Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Ogólnym celem tej procedury jest ocena supresyjnej funkcji in vitro limfocytów T regulatorowych, wyizolowanych od myszy zakażonych przewlekle wirusem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące fenotypu i funkcji supresyjnej in vitro aktywowanych limfocytów T regulatorowych podczas przewlekłej infekcji wirusowej. Technika ta może ocenić bezpośredni wpływ regulatorowych limfocytów T na osobę z pozytywną odpowiedzią na limfocyty T in vitro.

Jest to ogromna zaleta tej techniki. Zacznij od przeniesienia pięć razy dziesięć do piątej całkowitej liczby limfocytów śledziony w 50 mikrolitrach buforu facs do każdej studzienki nowej płytki 96-dołkowej z dnem U, a następnie 150 mikrolitrów buforu facs. Odwirować płytkę i wyrzucić supernatant.

Następnie wymieszaj granulki komórek i umyj komórki jeszcze dwa razy w 200 mikrolitrach buforu facs na studzienkę. Po drugim praniu ponownie zawieś granulki w 50 mikrolitrach koktajlu przeciwciał na studzienkę, przez 20 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki dwa razy w buforze facs i zdekantuj supernatant.

Następnie utrwal komórki przez 20 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą 100 mikrolitrów buforu utrwalającego, a następnie dwa płukania buforem do przemywania przepuszczalności. Po drugim płukaniu ponownie zawieś komórki w 50 mikrolitrach przeciwciała anty-FOXP3. Aby przygotować kulki powlekane anty CD3 CD28, przenieś odpowiednią objętość kulek magnetycznych do 15-mililitrowej rurki i dodaj równą objętość PPS.

Delikatnie wymieszaj roztwór przez pipetowanie i odwiruj kulki magnetyczne. Pod koniec prania wyrzucić supernatant i rozcieńczyć kulki w 50 mikrolitrach kompletnego podłoża na studzienkę. Następnie zasiewaj 50 mikrolitrów od jednego razy dziesięć do piątych dodatnich limfocytów T regulatorowych CD4 CD25 na studzienkę na 96-dołkową płytkę dolną U, a następnie 50 mikrolitrów po 1 razy dziesięć do piątych limfocytów T CD8 z dodatnią odpowiedzią na studzienkę.

Gdy wszystkie komórki zostaną platerowane, dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonych kulek pokrytych anty CD3 CD28 do każdej studzienki i dodaj do 50 mikrolitrów pożywki, aby całkowita objętość każdego dołka wzrosła do 200 mikrolitrów. Następnie przykryj płytkę folią i umieść ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla na 72 godziny. Aby przeanalizować produkcję cytokin limfocytów T CD8-dodatnich, po trzech dniach hodowli przenieś supernatanty na inną 96-dołkową płytkę i przeanalizuj supernatanty metodą ELISA, zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby przeanalizować proliferację limfocytów T CD8-dodatnich, trzykrotnie umyj płytkę komórek buforem facs. Następnie ponownie zawieś granulki w 50 mikrolitrach odpowiedniego koktajlu przeciwciał przeciwko namnażonym limfocytom T CD8-dodatnim przez 20 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć komórki dwa razy w buforze facs i utrwalić je na 20 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą 100 mikrolitrów buforu utrwalającego.

Na koniec umyj komórki jeszcze dwa razy w buforze facs i ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach buforu facs. Następnie zmierz procent proliferacji limfocytów T CD8-dodatnich z filatami za pomocą cytometrii przepływowej. W limfocytach śledziony uzyskanych od nieleczonych i zakażonych myszy PD-1 jest specyficznie regulowany w górę zarówno w konwencjonalnych FOXP3 ujemnych CD4, jak i FOXP3 ujemnych komórkach CD8 zakażonych klonem LCMV 13

Częstość występowania FOXP3 dodatnich limfocytów T regulatorowych CD4 jest dwukrotnie wyższa u myszy zakażonych klonem LCMV 13 niż u myszy naiwnych, przy czym większość komórek FOXP3 dodatnich CD4 wykazuje również aktywowany fenotyp o wysokim poziomie PD-1. Limfocyty T z dodatnią odpowiedzią na CD8 można z powodzeniem oddzielić bez znacznego zanieczyszczenia innymi komórkami odpornościowymi. Po izolacji regulatorowych limfocytów T można uzyskać dominującą populację limfocytów T CD25-dodatnich CD4 o czystości ponad 80 procent.

Stymulacja izolowanych limfocytów T regulatorowych i reagujących przez kulki pokryte anty CD3 CD28 powoduje hamowanie limfocytów T CD8 z dodatnią odpowiedzią w sposób zależny od dawki. Rzeczywiście, gdy limfocyty T z dodatnią odpowiedzią na CD8 są hodowane wspólnie z przewlekłymi limfocytami T regulatorowymi w stosunku jeden do jednego, proliferacja limfocytów T z dodatnią odpowiedzią CD8 jest znacznie zahamowana. Wytwarzanie interferonu gamma przez komórki CD8 z dodatnią odpowiedzią jest również znacznie hamowane, gdy limfocyty T CD8 z dodatnią odpowiedzią są hodowane wspólnie z aktywowanymi limfocytami T regulatorowymi od przewlekle zakażonych myszy, w porównaniu z kohodowlą z odpoczywającymi limfocytami T regulatorowymi od nieleczonych myszy.

Odkryliśmy, że tę technikę można wykonać w 80 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o użyciu świeżo wyizolowanych limfocytów T regulatorowych natychmiast po ich izolacji. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie medycyny do zbadania funkcji regulatorowych limfocytów T w przewlekłej chorobie zapalnej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować procedurę supresji regulatorowych limfocytów T in vitro, używając systemu kohodowli regulatorowych i reagujących limfocytów T.