Name: W pełni zautomatyzowane odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego z nanowłóknami tytanowymi. Technika ELISA osiąga czułość femtomolową w zaledwie 30 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), grant z Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych, Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej (A121994) oraz IBS-R020-D1 finansowany przez rząd koreański.

UWAGA: Krew pobrano od zdrowych osób i pobrano do probówki do pobierania krwi. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich ochotników.
1. Produkcja maty TiO2 NF
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu prekursora22
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1,5 g tetraizoproptlenku tytanu (TTIP) w mieszaninie etanolu (99,9%, 3 ml) i lodowatego kwasu octowego (3 ml) i mieszać roztwór w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 30 minut na mieszadle magnetycznym.</li>
		<li>Rozpuścić 11% wagowych poliwinylopirolidonu (PVP) w 3,64 g etanolu (99,9%) i mieszać roztwór w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę za pomocą mieszadła magnetycznego z płytą grzejną.</li>
		<li>Połączyć i mieszać oba roztwory w temperaturze 65 °C przez 4 godziny na mieszadle magnetycznym z płytą grzejną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przędzenie elektryczne
	<ol>
		<li>Załadować przygotowany roztwór do strzykawki podłączonej do igły ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 200 μm. Wlać roztwór bezpośrednio do strzykawki po wyjęciu tłoka.</li>
		<li>Roztwór wprowadzać stale z natężeniem przepływu 0,3 ml/h przez 10 minut na płytkę krzemową (2 cm x 2 cm) umieszczoną na uziemionym podłożu przy wysokim napięciu prądu stałego (15 kV). Podczas elektrowirowania należy ustawić odległość między igłą a uziemionym podłożem na 10 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalcynacja maty NF
	<ol>
		<li>Umieść matę NF w piecu i zwiększ temperaturę do 500 °C z prędkością narastania 3 °C/min w warunkach wysokiej próżni (5 x 10-5 torr).</li>
		<li>Utrzymać temperaturę 500 °C przez 3 godziny. Schłodzić temperaturę próbek do temperatury RT (25 °C) w piecu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Integracja maty TiO2 NF z odśrodkowym dyskiem mikroprzepływowym
<ol>
	<li>Wykonanie dysku
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania do projektowania 3D (np. SolidWorks lub podobnego), aby zobrazować komory, kanały lub zawory każdej warstwy dysku. Przekonwertuj pliki projektowe na kod sterowania numerycznego (CNC) za pomocą oprogramowania do generowania kodu (np. Edgecam lub podobnego). Używaj oprogramowania zgodnie z instrukcją obsługi. 23,24 Uwaga: Typowe wymiary kanału stosowane w tym urządzeniu to 1,0 mm x 0,3 mm (szerokość x głębokość).</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie operacyjne frezarki CNC (np. DeskCNC lub podobne) i załaduj kod CNC do oprogramowania operacyjnego, a następnie kliknij następujące elementy w kolejności: "AUTO" -> "G CODE OPEN" -> Wybierz wygenerowany kod CNC.</li>
		<li>Zamocuj płytkę PC na frezarce CNC: użyj płytek PC 1 mm dla warstwy wierzchniej i płytek PC 5 mm dla warstwy tarczy. Uruchom frezarkę CNC, aby przeciąć każdą warstwę tarczy, klikając przycisk "START".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeniesienie maty TiO2 NF na tarczę
	<ol>
		<li>Umieścić podłoże krzemowe i małą szalkę Petriego zawierającą 40 μl (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu w komorze próżniowej pod próżnią na 30 minut. Fluorozylan odparowuje i pokrywa się na podłożu.</li>
		<li>Wymieszaj prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) z utwardzaczem w stosunku 10:1 i odgazuj w komorze próżniowej. Wiruj PDMS na podłożu krzemowym z prędkością 650 obr./min przez 60 sekund.</li>
		<li>Utwardzić PDMS pokryty na podłożu silikonowym w piecu w temperaturze 65 °C przez 10 minut, aby uzyskać stan przylegania. 
		UWAGA: Czas utwardzania może być zmienny w zależności od warunków otoczenia, a siłę przyczepności można sprawdzić za pomocą testu przyczepności za pomocą reometru.</li>
		<li>Przenieś matę TiO2 NF przygotowaną przez elektroprzędzenie i kalcynację na krzem pokryty PDMS za pomocą pęsety. Następnie należy ręcznie przyłożyć konforemny nacisk na przenoszoną matę TiO2 NF za pomocą płaskiego przedmiotu (np. szkiełka podstawowego) i usunąć przedmiot. Umieścić tę próbkę w piecu w temperaturze 65 °C na 4 godziny lub w temperaturze 80 °C na 1 godzinę, aby całkowicie utwardzić warstwę PDMS.</li>
		<li>Pokryj komory reakcyjne wiążące w dysku 20 μl mieszaniny PDMS / utwardzacza (10:1), która działa jak warstwa adhezyjna do mocowania maty TiO2 NF na dysku.</li>
		<li>Dozować 50 μl etanolu (99,9%) na matę TiO2 NF na warstwę PDMS, naciąć matę NF z otworem o średnicy 6 mm i przenieść pociętą matę TiO2 NF do wiążących komór reakcyjnych pokrytych 20 μl PDMS w poprzednim kroku. 
		UWAGA: W tym kroku etanol będzie pomocny w oderwaniu przyciętej maty TiO2 NF od podłoża Si.</li>
		<li>Inkubować zintegrowany dysk z matą TiO2 NF w piecu w temperaturze 65 °C przez 4 godziny lub w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę, aby całkowicie utwardzić PDMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modyfikacja powierzchni maty TiO2 NF na tarczy 
	<ol>
		<li>Przygotować 1% v/v roztwór (3-glicydoksypropylo)metylodiboksysilanu (GPDES) w etanolu (99,9%).</li>
		<li>Zintegrowany dysk maty TiO2 NF należy traktować plazmą tlenową o mocy 140 W, przepływie tlenu 50 sccm przez 180 sek. Dozować 100 μl roztworu GPDES na każdą matę z nanowłókien i inkubować w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 2 godziny.</li>
		<li>Umyj krótko podłoża, dozując etanol (99,9%) za pomocą butelki do mycia, a następnie całkowicie usuń etanol, odwracając krążek i osuszając go czystą chusteczką. Utwardzać w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę. Przemyć dwukrotnie etanolem (99,9%) w taki sam sposób, jak podano powyżej, w celu usunięcia fizycznie zaadsorbowanych i niezwiązanych cząsteczek GPDES.</li>
		<li>Suszyć suszarką ze strumieniem azotu, suszyć w próżni. 
		UWAGA: Dysk można przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze suchej (25 °C) do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchomienie przeciwciał na powierzchni
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór 200 μg/ml przeciwciał wychwytujących (monoklonalny mysi anty-ludzki hsCRP lub monoklonalny mysi anty-cTnI) przez rozcieńczenie przeciwciał buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (pH 7,4). Dozować 5 μl roztworu na każdą matę NF w krążku za pomocą mikropipety. Zobacz listę materiałów, aby uzyskać więcej informacji na temat przeciwciał.</li>
		<li>Przechowywać krążki w wilgotnej komorze i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Umyć matę NF pokrytą przeciwciałami 0,1% buforem BSA-PBS. Napełnić komorę 100 μl buforu do płukania za pomocą mikropipety, usunąć bufor przez zasysanie lub dekantację. Na koniec odwróć krążek i zetrzyj go na czystej chusteczce, a następnie złóż dysk.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż tarczy
	<ol>
		<li>Narysuj projekt dysku na dwustronnej taśmie klejącej za pomocą programu CAD (np. AutoCAD lub podobnego). Załaduj projekt CAD do plotera tnącego.</li>
		<li>Przetnij dwustronną taśmę klejącą za pomocą plotera tnącego. Zdejmij jedną warstwę ochronną podwójnej taśmy klejącej i przymocuj ją do warstwy dysku. Zdejmij drugą warstwę ochronną i przymocuj górną warstwę do warstwy dysku.</li>
		<li>Załaduj wstępnie zmontowaną tarczę do prasy i precyzyjnie wyrównaj warstwy górne/kleju/tarczy, używając znaczników wyrównania w każdej warstwie, aby połączyć każdy zawór, kanał i komory. Zastosować ciśnienie konforemne za pomocą maszyny do prasowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test immunologiczny
<ol>
	<li>Napełnić komory 1% buforem BSA-PBS za pomocą mikropipety i inkubować krążek w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Usunąć bufor przez aspirację za pomocą mikropipety. Wykonaj ten krok, aby zablokować miejsca, w których nie przereagowano i zmniejszyć niespecyficzną adsorpcję białka w dysku.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 0,1% BSA-PBS, napełniając i odsysając komory za pomocą mikropipety. 
	UWAGA: Na tym etapie dysk można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Załadować 10 μl krwi pełnej z antygenem lub surowicy wolnej od CRP w celu wykrycia CRP na krążku za pomocą mikropipety. Do sporządzania wykresów kalibracyjnych stosuje się stężenia CRP od 1 pg/ml do 100 ng/ml; i cTnI od 10 pg/ml do 100 ng/ml. 
	UWAGA: Ze względu na wyższy poziom CRP we krwi pełnej, który zwykle mieści się w zakresie μM, użyto surowicy wolnej od CRP, aby wykazać niską granicę wykrywalności urządzenia.</li>
	<li>Obracaj dysk z prędkością 3,600 obr./min (391 x g) przez 60 sekund, aby oddzielić czerwone krwinki.</li>
	<li>Otwórz zawór #1 przez naświetlanie laserowe i przenieś 4 μl supernatantu plazmy do komory zawierającej 8 μl przeciwciał wykrywających sprzężonych z HRP, obracając dysk z prędkością 2400 obr./min przez 3 sek. 
	UWAGA: Ogólne procesy uruchamiania zaworu i wizualizacji pracy tarczy zostały szczegółowo opisane w poprzednim raporcie. 21</li>
	<li>Zastosuj tryb mieszania (15 Hz s-1, 15°) przez 5 sekund w celu związania białka i wykrycia przeciwciał.</li>
	<li>Otwórz zawór #2 i przenieś mieszaninę przygotowaną w kroku 6 do wiążącej komory reakcyjnej (2 400 obr./min, 3 sekundy). Następnie zastosuj tryb mieszania (60 Hz s-1, 2°) przez 20 minut, aby uzyskać reakcję immunologiczną między mieszaniną a przeciwciałami wiążącymi na TiO2 NFs. Po reakcji otwórz zawór #3 i przenieś pozostałą mieszaninę do komory odpadowej (2 400 obr./min, 10 sekund).</li>
	<li>Przenieść bufor płuczący (600 μl) do komory reakcji wiązania, otwierając zawór #4 i obracając tarczę (2 400 obr./min, 4 sekundy). Następnie zastosuj tryb mieszania (30 Hz s-1, 30°) przez 120 sekund, aby umyć TiO2 NF w komorze.</li>
	<li>Umyj TiO2 NF jeszcze dwukrotnie, postępując zgodnie z tym samym warunkiem w kroku 3.8, i całkowicie usuń resztki bufora myjącego, obracając dysk z prędkością 2,400 obr./min przez 20 sekund. Następnie zamknij zawór #5.</li>
	<li>W przypadku reakcji chemiluminescencyjnej należy zastosować tryb mieszania (30 Hz s-1, 2°) przez 1 minutę po przeniesieniu roztworu substratu chemiluminescencyjnego do komory reakcji wiążącej, otwierając zawór #6 i obracając dysk z prędkością 2,400 obr./min przez 10 sekund</li>.
	<li>Przenieś przereagowany roztwór substratu do komór detekcyjnych, otwierając zawór #7 i obracając dysk z prędkością 2 400 obr./min przez 10 sekund.</li>
	<li>Pomiar sygnałów chemiluminescencyjnych z przereagowanego roztworu substratu za pomocą systemu detekcji wyposażonego w moduł fotopowielacza (PMT). 
	UWAGA: System detekcji jest maszyną zbudowaną na zamówienie, składającą się z następujących części: silnika krokowego, komponentów optomechanicznych, stopni translacyjnych i dostępnego na rynku PMT. Części optomechaniczne i silnik krokowy są zmontowane w celu utrzymania urządzenia, a silnik może obracać tarczę. Detekcja odbywa się za pomocą PMT zamocowanego na częściach optomechanicznych i znajduje się nad komorami detencyjnymi urządzenia. Manipulując silnikiem krokowym, komory detekcyjne są ustawiane tuż pod strefą wykrywania PMT.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+Ultrasensitive+Protein+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection.</a> Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).</li>
<li>Hu, W., Li, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial-based+advanced+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Nanomed.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial-based advanced immunoassays.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).</li>
<li>Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYang-Kyu%2C+C+%22Biosensors+and+Cancer%22">Biosensors and Cancer</a>. , Science Publishers. 164-183 (2012).</li>
<li>Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltazar%2C+R+%22Nanocomposite+Particles+for+Bio-Applications%22">Nanocomposite Particles for Bio-Applications</a>. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).</li>
<li>Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO2+Nanotubes%3A+Synthesis+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+Nanofibrous+Membranes%3A+A+Novel+Solid+Substrate+for+Microfluidic+Immunoassays+for+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV.</a> Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).</li>
<li>Chantasirichot, S., Ishihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+phospholipid+polymer+substrate+for+enhanced+performance+in+immunoassay+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system.</a> Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+TiO2+Nanofiber-Based+Cell+Capture+Assay+for+Detecting+Circulating+Tumor+Cells+from+Colorectal+and+Gastric+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients.</a> Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).</li>
<li>Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-epidermal+growth+factor+receptor+conjugated+mesoporous+zinc+oxide+nanofibers+for+breast+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics.</a> Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).</li>
<li>Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Biofunctionalized+Mesoporous+Electrospun+TiO2+Nanofiber+Based+Interface+for+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).</li>
<li>Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Potential+Photoelectrochemical+Biosensing+Using+Porphyrin-Functionalized+TiO2+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles.</a> Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).</li>
<li>Liu, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coadsorption+of+Horseradish+Peroxidase+with+Thionine+on+TiO2+Nanotubes+for+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing.</a> Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).</li>
<li>Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+biocompatibility+between+TiO2+nanotubes+layer+and+human+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomed.Mater.Res.+Part+A%22%5BJournal%5D)">On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts.</a> J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).</li>
<li>Dettin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+surface+modification+of+titanium+oxide+with+different+adhesive+peptides%3A+Surface+characterization+and+osteoblast-like+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).</li>
<li>Kim, W. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Protein+Immobilization+Efficiency+on+a+TiO2+Surface+Modified+with+a+Hydroxyl+Functional+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group.</a> Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).</li>
<li>Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft+Copolymer-Templated+Mesoporous+TiO2+Films+Micropatterned+with+Poly%28ethylene+glycol%29+Hydrogel%3A+Novel+Platform+for+Highly+Sensitive+Protein+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).</li>
<li>Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+sensitivity+assays+for+human+cardiac+troponin+I+using+TiO2+nanotube+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays.</a> Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).</li>
<li>Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrospinning+technique+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Use of electrospinning technique for biomedical applications.</a> Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).</li>
<li>Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanomaterials+for+ultrasensitive+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors.</a> Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).</li>
<li>Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+electrospun+nanofibrous+PVDF+membranes+into+a+microfluidic+chip+assembled+by+PDMS+and+scotch+tape+for+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays.</a> ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).</li>
<li>Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+TiO2+nanofiber+integrated+lab-on-a-disc+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).</li>
<li>Li, D., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Titania+Nanofibers+by+Electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning.</a> Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).</li>
<li>Lombard, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLombard%2C+M+%22SolidWorks+2013+BIBLE%22">SolidWorks 2013 BIBLE</a>. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).</li>
<li>Tickoo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTickoo%2C+S+%22EdgeCAM+11.0+for+Manufacturers%22">EdgeCAM 11.0 for Manufacturers</a>. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).</li>
<li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+adhesion+of+interconnected+TiO2+nanofiber+network+on+conductive+substrate+and+its+application+in+polymer+photovoltaic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices.</a> Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102(2008).</li>
<li>Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO2+single-crystalline+nanorod+electrode+for+quasi-solid-state+dye-sensitized+solar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells.</a> Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113(2005).</li>
<li>Katsuhiro, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+processed+nanofibrous+TiO2+membranes+for+photovoltaic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications.</a> Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test na zintegrowanym dysku TiO2 NF jest szybką, niedrogą i wygodną techniką ultraczułego wykrywania białek o niskiej liczebności obecnych w bardzo małej objętości krwi. Technika ta ma tę zaletę, że wykorzystuje małe objętości próbek (10 μl) i nadaje się do jednoczesnej analizy wielu próbek. Daje to ogromny potencjał jako urządzenie do multipleksowania testów immunologicznych. Dodatkową zaletą urządzenia jest to, że nie wymaga etapów wstępnej obróbki próbek, takich jak separacja plazmowa, która jest wymagana w...

Kilka platform do diagnozowania chorób zostało opracowanych w oparciu o materiały w skalinano1,2, takie jak nanodruty,3 nanocząstki,4 nanorurki,5 i nanowłókna (NF)6-8. Nanomateriały te oferują doskonałe perspektywy w projektowaniu nowych technologii dla wysoce czułych testów biologicznych ze względu na ich unikalne właściwości fizykochemiczne. Na przykład mezoporowate nanowłókna tlenku zostały wykorzystane do femto-molowego wykrywania biomarkerów raka piersi. 9 Ostatnio nanomateriały na bazie dwutlenku tytanu (TiO2) są badane pod kątem zastosowań bioanalitycznych10 ze względu na ich stabilność chemiczną11, znikomą denaturację białek12 i biokompatybilność. 13 Ponadto grupy hydroksylowe na powierzchni TiO2 ułatwiają modyfikację chemiczną i kowalencyjne przyłączanie biomolekuł. 14,15 Wzorzyste cienkie warstwy TiO2 16 lub nanorurki TiO2 17 wykorzystano w celu zwiększenia czułości wykrywania białka docelowego poprzez zwiększenie powierzchni; Jednak proces produkcji jest dość złożony i wymaga drogiego sprzętu. Z drugiej strony, elektroprzędzone NF przyciągają uwagę ze względu na ich dużą powierzchnię, a także prosty i tani proces wytwarzania; 18,19 jednak delikatna lub luźna charakterystyka elektroprzędzonej maty TiO2 NF sprawia, że jest ona trudna w obsłudze i integracji z urządzeniami mikroprzepływowymi. 6,20 W związku z tym maty TiO2 NF były rzadko wykorzystywane w zastosowaniach bioanalitycznych, szczególnie tych wymagających trudnych warunków prania.
W tym badaniu, aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy nową technologię przenoszenia elektroprzędzonych mat NF na powierzchnię dowolnego docelowego podłoża poprzez wykorzystanie cienkiej warstwy kleju polidimetylosiloksanu (PDMS). Ponadto z powodzeniem pokazaliśmy integrację elektroprzędzonych mat TiO2 NF z odśrodkowym urządzeniem mikroprzepływowym wykonanym z poliwęglanu (PC). Za pomocą tego urządzenia w ciągu 30 minut uzyskano bardzo czułe, w pełni zautomatyzowane i zintegrowane wykrywanie białka C-reaktywnego (CRP) oraz troponiny sercowej I (cTnI) w ciągu 30 minut przy użyciu zaledwie 10 μl krwi pełnej. 21 Ze względu na połączone zalety właściwości NF i platformy odśrodkowej, test wykazał szeroki zakres dynamiki wynoszący sześć rzędów wielkości od 1 pg/ml (~8 fM) do 100 ng/ml (~0,8 pM) z dolną granicą wykrywalności 0,8 pg/ml (~6 fM) dla CRP i zakresem dynamicznym od 10 pg/ml (~0,4 pM) do 100 ng/ml (~4 nM) z granicą wykrywalności 37 pg/ml (~1,5 pM) dla cTnI. Te granice wykrywalności są ~300 i ~20-krotnie niższe w porównaniu z odpowiadającymi im konwencjonalnymi wynikami ELISA. Technika ta może być stosowana do wykrywania dowolnych białek docelowych z odpowiednimi przeciwciałami. Ogólnie rzecz biorąc, urządzenie to może w znacznym stopniu przyczynić się do diagnostyki in vitro i testów biochemicznych, ponieważ może wykrywać rzadkie ilości docelowych białek z dużą czułością nawet z bardzo małych ilości próbek biologicznych; np. 10 μl krwi pełnej. Chociaż w tym badaniu wykazaliśmy tylko wykrywanie białek w surowicy za pomocą ELISA, technologia transferu i integracji elektroprzędzonych NF z urządzeniami mikroprzepływowymi może być szerzej stosowana w innych reakcjach biochemicznych, które wymagają dużej powierzchni w celu uzyskania wysokiej czułości wykrywania.

<table><tbody><tr><td>Wafel Si</td> LG <td>SILTRON</td><td>Polerowany wafel, klasa testowa</td><td>Średnica (mm) = 150, orientacja = < 100>, domieszka = bor, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, grubość (&mu; m) = 650 - 700</td></tr><tr><td>Poliwęglan (PC)&nbsp;</td><td>Daedong Plastic</td><td>PCS#6900</td><td>Grubość (mm) = 1 i 5&nbsp;</td></tr><tr><td>Tetraizoproptlenek tytanu, 98%,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon, Mw = 1 300 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>PDMS i utwardzacz</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>GPDES</td><td>Gelest Inc</td><td>SIG5832.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>J T Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FE-SEM</td><td>FEI</td><td>Nova NanoSEM</td><td></td></tr><tr><td>rentgenowska spektroskopia fotoelektronów</td><td>ThermoFisher</td><td>K-alpha</td><td></td></tr><tr><td>Modelarka 3D</td><td>M& I CNC Lab, Korea</td><td></td><td>Frezarka CNC</td></tr><tr><td>Maszyna dozująca wosk</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td><td></td><td>Dostosowane</td></tr><tr><td>Dwustronna taśma klejąca</td><td>FLEXcon, USA</td><td>DFM 200 przezroczysta 150 POLY H-9 V-95</td><td></td></tr><tr><td>Ploter tnący</td><td>Graphtec Corporation, Japonia</td><td>Graphtec CE3000-60 MK2</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>MIDAS</td><td>SPIN-3000D</td><td></td></tr><tr><td>Piec (kalcynacja)</td><td>R. D. WEBB COMPANY</td><td>WEBB 99</td><td></td></tr><tr><td>Reometr (test przyczepności)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Haake MARS&nbsp; III - Pakiet</td><td></td>ORM</tr><tr><td>System plazmy tlenowej</td><td>FEMTO</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalny mysz antyludzka hsCRP</td><td>Hytest Ltd., Finlandia</td><td>4C28</td><td>(klon # C5)</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty-cTnI</td><td>Hytest Ltd., Finlandia</td><td>4T21</td><td>(klon # 19C7)</td></tr><tr><td>HRP sprzężona koza poliklonalna anty-hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab19175</td><td></td></tr><tr><td>HRP sprzężony mysz monoklonalna anty-cTnI</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab24460</td> <td>(klon # 16A11)</td></tr> <tr><td>hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab111647</td><td></td></tr><tr><td>cTnI</td><td>Fitzgerald, MA</td><td>30-AT43</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Amresco Inc</td><td>E404</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi</td><td>Vacutainer BD</td><td>367844</td><td>K2 EDTA 7,2 mg plus probówki do pobierania krwi </td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA femto</td><td>Invitrogen</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Modułowy czytnik płyt Multilabel</td><td>Perkin Elmer</td><td>Envision 2104</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do obsługi dysków</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td><td></td><td>Dostosowana</td></tr><tr><td>lampa fotopowielacza (PMT)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>H1189-210</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk</td><td>Wersja 2012</td><td>Oprogramowanie do projektowania</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CAD 3D SolidWorks&nbsp;</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Wersja 2013</td><td>Oprogramowanie do projektowania 3D,</td></tr> <tr>wersja oprogramowania <td>Edgecam</td><td>Vero</td><td>2009.01.06928</td><td>Oprogramowanie do generowania kodu</td></tr><tr><td>DeskCNC</td><td>Carken Co.</td><td>wersja 2.0.2.18</td><td>Oprogramowanie frezarki CNC</td></tr></tbody></table>

w pełni zautomatyzowane odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Test immunoenzymatyczny (ELISA) jest obiecującą metodą wykrywania niewielkiej ilości białek w próbkach biologicznych. Urządzenia, które stanowią platformę do zmniejszenia objętości próbki i czasu oznaczania, a także pełną automatyzację, są niezbędne do potencjalnego zastosowania w diagnostyce przyłóżkowej. Ostatnio zademonstrowaliśmy ultraczułe wykrywanie białek surowicy, białka C-reaktywnego (CRP) i troponiny sercowej I (cTnI), wykorzystując lab-on-a-disc złożony z mat nanowłóknistych TiO2 (NF). Wykazał duży zakres dynamiki z czułością wykrywania femtomolowców (fM), od małej objętości krwi pełnej w ciągu 30 minut. Urządzenie składa się z kilku elementów do separacji, dozowania, mieszania i mycia krwi, które są zautomatyzowane w celu poprawy czułości przy małych objętościach próbek. Tutaj, w demonstracji wideo, pokazujemy protokoły eksperymentalne i know-how w zakresie wytwarzania NF, a także dysku, ich integracji i działania w następującej kolejności: procesy przygotowania maty TiO2 NF; druk transferowy maty TiO2 NF na płycie; modyfikacja powierzchni pod kątem reakcji immunologicznych, montaż i obsługa tarczy; Wykrywanie na dysku i reprezentatywne wyniki dla testu immunologicznego. Korzystanie z tego urządzenia umożliwia analizę multipleksową przy minimalnym zużyciu próbek i odczynników. Biorąc pod uwagę zalety, urządzenie powinno znaleźć zastosowanie w wielu różnych zastosowaniach i okazać się korzystne w ułatwianiu analizy białek o niskiej obfitości.

Zgodnie z niniejszym protokołem przygotowano w pełni zautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe z napędem odśrodkowym do wysokoczułego wykrywania białek z krwi pełnej. Maty z nanowłókien (NF) TiO2 przygotowano za pomocą procesów elektroprzędzenia i kalcynacji. W celu wytworzenia nanowłókien o pożądanej średnicy, morfologii i grubości zoptymalizowano warunki elektroprzędzenia, takie jak szybkość przepływu, napięcie i czas przędzenia. W przypadku braku optymalizacji warunków jak...

Ten protokół pokazuje, jak osiągnąć czułość wykrywania femtomolowych białek w 10 μL pełnej krwi w ciągu 30 minut. Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu elektroprzędzonych mat nanowłóknistych zintegrowanych w lab-on-a-disc, który oferuje dużą powierzchnię, a także skuteczne mieszanie i mycie w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu.

W pełni zautomatyzowane odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Ogólnym celem tej procedury jest poprawa czułości wykrywania testu ELISA przy użyciu naturalnych przędzonych nanowłókien. Ten film pokazuje, jak osiągnąć czułość wykrywania femtomolowego białek w 10 mikrolitrach próbek krwi pełnej w ciągu 30 minut. W platformie lab-on-a-disc siła odśrodkowa jest wykorzystywana do przenoszenia cieczy przez komory, a cały proces jest w pełni zautomatyzowany.Czułość wykrywania może być znacznie zwiększona dzięki integracji nanowłókien. Problem polegał jednak na tym, że nanowłókno jest bardzo delikatne i trudne w obsłudze. W tym filmie przedstawiamy prosty proces mocowania delikatnych mat z nanowłókien dwutlenku tytanu na plastikowym dysku.Aby wytworzyć maty z nanowłókien z dwutlenku tytanu na podłożu silikonowym metodą elektroprzędzenia, podłoże silikonowe jest najpierw silanizowane, powlekane PDMS i wstępnie utwardzane. Mata z nanowłókien jest następnie przenoszona do tego wstępnie utwardzonego PDMS, a produkt ten jest dziurkowany w celu wytworzenia okrągłego elementu do mocowania. Pokryj komorę reakcyjną kroplą PDMS jako klejem i przymocuj okrągły element do dna komory.Następnie utwardź PDMS w piekarniku. Na koniec zmontuj warstwy dysku w jedno komp

fully-automated-centrifugal-microfluidic-device-for-ultrasensitive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Cyfrowa mikroprzepływność to technika polegająca na manipulowaniu pojedynczymi kroplami (~nL - mL) na macierzy elektrod poprzez przykładanie pól elektrycznych. Jest ona odpowiednia do przeprowadzania szybkich, sekwencyjnych, zminiaturyzowanych zautomatyzowanych analiz biochemicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę zdolną do automatyzacji kilku etapów przetwarzania proteomicznego.

Cyfrowa mikroprzepływowość w zautomatyzowanym przetwarzaniu proteomicznym

Opracowano zautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do wzbogacania krążących komórek z jądrem z krwi obwodowej poprzez lizę erytrocytów, co zapewnia izolację wysokiej jakości próbki bez utraty komórek.

Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

Ten film demonstruje protokół testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkera białkowego związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) z płytek krwi ludzkiej. Potwierdzenie obecności białka biomarkerowego ALS uzyskuje się poprzez rozdzielenie białek płytek krwi na podstawie wielkości, a następnie detekcję chemiluminescencyjną.

Test immunologiczny elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkerów białkowych

Ten film demonstruje system mikroprzepływowy do testu immunologicznego opartego na magnetycznych nanocząsteczkach. System detekcji wykorzystuje urządzenie mikroprzepływowe zawierające pułapkę magnetyczną w swoich kanałach. Do kanałów wprowadzane są wstępnie uformowane immunokompleksy, składające się z pokrytych antygenem nanocząstek magnetycznych związanych z przeciwciałami pierwszorzędowymi i przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą. Immunokompleksy zostają wychwycone w...

Test immunologiczny oparty na nanocząstkach magnetycznych przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

Tutaj demonstrujemy prostą metodę produkcji mikrokropelek o kontrolowanej wielkości, monodyspersyjnych, typu woda w oleju (W/O) za pomocą kapilarnego odśrodkowego urządzenia mikroprzepływowego. Metoda ta wymaga jedynie niewielkiej objętości próbki i umożliwia produkcję o wysokiej wydajności. Spodziewamy się, że ta metoda będzie przydatna do szybkich analiz biochemicznych i komórkowych.

Kapilarne odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do formowania mikrokropel monodyspersyjnych o kontrolowanej wielkości

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Poznaj metodę ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego z nanowłóknami tytanowymi. Technika ELISA osiąga czułość femtomolową w zaledwie 30 minut.

W pełni zautomatyzowane odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do ultraczułego wykrywania białek z krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów