Name: Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metodę analizy fenotypowej i funkcji supresyjnej komórek T regulatorowych izolowanych z myszy zakażonych wirusem LCMV. Protokół umożliwia ocenę aktywności komórek T reg in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2015R1A6A3A01020610 do HJP) oraz grant z Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych, Ministerstwa Zdrowia, Opieki Społecznej i Spraw Rodzinnych, Republiki Korei (HI15C0493 do SJH).

W tym badaniu, myszy były utrzymywane w specyficznym obiekcie wolnym od patogenów w Yonsei Laboratory Animal Research Center of Yonsei University. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Koreańskiej Agencji ds. Żywności i Leków przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Międzynarodowy Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Laboratorium Yonsei Animal Research Center na Uniwersytecie Yonsei.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 2% pożywki RPMI, rozcieńczając płodową surowicę bydlęcą (FBS) do 2% i penicylinę-streptomycynę do 1% w RPMI</li>
	<li>Przygotuj kompletne nośniki RPMI. Do pożywki RPMI dodaj 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, 1% L-glutaminy i 50 μM 2-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Przygotuj bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). W tym celu należy uzupełnić sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w 2% FBS.</li>
	<li>Przygotować bufor do izolacji limfocytów T. W tym celu należy uzupełnić PBS o 2% FBS i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego.</li>
</ol>
2. Izolacja limfocytów śledziony
<ol>
	<li>Usuń śledziony od myszy wcześniej nieleczonych lub zakażonych LCMV CL13, jak opisano wcześniej19 i umieść je na szalkach Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm zawierających 10 ml pożywki 2% RPMI. 
	UWAGA: W tym badaniu eksperymenty 5 do 6 tygodniowych samic myszy C57B1L / 6J otrzymało 2 x 106 jednostek tworzących płytkę (pfu) LCMV CL13 poprzez dożylne wstrzyknięcie przez żyłę ogonową. Złóż ofiary na myszy w 16 dniu po infekcji (16 d p.i.)25. Przeanalizuj, czy naiwne myszy były tego samego dnia.</li>
	<li>Umieść sitko do komórek w probówce o pojemności 50 ml i przepłucz je 2 ml pożywki 2% RPMI. Umieścić śledzionę na sitku o wielkości 70 μm i zmielić za pomocą tłoka strzykawki. Przepłucz sitko komórkowe 2 ml pożywki 2% RPMI i wyjmij je z probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Napełnić probówkę pożywką o stężeniu 2% RPMI i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu lizującego ACK. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut 
	UWAGA: Wskazana powyżej objętość buforu lizującego ACK dotyczy jednej śledziony. Odpowiednio zwiększ objętość dla zbiorczych próbek śledziony.</li>
	<li>Napełnić probówkę pożywką o stężeniu 2% RPMI i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki o gęstości 1 x 107 komórek/ml w pełnej pożywce RPMI. 
	UWAGA: W celu zliczania żywych komórek wybarwić komórki błękitem trypanowym i liczyć tylko żywe komórki, które nie są barwione za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
3. Fenotypowanie konwencjonalnych komórek T (Tconv) śledziony i limfocytówT reg
UWAGA: Przed izolacją limfocytów Treg zbadaj fenotyp limfocytów śledziony wyizolowanych od wcześniej nieleczonych lub zakażonych myszy, barwiąc komórki różnymi przeciwciałami i analizując je za pomocą cytometrii przepływowej.
<ol>
	<li>Przenieść 50 μl komórek (5 x 105 komórek) między całkowitymi limfocytami śledziony do każdej studzienki nowej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U i dodać 150 μl buforu FACS na studzienkę. Wirować przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Wymieszać osad komórkowy i dodać 200 μl buforu FACS do studzienki. Wirować przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C (2 razy).</li>
	<li>Przygotować koktajl przeciwciał do barwienia markerów powierzchniowych komórek w 50 μl buforu FACS na studzienkę z następującymi przeciwciałami i odczynnikami. Fioletowy barwnik anty-CD4, zielony barwnik anty-CD25, fioletowy barwnik anty-PD-1, barwnik anty-CD8 PerCP-Cy5.5 i odczynnik do wykrywania żywotności komórek w bliskiej podczerwieni (IR) fluorescencyjny barwnik reaktywny. 
	UWAGA: W celu dalszej analizy fenotypu aktywowanych limfocytów Treg można dodać anty-CD10323,25 do barwienia markerami powierzchniowymi komórek.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy z 50 μl koktajlu przeciwciał na studzienkę. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki dwukrotnie buforem FACS przez odwirowanie przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po ostatnim etapie płukania zdekantować supernatant i utrwalić komórki na 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C za pomocą 100 μl buforu utrwalającego przygotowanego zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przepłukać komórki dwukrotnie buforem do przemywania permeabilizacji (przygotowanym zgodnie z protokołem producenta) przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała do wewnątrzkomórkowego barwienia Foxp3 i ponownie zawiesić osad komórkowy z 50 μl roztworu przeciwciała anty-Foxp3. 
	UWAGA: Aby dokładniej przeanalizować fenotypy limfocytów Tconv i Treg, na tym etapie można dodać anty-CTLA.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C i powtórzyć krok 3.6. Po ostatnim etapie płukania ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl buforu FACS i zbadać fenotyp komórek za pomocą cytometru przepływowego25.</li>
	<li>Bramka żywej populacji komórek. Aby przeanalizować fenotypy limfocytów Tconv podczas infekcji LCMV CL13, zbadaj częstość komórek Foxp3-PD-1+ wśród limfocytów T CD4+ lub CD8+. 
	UWAGA: Na podstawie wyników eksperymentalnych procent Foxp3-PD-1 + wynosi ponad 50% zarówno w populacjach limfocytów T CD4 +, jak i CD8 + przy 16 d p.i. z LCMV CL13.
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować częstotliwość i fenotypy limfocytów Treg, zbadaj częstość komórek Foxp3 + lub Foxp3 + PD-1 + wśród limfocytów T CD4 +. 
		UWAGA: Na podstawie wyników eksperymentalnych odsetek komórek Foxp3 + lub Foxp3 + PD-1 + wynosi odpowiednio ponad 20% w populacji limfocytów T CD4 +.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja komórekT reg CD4+CD25+
UWAGA: Objętości wszystkich odczynników wskazanych poniżej dotyczą początkowej liczby komórek 1 x 107 wszystkich splenocytów.
<ol>
	<li>Przygotować komórki zgodnie z opisem w sekcji 2 przy użyciu myszy wcześniej zakażonych i przewlekle zakażonych LCMV. Umyj komórki, dodając 10 ml buforu do izolacji limfocytów T. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 μl buforu.</li>
	<li>W celu wzbogacenia limfocytów T CD4+ za pomocą magnetycznego systemu separacji komórek, dodaj 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał i dobrze wymieszaj. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 30 μl buforu, 20 μl mikrokulek antybiotyny do znakowania limfocytów T innych niż CD4+ i 10 μl przeciwciała CD25-PE do znakowania fluorescencyjnego komórek CD25+. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w ciemności.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu i przepuścić komórki przez sitko o pojemności 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml w celu usunięcia resztek komórek. Przemywać komórki przez odwirowanie przy stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w buforze o objętości 500 μl o gęstości do 1,25 x10,8 komórek.</li>
	<li>Zastosuj komórki do kolumny i zbierz komórki bez etykiet, które przechodzą przez kolumnę. Przemyć kolumnę, dodając 2 ml buforu i odwirować w sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty T CD4+ w 90 μl buforu.</li>
	<li>W celu znakowania magnetycznego komórek CD25+ dodać 10 μl mikrogranulek anty-PE, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu i przemywać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 500 μl buforu o gęstości do 1 x10,8 komórek.</li>
	<li>Aby wzbogacić komórkiT reg CD4 + CD25 +, nałóż komórki na kolumnę w celu pozytywnej selekcji i umyj kolumnę, dodając 2 ml buforu. Powtórz pranie trzy razy.</li>
	<li>Gdy kolumna jest pusta po ostatnim etapie mycia, dodać 1 ml buforu do kolumny i wypłukać magnetycznie znakowane komórki CD4 + CD25 + za pomocą tłoka.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.8-4.9, aby zwiększyć czystość izolowanych limfocytówT reg CD4 + CD25 +. Przemyć komórki buforem FACS przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty TCD4 + CD25 + w stężeniu 2 x 106 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI.</li>
	<li>Aby sprawdzić czystość izolowanych komórekT reg CD4 + CD25 +, użyj 2 x 105 komórek z całkowitej izolowanej komórkiT T CD4 + CD25 +. Wybarwić komórki 50 μl buforu FACS zawierającego anty-CD4 FITC i odczynnik wykrywający żywotność komórek w bliskiej podczerwieni fluorescencyjny barwnik reaktywny. 
	UWAGA: CD25 był już oznaczony PE podczas izolacji.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki buforem FACS przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Po umyciu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu FACS i sprawdzić czystość za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Bramka populacji żywych komórek. Aby przeanalizować czystość limfocytówT reg, potwierdź procentową zawartość komórek CD4 + CD25 +. 
	UWAGA: Na podstawie wyników eksperymentalnych odsetek komórek CD4 + CD25 + wśród oczyszczonych komórek wynosi ponad 80%.</li>
</ol>
5. Izolacja limfocytów T CD8+ i znakowanie limfocytów T CD8+
UWAGA: Objętości wszystkich odczynników wskazanych poniżej dotyczą początkowej liczby komórek 1 x 107 wszystkich splenocytów.
<ol>
	<li>Przygotuj komórki zgodnie z opisem w sekcji 2 przy użyciu naiwnych myszy. Umyj komórki, dodając 10 ml buforu do izolacji limfocytów T. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 μl buforu.</li>
	<li>W przypadku izolacji limfocytów T CD8 + za pomocą magnetycznego systemu separacji komórek, dodaj 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał do znakowania limfocytów T innych niż CD8 + i dobrze wymieszaj. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 30 μl buforu i 20 μl mikrogranulek antybiotyny. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zastosuj komórki do kolumny i zbierz komórki bez etykiet, które przechodzą przez kolumnę. Przemyć kolumnę, dodając trzykrotnie 2 ml buforu.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty T CD8+ w 2 ml buforu.</li>
	<li>Aby sprawdzić czystość wyizolowanych komórek, należy przygotować 50 μl roztworu przeciwciał w buforze FACS. Zawiesić 2 x 105 komórek między izolowanymi limfocytami T CD8 + w 50 μl roztworu przeciwciała. 
	UWAGA: Aby przygotować roztwór przeciwciała, dodaj anty-CD8 FITC i odczynnik do wykrywania żywotności komórek (reaktywny barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni) do bufora FACS.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki buforem FACS przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Po umyciu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu FACS i sprawdzić czystość komórek za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Bramka populacji żywych komórek. Aby sprawdzić czystość limfocytów T CD8 +, potwierdź procentową zawartość limfocytów T CD8 +. 
	UWAGA: Na podstawie wyników eksperymentalnych odsetek komórek CD8 + wśród oczyszczonych komórek wynosi ponad 90%.</li>
	<li>Dodaj PBS do izolowanych limfocytów T CD8 +. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty T CD8 + w stężeniu 1 x 107 komórek/ml w PBS.</li>
	<li>Aby oznaczyć limfocyty T CD8 + do testu supresji in vitro, należy rozcieńczyć proliferację komórek śledząc fioletowy barwnik w PBS, aby uzyskać stężenie 5 μM przy RT. 
	UWAGA: Przybliżone piki wzbudzenia i emisji fioletowego barwnika śledzącego proliferację komórek użytego w badaniu wynoszą odpowiednio 405 i 450 nm.</li>
	<li>Wymieszać dobrze równe objętości fioletowego barwnika śledzącego proliferację komórek (5 μM) i zawiesiny komórek (1 x 107 komórek/ml limfocytów T CD8+) w probówce o pojemności 15 ml i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Wirować probówkę co 10 minut.</li>
	<li>Napełnij probówkę zimnym, kompletnym podłożem RPMI i pozostaw probówkę na 10 minut w temperaturze pokojowej. Odwiruj przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w stężeniu 2 x 106 komórek/ml z wstępnie podgrzaną kompletną pożywką RPMI. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
6. Konfiguracja testu supresyjnego in vitro przy użyciu limfocytów T reg CD4+CD25+ i limfocytów TCD8+ 
<ol>
	<li>Aby przygotować kulki pokryte anty-CD3/CD28, przenieś odpowiednią objętość kulek magnetycznych do 15 ml probówki (2,5 μl/1 x 105 komórek). Dodaj równą objętość PBS i wymieszaj. Przemyć przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany osad. Rozcieńczyć kulki magnetyczne w kompletnym podłożu (50 μl/dołek).</li>
	<li>Podwielokrotność 50 μl komórekT reg CD4 + CD25 + na studzienkę 96-dołkowej płytki U (1 x 105 komórek / studzienkę). Dodaj 50 μl limfocytów T CD8 + jako odpowiadające limfocyty T (Tlub Resp) na studzienkę (1 x 105 komórek / dołek). Dodać 50 μl rozcieńczonych kulek pokrytych anty-CD3/CD28 do każdego dołka. 
	UWAGA: W tym kroku oznacz i ustaw studzienki kontrolne w następujący sposób: "tylko niestymulowana limfocyt T CD8 +" bez kulek pokrytych anty-CD3 / CD28; "tylko limfocyt T CD8+" z kulkami pokrytymi anty-CD3/CD28; "tylko limfocyt T CD8+" z kulkami pokrytymi anty-CD3/CD28; "Tylko komórkaT reg" z koralikami pokrytymi anty-CD3/CD28. Limfocyty Treg można rozcieńczać kompletnymi pożywkami i hodować wspólnie z komórkami Tresp w różnym stosunku komórek Tresp do komórekT reg (1: 0,25-1: 1).</li>
	<li>Dodać 50 μl lub odpowiednią objętość pożywki do wszystkich studzienek do całkowitej objętości 200 μl. Przykryć płytkę folią i inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.</li>
</ol>
7. Analiza proliferacji limfocytów T CD8+ i produkcji cytokin z limfocytów T CD8+
<ol>
	<li>W celu analizy produkcji cytokin, po 3 dniach hodowli, rozdzielić supernatant z każdej studzienki na inną płytkę i przeprowadzić test immunoenzymatyczny (ELISA). 
	UWAGA: Supernatant może być podawany i przechowywany w temperaturze -70 °C. W tym eksperymencie zastosowano płytkę pokrytą przeciwciałem przeciw myszom IFN-γ do wykrycia produkcji IFN-γ zgodnie z protokołem producenta. Aby określić produkcję IFN-γ proliferujących limfocytów T CD8 + na poziomie pojedynczej komórki, można przeprowadzić barwienie cytokiny wewnątrzkomórkowej.</li>
	<li>Po oddzieleniu supernatantu od każdej studzienki, przemyć płytkę zawierającą komórki buforem FACS i odwirować przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C (3 razy).</li>
	<li>Po umyciu wyrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 50 μl koktajlu przeciwciał w celu barwienia proliferowanych limfocytów T CD8 +. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Aby przygotować koktajl przeciwciał, dodaj anty-CD4 FITC, anty-CD8 PerCP-Cy5.5 i odczynnik do wykrywania żywotności komórek (reaktywny barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni) do bufora FACS. 
	UWAGA: Przeciwciała przeciwko różnym markerom, takim jak CD44 lub CD69, można łączyć z innymi przeciwciałami w celu potwierdzenia aktywacji limfocytów T CD8 +. Pamiętaj, że limfocyty T CD8 + zostały już oznaczone fioletowym barwnikiem śledzącym proliferację komórek w kroku 5.10.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Po ostatnim etapie płukania odrzucić supernatant i utrwalić komórki na 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C za pomocą 100 μl buforu utrwalającego.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl buforu FACS i zmierzyć proliferację proliferacji komórek, śledząc fioletowe limfocyty T CD8 + znakowane fioletowym barwnikiem za pomocą cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Bramka populacji limfocytów T CD8 + wśród żywych komórek. Zmierz procenty podzielonych i niepodzielonych komórek zgodnie z rozcieńczeniem proliferacji komórek, śledzeniem fioletowego barwnika i rozcieńczeniem limfocytów T CD8 + zgodnie z następującym równaniem. % zahamowania = [(% proliferowanych limfocytów T CD8+ przy braku limfocytówT reg - % proliferowanych limfocytów T CD8+ w obecności limfocytówT reg)/(% proliferowanych limfocytów T CD8+ przy braku limfocytówT reg)] x 100. Kontynuuj analizę danych za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej25.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+LAG-3+in+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of LAG-3 in regulatory T cells.</a> Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).</li>
<li>McHugh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+immunoregulatory+T+cells%3A+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+T+cells+constitutively+expressing+cytotoxic+T+lymphocyte-associated+antigen+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4.</a> J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).</li>
<li>Manigold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3%2BCD4%2BCD25%2B+T+cells+control+virus-specific+memory+T+cells+in+chimpanzees+that+recovered+from+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Blood%22%5BJournal%5D)">Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis.</a> C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).</li>
<li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+regulatory+T+cells+in+lymphoid+tissue+is+correlated+with+viral+load+in+HIV-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients.</a> J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29FoxP3%28%2B%29+regulatory+T+cells+suppress+Mycobacterium+tuberculosis+immunity+in+patients+with+active+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease.</a> Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).</li>
<li>Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-specific+regulatory+T+cells+delay+the+arrival+of+effector+T+cells+in+the+lung+during+early+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis.</a> J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).</li>
<li>Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+control+Leishmania+major+persistence+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity.</a> Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).</li>
<li>Grainger, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helminth+secretions+induce+de+novo+T+cell+Foxp3+expression+and+regulatory+function+through+the+TGF-beta+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway.</a> J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).</li>
<li>cells in helminth infection: the regulators and the regulated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Trends+Immunol%22">Trends Immunol</a>. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).</li>
<li>You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regulatory+T+cells+potently+abrogate+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity.</a> J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).</li>
<li>Curiel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li>
<li>Dittmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impairment+of+CD8%28%2B%29+T+cells+by+regulatory+T+cells+during+persistent+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection.</a> Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).</li>
<li>Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+suppression+of+CD8%2B+T+cell+function+by+Friend+virus-induced+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells.</a> J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).</li>
<li>Iwashiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+by+CD4%2B+regulatory+T+cells+induced+by+chronic+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).</li>
<li>Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2B+T+cells+regulate+virus-specific+primary+and+memory+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses.</a> J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).</li>
<li>Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+control+the+severity+of+viral+immunoinflammatory+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions.</a> J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).</li>
<li>Veiga-Parga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+regulatory+T+cells+during+viral-induced+inflammatory+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions.</a> J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signature+of+CD8%2B+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).</li>
<li>Jin, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+Tim-3+and+PD-1+in+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).</li>
<li>Punkosdy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T-cell+expansion+during+chronic+viral+infection+is+dependent+on+endogenous+retroviral+superantigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).</li>
<li>Blackburn, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coregulation+of+CD8%2B+T+cell+exhaustion+by+multiple+inhibitory+receptors+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection.</a> Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).</li>
<li>Park, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+upregulated+on+regulatory+T+cells+during+chronic+virus+infection+enhances+the+suppression+of+CD8%2B+T+cell+immune+response+via+the+interaction+with+PD-L1+expressed+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells.</a> J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).</li>
<li>Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining chronic viral infection.</a> Cell. 138 (1), 30-50 (2009).</li>
<li>Penaloza-MacMaster, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+regulatory+T+cells+and+PD-1+in+modulating+T+cell+exhaustion+and+viral+control+during+chronic+LCMV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection.</a> J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).</li>
<li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Peli1+negatively+regulates+T+cell+activation+and+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity.</a> Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).</li>
<li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+infection+with+respiratory+syncytial+virus+impairs+regulatory+T+cell+function+and+increases+susceptibility+to+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma.</a> Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).</li>
<li>Tai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basis+of+CTLA-4+function+in+regulatory+and+conventional+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells.</a> Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).</li>
<li>Rushbrook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+suppress+in+vitro+proliferation+of+virus-specific+CD8%2B+T+cells+during+persistent+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).</li>
<li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+orphan+receptor+Nr4a2+induces+Foxp3+and+regulates+differentiation+of+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22T+cells.+Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4.</a> T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).</li>
<li>Merianos, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li>
<li>Allakhverdi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD103+identifies+human+regulatory+T-cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets.</a> J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).</li>
<li>Camisaschi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAG-3+expression+defines+a+subset+of+CD4%28%2B%29CD25%28high%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+that+are+expanded+at+tumor+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites.</a> J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li>
<li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5%2B+natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li>
</ol>

S.-J.H. posiada patent i otrzymuje tantiemy patentowe związane ze szlakiem PD-1. Pozostali autorzy nie mają finansowych konfliktów interesów.

Chociaż u myszy i ludzi występuje tylko niewielka liczba limfocytów Treg , ważne jest, aby zrozumieć ich funkcję, ponieważ odgrywają one kluczową rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej i utrzymaniu tolerancji immunologicznej. Liczba i funkcje supresyjne limfocytów Treg wzrastają podczas przewlekłej infekcji wirusowej15-20 , a także progresji raka13,14. Jest to prawdopodobnie spowodowane ciągłą stymulacją antygenową. Aby ocenić funkcję limfocytów Treg w warunkach...

Regulatorowe komórki T (T reg) wyrażają skrzynkę widłową P3 (Foxp3) jako czynnik transkrypcyjny dla ich rozwoju i funkcji1. Ponadto limfocytyT reg wyrażają różne inne cząsteczki, takie jak CD252, gen aktywacji limfocytów 3 (LAG-3)3, receptor czynnika martwicy nowotworu indukowany glikokortykosteroidami 4 i cytotoksyczne białko związane z limfocytami T 4 (CTLA-4)5 na ich powierzchni lub w regionie wewnątrzkomórkowym. Podczas przewlekłego zakażenia różnego rodzaju patogenami, takimi jak wirusy6,7, bakterie8,9 i pasożyty10-12, lub w trakcie rozwoju raka13,14, limfocyty Treg różnicują się w aktywowane komórki, wykazując zwiększoną funkcję supresyjną ukierunkowaną na efektorowe limfocyty T CD4 + i CD8 +. Wiele prac sugeruje, że rozszerzone i aktywowane limfocyty Treg przyczyniają się do upośledzonej odpowiedzi limfocytów T CD8 + podczas infekcji przyjacielskim retrowirusem (FV)15-17. LimfocytyT reg indukowane FV hamują ekspresję IFN-γ lub granzymu B i reaktywność cytotoksyczną limfocytów T CD8 + 15-17. Co więcej, w modelu zakażenia wirusem opryszczki pospolitej stwierdzono, że wyczerpanie limfocytówT reg CD4 + CD25 + spowodowało ekspansję limfocytów T CD8 + specyficznych dla wirusa i poważne uszkodzenie tkanek przez infiltrację immunopatogennych limfocytów T CD4 + 18-20.
Myszy przewlekle zakażone szczepem klonu 13 wirusa limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV CL13)21-24 były szeroko stosowane do charakteryzowania fenotypu i funkcji efektorowych limfocytów T (T eff) i limfocytówT reg podczas przewlekłej infekcji wirusowej. Podczas uporczywego zakażenia LCMV specyficzne dla wirusa limfocytyT eff stopniowo tracą swoją funkcję efektorową i stają się wyczerpanymi limfocytami T (Texh). Z drugiej strony, limfocytyT reg wzmacniają ich zdolność do tłumienia odpowiedzi limfocytów T specyficznej dla wirusa25. Spadek zdolności funkcjonalnej limfocytów Teff można wytłumaczyć kilkoma czynnikami, takimi jak regulacja w górę receptorów hamujących na komórkach Teff, zmieniona funkcja komórek prezentujących antygen, produkcja cytokin immunoregulacyjnych oraz zwiększona częstotliwość lub zwiększona funkcja limfocytów Treg 26. Wśród czynników zaangażowanych w supresję limfocytów T, limfocyty Texh i limfocyty Treg ekspujące białko programowanej śmierci komórki-1 (PD-1) są powszechnie uważane za cechy charakterystyczne trwałości antygenu i środowiska supresyjnego. Niedawno doniesiono, że blokada szlaku PD-1 i ablacja limfocytówT reg prowadzą do poprawy funkcji limfocytów T i zmniejszenia wiremii podczas przewlekłej infekcji LCMV27. Ponadto limfocyty Treg są aktywowane podczas przewlekłego zakażenia myszy LCMV23,25, a ich funkcja supresyjna jest wzmocniona25. PD-1 ulega silnej ekspresji na komórkach Treg, a także na komórkach Texh, a poziom PD-1 wyrażany przez limfocyty Treg koreluje z siłą ich funkcji supresyjnej hamującej proliferację komórek T25.
Tutaj opisujemy metodę porównywania cech aktywowanych limfocytów Treg wyizolowanych od myszy zakażonych LCMV CL13 i limfocytów Treg w stanie spoczynku wyizolowanych od myszy wcześniej nieleczonych. Ponadto wyjaśniamy szereg procesów oddzielania aktywowanych limfocytów Treg i badamy ich fenotyp ex vivo, a także mierzymy ich aktywność supresyjną in vitro.

<table><tbody><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>RM4-5</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td></tr><tr><td>U-Bottom Płytki</td><td></td> do hodowli tkankowych <td>BD Biosciences</td><td>353077</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td> utrwalający BD <td>Biosciences</td><td>554655</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD25</td><td>7D4</td><td>BD Biosciences</td><td>553072</td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 70 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 40 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anti-Mouse CD279 (PD-1)</td><td>29F.1A12</td><td>BioLegend</td><td>135217</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td><td>RM4-5</td><td>Biolegend</td><td>100547</td></tr><tr><td>APC Anti-Mouse/Rat Foxp3&nbsp;</td><td>FJK-16s</td><td>eBioscience</td><td>17-5773</td></tr><tr>Zestaw <td></td><td>do barwienia Foxp3/czynnika transkrypcyjnego</td><td>eBioscience</td><td>00-5223</td></tr><tr><td>PerCP-cyjanina5.5 Anty-mysz CD8a</td><td>53-6.7</td><td>eBiosicence</td><td>45-0081</td></tr><tr><td>Mysz IFN-gamma Platinum ELISA</td><td></td><td>eBiosicence</td><td>BMS606</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td>GE Nauki przyrodnicze</td><td>SH30027</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30256</td></tr><tr><td>ACK Bufor</td><td></td> lizujący <td>Gibco</td><td>A10492-01</td></tr><tr><td>L-glutamina, roztwór 200 mM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td>Numer katalogowy 25030</td></tr> TGL<tr><td>Penicylina-Streptomycyna, 10 000 U/ml</td><td></td><td>Gibco&nbsp;</td><td>Numer katalogowy 10378-016</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do naprawy martwych komórek w bliskiej podczerwieni Life</td><td></td><td>technologies</td><td>L-34975</td></tr><tr><td>CD8a+ Zestaw do izolacji komórek T, mysz</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-104-075</td></tr><tr><td>CD4+ CD25+ Zestaw do izolacji regulatorowych komórek T, mysz</td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-091-041</td></tr><tr><td>Kolumny separacyjne MACS, kolumny</td><td></td> <td>LDMiltenyibiotec</td><td>130-042-901</td></tr><tr><td>Kolumny separacyjne MACS, kolumny</td><td></td> LS <td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-401</td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M (pH 8,0)</td><td></td><td>Promega</td><td>V4231</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td></td><td>Sigma Life Science</td><td>M7522</td></tr><tr><td>Płodowa surowica</td><td></td> bydlęca <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30919.03</td></tr><tr><td>CellTrace Zestaw</td> <td>do proliferacji komórek fioletowych</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>C34557</td></tr><tr><td>BD Canto II przepływocytometr</td><td>BD Biosciences</td><td></td>Flowjo TreeStar Hematocytomer <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Marienfeld superior</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów t regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Limfocyty T regulatorowe (T reg), które wyrażają Foxp3 jako czynnik transkrypcyjny, są podzbiorami limfocytów T CD4+. Limfocyty Treg odgrywają kluczową rolę w tolerancji immunologicznej i utrzymaniu homeostazy poprzez regulację odpowiedzi immunologicznej. Podstawową rolą limfocytówT reg jest hamowanie proliferacji efektorowych komórek T (Teff) i wytwarzanie cytokin, takich jak IFN-γ, TNF-α i IL-2. Wykazano, że zdolność limfocytów Treg do hamowania funkcji limfocytów Teff jest zwiększona podczas uporczywego zakażenia patogenem i rozwoju raka. Aby wyjaśnić funkcję limfocytów Treg w stanie spoczynku lub stanu zapalnego, opracowano różne testy supresji in vitro z wykorzystaniem mysich lub ludzkich limfocytówT reg. Głównym celem tego badania jest opracowanie metody porównywania różnic w fenotypie i funkcji supresyjnej między spoczynkowymi i aktywowanymi limfocytami Treg. Aby wyizolować aktywowane limfocytyT reg, myszy zostały zakażone klonem 13 (CL13) wirusa limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV), przewlekłym szczepem LCMV. Limfocyty Treg wyizolowane ze śledziony myszy zakażonych LCMV CL13 wykazywały zarówno aktywowany fenotyp, jak i zwiększoną aktywność supresyjną w porównaniu z limfocytami Treg w stanie spoczynku wyizolowanymi od myszy nieleczonych. W tym miejscu opisujemy podstawowy protokół analizy fenotypu ex vivo w celu odróżnienia aktywowanych limfocytów Treg od spoczynkowych limfocytów Treg. Ponadto opisujemy protokół pomiaru aktywności supresyjnej w pełni aktywowanych limfocytów Treg.

Myszy z trwałą infekcją wirusową generowano poprzez dożylne wstrzyknięcie 2 x 106 p.f.u. LCMV CL13. Aby zbadać zmiany fenotypowe w komórkach Treg i Tconv podczas przewlekłej infekcji wirusowej, limfocyty śledzionowe otrzymane od myszy naiwnych i zainfekowanych barwiono różnymi przeciwciałami i analizowano metodą cytometrii przepływowej. W 16 dniu p.i. stwierdzono upregulację PD-1 zarówno w komórkach Foxp3-CD4+ Tconv (<stron...

Tutaj opisujemy protokół analizy fenotypu limfocytów regulatorowych T (T reg) wyizolowanych od naiwnych i przewlekłych myszy zakażonych wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Ponadto zapewniamy proces oceny aktywności supresyjnej limfocytówT reg.

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena in vitro funkcji supresyjnej limfocytów T regulatorowych, wyizolowanych od myszy z chroniczną infekcją wirusową. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania dotyczące fenotypu i funkcji supresyjnej in vitro aktywowanych limfocytów T regulatorowych podczas chronicznej infekcji wirusowej. Technika ta pozwala ocenić bezpośredni wpływ limfocytów T regulatorowych na osobników wykazujących pozytywną odpowiedź limfocytów T in vitro.Jest to ogromna zaleta tej techniki. Należy rozpocząć od przeniesienia 5 × 10⁵ całkowitych limfocytów śledzionowych w 50 µL buforu FACS do każdego dołka nowej płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U, a następnie dodać 150 µL buforu FACS. Płytkę należy odwirować i usunąć nadsącz.Następnie wymieszaj osady komórkowe i przemyj komórki jeszcze dwa razy w 200 µL buforu FACS na każdą studniczkę. Po drugim przemyciu resuspenduj osady w 50 µL koktajlu przeciwciał na każdą studniczkę i inkubuj przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Następnie przemyj komórki dwukrotnie w buforze FACS i odlej nadsącz.Następnie utrwalaj komórki przez 20 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, używając 100 µL buforu do utrwalania, a następnie przeprowadź dwa przemycia buforem do przemywania i permeabilizacji. Po drugim przemyciu resuspenduj komórki w 50 µL przeciwciała anty-FOXP3. Aby przygotować kulek powlekanych przeciwciałami anty-CD3 i CD28, przenieś odpowiednią objętość kulek magnetycznych do probówki o pojemności 15 ml i dodaj równą objętość PPS.Delikatnie wymieszaj roztwór za pomocą pipety, a następnie odwiruj kuleczki magnetyczne. Po zakończeniu płukania odlej nadsącz i rozcieńcz kuleczki w 50 µL pełnej pożywki na każdą studzienkę. Następnie, w 96-dołkowej płytce z wypukłym dnem (U-bottom), zasiadź 50 µL z 1×10⁵ komórek regulacyjnych T CD4+ CD25+ na studzienkę, a następnie dodaj 50 µL z 1×10⁵ komórek efektorowych T CD8+ na studzienkę.Po wysianiu wszystkich komórek, dodaj 50 µL rozcieńczonych kulek powlekanych anti CD3 CD28 do każdej studni, a następnie dolej do 50 µL medium, aby całkowita objętość w każdej studni wyniosła 200 µL. Następnie przykryj płytkę folią i inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przez 72 godziny. Aby przeanalizować produkcję cytokin przez limfocyty T CD8+, po trzech dniach hodowli przenieś nadsącz do innej płytki 96-dołkowej i przeanalizuj nadsącze za pomocą testu ELISA zgodnie z instrukcją producenta.Aby przeanalizować proliferację komórek T CD8+, trzykrotnie przemyj płytkę z komórkami buforem facs. Następnie zawieś osady w 50 µl odpowiedniego koktajlu przeciwciał przeciwko proliferującym komórkom T CD8+ na 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu inkubacji dwukrotnie przemyj komórki buforem facs i utrwalaj je przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C, używając 100 µl buforu do utrwalania.Na koniec przemyj komórki dwukrotnie buforem do FACS i resuspenduj osady w 200 µL buforu do FACS. Następnie zmierz za pomocą cytometrii przepływowej procent proliferacji komórek T CD8-dodatnich podwójnie znakowanych filatą. W limfocytach śledzionowych uzyskanych od myszy naiwnych i zainfekowanych, PD-1 jest specyficznie upregulowany zarówno w konwencjonalnych komórkach FOXP3-ujemnych CD4-dodatnich, jak i FOXP3-ujemnych CD8-dodatnich u myszy zainfekowanych klonem 13 LCMV.Częstość występowania regulacyjnych limfocytów T CD4+ FOXP3+ jest dwukrotnie wyższa u myszy zakażonych LCMV klonu 13 niż u myszy naiwnych, przy czym większość komórek CD4+ FOXP3+ wykazuje również aktywowany fenotyp z wysoką ekspresją PD-1. Limfocyty T efektorowe CD8+ mogą zostać skutecznie odseparowane bez znaczącej kontaminacji innymi komórkami odpornościowymi. Po izolacji regulacyjnych limfocytów T można uzyskać dominującą populację limfocytów T CD4+ CD25+ o czystości przekraczającej 80%.Stymulacja wyizolowanych limfocytów T regulatorowych i efektorowych za pomocą kulek powlekanych przeciwciałami anty-CD3 i CD28 prowadzi do hamowania limfocytów T efektorowych CD8+ w sposób zależny od dawki. W rzeczywistości, gdy limfocyty T efektorowe CD8+ są hodowane wspólnie z chronicznymi limfocytami T regulatorowymi w stosunku jeden do jednego, proliferacja limfocytów T efektorowych CD8+ jest znacząco hamowana. Produkcja interferonu gamma przez komórki efektorowe CD8+ jest również znacząco zahamowana, gdy limfocyty T efektorowe CD8+ są hodowane wspólnie z aktywowanymi limfocytami T regulatorowymi z myszy z chroniczną infekcją, w porównaniu do hodowli wspólnie z nieaktywnymi limfocytami T regulatorowymi z myszy naiwnych.Ustaliliśmy, że technika ta może zostać zrealizowana w ciągu 80 godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wykorzystaniu świeżo wyizolowanych limfocytów T regulatorowych niezwłocznie po ich izolacji. Opracowanie tej metody utorowało badaczom z dziedziny medycyny drogę do zgłębienia funkcji limfocytów T regulatorowych w przebiegu przewlekłych chorób zapalnych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować procedurę supresji limfocytów T regulatorowych in vitro, wykorzystując system kokultury limfocytów T regulatorowych i odpowiadających.

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Wiele eksperymentalnych systemów zostało wykorzystanych do zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo, a co najważniejsze, bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Poznaj metodę analizy fenotypowej i funkcji supresyjnej komórek T regulatorowych izolowanych z myszy zakażonych wirusem LCMV. Protokół umożliwia ocenę aktywności komórek T reg in vitro.

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (Wideo) | JoVE Journal

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Przeglądaj więcej filmów