Tworzenie połączeń nanofluidycznych poniżej 50 nm w chipie mikroprzepływowym PDMS poprzez proces samoorganizacji cząstek koloidalnych

Protokół ten demonstruje nowatorską i prostą technikę samoorganizacji koloidalnych nanocząstek krzemionki w celu stworzenia nanofluidycznego połączenia między dwoma mikrokanałami w polidimetylosiloksan. Membrana perełkowa o wielkości porów około 45 nanometrów, działająca jako membrana kationoselektywna, może być używana do elektrokinetycznego zagęszczania próbek DNA i białek. Przegląd:W pierwszym etapie urządzenie PDMS z nanopułapkami jest poddawane procesowi podwójnego formowania.

Po plazmowym połączeniu urządzenia ze szklanym podłożem, funkcjonalizowane powierzchniowo kulki krzemionki są wstrzykiwane do mikrokanalików w celu utworzenia samoorganizującej się membrany koloidalnej. Na koniec napięcie jest doprowadzane przez membranę za pomocą miernika źródła i dzielnika napięcia. Ubytek jonów i wzrost stężenia obserwuje się za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego z kamerą CCD.

Przygotowanie zawiesin cząstek koloidalnych krzemionki: Począwszy od kulek krzemionkowych o wielkości 300 nanometrów; bulion wirowy przez 30 sekund; Pobrać zawiesinę o objętości 600 mikrolitrów do probówki Eppendorfa i odwirować przez jedną minutę w stężeniu 2 600 g. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 400 mikrolitrów jednomilimolowego buforu fosforanu sodu, aby osiągnąć 15% stężenie robocze.

Wirować, aby osiągnąć jednorodną zawiesinę. Powtórz te same kroki, aby przygotować 500-nanometrowe kulki krzemionkowe. W przypadku 500-nanometrowych karboksylowych kulek krzemionkowych zważ 100 miligramów w 15-mililitrowej tubie Falcon.

Następnie przenieś 9,8 mililitra jednomolowego chlorku sodu w celu ponownego zawieszenia kulek. Energicznie wymieszaj rurkę. Odwróć rurkę kilka razy, aby przesunąć koraliki uderzone na dole.

Aby zmodyfikować ładunek powierzchniowy na kulkach, przygotowujemy dwa polielektrolity: PAH i PSS. 0,9% PSS przygotowuje się przez rozpuszczenie 180 miligramów PSS w 200 mililitrach, jednomolowym chlorku sodu. 0,4% WWA jest otrzymywany przez zmylenie 300 mikrolitrów roztworu podstawowego z 15 mililitrami jednomolowego chlorku sodu.

Odwiruj oba roztwory, aby upewnić się, że są całkowicie rozpuszczone. Aby zdeponować dodatnio naładowaną warstwę PAH, dodaj 200 mikrolitrów roztworu PAH do zawiesiny perełek. Wirować przez minutę i inkubować zawiesinę w rotatorze przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Aby zmyć niezwiązany WWA, należy odwirować zawiesinę o masie 1,801 g przez jedną minutę, aby wytrącić kulki. Usunąć supernatant. Odpipetuj od jednego do dwóch mililitrów wody do probówki, aby rozbić kulki.

Dodaj pozostałe osiem mililitrów wody, a następnie wiruj. Powtórz procedurę prania jeszcze cztery razy. Po piątym przemyciu i odwirowaniu wyrzucić supernatant i przywrócić kulki za pomocą 9,8 mililitra jednomolowego chlorku sodu.

W celu osadzenia ujemnie naładowanej warstwy PSS należy dodać 200 mikrolitrów roztworu PSS do zawiesiny kulek. Wirować przez jedną minutę i inkubować zawiesinę w rotatorze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj koraliki pięciokrotnie wodą DI, tak jak w przypadku powłoki PAH.

Po ostatnim praniu wyrzuć supernatant i ponownie zawieś kulki z 650 mikrolitrami jednomilimolowego buforu fosforanu sodu z 0,05% Tween 20. Przenieś zawiesinę stopki do rurki eppendorfa. W celu przygotowania 500-nanometrowych kulek aminowo-krzemionkowych powtórz tę samą procedurę, aby zdeponować pojedynczą ujemnie naładowaną warstwę PSS.

Produkcja chipa mikroprzepływowego PDMS: Aby wytworzyć krzemowy wzorzec, najpierw powlekaj fotorezystor o grubości jednego mikrometra z prędkością 4 000 obr./min na płytce krzemowej. Następnie użyj litografii projekcyjnej i reaktywnego trawienia jonowego, aby stworzyć płaskie nanokanały o głębokości 700 nanometrów i szerokości dwóch mikrometrów jako nanopułapki dla kulek. Następnie obrócić drugą warstwę fotorezystu z prędkością 2 000 obr./min i wykonać wyrównanie do wcześniej utworzonych nanopułapek.

Dodać mikrokanaliki za pomocą litografii kontaktowej i głęboko reaktywnego trawienia jonowego krzemu. Aby utworzyć warstwę antyadhezyjną, silanuj krzem główny w słoiku próżniowym z 50 mikrolitrami trichlorosilanu przez noc. Aby odlać formę PDMS, wymieszaj bazę PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1.

Wlej mieszankę na wierzch silikonowego wzorca. Umieść mistrza z PDMS w słoiku próżniowym, aby usunąć pęcherzyki powietrza i upiecz go w piekarniku w temperaturze 70 stopni C, aby usieciować PDMS. Po pieczeniu przez dwie godziny ostrożnie wyjmij płytę PDMS z wzorca krzemowego.

Potraktuj powierzchnię plazmą, aby stworzyć trwałe połączenie z pustą płytką krzemową. Przymocuj taśmę wzdłuż krawędzi, aby zaznaczyć linię podziału dla następnego kroku odlewania PDMS. Aby utworzyć warstwę antyadhezyjną, silanuj formę PDMS w słoiku próżniowym przez noc.

Odlew PDMS na wierzch formy PDMS i przenieś go do słoika próżniowego w celu odgazowania. Następnie upiecz go w piekarniku. Oderwij utwardzoną płytę PDMS od formy PDMS wzdłuż linii podziału oznaczonej taśmą.

Ostrożnie odetnij urządzenia i przebij otwory 1,5-milimetrowym dziurkaczem do biopsji w zbiornikach. Po oczyszczeniu powierzchni taśmą i IPA, plazma spaja urządzenie PDMS na szkiełku mikroskopowym o wymiarach 25 milimetrów na 75 milimetrów. Natychmiast po spajaniu plazmowym wstrzyknąć 10 mikrolitrów zawiesiny do wlotów czterech i sześciu kanałów doprowadzających kulki.

Po napełnieniu kanałów doprowadzających kulki zakryj wszystkie zbiorniki z wyjątkiem wylotów pierwszego i dziewiątego kanałów doprowadzających kulki. Suszyć urządzenie na powietrzu przez trzy godziny w temperaturze pokojowej i przechowywać w temperaturze czterech stopni C przed użyciem. Mikrofotografie urządzenia pokazują cząstki koloidalne gromadzące się wewnątrz górnego i dolnego kanału dostarczania kulek.

Obraz SEM pokazuje samoorganizujące się 300-nanometrowe cząstki koloidalne krzemionki uwięzione w układach nanopułapek, między próbką a kanałem buforowym. Napełnij wloty trzy i siedem kanałów buforowych 10 mikrolitrami jednomilimolowego buforu fosforanu sodu. Wypełnij piąty wlot kanału próbki 10 mikrolitrami 10-nanomolowej próbki DNA.

Zastosuj delikatne podciśnienie za pomocą odwróconej końcówki pipety na wszystkich wylotach, aby wypełnić kanały roztworami bez pęcherzyków powietrza. Dodać 10 mikrolitrów buforu fosforanu sodu do zbiorników drugiego i ósmego oraz 10 mikrolitrów próbki DNA do zbiornika 10, aby ustabilizować ciśnienie przez pięć minut. Eksperyment na stężenie elektrokinetyczne DNA:Połącz chip mikroprzepływowy z dzielnikiem napięcia podłączonym do miernika źródła.

Włóż przewody PT do zbiorników numer trzy, siedem, pięć i 10. Przyłóż napięcie do złącza nanofluidycznego. Najpierw zastosuj 30 woltów na zbiornikach piątym i dziesiątym, a następnie zmielone na zbiornikach 3 i 7.

Zmniejsz napięcie do 25 V w zbiorniku 10 po około 30 sekundach. Wyniki wstępnej koncentracji elektrokinetycznej: Kanał mikroprzepływowy jest wypełniony DNA o początkowym stężeniu 10 nanomolowych. Mikrofotografie poklatkowe pokazują tworzenie się obszaru zubożenia jonów, albo nanofluidycznych połączeń koloidalnych.

Obszar zubożenia jonów został zainicjowany w ciągu 10 sekund. Skoncentrowany czop DNA został wygenerowany, gdy napięcie zostało przyłożone do kanału próbki, podczas gdy kanały buforowe były uziemione. Przerywane linie zostały użyte do podświetlenia ścian kanału.

Współczynnik koncentracji około 1,700-krotności osiąga się w ciągu 15 minut przy użyciu 300-nanometrowej membrany koloidalnej. Średnia intensywność fluorescencji DNA wzrasta w funkcji czasu w nanoporowatej membrabie. Linie przerywane reprezentują poziom sygnału dla DNA 10-nanomolowego, 17-mikromolowego, dwumikromolowego i 10-mikromolowego.

Skoncentrowany czop jest generowany na nanoporowatej membranie 300-nanometrowych kulek krzemionkowych; 500-nanometrowe kulki krzemionkowe; 500-nanometrowe kulki aminy krzemionkowej, pokryte pojedynczą warstwą PSS; oraz 500-nanometrowe kulki karboksylowe z krzemionki, pokryte dwiema warstwami WWA i PSS. Wnioski: Korzystając z samoorganizującej się koloidalnej membrany krzemionkowej o szacowanej wielkości porów 45 nanometrów, wykazaliśmy polaryzację stężenia jonów w pobliżu złącza nanofluidycznego i zagęściliśmy próbkę DNA 1700 razy w ciągu 15 minut. W porównaniu z nanokanałami opartymi na krzemie, główną zaletą samoorganizującej się membrany koloidalnej jest możliwość przeprowadzenia funkcjonalizacji powierzchni całkowicie poza szczelnym urządzeniem mikroprzepływowym, w osobnej fiolce.

Uważamy, że takie podejście otwiera możliwość szybkiego wytworzenia platformy mikronanofluidycznej o łatwo regulowanych rozmiarach porów, poprzez kontrolowanie wielkości kulek, siły jonowej lub wartości pH roztworu buforowego w celu zbadania transportu jonowego i molekularnego w zakresie od 10 do 100 nanometrów.