Name: Pomiar czasu przeżycia u wrotków Brachionus: synchronizacja warunków matczynych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Poznaj protokół pomiaru czasu przeżycia wrotków Brachionus z synchronizacją warunków matczynych. Ta metoda zapewnia wysoką powtarzalność i moc statystyczną w badaniach nad starzeniem oraz ekotoksykologią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni George'owi Jarvisowi, Marcie Bock i Bette Hecox-Lea, Morskiemu Laboratorium Biologicznemu, za pomoc w filmowaniu.

1. Przygotowanie mediów
Uwaga: Użyj do połowy rozcieńczonej sztucznej wody morskiej Brujewicza o zasoleniu 16,5 ppt (PSU). Inne sztuczne wody morskie są również często wykorzystywane do hodowli wrotków Brachionus 25,26.
<ol>
	<li>Dodaj 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM KCl i 10 mM CaCl2 do 4,5 l wody destylowanej (końcowa objętość wyniesie 5 l). Alternatywnie użyj dejonizowanej wody rozcieńczającej zamiast wody destylowanej. Dodaj CaCl2 po rozpuszczeniu wszystkich innych soli.</li>
	<li>Przygotować 0,48 M roztwór podstawowy NaHCO3 (stężenie 200x). Dodaj 25 ml do powyższego roztworu. Końcowe stężenie NaHCO3 wynosi 2,4 mM.</li>
	<li>Przygotować 0,4 M roztwór podstawowy NaBr (stężenie 500x). Dodaj 10 ml do powyższego roztworu. Końcowe stężenie NaBr wynosi 0,8 mM. Uzupełnić do 5 l wodą destylowaną.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór za pomocą filtra membranowego 0,45 μm. Przed użyciem rozcieńczyć go dwa razy sterylną wodą (v/v). 
	Uwaga: Możliwe jest wykonanie 2x stężenia sztucznej wody morskiej Brujewicza jako roztworu podstawowego.</li>
</ol>
2. Ogólne warunki hodowli
<ol>
	<li>Hodowla wrotków hodowanych w laboratorium lub dziko żyjących w sterylnej zlewce o pojemności 100 ml w temperaturze od 20 do 30 °C. Wyższe temperatury skutkują krótszą żywotnością i przyspieszoną reprodukcją. Użyj 25 °C dla wygody eksperymentów. Gęstość wrotka czy objętość sztucznej wody morskiej nie jest tutaj dużym problemem.</li>
	<li>Hodowla dietetycznych gatunków mikroalg w sztucznej wodzie morskiej 11. Zobacz Snell et al. (2014) w celu uzyskania szczegółowych informacji 11. Zazwyczaj stosuje się Tetraselmis tetrathele (~2 x 105 komórek/ml 27,28), T. suecica (~6 x 105 komórek/ml 25,29) i Nannochloropsis oculata (~7 x 106 komórek/ml 30,31). Ponieważ glony dietetyczne (gatunek, warunki hodowli, skład biochemiczny) znacząco wpływają na czas przeżywalności wrotków Brachionus, należy stosować tę samą partię mikroalg we wszystkich grupach eksperymentalnych.</li>
	<li>Utrzymuj populację wrotków w hodowli okresowej, karmiąc i zmieniając od czasu do czasu pożywkę (np. karmić co 2 dni i zaszczepiać co tydzień). Wiele noworodków i dorosłych noszących 2-3 jaja można zaobserwować, gdy wrotki są w optymalnych warunkach. 
	Uwaga: Alternatywnym sposobem uzyskania eksperymentalnych wrotków jest wykluwanie jaj spoczynkowych. Wrotki wyklute z jaj spoczynkowych uważa się za dobrze zsynchronizowane, a ich długość życia nie różni się znacząco od żywotności wrotków wyklutych z jaj amiktycznych 11. Jednak wrotki z jaj spoczynkowych zaczynają rozmnażać się wcześniej niż te z jaj amiktycznych. Dlatego należy zachować ostrożność przy pomiarach ich cech rozrodczych.</li>
</ol>
3. Synchronizacja wrotków przez prekulturę
<ol>
	<li>Należy wybrać pojedynczy wrotek z populacji i kultury podstawowej, jak opisano w ppkt 2.1-2.3, aby ustalić subpopulację, która zostanie wykorzystana do eksperymentów. Zazwyczaj uprawa przez dwa tygodnie.</li>
	<li>Zbierz jajonośne wrotki z subpopulacji (zbierz podwójną liczbę osobników, które zostaną wykorzystane do eksperymentu). Hoduj je jako pojedynczą kohortę (gęstość: ~ 50 osobników/ml) na 6-dołkowej płytce hodowlanej, jak opisano w 2.1-2.3, w świeżej pożywce pod wpływem ad libitum. Kontrolowanie zagęszczenia populacji jest ważne, ponieważ kondycjonowana pożywka wpływa na fizjologię rozrodu wrotków Brachionus 32,33.</li>
	<li>Przenieść noworodki, które wykluły się z pierwszych jaj dorosłych osobników, do nowo przygotowanych pożywek hodowlanych. Powtórz tę procedurę przez 2-3 pokolenia</li>.
	<li>Do pomiaru czasu przeżycia wykorzystuje się noworodki, które wykluły się w określonym czasie (np. <3 godziny). Aby uniknąć możliwego błędu w wyborze pojedynczego osobnika, choć jest to bardzo mało prawdopodobne, sprawdź odtwarzalność przy użyciu kilku niezależnych subpopulacji. 
	Uwaga: Ponieważ wrotki zwykle rozmnażają się tylko bezpłciowo w tych warunkach, upewnij się, że podczas eksperymentu nie ma samców. Samce są mniejsze od noworodków i zazwyczaj poruszają się szybciej niż samice. Samice miktyczne mają inną długość życia niż samice amiktyczne w pewnych warunkach 29.</li>
</ol>
4. Pomiary czasu przeżycia
<ol>
	<li>Umieść noworodki na plastikowych płytkach (zwykle 24- lub 48-dołkowych, z których każda zawiera 1 ml sztucznej wody morskiej).</li>
	<li>W odstępach 24-godzinnych przenieść wrotki na nowo przygotowane pożywki hodowlane lub w odstępach 12-godzinnych, jeśli temperatura jest wyższa (30 °C lub wyższa). Zapisz liczbę potomstwa i to, czy każdy osobnik jest żywy, czy martwy. Zapisz wrotek jako martwy, gdy ruch rzęsek korony całkowicie ustał. 
	Uwaga: Wrotki często mocują się do bocznych ścian studni. Delikatne pipetowanie wody pomaga je znaleźć. Jeśli wrotki nie zostaną znalezione lub zostaną przypadkowo uszkodzone przez pipetowanie, zapisz je jako "ocenzurowane", a nie jako "martwe".</li>
	<li>Usuń noworodki, gdy eksperymentalne wrotki aktywnie się rozmnażają. Noworodki rosną szybko i czasami trudno je odróżnić od eksperymentalnych wrotków.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Utwórz krzywą przeżycia Kaplana-Meiera (rysunki 1 i 2), wykreślając skumulowany współczynnik przeżycia na osi Y i czas na osi X. Jest to najczęstsza reprezentacja danych dotyczących przeżycia. Użyj nieparametrycznego testu logarytmicznego rangi (zwanego również testem Mantela-Coxa) do statystycznego porównania czasu przeżycia 34. Test log-rank jest również zawarty w innych standardowych pakietach statystycznych, takich jak JMP i R. 
	Uwaga: Nie należy stosować testu t Studenta ani analizy wariancji (ANOVA), po którym następuje parametryczne wielokrotne porównanie, ponieważ rozkład normalny zwykle nie jest spełniony przez dane dotyczące przeżycia 35. Ponadto metody te nie uwzględniają osób ocenzurowanych. Test U Manna-Whitneya może być stosowany, jeśli nie ma ocenzurowanych danych.</li>
</ol>

<ol><li>Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWallace%2C+RL+%22Rotifera+Vol.1%3A+Biology%2C+ecology+and+systematics%22">Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics</a>. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).</li>
<li>Segers, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSegers%2C+H+%22Annotated+checklist+of+the+rotifers+%28Phylum+Rotifera%29%2C+with+notes+on+nomenclature%2C+taxonomy+and+distribution%22">Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution</a>. , Magnolia Press. Auckland. (2007).</li>
<li>Mark Welch, D. B., Meselson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+evolution+of+bdelloid+rotifers+without+sexual+reproduction+or+genetic+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange.</a> Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).</li>
<li>Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expressed+sequence+tags+of+the+cyclically+parthenogenetic+rotifer+Brachionus+plicatilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis.</a> PLoS ONE. 2, e671(2007).</li>
<li>Denekamp, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+genes+associated+with+dormancy+in+the+monogonont+rotifer+Brachionus+plicatilis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis.</a> BMC Genomics. 10, 108(2009).</li>
<li>Lee, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+genomic+DNA+%28680+Mb%29+by+GS-FLX-Titanium+sequencer+in+the+monogonont+rotifer%2C+Brachionus+ibericus%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus.</a> Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).</li>
<li>Flot, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+evidence+for+ameiotic+evolution+in+the+bdelloid+rotifer+Adineta+vaga%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga.</a> Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).</li>
<li>Dunn, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+phylogenomic+sampling+improves+resolution+of+the+animal+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life.</a> Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).</li>
<li>Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanisms+of+life+history+alterations+in+a+rotifer%3A+a+novel+approach+in+population+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+B+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics.</a> Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).</li>
<li>Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecotoxicology%2C+ecophysiology%2C+and+mechanistic+studies+with+rotifers%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers.</a> Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).</li>
<li>Snell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotifers+as+models+for+the+biology+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Hydrobiol%22%5BJournal%5D)">Rotifers as models for the biology of aging.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).</li>
<li>Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotifers+as+experimental+tools+for+investigating+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebr.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Rotifers as experimental tools for investigating aging.</a> Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).</li>
<li>Kaneko, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Mn-superoxide+dismutase+and+gene+expression+studies+in+dietary+restricted+Brachionus+plicatilis+rotifers%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers.</a> Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).</li>
<li>Yoshinaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+signaling+pathway+involved+in+regulating+longevity+of+rotifers%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers.</a> Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).</li>
<li>Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+in+the+rotifer+Brachionus+plicatilis+enhances+hypoxia+tolerance+in+association+with+the+increased+mRNA+levels+of+glycolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes.</a> Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).</li>
<li>Kailasam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+calorie+restriction+on+the+expression+of+manganese+superoxide+dismutase+and+catalase+under+oxidative+stress+conditions+in+the+rotifer+Brachionus+plicatilis%5BTitle%5D)+AND+%22Fish.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis.</a> Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).</li>
<li>Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mixture+of+two+endocrine+disruptors+%28ethinylestradiol+and+levonorgestrel%29+on+selected+ecological+endpoints+of+Anuraeopsis+fissa+and+Brachionus+calyciflorus+%28Rotifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Hydrobiol%22%5BJournal%5D)">Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera).</a> Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).</li>
<li>Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+expression+of+four+heat+shock+proteins+during+the+aging+process+in+Brachionus+calyciflorus+%28rotifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera).</a> Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+gamma+irradiation+affects+reproductive+impairment+and+elevates+antioxidant+enzyme+and+DNA+repair+activities+in+the+monogonont+rotifer+Brachionus+koreanus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus.</a> Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).</li>
<li>Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+caloric+restriction+partially+rescues+the+deleterious+effects+of+advanced+maternal+age+on+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring.</a> Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).</li>
<li>Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+periodical+starvation+on+the+survival+of+offspring+in+the+rotifer+Brachionus+plicatilis%5BTitle%5D)+AND+%22Fish.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis.</a> Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).</li>
<li>Kaneko, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction-induced+maternal+longevity+is+transmitted+to+their+daughters+in+a+rotifer%5BTitle%5D)+AND+%22Funct.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer.</a> Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).</li>
<li>Lansing, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmissible%2C+cumulative%2C+and+reversible+factor+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging.</a> J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).</li>
<li>Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+periodical+starvation+on+the+life+history+of+Brachionus+plicatilis+O.+F.+M%C3%BCller+%28Rotifera%29%3A+a+possible+strategy+for+population+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Mar.+Biol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability.</a> J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).</li>
<li>Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+intraspecific+variability+in+the+response+to+caloric+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction.</a> Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).</li>
<li>Snell, T. W., Johnston, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+extends+lifespan+of+Brachionus+manjavacas+%28Rotifera%29+and+protects+against+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors.</a> Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).</li>
<li>Kim, H. -J., Hagiwara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+female+aging+on+the+morphology+and+hatchability+of+resting+eggs+in+the+rotifer+Brachionus+plicatilis+M%C3%BCller%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller.</a> Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).</li>
<li>Kim, H. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+transcriptional+events+during+resting+egg+hatching+of+the+rotifer+Brachionus+manjavacas%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas.</a> Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).</li>
<li>Gribble, K. E., Welch, D. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-span+extension+by+caloric+restriction+is+determined+by+type+and+level+of+food+reduction+and+by+reproductive+mode+in+Brachionus+manjavacas+%28Rotifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera).</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).</li>
<li>Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+expression+patterns+of+stress+protein+genes+during+population+growth+of+the+rotifer+Brachionus+plicatilis%5BTitle%5D)+AND+%22Fish.+Sci%22%5BJournal%5D)">Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis.</a> Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).</li>
<li>Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+and+reproduction+of+the+rotifer+Brachionus+plicatilis+species+complex+under+different+light+wavelengths+and+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Hydrobiol%22%5BJournal%5D)">Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).</li>
<li>Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conditioned+media+on+the+asexual+reproduction+of+the+monogonont+rotifer+Brachionus+plicatilis+O.+F.+M%C3%BCller%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller.</a> Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).</li>
<li>Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+growth-promoting+protein+in+the+conditioned+media+from+the+rotifer+Brachionus+plicatilis+at+an+early+exponential+growth+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase.</a> Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).</li>
<li>GraphPad Statistics Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/">http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/</a> (2015).</li>
<li>Collet, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollet%2C+D+%22Modelling+Survival+Data+in+Medical+Research%22">Modelling Survival Data in Medical Research</a>. , 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).</li>
<li>Bouliotis, G., Billingham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+survival+curves%3A+alternatives+to+the+log-rank+test%5BTitle%5D)+AND+%22Trials%22%5BJournal%5D)">Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test.</a> Trials. 12, Suppl 1. A137(2011).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+expression+of+manganese+superoxide+dismutase%2C+copper+and+zinc+superoxide+dismutase+and+catalase+in+Brachionus+calyciflorus+during+the+aging+process%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process.</a> PloS ONE. 8 (2), e57186(2013).</li>
<li>Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+inhibition+of+TOR+and+JNK+pathways+interacts+to+extend+the+lifespan+of+Brachionus+manjavacas+%28Rotifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera).</a> Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+nematode+Caenorhabditis-elegans+-+major+biological+and+environmental-factors+influencing+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span.</a> Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).</li>
<li>Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parental+age+effects+on+the+evolution+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The role of parental age effects on the evolution of aging.</a> Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecny protokół opisuje metodę pomiaru czasu przeżycia wrotków Brachionus . Krytycznym krokiem jest synchronizacja warunków panujących w wrotku przez kilka pokoleń. Gdy eksperymentalne wrotki są dobrze zsynchronizowane, obserwuje się typową krzywą przeżycia typu I z bardzo małą wczesną śmiertelnością, jak podano w kilku poprzednich badaniach 18,24,37,38. Odchylenia standardowe ich czasu przeżycia stają się zatem mniejsze w porównaniu ze słabo zsynchronizowanymi wrotkami, co skutkuje wysoką mocą statys...

Wrotki to mikroskopijny kosmopolityczny zooplankton (<1 mm), który tworzy gromadę Rotifera 1. Mają prosty plan ciała składający się z około 1000 komórek somatycznych, a także charakterystyczny przypominający koło aparat rzęskowy zwany koroną, który służy do poruszania się i karmienia. Większość wrotków należy do klas Monogononta lub Bdelloidea, które zawierają odpowiednio około 1,600 i 500 gatunków2. Wrotki monogonontowe mają na ogół zarówno płciową, jak i bezpłciową fazę rozrodczą (cykliczna partenogeneza), podczas gdy wrotki bdelloidalne rozmnażają się przez obowiązkową partenogenezę 3. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie genetycznie identycznych osobników wrotków, co zapewnia wysoką powtarzalność w eksperymentach. Ponadto mają kilka innych zalet jako organizmy modelowe, takich jak krótka długość życia, łatwość hodowli, dostępność danych sekwencji genomicznych i transkryptomicznych 4-7 oraz wyjątkowa pozycja filogenetyczna z dala od stawonogów i nicieni 8. Wrotki są zatem obiecującymi modelami bezkręgowców w badaniach ekologicznych, toksykologicznych i starzeniowych 9-12.
Czas przeżycia w warunkach stresu środowiskowego lub chemikaliów jest często mierzonym parametrem w tych dziedzinach badawczych 13-19. Należy jednak zachować ostrożność przy pomiarze czasu przeżycia wrotków, ponieważ są one podatne na warunki środowiskowe ich matek. Mianowicie, u wrotka jednoogonowego Brachionus manjavacas, potomstwo płci żeńskiej ze starszych matek ma krótszą długość życia niż potomstwo młodych matek; jednak ograniczenie kalorii u matki (CR) częściowo równoważy szkodliwe skutki zaawansowanego wieku matki 20 lat. U B. plicatilis matczyny CR zapewnia potomstwu długowieczność, długi czas przeżycia w warunkach głodu i wysoką odporność na stres oksydacyjny związaną ze zwiększoną ekspresją enzymów przeciwutleniających 21,22. Wpływ na wiek matki zaobserwowano również u wrotków bdelloidalnych 23. W związku z tym warunki doświadczalnych wrotków powinny być starannie zsynchronizowane przez kilka pokoleń przed pomiarami czasu przeżycia.
Tutaj udostępniamy protokół pomiaru czasu przeżycia u wrotków Brachionus po synchronizacji warunków hodowli przez kilka pokoleń. Post przerywany (IF), odmiana CR, w której wrotki są karmione okresowo, została zastosowana w celu ujawnienia wpływu synchronizacji ze względu na dobrze znany wpływ IF na długowieczność 22,24.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Wako</td><td>190-13921</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Wako</td><td>136-03995</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Wako</td><td>131-00427</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Wako</td><td>168-22111</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Wako</td><td>035-00455</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>Bromek sodu</td><td>Wako</td><td>190-01515</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy (0,45 &mikro; m wielkość porów)</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana, 6-dołkowa, niepoddana obróbce</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D01</td><td></td></tr><tr><td>Płaska płytka hodowlana, 48-dołkowa, niepoddana obróbce</td><td>Thomas Scientific</td><td>6902D07</td><td></td></tr><tr><td>Tetraselmis, Living</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>152610</td><td></td></tr><tr><td>PRISM 6</td><td>GraphPad</td><td>Software Version 6.0d</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar czasu przeżycia u wrotków brachionus: synchronizacja warunków matczynych

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Rotifers to mikroskopijny kosmopolityczny zooplankton używany jako modele w badaniach ekotoksykologicznych i starzeniowych ze względu na ich zalety takie jak krótka żywotność, łatwość hodowli i partenogeneza, która umożliwia hodowlę klonalną. Należy jednak zachować ostrożność przy mierzeniu czasu przeżycia dziecka, ponieważ ma na niego wpływ wiek matki i warunki żywienia przez matkę. W tym miejscu przedstawiamy protokół do wydajnego i powtarzalnego pomiaru czasu przeżycia u wrotków Brachionus po starannej synchronizacji warunków hodowli przez kilka pokoleń. Empirycznie, słaba synchronizacja skutkuje wczesną śmiertelnością i stopniowym spadkiem wskaźnika przeżycia, co skutkuje słabą mocą statystyczną. Rzeczywiście, w takich warunkach ograniczenie kalorii (CR) nie przedłużyło znacząco żywotności B. plicatilis, chociaż długowieczność wywołana CR została wykazana z dobrze zsynchronizowanymi próbkami wrotków w przeszłych i obecnych badaniach. Protokół ten jest prawdopodobnie przydatny dla innych modeli bezkręgowców, w tym muszki owocowej Drosophila melanogaster i nicienia Caenorhabditis elegans, ponieważ u tych gatunków odnotowano również wpływ na wiek matki.

Rycina 1 przedstawia reprezentatywne krzywe przeżywalności słabo zsynchronizowanych populacji (z dwóch powtórzeń). W tym eksperymencie wrotki były karmione albo codziennie [grupa ad libitum (AL)], albo co drugi dzień (grupa IF). Mediana przeżywalności wynosiła odpowiednio 13 i 18 dni w grupach AL i IF. Choć wiadomo, że IF wydłuża czas życia wrotka, w tym eksperymencie nie udało się wykryć statystycznie istotnej różnicy między długością życia grup AL i IF. Em...

Wrotki to mikroskopijny zooplankton używany jako modele w badaniach ekotoksykologicznych i starzeniowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół do skutecznego i powtarzalnego pomiaru czasu przeżycia u wrotków Brachionus. Synchronizacja warunków hodowli na przestrzeni kilku pokoleń ma szczególne znaczenie, ponieważ stan matki wpływa na historię życia potomstwa.

Pomiar czasu przeżycia u wrotków Brachionus: synchronizacja warunków matczynych

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dokładny pomiar czasu przeżycia rotiferów z rodzaju Brachionus, przy jednoczesnym wyeliminowaniu możliwych szkodliwych efektów pokoleń macierzystych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad starzeniem.Metoda ta zapewnia wiarygodny sposób pomiaru czasu przeżycia wrotków. Główną zaletą tej techniki jest jej powtarzalność oraz wysoka moc statystyczna. Aby rozpocząć, do 4,5 litrów destylowanej lub dejonizowanej wody do rozcieńczania należy dodać 454 mM chlorku sodu, 26 mM chlorku magnezu, 27 mM siarczanu magnezu, 10 mM chlorku potasu oraz 10 mM chlorku wapnia.Przygotuj 0,48 M roztwór zapasowy wodorowęglanu sodu. Następnie dodaj 25 ml tego roztworu do świeżo przygotowanego roztworu soli. Przygotuj 0,4 M roztwór zapasowy bromku sodu.Następnie należy dodać 10 ml tego roztworu do roztworu soli. Potem, za pomocą wody destylowanej, należy doprowadzić objętość roztworu soli do 5 l. Następnie roztwór należy przefiltrować przez membranę filtracyjną o wielkości oczek 0,45 µm.Aby hodować rotiferы hodowane laboratoryjnie lub odłowione w naturze, należy umieścić je w sterylnym zlewce o pojemności 100 ml z sztuczną wodą morską. Hodowlę prowadzić w temperaturze 25 °C. Zgodnie z metodami Snella, należy hodować gatunki mikroalg stanowiących pokarm w sztucznej wodzie morskiej.Należy upewnić się, że we wszystkich grupach eksperymentalnych wykorzystano tę samą partię mikroalg. Populację zapasową wrotków należy utrzymywać w kulturze okresowej, karmiąc je co dwa dni oraz wymieniając pożywkę raz w tygodniu.W optymalnych warunkach można zaobserwować wiele osobników w stadium neonatów oraz dorosłych noszących od dwóch do trzech jaj. Aby zsynchronizować rotifery poprzez prekulturę, należy wybrać pojedynczego osobnika z populacji wyjściowej. Następnie należy go hodować w sztucznej wodzie morskiej w zlewce o pojemności 100 ml, zgodnie z powyższym opisem, przez około dwa tygodnie.Po inkubacji należy zebrać rotatory niosące jaja z subpopulacji. Hoduj je jako pojedynczą kohortę, umieszczając około 50 rotatorów na mililitr wody morskiej w dołkach płytki sześciodołkowej, i karm je ad libitum. Po wykluciu się jaj przenieś noworodki do świeżo przygotowanego medium hodowlanego.Powtarzaj hodowlę i przenoszenie osobników młodocianych przez dwie do trzech generacji. Aby zmierzyć czas przeżycia, umieść osobników młodocianych, które wykluły się w ciągu trzech godzin, w dołkach płytek 24 lub 48-dołkowych zawierających 1 ml sztucznej wody morskiej. W odstępach 12 lub 24 godzin przenoś rotifery do nowo przygotowanej pożywki hodowlanej.Zapisz liczbę potomstwa oraz informację, czy każda z osobników jest martwa czy żywa. Wrotka jest uznawana za martwą, gdy ruch rzęsek korony całkowicie ustał. W przypadku aktywnego rozmnażania się badanych wrotków, należy usuwać noworodki, ponieważ szybko rosną i niekiedy trudno odróżnić je od osobników doświadczalnych.Przeprowadzić analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym. Na tym rysunku przedstawiono krzywe przeżywalności z dwóch powtórzeń słabo zsynchronizowanych populacji wrotków. Karmionych albo ad libitum, co pokazano w sekcji A-L, albo co drugi dzień, co oznaczono jako post przerywany, I-F.Mediana przeżycia w dwóch grupach wynosiła odpowiednio 13 i 18 dni. Chociaż wiadomo, że przerywany post wydłuża długość życia wrotków, różnice te nie były istotne statystycznie. W niniejszym eksperymencie warunki utrzymania wrotków były optymalne i dobrze zsynchronizowane.Zwierzęta miały tendencję do przeżycia do późniejszej fazy eksperymentu. Mediana przeżycia wynosiła 13 dni dla rotiferów AL oraz 20 dni dla grup IF, co było istotne statystycznie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat synchronizacji warunków hodowli wrotków. Mamy nadzieję, że niniejszy protokół przyczyni się do rozwoju hodowli wrotków jako organizmu modelowego w badaniach nad starzeniem.

measurement-survival-time-brachionus-rotifers-synchronization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

W tym filmie pokazujemy metodę wytwarzania rozwojowo zsynchronizowanej populacji bezpłodnych dorosłych C. elegans. Przykładowy protokół synchronizuje robaki w celu zbadania wskaźników zużycia tlenu u żywych zwierząt.

Synchronizacja nicieni: metoda uzyskiwania populacji robaków w identycznych stadiach rozwoju

Ten film opisuje tradycyjną, opartą na płytkach metodę pomiaru długości życia C. elegans. Przykładowy protokół mierzy długość życia robaków poddanych działaniu RNAi.

Analiza długości życia: pomiar długowieczności C. elegans

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Długoterminowe badania są niezbędne do zrozumienia procesu ewolucji i mechanizmów adaptacji. Ogólnie rzecz biorąc, badania te wymagają zobowiązań wykraczających poza okres życia badaczy. W tym miejscu opisano potężną metodę, która radykalnie przyspiesza najnowocześniejsze gromadzenie danych w celu generowania danych podłużnych w systemach naturalnych.

Wskrzeszenie uśpionej rozwielitki magna: protokół i zastosowania

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Poznaj protokół pomiaru czasu przeżycia wrotków Brachionus z synchronizacją warunków matczynych. Ta metoda zapewnia wysoką powtarzalność i moc statystyczną w badaniach nad starzeniem oraz ekotoksykologią.

Pomiar czasu przeżycia u wrotków Brachionus: synchronizacja warunków matczynych

Przeglądaj więcej filmów