Name: Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj metodę RP-HPLC do ilościowego oznaczania metabolizmu puryn w komórkach CLL. Ta technika pozwala mierzyć produkcję adenozyny w mikrośrodowisku nowotworowym u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez Associazione Italiana Ricerca Cancro (IG #12754).

Próbki krwi od pacjentów z CLL pobierane są zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz Deklaracją Helsińską.
1. Izolacja limfocytów białaczkowych z próbek krwi pacjentów z CLL
<ol>
	<li>Pobrać próbkę krwi do probówki z heparyną sodową (z zieloną zakrętką)17.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie krwi pełnej w stosunku 1:3 w 1x soli fizjologicznej fosforanowej (PBS) w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Oczyścić mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) z próbek krwi metodą wirowania w gradiencie gęstości.
	<ol>
		<li>Wlać 5 ml medium do wirowania gęstościowego (np. Ficoll) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, a następnie ostrożnie nanieść 10 ml rozcieńczonej krwi. Bezzwłocznie wirować przy 1,500 x g przez 20 min w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odssać część nadsączu za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej i zebrać pierścień PBMC z interfejsu między medium do wirowania gęstościowego a rozcieńczoną plazmą za pomocą pipety 5 ml. Przenieść zawartość do probówki wirówkowej 50 ml i przemyć PBS (końcowa objętość 50 ml). Wirować przy 500 x g przez 5 min w 4 °C.</li>
	<li>Odssać nadsącz szklaną pipetą Pasteura, resuspendować osad w 50 ml PBS i policzyć komórki przy użyciu hemocytometru.</li>
	<li>Przebarwić PBMC przeciwciałami anty-CD19 i -CD5 do cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowym protokołem immunobarwienia i sprawdzić skład subpopulacji PBMC18. 
	Uwaga: Limfocyty w CLL są CD19+/CD5+.</li>
	<li>Oznaczyć % komórek CD19+/CD5+ za pomocą cytometru przepływowego18. Oczyścić limfocyty B od pacjentów z ≥95% leukemicznych komórek CD19+/CD5+ zgodnie z instrukcjami szczegółowo opisanymi w kroku 2 dotyczącymi negatywnej izolacji limfocytów B19.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie leukemicznych limfocytów B metodą izolacji negatywnej
<ol>
	<li>Resuspendować 107 PBMC/ml w PBS z 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA, pH 7,4 (bufor do izolacji).</li>
	<li>Do 107 komórek dodać 10 µg mysich przeciwciał monoklonalnych pierwotnych anty-CD3, -CD14 i -CD16, a następnie inkubować przez 30 min w 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki buforem do izolacji i odwirować przy 500 x g przez 5 min w 4 °C.</li>
	<li>Resuspendować komórki w buforze do izolacji w stężeniu 107 PBMC/ml.</li>
	<li>Przed inkubacją z komórkami resuspendować magnetyczne kulki z owczymi przeciwciałami anty-mysie IgG w fiolce. Przenieść 100 µl kulek na 107 komórek do probówki.</li>
	<li>Dodać 1 mL buforu do izolacji i umieścić probówkę w uchwycie magnetycznym na 1 min. Odpipetować nadsącz za pomocą pipety 5 ml.</li>
	<li>Wyjąć probówkę z magnesu i resuspendować przemyte kulki w 100 µl buforu do izolacji.</li>
	<li>Inkubować 107 komórek ze 100 µl kulek magnetycznych przez 30 min w 4 °C przy delikatnym przechylaniu i rotacji.</li>
	<li>Umieścić probówkę w uchwycie magnetycznym na 2 min i przenieść nadsącz z niezwiązanymi komórkami CD19+/CD5+ do nowej probówki za pomocą pipety 5 ml.</li>
	<li>Po zakończeniu protokołu izolacji, 100 µl komórek zbarwić przeciwciałami anty-CD19 i -CD5 do cytometrii przepływowej i inkubować przez 30 min w 4 °C. Przemyć komórki 3 ml PBS z 1% BSA, odpipetować nadmiar nadsączu i ponownie sprawdzić czystość limfocytów B za pomocą cytometrii przepływowej19. 
	Uwaga: Jeśli czystość limfocytów B jest niższa niż 95%, należy przeprowadzić dodatkowy etap izolacji negatywnej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów standardu i roztworów zapasowych inhibitorów
<ol>
	<li>Aby przygotować AMP, odważ 0,00345 g AMP i rozpuść w 5 ml medium bezsurowiczego, aby otrzymać 2 mM roztwór standardowy AMP.</li>
	<li>Aby przygotować ADO, odważ 0,00265 g ADO i rozpuść w 5 ml medium bezsurowiczego, aby otrzymać 2 mM roztwór standardowy ADO.</li>
	<li>Aby przygotować INO, odważ 0,00268 g INO i rozpuść w 5 ml medium bezsurowiczego, aby otrzymać 2 mM roztwór standardowy INO.</li>
	<li>Przygotuj 400 µM roztwór AMP, ADO i INO, mieszając 1 ml 2 mM roztworu stokowego z 4 ml medium bezsurowiczego (objętość końcowa 5 ml).
	<ol>
		<li>Wykonaj rozcieńczenie 1:4 każdego 400 µM roztworu standardowego, aby uzyskać stężenie 100 µM, pipetując 500 µl roztworu 400 µM do 1 500 µl medium bezsurowiczego (objętość końcowa 2 ml).</li>
		<li>Przygotuj rozcieńczenia seryjne każdego związku w medium bezsurowiczym, aby uzyskać następujące stężenia: 100 µM - 50 µM - 25 µM - 10 µM - 5 µM - 2,5 µM - 1 µM - 0,5 µM - 0,25 µM. 
		Uwaga: Na przykład, pipetuj 1 ml roztworu 100 µM do 1 ml medium bezsurowiczego (rozcieńczenie 1:2), aby uzyskać stężenie 50 µM, a następnie kontynuuj pozostałe rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 10 mM roztwór stokowy APCP rozpuszczony w PBS; podziel na aliquoty i przechowuj w temperaturze -30 °C.</li>
	<li>Przygotuj 10 mM roztwory stokowe chlorowodorku EHNA, dCF i dipyrydamolu rozpuszczone w dimetylosulfoksydzie (DMSO); podziel na aliquoty i przechowuj w temperaturze -30 °C.</li>
</ol>
4. Programowanie metody HPLC
<ol>
	<li>Przygotować bufor octanu amonu o stężeniu 7 mM, rozpuszczając 0,770 g octanu amonu w 2 L podwójnie dejonizowanej wody (Bufor A). Dostosować pH do wartości 3,0 za pomocą kwasu solnego.</li>
	<li>Przygotować szklaną butelkę zawierającą co najmniej 2 L ultrazczystego acetonitrylu do HPLC (Bufor B) i podłączyć kolumnę guardingową oraz kolumnę analityczną do układu HPLC. 
	Uwaga: Kolumny i bufory pozostają w temperaturze RT podczas użytkowania.</li>
	<li>Zalogować się do oprogramowania HPLC i wybrać przycisk „browse project”. Przejść do menu „file”, wybrać „new method”, a następnie „instrument method”.</li>
	<li>Zaprogramować metodę równoważenia kolumny zgodnie z Tabelą 1. Ustawić szybkość przepływu na 1,00 ml/min i zaprogramować detektor UV na odczyt przy 260 nm. Zapisać metodę instrumentu, ponownie wybrać „new method” z menu „file”, a następnie „method set”. Wybrać wcześniej zapisaną metodę instrumentu i zapisać bieżący zestaw metod pod tą samą nazwą.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Czas</td>
			<td >Przepływ (ml/min)</td>
			<td >%A</td>
			<td >%B</td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td >
			<td >1.00</td >
			<td >100</td >
			<td >0</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >1.24</td >
			<td >1.00</td >
			<td >100</td >
			<td >0</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >6.22</td >
			<td >1.00</td >
			<td >2</td >
			<td >98</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >18.65</td >
			<td >1.00</td >
			<td >2</td >
			<td >98</td >
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Metoda równoważenia kolumny. Schematyczny przedstawienie zmian rozpuszczalnika podczas równoważenia kolumny. Bufor A: 7 mM octanu amonu, pH 3.0. Bufor B: acetonitryl.
<ol start="5">
	<li>Powtórz krok 4.3, aby zaprogramować metodę analizy próbki wskazaną w Tabeli 2. Ustaw szybkość przepływu na 1,00 mL/min i zaprogramuj detektor UV na odczyt przy 260 nm. Zapisz metodę urządzenia i powtórz tę samą procedurę opisaną w kroku 4.4, aby zapisać zestaw metod.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Czas</td>
			<td >Przepływ (ml/min)</td>
			<td >%A</td>
			<td >%B</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >1.00</td>
			<td >0</td>
			<td >100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >3.74</td>
			<td >1.00</td>
			<td >0</td>
			<td >100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >13.71</td>
			<td >1.00</td>
			<td >15</td>
			<td >85</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >17.00</td>
			<td >1.00</td>
			<td >100</td>
			<td >0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >20.00</td>
			<td >1.00</td>
			<td >100</td>
			<td >0</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Metoda analizy próbek. Schematyczne przedstawienie zmian rozpuszczalników dla pomiaru związków purynowych metodą HPLC. Bufor A: 7 mM octanu amonu, pH 3.0. Bufor B: acetonitryl.
<ol start="6">
	<li>Wybierz przycisk „run samples”, a następnie z menu „file” wybierz opcję „new sample set method”.</li>
	<li>Wybierz opcję „empty” i wprowadź numer fiolki (w autosamplerze), nazwę próbki oraz objętość wtrysku (50 µl). W kolumnie „method set” wybierz wcześniej zapisany zestaw metod i wprowadź całkowity czas analizy (min). 
	Uwaga: Przed analizą każdej próbki wprowadź w kolumnie „method set” metodę równoważenia kolumny (Tabela 1) oraz podaj całkowity czas analizy (min).</li>
</ol>
5. Wyznaczenie standardowej krzywej kalibracyjnej dla każdego związku
<ol>
	<li>Wstrzyknij 50 µl próbki ślepej (specyficzne medium bezsurowicze, które nie zawierat adenozynodeaminazy) oraz każdej próbki standardowej zgodnie z metodami opisanymi w Tabeli 1 i Tabeli 2.
	<ol>
		<li>Przed każdym przebiegiem próbki zastosuj metodę kolumny równoważącej (Tabela 1) i ustaw warunki gradientu opisane w Tabeli 2, aby uzyskać odpowiednią separację pików. Czasy retencji AMP, ADO i INO w tych warunkach HPLC podano w Tabeli 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Czas retencji</td>
			<td>λmaksymalny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>8,00 min</td>
			<td>260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INO</td>
			<td>11,00 min</td>
			<td>260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADO</td>
			<td>11.90 min</td>
			<td>260</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Czasy retencji związków purynowych.Typowe czasy retencji zaobserwowane dla AMP, ADO i INO. Detektor UV jest zaprogramowany na odczyt przy 260 nm.
<ol start="2">
	<li>Wyznacz pole powierzchni piku dla AMP, ADO i INO przy różnych stężeniach, wybierając przycisk „process” w oprogramowaniu HPLC, a następnie opcję „integrate”. Alternatywnie można ręcznie zaznaczyć punkty początkowe i końcowe każdego piku.</li>
	<li>Wykreśl zależność pól powierzchni pików od nominalnego stężenia każdego standardu, aby otrzymać dziewięciopunktową krzywą kalibracyjną (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 µM).</li>
	<li>Oblicz równanie linii prostej dla AMP, ADO i INO: y = mx + b, 
	gdzie x to stężenie w µM, a y odpowiada polu powierzchni piku.</li>
</ol>
<img alt="Wykres stężenia ADO w funkcji powierzchni piku, zależność liniowa; dane w formie tabelarycznej, analiza spektroskopowa." src="/files/ftp_upload/54124/54124fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wyznaczenie krzywej wzorca wewnętrznego. Reprezentatywna krzywa kalibracyjna dla ADO oraz uzyskane równanie względne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54124/54124fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
6. Obróbka wstępna inhibitorami i inkubacja z substratem (AMP)
<ol>
	<li>Aby zbadać zużycie AMP oraz generowanie ADO i INO bez hamowania CD73, ADA i transporterów nukleozydów, zawiesić 2 x 106 komórek CLL CD19+/CD5+ (wyizolowanych i oczyszczonych w krokach 1 i 2) w 250 µl medium bezsurowiczego i wysiać komórki na płytkę 48-dołkową (lub do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml).</li>
	<li>Aby zablokować aktywność enzymatyczną CD73, rozcieńczyć roztwór zapasowy APCP (10 mM) w medium hodowlanym w stosunku 1:1 000, aby uzyskać stężenie końcowe 10 µM. Zawiesić 2 x 106 komórek CLL w 250 µl medium hodowlanego zawierającego APCP i poddać obróbce wstępnej przez 60 min w 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Aby zablokować konwersję ADO do INO, rozcieńczyć roztwór zapasowy chlorowodorku EHNA i/lub dCF (oba 10 mM) w medium bezsurowiczym w stosunku 1:1 000, aby uzyskać stężenie końcowe 10 µM. Zawiesić 2 x 106 komórek CLL w 250 µl medium hodowlanego zawierającego EHNA i/lub dCF. Inkubować przez 30 min w 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Aby zablokować pobieranie ADO przez transportery nukleozydów, rozcieńczyć roztwór zapasowy dipirydamolu (10 mM) w medium bezsurowiczym w stosunku 1:1 000, aby uzyskać stężenie końcowe 10 µM. Zawiesić 2 x 106 komórek CLL w 250 µl medium hodowlanego zawierającego dipirydamol i inkubować przez 30 min w 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Przygotować pojedyncze roztwory APCP, EHNA, dCF i dipirydamolu rozcieńczone 1:1 000 w 400 µM AMP.</li>
	<li>Dodać 250 µl 400 µM AMP lub AMP z inhibitorami, aby uzyskać stężenie końcowe 200 µM AMP. Uwzględnić warunek bez substratu, który będzie służył jako próbka ślepa.</li>
	<li>Inkubować od 30 do 60 min w 37 °C. 
	Uwaga: Optymalne stężenie AMP oraz czas inkubacji zostały określone eksperymentalnie.</li>
	<li>Po zakończeniu czasu inkubacji zebrać 500 µl nadnadłożów do zimnych probórek do mikrocentryfugi (na lodzie) i natychmiast odwirować przy 17 000 x g w 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Przenieść nadnadłoża do nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i natychmiast przechowywać w -80 °C lub przystąpić do przygotowania próbek do analiz HPLC.</li>
</ol>
7. Przygotowanie próbek do HPLC
<ol>
	<li>Przefiltrować nadsączniki do nowych probówek mikrocentryfużowych o pojemności 1,5 ml, używając filtrów strzykawkowych 0,2 µm. Do filtrowania należy używać strzykawek 1 ml.</li>
	<li>Jeśli system HPLC jest wyposażony w autoprobnik, należy przygotować szklane fiolki do HPLC i zastosować mikroinserty 0,1 ml w przypadku małych objętości próbki.</li>
	<li>Przenieść co najmniej 100 µl próbki do szklanej fiolki za pomocą mikropipety lub szklanej pipety Pasteura. Należy uważać, aby przenieść ciecz bez pęcherzyków powietrza, a następnie zamknąć fiolkę zakrętką z gwintem.</li>
	<li>Próbki są teraz gotowe do analizy metodą RP-HPLC.</li>
</ol>
8. Pomiary puryn metodą HPLC
<ol>
	<li>Wybierz przycisk „run samples”; z menu „file” wybierz opcję „new sample set method”.</li>
	<li>Wybierz opcję „empty” i określ: numer fiolki (w autosamplerze), nazwę próbki oraz objętość wtrysku (50 µl).</li>
	<li>Wybierz metodę równoważenia kolumny oraz metodę analizy próbki opisane odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli 2 dla wszystkich następujących pomiarów ślepych prób i próbek. 
	Uwaga: Metodę równoważenia kolumny (Tabela 1) należy ustawić przed każdą analizą próbki.</li>
	<li>Wstrzyknij 50 µl próby ślepej (pożywka bez surowicy) oraz każdej z próbek.</li>
	<li>Określ stężenie puryn w każdej próbce, skwantyfikuj AMP, ADO i INO, uzyskując pola powierzchni pików w czasach retencji opisanych w Tabeli 3.
	<ol>
		<li>Wybierz przycisk „process”, a następnie opcję „integrate”. Alternatywnie można ręcznie wybrać punkty początkowy i końcowy każdego pojedynczego piku, aby uzyskać pomiar pola powierzchni. Odbywa się to poprzez wyrysowanie linii między punktem początkowym a końcowym piku.</li>
		<li>Wyznacz stężenie w µM, stosując równanie otrzymane dla krzywej wzorcowej: y = mx + b, gdzie x oznacza stężenie w µM, a y to pole powierzchni piku zmierzone w nieznanej próbce. 
		Uwaga: Przykład krzywej wzorcowej dla kalibracji ADO przedstawiono na Rysunku 2, gdzie: x = (y area - 981.02)/40026</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyjmując, że 2 x 106 komórek resuspenderowano w 0,500 ml pożywki, oblicz liczbę µmoli AMP, ADO i INO zużytych i/lub wytworzonych przez 106 komórek CLL, stosując następującą proporcję: 
	µmoles : 1,000 ml = x µmoles : 0.250 ml 
	Uwaga: Liczba µmoli w 1,000 ml (liczba µmoli w 1 L) jest równoważna stężeniu w µM, a x to liczba µmoli nukleotydu lub nukleozydu wytworzonych przez 106 komórek.
	<ol>
		<li>Na koniec przelicz µmole na nmole zużyte i/lub wytworzone przez 106 komórek CLL: 
		nmoles = µmoles x 1,000</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Critical+role+for+A2A+adenosine+receptors+in+the+T+cell-mediated+regulation+of+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis.</a> J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).</li>
<li>Nemeth, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+receptor+activation+ameliorates+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes.</a> FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).</li>
<li>Fan, M., Jamal Mustafa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+adenosine+in+airway+inflammation+in+an+allergic+mouse+model+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma.</a> Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).</li>
<li>Csoka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A2B+adenosine+receptors+protect+against+sepsis-induced+mortality+by+dampening+excessive+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation.</a> J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).</li>
<li>Peart, J. N., Headrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosinergic+cardioprotection%3A+multiple+receptors%2C+multiple+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways.</a> Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).</li>
<li>Ohta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A2A+adenosine+receptor+protects+tumors+from+antitumor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).</li>
<li>Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+receptors%3A+therapeutic+aspects+for+inflammatory+and+immune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).</li>
<li>Cronstein, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%2C+an+endogenous+anti-inflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent.</a> J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).</li>
<li>Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+transporter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Vasc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nucleoside transporter proteins.</a> Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).</li>
<li>Deaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+generation+catalyzed+by+CD39+and+CD73+expressed+on+regulatory+T+cells+mediates+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression.</a> J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).</li>
<li>Linden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+leukocyte+function+by+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of leukocyte function by adenosine receptors.</a> Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).</li>
<li>Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation+and+cancer%3A+a+leading+role+for+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine.</a> Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).</li>
<li>Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+and+inflammation%3A+what%27s+new+on+the+horizon%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Adenosine and inflammation: what's new on the horizon.</a> Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).</li>
<li>Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia.</a> N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).</li>
<li>Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectonucleoside+triphosphate+diphosphohydrolase-1+%28E-NTPDase1%2FCD39%29+as+a+new+prognostic+marker+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).</li>
<li>Serra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73-generated+extracellular+adenosine+in+chronic+lymphocytic+leukemia+creates+local+conditions+counteracting+drug-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death.</a> Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).</li>
<li>Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection+methods+affect+cellular+protein+integrity%3A+implications+for+clinical+trial+biomarkers+and+ZAP-70+inn+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL.</a> Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).</li>
<li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
<li>Deaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD38+and+ZAP-70+are+functionally+linked+and+mark+CLL+cells+with+high+migratory+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential.</a> Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).</li>
<li>Sachsenmeier, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+ectonucleotidase+assay+suitable+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół pozwala na ocenę aktywności maszynerii adenozynergicznej CD39/CD73 w pożywkach do hodowli komórkowych z oczyszczonych ludzkich komórek białaczkowych. Dzięki tej metodzie HPLC możemy śledzić i ilościowo mierzyć enzymatyczne wytwarzanie ADO (zależne od CD73) i jego późniejszą degradację do INO (zależne od CD26 / ADA). Stosowanie inhibitorów enzymów pozwala na kontrolowanie protokołu i przeprowadzanie kontroli wewnętrznych. Zaletami i nowościami tego protokołu są to, że i) można go stosować do komórek...

Adenozyna (ADO) jest nukleozydem purynowym, w którym cząsteczka adeniny jest połączona z fragmentem cząsteczki cukru rybozy poprzez wiązanie glikozydowe. Gdy występuje w środowisku zewnątrzkomórkowym, chroni ona komórki przed nadmiernymi uszkodzeniami wywołanymi przez układ odpornościowy. Rola ta została podkreślona w różnych modelach chorobowych, takich jak zapalenie jelita grubego1, cukrzyca2, astma3, sepsa4 oraz uszkodzenia niedokrwienne5. Jedną z głównych funkcji ADO jest hamowanie odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowisku guza, co przyczynia się do ucieczki immunologicznej nowotworu6. Z tego powodu mechanizmy zaangażowane w powstawanie i sygnalizację ADO budzą znaczne zainteresowanie terapeutyczne7.
Poziomy ADO w mikrośrodowisku tkankowym są stosunkowo niskie w normalnych warunkach fizjologicznych i z pewnością znajdują się poniżej progu wrażliwości komórek odpornościowych. Jednakże podczas hipoksji, niedokrwienia, stanu zapalnego, infekcji, stresu metabolicznego i transformacji nowotworowej gwałtownie wzrastają8. Podwyższone pozakomórkowe poziomy ADO w odpowiedzi na sygnały zaburzające strukturę tkanki pełnią podwójną funkcję: informują o uszkodzeniu tkanki w sposób autokrynny i parakrynny oraz generują odpowiedzi tkankowe, które można ogólnie uznać za cytoprotekcyjne.
Zewnątrzkomórkowa ADO może powstawać poprzez różne mechanizmy, do których należy uwalnianie z przedziałów wewnątrzkomórkowych za pośrednictwem transporterów nukleozydów9 lub gromadzenie się w wyniku upośledzonej degradacji katalizowanej przezt przezt adenozynodeaminazę. Główna ścieżka prowadząca do zwiększenia zewnątrzkomórkowego poziomu ADO obejmuje działanie kaskady ektonukleotydaz, które są związanymi z błoną ektoenzymami generującymi ADO poprzez fosfohydrolizę nukleotydów uwalnianych z martwych lub obumierających komórek. Ścieżka ta przebiega poprzez sekwencyjne działanie CD39 (ektonukleozydotrifosforanodifosfohydrolazy-1), która przekształca zewnątrzkomórkowy adenozynotrifosforan (ATP) lub adenozynodifosforan (ADP) w adenozynomonofosforan (AMP), oraz CD73 (5'-nukleotydazy), która przekształca AMP w ADO10.
Zewnątrzkomórkowa ADO wywołuje odpowiedzi fizjologiczne poprzez wiązanie się z czterema receptorami ADO zlokalizowanymi w błonie komórkowej, mianowicie A1, A2A, A2B i A3. Każdy z receptorów wykazuje inne powinowactwo do ADO oraz specyficzną dystrybucję tkankową. Wszystkie receptory posiadają siedem domen transbłonowych i są sprzężone z wewnątrzkomórkowymi białkami wiążącymi GTP (białkami G), które mogą indukować (białko Gs) lub hamować (białko Gi) aktywność cyklazy adenylanowej, a w konsekwencji produkcję wewnątrzkomórkowego cAMP. W związku z tym zmiany poziomu cAMP w cytoplazmie wpływają na aktywność wewnątrzkomórkowych kinaz białkowych podczas odpowiedzi fizjologicznych.11W warunkach fizjologicznych stężenie zewnątrzkomórkowej ADO wynosi poniżej 1 µM, który może niespecyficznie aktywować receptory A1, A2A i A3. Jednakże aktywacja podtypu A2B wymaga znacznie wyższych stężeń nukleozydu, takich, jakie powstają w warunkach patofizjologicznych. Alternatywnie, zewnątrzkomórkowa ADO może być degradowana do anozyny (INO) przez adenozynodeaminazę (ADA) oraz CD26, białko kompleksujące ADA, które lokalizuje tę enzym na powierzchni komórki. Inną możliwością jest internalizacja ADO do wnętrza komórki poprzez równowagowe transportery nukleozydów (ENT) i fosforylacja do AMP przez białko kinazy ADO12,13.
Celem niniejszego protokołu jest opis analitycznej metody odwrotnej fazowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (RP-HPLC) w celu ilościowego oznaczenia w jednym przebiegu substratu AMP oraz produktów ADO i INO, generowanych przez ludzkie limfocyty. Nasze doświadczenie zdobyto początkowo z wykorzystaniem komórek od pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), która charakteryzuje się ekspansją dojrzałej populacji limfocytów B CD19+/CD5+ konstytutywnie wykazujących ekspresję CD3914,15. Wykazaliśmy, że około 30% pacjentów z CLL wykazuje ekspresję ektoenzymu CD73 i że fenotyp ten koreluje ze złym rokowaniem16. Ta subpopulacja komórek białaczkowych koekspresujących CD39 i CD73 może aktywnie produkować zewnątrzkomórkowe ADO z ADP i/lub AMP. Preinkubacja komórek CLL CD73+ z α,β-metylenowo-ADP (APCP), znanym inhibitorem aktywności enzymatycznej CD73, całkowicie blokuje syntezę zewnątrzkomórkowego ADO, co potwierdza, że CD73 jest enzymem ograniczającym szybkość tej kaskady16.
Komórki CLL wykazują również ekspresję ADA oraz białka kompleksującego ADA, CD26, które odpowiadają za konwersję ADO do INO. Dzięki zastosowaniu specyficznych inhibitorów ADA, takich jak chlorowodorek erythro-9-(2-hydroksy-3-nonyl)adeniny (EHNA) i ksylokortyna (dCF), możliwe jest zablokowanie zewnątrzkomórkowej degradacji ADO do INO. Ponadto wstępna inkubacja z inhibitorem ADA w połączeniu z dipirydamolem, który blokuje transportery nukleozydów, zwiększa akumulację ADO w nadsączach komórkowych.
Następnie rozszerzyliśmy ten protokół na komórki pochodzące z innych linii, w tym na limfocyty T i komórki mieloidalne, potwierdzając zależną od CD73 produkcję ADO. Wyniki te sugerują, że niniejszy protokół HPLC jest niezwykle wszechstronny i może być stosowany w odniesieniu do różnych linii komórkowych oraz różnych warunków hodowli (Rycina 1).
<img alt="Schemat metabolizmu adenozyny z enzymami CD39, CD73, ADA/CD26; szlaki transportu komórkowego." src="/files/ftp_upload/54124/54124fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny opis mechanizmu enzymatycznego odpowiedzialnego za pozakomórkową produkcję ADO. Adenozynotrifosforan (ATP) i/lub adenozynodifosforan (ADP) mogą być degradowane przez CD39 do adenozynomonofosforanu (AMP), który z kolei jest przekształcany przez CD73 w nukleozyd adenozynę (ADO). Po wytworzeniu ADO w przestrzeni pozakomórkowej może ona ponownie wniknąć do komórki poprzez transportery nukleozydów (ENT), zostać przekształcona w anozynę (INO) lub związać się z różnymi typami receptorów P1 dla ADO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54124/54124fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td>Krew ludzka</td></tr><tr><td>Woda Milli-Q</td><td>Podwójnie dejonizowana woda</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>oczyszczony anty-CD3, -CD14, -CD16</td><td>wyprodukowany we własnym zakresie</td><td></td><td>mysi monoklonalny</td></tr><tr><td>PE z oznaczeniem anty-CD19</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>120-014-229</td><td></td></tr><tr><td>z oznaczeniem FITC anty-CD5</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-574</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads owcze anty-mysie IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11031</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Amresco</td><td>E404-200TABS tabletki</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>ID Bio</td><td>1000-70</td><td>standardowy</td></tr><tr><td>bufor</td><td></td><td></td> izolacyjny <td>PBS 0,1% BSA 2 mM EDTA, pH 7,4</td></tr><tr><td>AIM V surowica wolne podłoże</td><td>GIBCO</td><td>12055-091</td><td>płyn (klasa badawcza)</td></tr><tr><td>adenozyno5'-difosforan (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>adenozyno5'-monosfat (AMP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>adenozyna (ADO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>inozyna (INO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125</td><td></td></tr><tr><td>& alfa;,&beta;-metyleno-ADP (APCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8386</td><td>Inhibitor CD73</td></tr><tr><td>Chlorowodorek EHNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E114</td> inhibitor <td>deaminazy adenozynowej</td></tr><tr><td>Deoksykoformycyna (dCF)</td><td>Tocris</td><td>2033</td><td>inhibitor deaminazy adenozynowej</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dipirydamol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9766</td> inhibitor <td>transportera nukleozydów</td></tr><tr><td>acetonitryl (CHROMASOLV Plus)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>octan amonu</td> klasy HPLC <td>Sigma-Aldrich</td><td>9688</td><td>7 mM, pH 3,0</td></tr><tr><td>kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1L</td><td>min. 37%</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Katalog Numer</silny></td><td><silny>Komentarze</silny></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; licznik komórek rker</td><td>hemocytometr</td><td>VWR</td><td>631-0920</td></tr><tr><td>DynaMag-15 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12301D</td><td>Dynal magnetyczny separator kulek</td></tr><tr><td>mikrowirówka probówki safe-lock</td><td>Eppendorf</td><td>030-120-0086</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>probówki wirówkowe PET</td><td>Corning</td><td>430053/430304</td><td>15 &ndash; 50 ml</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Minisart RC4</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>17821</td><td>membrana 0,2 i mikro; </td></tr><tr><td>m fiolki z krótkim gwintem</td><td>VWR</td><td>548-0029</td><td>1,5 ml/mikrowkładki szklane</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>548-0006</td><td>0,1 ml/nakrętki szklane</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>548-0085</td><td>9 mm/PP niebieskie</td></tr><tr><td>Atlantis dC18 Wody kolumnowe</td><td></td><td>186001344</td><td>5 &mikro; m, 4.6 mm x 150 mm</td></tr><tr><td>Atlantis dC18 Kolumna ochronna</td><td>Wody</td><td>186001323</td><td>5 & mikro; m, 4,6 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Moduł separacyjny Waters Alliance 2965</td><td>Moduł</td><td></td><td>separacji wody</td></tr><tr><td>HPLC Detektor fotodiodowy (PDA) Waters 2998 Detektor</td><td>UV</td><td>Waters</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Empower2</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test oparty na hplc do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

Ta metoda opisuje czuły, specyficzny, niezawodny i powtarzalny test wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC), opracowany i zatwierdzony do oznaczania ilościowego zewnątrzkomórkowych nukleotydów purynowych i nukleozydów wytwarzanych przez oczyszczone komórki przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) w różnych warunkach hodowli. Chromatograficzne rozdzielanie adenozyno-5'-monofosforanu (AMP), adenozyny (ADO) i inozyny (INO) przeprowadza się w temperaturze pokojowej na kolumnie o odwróconych fazach na bazie krzemionki, która służy do zatrzymywania związków polarnych. Metoda obejmuje dwuskładnikową fazę ruchomą, która składa się z octanu amonu i acetonitrylu o natężeniu przepływu 1,00 ml/min. Eluaty są monitorowane za pomocą detektora UV Photodiode Array ustawionego na 260 nm. Standardowa krzywa kalibracyjna jest generowana w celu obliczenia równania analitycznego oznaczania ilościowego każdego związku purynowego. Następnie przeprowadzana jest kontrola systemu, akwizycja i analiza danych. Stosując ten protokół, AMP, INO i ADO eluują odpowiednio po 7, 11 i 11,9 min, a całkowity czas pracy dla każdej próbki wynosi 20 min. Protokół ten może być stosowany do różnych typów komórek i linii komórkowych (zarówno zawiesinowych, jak i adherentnych), przy użyciu pożywek hodowlanych jako matrycy. Zaletami są łatwe i szybkie przygotowanie próbki oraz wymóg użycia niewielkiej ilości supernatantu do analizy. Co więcej, zastosowanie pożywki bez surowicy pozwala na pominięcie etapu wytrącania białek acetonitrylem, który wpływa na końcowe stężenie związków purynowych. Jednym z ograniczeń tej metody jest wymóg uruchomienia kolumny równowagi przed każdym pojedynczym cyklem próbki, co wydłuża całkowity czas trwania eksperymentu i zapobiega aplikacjom przesiewowym o wysokiej przepustowości.

Aby ocenić procent (%) komórek białaczkowych w świeżo oczyszczonych PBMC od reprezentatywnego pacjenta z CLL, komórki znakuje się przeciwciałami anty-CD19 i anty-CD5. Lewy panel Rysunku 3 przedstawia cytofluorymetryczny wykres kropkowy z selektywnym bramkowaniem żywych komórek. Rysunek 3 pokazuje przykład PBMC od pacjenta z CLL przed (panel środkowy) i po (panel prawy) oczyszczaniu limfocytów B.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

Opisany tutaj protokół reprezentuje łatwą i powtarzalną metodę, która wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu puryn na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) hodowanych w różnych warunkach.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej w fazie odwróconej do ilościowego oznaczenia metabolizmu puryn w komórkach przewlekłej białaczkowej białaczki limfatycznej (CLL), mierzonych w różnych warunkach hodowli. Metoda ta została zastosowana w celu ustalenia, kiedy i w jaki sposób komórki mogą produkować adenozynę w środowisku zewnątrzkomórkowym. Jest to kwestia kluczowa, ponieważ adenozyna jest cząsteczką o działaniu zarówno cytoprotekcyjnym, jak i immunosupresyjnym.Ponadto metoda ta wymaga niewielkiej ilości pożywki hodowlanej, a jej przygotowanie jest niezwykle proste. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy rozpoczęliśmy badania nad metabolizmem puryn w mikrośrodowisku nowotworowym. Zdaaliśmy sobie sprawę, że niezbędne jest opracowanie łatwej i powtarzalnej metody pomiaru tego metabolizmu z wykorzystaniem komórek pierwotnych.Przygotować rozcieńczenie krwi pełnej w stosunku od 1:2 do 1:3 w roztworze buforu fosforanowego (PBS) 1x o temperaturze pokojowej; krok ten jest niezbędny do uzyskania oczyszczonych limfocytów CLL. Następnie wykorzystać je do pomiaru metabolizmu puryn zewnątrzkomórkowych. Oczyszczone mononuklearnymi komórki k

hplc-based-assay-to-monitor-extracellular-nucleotidenucleoside

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Film opisuje stopniowy test znakowania impulsowego komórek ssaków za pomocą bromodeoksyurydyny (BrdU) do pomiaru proliferacji komórek. Wychwyt BrdU pozwala na czasowe śledzenie komórek, które znajdowały się w fazie syntezy w określonym momencie, bez konieczności synchronizacji komórek.

Test znakowania impulsowego bromodeoksyurydyny: technika pomiaru proliferacji komórek

Ten film wyjaśnia ilościową metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu adenozyny i powiązanych puryn generowanych przez konsumpcję AMP w środowisku zewnątrzkomórkowym komórek raka białaczkowego. Protokół opisuje czuły, specyficzny, wiarygodny i powtarzalny test RP-HPLC opracowany i zwalidowany do oznaczania ilościowego zewnątrzkomórkowych nukleotydów purynowych i nukleozydów wytwarzanych przez oczyszczone komórki przewlekłej białaczki...

Zewnątrzkomórkowy metabolizm puryn: test oparty na HPLC do pomiaru wytwarzania i metabolizmu adenozyny w komórkach białaczkowych

Ten film pokazuje test badający rolę komórek podobnych do neutrofili w ochronie komórek chłoniaka przed cytotoksycznością środków chemioterapeutycznych. Powstaje kokultura 3D, składająca się z chłoniaka i komórek podobnych do neutrofili, i wystawia się ją na działanie winkrystyny - leku stosowanego w chemioterapii. Bezpośredni kontakt z komórkami podobnymi do neutrofili indukuje regulację w górę białek antyapoptotycznych w komórkach chłoniaka, sprzyjając w ten sposób ich przetrwaniu w obecności...

Określanie roli komórek neutrofilopodobnych we wrażliwości komórek chłoniaka na badany lek

Neutrofile to najliczniejszy rodzaj białych krwinek. Opisano tutaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą separacji w gradinie gęstości i różnicowanie ludzkich komórek promielocytowych (HL60) wzdłuż szlaku granulocytarnego; w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Ten protokół umożliwia optymalizację i późniejsze efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Próbki te są wykorzystywane do określenia lokalizacji białek, a także zmian w transporcie białek, które zachodzą między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym.

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Tu opisano jest precyzyjna i możliwa do powtórzenia metoda ilościowego oceny nukleozydów/nukleotydów in vivo w roślinach. Ta metoda wykorzystuje HPLC-MS/MS.

Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Poznaj metodę RP-HPLC do ilościowego oznaczania metabolizmu puryn w komórkach CLL. Ta technika pozwala mierzyć produkcję adenozyny w mikrośrodowisku nowotworowym u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (Wideo) | JoVE Journal

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Przeglądaj więcej filmów