Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pierwotnych hemogennych komórek śródbłonka z mysich tkanek embrionalnych poprzez sortowanie komórek aktywowane kwitnieniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia niezawodną i specyficzną izolację żywotnych hemogennych komórek śródbłonka z embrionalnych tkanek krwiotwórczych. Komórki te można następnie wykorzystać do późniejszej analizy i hodowli.

Hemogenne komórki śródbłonka, a także hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe, które można wyizolować za pomocą tej metody, zostaną następnie wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regulacji ich rozwoju i funkcji. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności z identyfikacją bocznej populacji komórek, która obejmuje hemogenne komórki śródbłonka oraz hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe. Procedury preparowania i skanowania tkanek embrionalnych zostaną zademonstrowane przez Kat Marcelo, byłą doktorantkę z mojego laboratorium.

A także Emily Grits, obecna badaczka kliniczna. I Jen Fang, obecnie post-doc. Zacznij od przetarcia wszystkich powierzchni roboczych 70% etanolem i umieszczenia absorbentu pod podkładką na powierzchni stołu laboratoryjnego.

Następnie umieść uśpioną łodygę na wznak na dolnej oduszce i obficie spryskaj dolną część brzucha 70% etanolem. Wykonaj długie poziome nacięcie prostopadłe do linii środkowej dolnej ściany brzucha. Następnie dwa dodatkowe poziome nacięcia o długości jednego cala rozciągające się w górę iw dół od środka poziomego nacięcia.

Następnie wypreparuj ścianę brzucha, aby w pełni odsłonić prawe i lewe rogi macicy zawierające wiele ciążowych zarodków. Za pomocą kleszczy chwyć jeden z dwóch rogów macicy i użyj nożyczek i kleszczy, aby oddzielić macicę od otaczającego mięśniówki macicy. I przenieś oba rogi na sterylną 60-milimetrową płytkę do hodowli tkankowej z polistyrenu na lodzie.

Umieść płytkę pod standardowym mikroskopem preparacyjnym i użyj kleszczy, aby oddzielić każdą jednostkę łożyskową płodu. Dla każdej jednostki wypreparuj warstwę mięśniową każdego worka macicy, odsłaniając leżący pod nim worek ciążowy i decidua. Aby wyizolować woreczek żółtkowy, delikatnie usuń jak najwięcej woreczka z zamkniętego zarodka.

Usunięcie reszty tkanki worka jarzmowego z zarodka właściwego w momencie embrionalnego pochodzenia naczyń witelinowych, jeśli jest to konieczne. Aby wyizolować aortę-gonadę-mezononerkę lub AGM, należy przeciąć zarodek poniżej serca i kończyn przednich i odrzucić klatkę piersiową i obszar głowy. Następnie przeciąć zarodek tuż poniżej tylnych kończyn, a następnie usunąć i wyrzucić tkankę ogona.

Następnie należy usunąć kończyny tylne i nadmiar tkanki brzusznej z pozostałego odcinka zawierającego AGM. Podczas zbierania każdego woreczka żółtkowego lub AGM połącz tkanki embrionalne w HPSS + w 1,5 mililitrowych probówkach na lodzie. Aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, odwiruj tkankę embrionalną i ponownie zawieś osad tkankowy w jednym mililitrze kolagenazy typu dwa rozcieńczonego w HPSS + inkubuj probówkę przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Mieszanie przez odwrócenie co pięć minut. Pod koniec inkubacji przepuść próbkę 10 razy przez pipetę P1000, aby delikatnie mechanicznie zdysocjować tkankę. Następnie ponownie odwiruj próbkę, ponownie zawieszając granulkę w jednym mililitrze lodowatego lodu HPSS+ Teraz przefiltruj próbkę przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikronów i policz komórki.

Po policzeniu ponownie zebrać komórki przez odwirowanie. I ponownie zawiesić osad w DMN o temperaturze 37 stopni Celsjusza + w stężeniu od jednego razy 10 do szóstego ogniwa na mililitr. Aby oznaczyć komórki do sortowania fac, należy poddzielić co najmniej 100 mikrolitrów komórek do 1,5 mililitrowych probówek i dodać werapamil rozcieńczony w 95% etanolu tylko do hoechst plus probówkę kontrolną werapamilu do końcowego stężenia 50 mikromolów.

Umieść wszystkie probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Następnie dodać hoechst tylko do probówek kontrolnych hoechst i hoechst plus verapamil, a probówkę z próbką do końcowego stężenia pięciu mikrogramów na mililitr i przywrócić probówki do 37 stopni Celsjusza na godzinę chronioną przed światłem, delikatnie mieszając probówki przez inwersję co 15 minut. Pod koniec inkubacji odwirować wszystkie próbki i rozcieńczyć granulki do stężenia jeden razy 10 do piątych komórek na mililitr w zimnym HPSS + Teraz dodaj fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała do odpowiednich probówek kontrolnych tylko z przeciwciałami, a do probówki z próbką do końcowego stężenia dwóch mikrogramów na mililitr przez 30 minut inkubacji na lodzie chronionym przed światłem.

Pod koniec inkubacji odwirować próbki i ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach lodowatego HPSS. Przecedzić próbki przez siatkowe nasadki filtracyjne z pięciomililitrowymi rurkami z polistyrenu o okrągłym dnie i umieścić probówki na lodzie chronionym przed światłem. Następnie natychmiast przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej.

Zgodnie ze standardową dyskryminacją żywych komórek i dubletów przez populację po stronie rozproszenia przodu i boku, zdarzenia populacji są wizualizowane na liniowym wykresie czerwonej czerwonej i niebieskiej kropki Hoechsta jako ramię w lewo przesunięte ze zdarzeń populacji niebocznej. Ta populacja uboczna ulega znacznemu zmniejszeniu dzięki leczeniu werapamilem. Komórki populacji niebocznej są identyfikowane jako gęste skupisko komórek przylegających do populacji bocznej.

Frakcja komórkowa populacji niebocznej zawiera niehemogenne komórki śródbłonka, które są dalej rozróżniane jako zdarzenia CD31 + CD45. Aby zidentyfikować hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe oraz hemogenne komórki śródbłonka, pobiera się bramki potomne z bocznej frakcji populacji, odsłaniając komórki CD45+ i CD45. Hemogenne komórki śródbłonka są następnie identyfikowane z komórek CD45 na różnicowym wykresie potomnym cKit w porównaniu z Flk1 jako zdarzenia podwójnie dodatnie.

Krwiotwórcze komórki macierzyste i progenitorowe są identyfikowane na podstawie frakcji CD45+ na oddzielnym poletku potomnym jako komórki Flk1-cKit+. Po tej procedurze można skonfigurować hodowle na bazie metylocelulozy, aby zapewnić funkcjonalną ocenę pojemności krwiotwórczej izolowanych komórek lub komórki mogą być natychmiast przetworzone do analiz ekspresji genów i białek. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około czterech do pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o ochronie próbek przed światłem i lodem, chyba że wskazano inaczej, aby zmaksymalizować żywotność komórek. Technika ta umożliwiła naukowcom zajmującym się biologią naczyń krwionośnych zbadanie hemogennej specyfikacji komórek śródbłonka i produkcji przez nie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych podczas rozwoju embrionalnego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować hemogenne komórki śródbłonka z mysich tkanek embrionalnych za pomocą cytometrii przepływowej.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.