pomocą środka sieciującego aldehyd glutarowy, wykazały zwiększoną aktywność wiązania z celem w porównaniu z metodą utleniania periodatycznego. IgG (w mysiej surowicy referencyjnej) zastosowano jako cel referencyjny w tym badaniu w celu przetestowania zastosowania kowalencyjnie unieruchomionych przeciwciał za pomocą aldehydu glutarowego. Z powodzeniem opracowano i poddano walidacji nowy test immunoenzymatyczny (ELISA) oparty na papierze pod kątem wykrywania IgG. Ta metoda nie wymaga sprzętu i może wykryć 100 ng / ml IgG. Bibuła filtracyjna o szybkim przepływie była bardziej czuła niż bibuła filtracyjna o średnim przepływie. Okres inkubacji tego testu był krótki i wymagał małych objętości próbek. Ten kolorymetryczny test immunologiczny gołym okiem można rozszerzyć o wykrywanie innych celów, które są identyfikowane za pomocą konwencjonalnego testu ELISA.

<img alt="Wykres spektroskopii w podczerwieni różnych typów papieru celulozowego przedstawiający absorbancję w funkcji liczb falowych." src="/files/ftp_upload/54111/54111fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Widma fourierowskiej spektroskopii w podczerwieni (FTIR) niepoddanego obróbce i poddanego obróbce APS papieru filtracyjnego o średnim przepływie (A) oraz niepoddanego obróbce i poddanego obróbce APS papieru filtracyjn...

W tym manuskrypcie przedstawiono metody periodatowego utleniania i sieciowania aldehydu glutarowego do kowalencyjnego unieruchamiania przeciwciał na krążkach papierowych. Oceniano aktywność wiązania unieruchomionych przeciwciał. Na podstawie tych wyników zastosowano metodę sieciowania aldehydu glutarowego w celu opracowania nowatorskiego, opartego na papierze testu immunologicznego do wykrywania immunoglobuliny G (IgG).

Kowalencyjne wiązanie przeciwciał z krążkami papieru celulozowego i ich zastosowania w kolorymetrycznych testach immunologicznych gołym okiem

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest stabilizacja przeciwciał i białek na matrycy celulozowej, aby ułatwić opracowanie kolorymetrycznego testu immunoenzymatycznego widocznego gołym okiem, który może być przydatny w diagnostyce w punkcie opieki (point-of-care). Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki point-of-care. Główną zaletą tej techniki jest to, że wspomaga ona stabilizację białek na celulozie, co umożliwia opracowanie niskokosztowych papierowych testów diagnostycznych.Procedurę zaprezentuje Gloria Chang, studentka z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować jeden kwadratowy kawałek papieru o wymiarach 1 cm na 1 cm. Należy również przygotować 100 papierowych dysków o średnicy 6,0 mm, wykonanych z papieru celulozowego Whatman klasy nr 1, przy użyciu dziurkacza.Aby wprowadzić grupy aminowe na dyskach papierowych, zmieszaj 1 ml APS i 10 ml acetonu w 50 ml szklanej butelce w dygestorium. Dodaj dyski papierowe do świeżo przygotowanej mieszaniny odczynnika APS. Następnie inkubuj dyski w mieszaninie przez pięć godzin przy mieszaniu orbitalnym w temperaturze pokojowej.Odlać nadmiar roztworu z 50 mililitrowej szklanej butelki do pojemnika na odpady organiczne. Dodać 10 mililitrów acetonu do szklanej butelki, dobrze wymieszać i całkowicie odlać, aby usunąć nieprzereagowany APS oraz inne zanieczyszczenia. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.Rozłóż papierowe krążki na ręczniku papierowym i umieść je w piekarniku nagrzanym do 110 °C na trzy godziny. Po ostudzeniu krążków papierowych należy przechowywać je w probówce do wirowania o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej. W celu sprawdzenia szczepienia grup aminowych na kwadratowym papierze celulozowym należy zastosować spektroskopię w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR).Uruchom oprogramowanie do spektroskopii FTIR. Przejdź do inicjalizacji pomiaru. Wybierz dane znajdujące się poniżej prostokątów i ustaw procentową transmitancję jako tryb pomiaru.Następnie wybierz funkcję apodyzacji Happ-Genzel, ustaw liczbę skanów na 45, rozdzielczość na 4,0 i określ zakres od minimum 400 do maksimum 4 000. Kliknij przycisk pomiaru (measure), a następnie wybierz plik danych dla tła. Kliknij BKG, aby uzyskać linię bazową dla tła.Następnie przymocuj kwadratowy papier do uchwytu próbek folii. Następnie wybierz plik danych dla danych próbki i kliknij „sample”, aby uzyskać widmo próbki. Zamknij aplikację do spektroskopii FTIR i wyłącz komputer.Do szklanej butelki o pojemności 20 ml dodać 5 ml 0,05% roztworu glutaraldehydu. Zanurzyć w tym roztworze 15 dysków z papieru filtrującego do przepływu średniego, funkcjonalizowanych grupami aminowymi, i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu. Równolegle powtórzyć ten krok w celu przygotowania kolejnych 15 dysków z papieru filtrującego do przepływu szybkiego, funkcjonalizowanych grupami aldehydowymi.Aby usunąć niezareagowany glutaraldehyd z papierowych krążków, należy najpierw umieścić krążki z papieru filtracyjnego o średnim przepływie oraz krążki z papieru filtracyjnego o szybkim przepływie w oddzielnych probówkach wirówkowych o pojemności 15 mililitrów. Następnie do każdej probówki należy dodać pięć mililitrów wody dejonizowanej i wstrząsać probówkami przez 10 sekund. Wodę należy usunąć, odsysając ją za pomocą pipety.Powtórz czynność dwukrotnie, aby usunąć nieprzereagowany glutaraldehyd. Następnie wysusz papierowe krążki w piecu w temperaturze 37 °C. Po wyschnięciu dodaj 5 µL przeciwciał fragmentu Fc IgG mysiego o stężeniu 0,025 mg/mL do papierowych krążków filtracyjnych o średnim przepływie oraz 8 µL do papierowych krążków filtracyjnych o szybkim przepływie.Po 20 minutach inkubacji, do każdego krążka papierowego dodać 10 µL 50 mM PBS pH 7.4, nie usuwając przeciwciał. Inkubować przez 40 minut w celu przeprowadzenia reakcji aminowo-aldehydowej. Przemyć krążki papierowe 0,2 mL buforu piorącego, kładąc je na ręczniku papierowym.Powtórz płukanie trzy razy. Po wysuszeniu papierowych dysków w inkubatorze w temperaturze 37°C, zablokuj papierowe dyski, nakładając 15 µL buforu blokującego na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj każdy papierowy dysk 0,2 mL buforu płuczącego, kładąc go na ręczniku papierowym.Powtórz płukanie trzykrotnie. Następnie przeprowadź analizę wzorców IgG. Nanieś 10 µL różnych stężeń IgG na poszczególne krążki w trzech powtórzeniach.Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć krążki papierowe 0,2 ml buforu piorącego, kładąc je na ręczniku papierowym. Powtórzyć czynność płukania trzy razy.Po etapach płukania nanieś 10 µL przeciwciał przeciwko fragmentowi Fc IgG mysiego sprzężonych z HRP i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłucz krążki papierowe 0,2 mL buforu do płukania, kładąc je na ręczniku papierowym. Powtórz płukanie trzykrotnie.Na koniec nanieś 10 µL mieszaniny TMB i nadtlenku wodoru na każdy krążek. Po pięciu minutach inkubacji wykonaj zdjęcia wszystkich papierowych krążków za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona i przeprowadź analizę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawione tutaj widma FTIR dotyczą niepoddanego oraz poddanego działaniu APS papieru filtracyjnego o średnim przepływie oraz papieru filtracyjnego o szybkim przepływie.Wzrost intensywności pasm przy 902 i 1 170 cm⁻¹ oraz w zakresie od 1 210 do 1 500 cm⁻¹ dla papieru filtracyjnego o średnim przepływie, a także charakterystyczne piki w zakresie od 972 do 1 180 cm⁻¹ dla papieru filtracyjnego o szybkim przepływie wykazały, że APS został pomyślnie zaszczepiony na papierze celulozowym. Przedstawiono tutaj wpływ różnych stężeń glutaraldehydu na unieruchomienie IgG FITC na dyskach papierowych. Optymalne stężenie glutaraldehydu wynosi 0,05%. Podobnie zaprezentowano wpływ różnych stężeń IgG FITC na unieruchomienie IgG FITC na dyskach papierowych.Zwiększenie ilości i stężenia IgG FITC zwiększa ilość unieruchomionego IgG FITC na papierowych krążkach. Jednak zwiększone stężenie unieruchomionego IgG FITC nie poprawia zdolności wiązania antygenu. Przedstawiono tutaj krzywe kalibracyjne dla oznaczania IgG za pomocą papierowego testu ELISA.Przeciwciała w stężeniu jednego nanograma na mililitr IgG zostały wykryte gołym okiem przy użyciu tego testu papierowego. Stężenie IgG w surowicy wykazywało liniową zależność od intensywności kolorymetrycznej w zakresie od zera do 500 nanogramów na mililitr, gdy każdy etap był inkubowany przez jedną godzinę. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak unieruchamiać przeciwciała na matrycy komórkowej w celu opracowania testów immunoologicznych.Pomysł ten pojawił się po raz pierwszy podczas opracowywania tanich testów diagnostycznych o ograniczonej czułości. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care) do opracowania tanich testów diagnostycznych wykonywanych na miejscu w celu wykrywania różnych patogenów.

covalent-binding-antibodies-to-cellulose-paper-discs-their

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje wykrywanie chemicznie sprzężonych kompleksów przeciwciało-antygen za pomocą testu immunoenzymatycznego typu sandwich, czyli ELISA. Przechwycone przeciwciało wiąże się ze specyficznym epitopem antygenu koniugatu przeciwciało-antygen, który można później uwidocznić za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem.

Test immunoenzymatyczny w celu weryfikacji chemicznie sprzężonych koniugatów przeciwciało-antygen

Film demonstruje test immunologiczny oparty na papierze, obejmujący funkcjonalizowane aminami krążki celulozowe usieciowane aldehydem glutarowym. Kowalencyjna immobilizacja przeciwciał wychwytujących swoistych dla IgG-Fc, a następnie wprowadzenie immunoglobuliny G i przeciwciał detekcyjnych sprzężonych z peroksydazą chrzanową, powoduje zmianę koloru potwierdzającą obecność immunoglobuliny G.

Papierowy test immunologiczny do wykrywania immunoglobuliny G

Ten protokół opisuje rozwój dwóch przeciwciał monoklonalnych klasy IgG (mAb) silnie reaktywnych na mioglobinę u waleni. Te mAb są nakładane na koloidalny złoty immunochromatograficzny pasek testowy oparty na formacie kanapkowym w celu odróżnienia Mb waleni od fok i innych zwierząt.

Opracowanie immunochromatograficznego paska testowego na bazie złota koloidalnego do wykrywania mioglobiny waleni

Sondy optyczne oparte na nanocząstkach zostały zaprojektowane jako nośnik do wykrywania antygenów za pomocą spektroskopii Ramana i UV-Vis. W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania takich sond do testu immunologicznego spektroskopii UV-Vis/Ramana w taki sposób, aby uwzględnić przyszłe możliwości multipleksowania.

Wytwarzanie platformy testów immunologicznych UV-VIS i spektroskopii Ramana

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych

Ten protokół opisuje metodologię przygotowania kulek lateksowych do testów z użyciem przeciwciał IgY do wykrywania antygenów.

Standaryzacja cytometrycznego testu kulkowego opartego na przeciwciałach przeciwko żółtku jaja kurzego

Wychodząc naprzeciw pilnym potrzebom diagnostycznym dengi, przedstawiamy zintegrowane z aplikacją na smartfony papierowe urządzenie analityczne Dengue NS1 (DEN-NS1-PAD) do ilościowego określania stężenia antygenu dengi NS1 w próbkach klinicznych surowicy/krwi. Ta innowacja usprawnia zarządzanie dengą, wspomagając podejmowanie decyzji klinicznych w różnych placówkach opieki zdrowotnej, nawet tych o ograniczonych zasobach.

Przenośny papierowy test immunologiczny w połączeniu z aplikacją na smartfony do kolorymetrycznego i ilościowego wykrywania antygenu dengi NS1

Tutaj opisujemy protokół przygotowania nanokulek kropek kwantowych (QDNB) i wykrywania biomarkerów choroby za pomocą pasków do testów immunologicznych opartych na przepływie bocznym opartych na QDNB. Wyniki testu można ocenić jakościowo przy oświetleniu światłem UV i zmierzyć ilościowo za pomocą fluorescencyjnego czytnika pasków w ciągu 15 minut.

Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Poznaj metodę kowalentnej immobilizacji przeciwciał na krążkach celulozowych przy użyciu utleniania okresowego i retikulacji glutaraldehydem. Technika ta umożliwia rozwój tanich testów immunologicznych do diagnostyki point-of-care.

Kowalencyjne wiązanie przeciwciał z krążkami papieru celulozowego i ich zastosowania w kolorymetrycznych testach immunologicznych gołym okiem (Wideo) | JoVE Journal

Kowalencyjne wiązanie przeciwciał z krążkami papieru celulozowego i ich zastosowania w kolorymetrycznych testach immunologicznych gołym okiem

Przeglądaj więcej filmów