W pełni zautomatyzowane odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej
16 kwietnia 2016
Ten protokół pokazuje, jak osiągnąć czułość wykrywania femtomolowych białek w 10 μL pełnej krwi w ciągu 30 minut. Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu elektroprzędzonych mat nanowłóknistych zintegrowanych w lab-on-a-disc, który oferuje dużą powierzchnię, a także skuteczne mieszanie i mycie w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu.
Ogólnym celem tej procedury jest poprawa czułości wykrywania testu ELISA przy użyciu naturalnych przędzonych nanowłókien. Ten film pokazuje, jak osiągnąć czułość wykrywania femtomolowego białek w 10 mikrolitrach próbek krwi pełnej w ciągu 30 minut. W platformie lab-on-a-disc siła odśrodkowa jest wykorzystywana do przenoszenia cieczy przez komory, a cały proces jest w pełni zautomatyzowany.
Czułość wykrywania może być znacznie zwiększona dzięki integracji nanowłókien. Problem polegał jednak na tym, że nanowłókno jest bardzo delikatne i trudne w obsłudze. W tym filmie przedstawiamy prosty proces mocowania delikatnych mat z nanowłókien dwutlenku tytanu na plastikowym dysku.
Aby wytworzyć maty z nanowłókien z dwutlenku tytanu na podłożu silikonowym metodą elektroprzędzenia, podłoże silikonowe jest najpierw silanizowane, powlekane PDMS i wstępnie utwardzane. Mata z nanowłókien jest następnie przenoszona do tego wstępnie utwardzonego PDMS, a produkt ten jest dziurkowany w celu wytworzenia okrągłego elementu do mocowania. Pokryj komorę reakcyjną kroplą PDMS jako klejem i przymocuj okrągły element do dna komory.
Następnie utwardź PDMS w piekarniku. Na koniec zmontuj warstwy dysku w jedno kompletne urządzenie do testu ELISA. Ta technika transferu nanowłókien pozwala nam wykorzystać dużą powierzchnię nanowłókien do bioanalizy.
Odśrodkowe urządzenie mikrofilyczne oferuje pełną integrację i automatyzację wszystkich procesów wymaganych w teście ELISA. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami jest to, że może ona wykryć femtomolowe stężenia białek już z 10 mikrolitrów krwi pełnej. Przygotować roztwory prekursorów zgodnie z opisem w dołączonym protokole badania.
Następnie załaduj roztwór do elektroprzędzarki i wytwórz nanowłókna przez elektroprzędzenie, w optymalnych warunkach. Po przygotowaniu mat z nanowłókien polimerowych należy je kalcynować w piecu pod próżnią. Po kalcynacji maty z nanowłókien dwutlenku tytanu są ostatecznie przygotowywane.
Przygotuj układ mikrofilityczny za pomocą oprogramowania do projektowania 3D, takiego jak SOLIDWORKS, i przenieś projekt do frezarki CNC. Uruchom frezarkę CNC, aby wyprodukować tarczę z kanałami i komorami. Mata z dysku i nanowłókien jest teraz gotowa do integracji.
Przygotuj komorę próżniową, podłoże silikonowe i fluorozylan. Silanizować podłoże silikonowe fluorosilanem w próżni przez 30 minut. Przygotuj PDMS gościa, przygotowując prepolimer z utwardzaczem w stosunku 10 do jednego i odwiruj warstwę na silanizowanym podłożu silikonowym z prędkością 650 obr./min przez 60 sekund.
Utwardź PDMS pokryty silanizowaną płytką w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby się przykleił. Teraz przenieś te maty z nanowłókien na silikon pokryty PDMS, wywierając odpowiedni nacisk za pomocą płaskiego przedmiotu, takiego jak szklane szkiełko. Piecz próbkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez godzinę, aby całkowicie utwardzić klej PDMS.
Dozuj kilka kropel etanolu na maty z nanowłókien przymocowane do warstwy PDMS i wykonaj otwór o średnicy sześciu milimetrów za pomocą PunchIt. Następnie oderwij od podłoża silikonowego dziurkowane maty z nanowłókien przymocowane do PDMS. Następnie pokryj komorę reakcji wiązania w dysku około 20 mikrolitrami mieszaniny PDMS i umieść nanowłókna przyczepione do PDMS w komorach.
Następnie inkubuj zintegrowany dysk z maty z nanowłókien w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez godzinę. Przygotować roztwór GPDES w etanolu o stężeniu 1% objętości na objętość. Następnie potraktuj nanowłókna w dysku plazmą tlenową.
Dozuj 100 mikrolitrów roztworu GPDES na każdą matę z nanowłókien i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w szczelnie zamkniętym pojemniku. Po inkubacji usuń roztwór GPDES, stukając dyskiem w wycieraczkę. Umyj etanolem, wyjmij i piecz w 80 stopniach Celsjusza przez godzinę.
Po upieczeniu umyj alkoholem etylowym i dotknij, aby wyjąć. Powtórz ten proces i wysusz suszarką strumieniem azotu. W celu unieruchomienia przeciwciał należy dozować rozcieńczony przechwycony roztwór przeciwciała.
Przechowuj krążki w wilgotnej komorze i inkubuj w temperaturze 37 stopni przez cztery godziny. Pozostały roztwór zmyć buforem myjącym. Teraz zmontuj dysk za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.
Zastosuj rozsądny nacisk, aby złożyć warstwy w kompletny dysk. Napełnij wiążące komory reakcyjne buforem blokującym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj dwukrotnie buforem myjącym i przechowuj krążek w temperaturze 40 stopni Celsjusza do czasu użycia.
Załadować odczynniki, płuczące i 10 mikrolitrów krwi pełnej do komór na odczynniki i próbki. Umieść dysk w specjalnie zbudowanej maszynie do wizualizacji w celu zautomatyzowanego testu immunologicznego. System wizualizacji składa się z wirnika podłączonego do komputera w celu automatycznej pracy dysku wraz ze światłem stroboskopowym i kamerą CCD do wykonywania zdjęć.
Obracaj dyskiem z prędkością 3 600 obr./min przez 60 sekund, aby oddzielić czerwone krwinki. Zmieszać osocze z przeciwciałami wykrywającymi. Przenieść mieszaninę do komory reakcyjnej zintegrowanej z matą z nanowłókien dwutlenku tytanu.
Po reakcji immunologicznej przemyć nanowłókna, przenosząc bufor myjący do komory reakcyjnej. Następnie przenieść roztwór substratu chemiluminescencyjnego do komory reakcji wiązania i inkubować w trybie mieszania przez jedną minutę. Na koniec przenieś przereagowany roztwór substratu do komory detekcyjnej.
Po zakończeniu całej reakcji przenieś dysk do systemu detekcji i odczytaj sygnał chemiluminescencyjny za pomocą specjalnie opracowanego oprogramowania. Obsługa dysku i system detekcji można zintegrować w jednej platformie. Optymalizując napięcie i fluoran, uzyskano jednolite maty z nanowłókien, jak pokazano na tym obrazie SEM.
W celu optymalizacji czasu utwardzania PDMS zmierzono siłę przylegania. Jeśli była za krótka, mata z nanowłókna była zatopiona w PDMS lub odklejana, jeśli była zbyt długa. Po optymalizacji mata z nanowłókien została stabilnie przymocowana do PDMS.
Na tym wykresie przedstawiono liniowy zakres wykrywania białka C-reaktywnego z dwóch platform. Korzystając z laboratorium integralności nanowłókien na dysku, byliśmy w stanie osiągnąć znacznie zwiększoną czułość wykrywania białka C-reaktywnego już od 10 mikrolitrów surowicy w ciągu 30 minut. Obecnie dostępne technologie, takie jak 96-dołkowy test ELISA na płytkach, wymagają większej objętości próbki i dłuższego czasu wykrywania.
Ogólnie rzecz biorąc, zintegrowany test ELISA oparty na dysku z nanowłókien wykazał szeroki, dynamiczny zakres sześciu rzędów wielkości z granicą wykrywalności wynoszącą sześć femtomoli białka C-reaktywnego. Ta czułość wykrywania, wspomagana przez dużą powierzchnię zapewnianą przez nanowłókno zintegrowane z dyskiem, przewyższała konwencjonalną metodę ELISA, która była ograniczona do 2 000 femtomoli. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak przygotować odśrodkowe urządzenie mikrofilitowe, jak zintegrować nanowłókna fazalne i jak przeprowadzić detekcję białek za pomocą testu ELISA.
Technika ta może być przydatna do wykrywania białek o niskim poziomie wiązań w bardzo małej ilości próbek biologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje, jak osiągnąć femtomolową czułość detekcji białek w 10 µL krwi pełnej w ciągu 30 minut. Metoda wykorzystuje elektroprzędzone maty nanowłókniste zintegrowane z platformą lab-on-a-disc, co zwiększa stosunek sygnału do szumu dzięki efektywnemu mieszaniu i płukaniu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Detekcja białek
- Nanotechnologia
Wstęp
- ELISA jest powszechną metodą wykrywania białek.
- Zwiększenie czułości detekcji jest kluczowe dla dokładnej diagnostyki.
- Naturalne nanowłókna przędzone mogą zwiększyć czułość, lecz są kruche.
- Zautomatyzowane systemy typu lab-on-a-disc mogą usprawnić ten proces.
Cel badania
- Poprawa czułości detekcji w teście ELISA.
- Zaprezentowanie zastosowania nanowłókien w układzie lab-on-a-disc.
- Przedstawienie metody obchodzenia się z kruchymi matami nanowłóknistymi.
Zastosowane metody
- Integracja mat nanowłókien dwutlenku tytanu na plastikowym dysku.
- Wykorzystanie siły odśrodkowej do transferu cieczy między komorami.
- Automatyzacja całego procesu detekcji.
- Ocena czułości detekcji w próbkach krwi pełnej.
Główne wyniki
- Osiągnięto czułość na poziomie femtomolarnym w detekcji białek.
- Wykazano skuteczność procesów mieszania i płukania.
- Potwierdzono możliwość wykorzystania kruchych nanowłókien w zastosowaniu praktycznym.
- Zwalidowano zautomatyzowany proces szybkiej analizy.
Wnioski
- Integracja nanowłókien znacząco zwiększa czułość detekcji.
- Technologia lab-on-a-disc stanowi obiecujące podejście do analiz białek.
- Metodę tę można dostosować do różnych zastosowań diagnostycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technologia ta odpowiada na krytyczną potrzebę ultrasensytywnego wykrywania białek w klinicznych próbkach o małej objętości, umożliwiając wczesne odkrywanie biomarkerów z minimalnych ilości krwi pełnej. Poprzez integrację nanowłókien otrzymanych metodą elektroprzędzenia z odśrodkową platformą mikroprzepływową, osiąga ona czułość na poziomie femtomolarnym w ciągu 30 minut, co znacząco obniża granicę wykrywalności w porównaniu do konwencjonalnego testu ELISA. Postęp ten wspiera walidację celów oraz identyfikację związków wiodących poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych w przesiewowych badaniach białek o niskiej zawartości, co bezpośrednio wpływa na ograniczanie ryzyka w fazie przedklinicznej i decyzje dotyczące priorytetyzacji portfolio.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie białek o niskiej liczebności w krwi pełnej, co zwiększa pewność w określaniu powiązań między celem a chorobą.
- Wartość operacyjna: Redukuje zużycie próbki do 10 µL, co pozwala na wielokrotne wykorzystanie cennych materiałów klinicznych w wielu różnych testach.
- Wartość prognostyczna: Femtomolarny limit detekcji poprawia stosunek sygnału do szumu, co wspiera bardziej wiarygodną kwantyfikację biomarkerów w procesach odkrywczych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowaną, zautomatyzowaną platformę do opracowywania testów immunoenzymatycznych z powtarzalnym dozowaniem i mieszaniem cieczy.
- Wartość operacyjna: Eliminuje ręczne etapy pipetowania, co zmniejsza zmienność i zwiększa przepustowość kampanii przesiewowych przeciwciał.
- Gotowość do analizy: Wspiera analizy multipleksowe przy minimalnym zużyciu odczynników, co ułatwia walidację celów w oparciu o panele.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając spójną kwantyfikację białek w różnych typach i objętościach próbek.
- Minimalizacja ryzyka: Wysoka czułość zmniejsza prawdopodobieństwo pominięcia wczesnych sygnałów farmakokinetycznych lub farmakodynamicznych w modelach chorób.
- Użyteczność przedkliniczna: Kompatybilność z objętościami krwi małych zwierząt, co wspiera badania podłużne bez konieczności pobierania próbek terminalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celów opartą na hipotezach poprzez ilościowe oznaczanie białek w matrycach o znaczeniu klinicznym.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie wykrywania biomarkerów specyficznych dla danej ścieżki w krwi pełnej, co zwiększa pewność co do wybranego celu.
- Przesiew: Zapewnia wydajność immunoanaliz gotowych do automatyzacji dzięki precyzyjnemu dozowaniu i płukaniu płynów, co jest niezbędne do odtwarzalnej walidacji trafień.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty chemiluminescencyjne w zakresie sześciu rzędów wielkości, umożliwiając dokładne porównanie ekspresji białek w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez wykrywanie białek istotnych klinicznie (np. CRP, cTnI) w krwi poddanej minimalnemu przetwarzaniu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Konstrukcja typu lab-on-a-disc pozwala na adaptację platformy do różnych immunoanaliz, co sprzyja standaryzacji odczynników i przepływu pracy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dzięki poprawie granic wykrywalności i zakresu dynamicznego.
- Wartość operacyjna: Pełna automatyzacja skraca czas pracy manualnej i ogranicza zmienność między użytkownikami, poprawiając odtwarzalność testu w różnych ośrodkach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji typu go/no-go w oparciu o wiarygodne dane o biomarkerach z ograniczonej liczby próbek, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera rozwój projektów z uwzględnieniem ryzyka poprzez zapewnienie wiarygodnej kwantyfikacji celów o niskiej liczbie kopii na wczesnym etapie procesu badawczego.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Pomyślna fabricacja wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie elektroprzędzenia, obchodzenia się z nanowłóknami oraz projektowania mikroprzepływowego.
- Proces zależy od dostępu do frezowania CNC, obróbki plazmowej i sprzętu próżniowego w celu przygotowania dysków i mat nanowłóknistych.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów powlekania i utwardzania PDMS, aby zapewnić spójną adhezję nanowłókien pomiędzy partiami.
- Adaptacja do alternatywnych białek docelowych wymaga ponownej optymalizacji chemii powierzchni i warunków inkubacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność zachowania kontrolowanych warunków środowiskowych podczas transferu nanowłókien oraz potencjalną zmienność jednorodności maty włóknistej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
1:22
Introduction
1:47
Fabrication of TiO2 NF Mats and Discs
2:35
Integration of TiO2 NF Mat into a Centrifugal Microfluidic Device
4:06
Surface Modification and Disc Assembly
5:35
On-disc Immunoassay and Detection
7:11
Results
8:27
Conclusion
