Name: Elektroforeza w żelu mucynowo-agarozowym: Western Blotting dla glikoprotein o dużej masie cząsteczkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj elektroforezę w żelu agarozowym do analizy mucyn o dużej masie cząsteczkowej metodą Western blotting. Technika umożliwia separację i ilościową ocenę stanu polimeryzacji glikoprotein w próbkach bogatych w śluz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować dr Johnowi Sheehanowi i dr Lubnie Abdullahowi za ich wskazówki i mentoring, które były kluczowe w ukończeniu tej pracy. Prace te były wspierane przez fundusze z National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) i Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey jest wspierana przez stypendium NHMRC Early Career Research.

1. Przygotuj do Western Blotting w żelu mucynowym
<ol>
	<li>Przygotuj 1 litr 50x buforu TAE (Tris-acetate-EDTA).
	<ol>
		<li>Do 700 ml wody destylowanej (dH2O) dodać 242 g zasady Tris (0,4 M), 57,1 g lodowatego kwasu octowego (zważyć płyn) (0,2 M) i 14,61 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (50 mM).</li>
		<li>Dostosuj pH do 8,0 i uzupełnij objętość do 1 litra za pomocą dH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 10 ml buforu 10x ładującego.
	<ol>
		<li>Przygotować 5 ml 1x buforu TAE. Aby to zrobić, dodaj 5 ml glicerolu (50%), 25 mg błękitu bromofenolowego (0,25%) i 100 mg dodecylosiarczanu sodu (SDS) (1%).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 2 litry 20x buforu cytrynianu soli sodowej (SSC).
	<ol>
		<li>Do 1,5 litra dH2O dodać 350,6 g NaCl (3 M) i 176,4 g cytrynianu trisodowego (Na3C6H5O7) (0,3 M). Doprowadzić pH do 7,0 i uzupełnić objętość do 2 litrów za pomocądH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1 litr 1x bufor SDS TAE-0,1%.
	<ol>
		<li>Dodać 20 ml 50x TAE do 980 mldH2O. Dodać 1 g SDS, aby uzyskać 0,1% roztwór SDS-TAE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. TAE-SDS Preparat żelu agarozowego
<ol>
	<li>Wlać odpowiednią objętość (tj. 150 ml) 1x buforu SDS TAE-0,1% do kolby Erlenmeyera nadającej się do kuchenki mikrofalowej, aby uzyskać żel o grubości 5 - 7 mm. Dodać 0,8% (1,2 g) agarozy w proszku.</li>
	<li>Kolba mikrofalowa w odstępach 30 sekund z przerywanym wirowaniem aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy (zwykle 1 - 3 minuty). Podczas tego procesu używaj gorących padów ręcznych. Uważaj na erupcyjne gotowanie podczas wirowania.</li>
	<li>Pozostaw roztwór agarozy do ostygnięcia przez 5 - 10 minut. Uwaga: Roztwór agarozy będzie gotowy do nalewania, gdy dno kolby będzie można pozostawić na dłoni na 5 sekund.</li>
	<li>Przygotuj tacę do odlewania elektroforezy (10 x 15 cm), uszczelniając krawędzie taśmą i umieszczając dobrze osadzony grzebień.</li>
	<li>Powoli wlewaj roztwór agarozy do tacki odlewniczej, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Usuń bąbelki za pomocą końcówki do pipety. Poczekaj, aż żel ostygnie i całkowicie stężeje. Po zestaleniu powoli wyjmij grzebień, aby uniknąć zapadania się studzienek przez zasysanie i usuń taśmę z krawędzi tacy.</li>
	<li>Umieść żel agarozowy w pudełku z żelem i napełnij jednostkę do elektroforezy 1x buforem SDS TAE-0,1%, aż żel zostanie całkowicie pokryty.</li>
</ol>
3. Ładowanie próbki i separacja elektroforezą
Uwaga: W naszym laboratorium często używamy próbek zarówno od myszy, jak i ludzi, w tym płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF; oba gatunki), popłuczyn z ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (HBE) oraz próbek ludzkiej śliny i plwociny. Próbki mogą być denaturowane w 6 M moczniku po pobraniu lub przechowywane przez krótki okres czasu (6 godzin) poprzez dodanie inhibitora koktajlu proteinazy. 
<ol>
	<li>Przygotować próbki do obciążenia, dodając do każdej próbki 10% barwnika ładującego (tj. 30 μl próbki i 3 μl barwnika). Homogenizować próbki, pipetując w górę i w dół. Krótko odkręć rurki z prędkością 5,000 obr./min, aby zebrać kropelki.</li>
	<li>Ostrożnie załaduj równą objętość próbek do studzienek.
	<ol>
		<li>Wstępnie zwilżone końcówki i/lub pipety wyporowe ułatwiają ładowanie próbek o dużej lepkości. Powoli odessać 80 - 90% roztworu próbki i barwnika (tj. 27 - 30 μl), aby uniknąć pęcherzyków pipetowania.</li>
		<li>Powoli załaduj na dno studzienek i stopniowo przesuwaj końcówkę pipety do góry. W przypadku próbek, które pozostają przymocowane do końcówki pipety, należy dozować pod kątem 45° i wydłużyć bezpośrednio nad studzienką lub delikatnie użyć boku studzienki do rozdrobnienia żylastego śluzu. Nie przeciążaj studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz elektrody z pudełka żelowego do generatora prądu do elektroforezy. Upewnij się, że elektrody są prawidłowo podłączone (tj. czerwony przewód jest podłączony do dodatniego wyjścia generatora), aby umożliwić przepływ ujemnie naładowanych mucyn w kierunku elektrody dodatniej.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 80 V przez 90 minut w przypadku żelu z pojedynczym grzebieniem lub 60 - 75 minut w przypadku żelu z podwójnym grzebieniem, aby zapobiec nakładaniu się dwóch rzędów.</li>
	<li>Wyłącz zasilanie generatora i odłącz elektrody od źródła zasilania.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij żel z pudełka na żel jedną ręką po obu stronach tacki odlewniczej, aby upewnić się, że żel pozostaje na swoim miejscu.</li>
</ol>
4. Zmniejsz ilość żelu agarozowego, aby zapewnić efektywny transfer mucyny
<ol>
	<li>Ostrożnie umieść żel płasko w szklanym pojemniku. Przepłukać żel dH2O, aby usunąć ślady buforu TAE-SDS.</li>
	<li>Przygotować 1 litr 4x buforu SSC, dodając 200 ml 20x SSC do 800 ml dH2O. Przygotować 200 ml 10 mM roztworu 4x SSC ditiotreitolu (DTT), dodając 309 mg świeżej DTT do 200 ml 4x buforu SSC.</li>
	<li>Namocz żel w buforze DTT-4x SSC i pokrywie. Delikatnie kołysz się przez 20 minut (10 obrotów na minutę). Żel do płukania z buforem 4x SSC bez naziemnej telewizji cyfrowej.</li>
</ol>
5. Montaż bibuły próżniowej i transfer próbki do membrany nitrocelulozowej
<ol>
	<li>Przygotuj blotter próżniowy do przenoszenia.
	<ol>
		<li>Ostrożnie przyciąć membranę nitrocelulozową o wymiarach nieco szerszych niż żel (tj. 10 x 15 cm).</li>
		<li>Zwilż porowatą matę z dH2O i umieść ją gładką stroną do góry w bibułce.</li>
		<li>Zwilż membranę nitrocelulozową buforem 4x SSC bez DTT i umieść ją na środku porowatej maty.</li>
		<li>Przykryj porowatą matę gumową uszczelką, pozostawiając otwór uszczelki dokładnie wyrównany z membraną nitrocelulozową. Jeśli porowata mata jest nadal widoczna, ostrożnie wyreguluj membranę, aby upewnić się, że między uszczelką a membraną nie pozostała żadna szczelina.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie umieść żel agarozowy na wierzchu membrany. Upewnij się, że żel tworzy szczelne uszczelnienie z uszczelką, a dołki żelu są umieszczone na membranie w celu przenoszenia.
	<ol>
		<li>Unikaj tworzenia się pęcherzyków między membraną a żelem. Aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków, spryskaj membranę kilkoma kroplami buforu 4x SSC i przesuń żel od góry do dołu, aby wypłukać powstałe pęcherzyki. Unikaj przesuwania żelu po membranie, ponieważ białka natychmiast zaczną się wysuszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie przykryj żel 4x buforem SSC.</li>
	<li>Rozpocznij przenoszenie mucyny przez odsysanie.
	<ol>
		<li>Włącz blotter próżniowy i ustaw ciśnienie na 40 - 50 mBar. Dodawaj kilka kropel 4x buforu SSC na żel co 5 - 10 minut, aby zapobiec wysychaniu żelu. Uruchom transfer przez 90 minut. Opcjonalnie: Po zakończeniu zaznacz dołki ołówkiem w celu orientacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrzuć żel i odzyskaj membranę nitrocelulozową za pomocą plastikowej pęsety na krawędzi membrany.</li>
</ol>
6. Blokowanie i wykrywanie membrany
<ol>
	<li>Natychmiast przepłukać membranę 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Nie pozwól, aby membrana wyschła.</li>
	<li>Zanurz membranę w 50 ml 3% buforu blokującego mleko-PBS i umieść na kołysce w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Po inkubacji wyrzucić bufor blokujący.</li>
	<li>Zanurz membranę w 1% roztworze przeciwciał pierwszorzędowych mleko PBS. Inkubować błonę w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc na kołysce w temperaturze 4 °C. Po inkubacji odrzucić pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w stosunku 1:2 000 roztworu przeciwciała do buforu blokującego. Uwaga: W przypadku próbek pochodzących od myszy używamy UNC 222 królika anty-Muc5b i koziego białka anty-zielonej fluorescencji (GFP). W przypadku próbek pochodzących od ludzi stosujemy przeciwciała pierwotne anty-MUC5B i 45M1 anty-MUC5AC.</li>
	<li>Umyj membranę 3 razy PBS przez 10 minut na bujaku.</li>
	<li>Zanurz membranę w 1% roztworze przeciwciał drugorzędowych mleka-PBS. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:7,500 roztworu przeciwciała do buforu blokującego (np. 700 anty-królika i 680 anty-kozy) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na kołysce. Chronić przed światłem poprzez inkubację w nieprzezroczystym pojemniku. Roztwór przeciwciał drugorzędowych należy wyrzucić po 1 godzinie.</li>
	<li>Umyć membranę 3 razy PBS przez 5 min. Przepłukać membranędH2O, aby usunąć sól.</li>
	<li>Odczytaj membranę w systemie fluorescencji na podczerwień zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyperconcentration+and+increased+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li>
<li>Preciado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+Is+the+predominant+mucin+glycoprotein+in+chronic+otitis+media+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid.</a> Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+in+cervicovaginal+mucus+traps+HSV+and+prevents+vaginal+herpes+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).</li>
<li>Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+the+mucosal+barrier+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucins in the mucosal barrier to infection.</a> Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).</li>
<li>Thornton, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucus+glycoproteins+from+%27normal%27+human+tracheobronchial+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion.</a> Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).</li>
<li>Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpacking+a+gel-forming+mucin%3A+a+view+of+MUC5B+organization+after+granular+release%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).</li>
<li>Kesimer, M., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+analysis+of+mucin+core+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric analysis of mucin core proteins.</a> Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).</li>
<li>van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+enzyme+approach+for+the+characterization+of+glycan+modifications+on+the+C-terminus+of+the+intestinal+MUC2mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characterization+of+the+MUC5AC+mucin%3A+a+highly+oligomeric+glycoprotein+whether+isolated+from+cell+culture+or+in+vivo+from+respiratory+mucous+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions.</a> Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).</li>
<li>Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+glycoforms+of+the+MUC5B+mucin+in+human+respiratory+mucus.+Evidence+for+a+cysteine-rich+sequence+repeated+within+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule.</a> J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+molecular+intermediates+in+the+assembly+pathway+of+the+MUC5AC+mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin.</a> J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).</li>
<li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+mouse+model+demonstrates+the+protective+role+of+Muc5ac+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).</li>
<li>Livraghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+and+lung+pathology+due+to+mucosal+surface+dehydration+in+%7Bbeta%7D-epithelial+Na%2B+channel-overexpressing+mice%3A+role+of+TNF-%7Balpha%7D+and+IL-4R%7Balpha%7D+signaling%2C+influence+of+neonatal+development%2C+and+limited+efficacy+of+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment.</a> J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).</li>
<li>Martino, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER+stress+transducer+IRE1beta+is+required+for+airway+epithelial+mucin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).</li>
<li>Nguyen, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+beta-blockers+attenuates+inflammation+and+mucin+content+in+a+murine+asthma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).</li>
<li>Papakonstantinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations+are+associated+with+pro-inflammatory+degradation+of+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid.</a> Chest. , (2015).</li>
<li>Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+mucin+secretion+from+human+bronchial+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół Western blotting mucyny opisany w tym filmie łączy konwencjonalne techniki stosowane w biologii molekularnej do separacji i transferu dużych makrocząsteczek, takich jak DNA, ze zwykłymi technikami wykrywania białek, tj. immunoblottingiem. Ta sama technika może być zastosowana do badania biologii złożonych glikozaminoglikanów, takich jak rozkład wysokocząsteczkowego kwasu hialuronowego18. Chociaż technika ta może być stosowana w szerokim zakresie testów, skuteczne osuszanie agarozy Western blo...

Mucyny są zwykle wytwarzane przez powierzchnie błon śluzowych, które wyściełają jamy wystawione na działanie środowiska zewnętrznego (np. układu oddechowego, pokarmowego, dróg rodnych, powierzchni oka), a także przez narządy wewnętrzne (np. trzustkę, woreczek żółciowy, gruczoły sutkowe). Obecność tych glikoprotein utrzymuje nawodnienie powierzchni i tworzy fizyczną barierę przed patogenami. Chociaż produkcja mucyny jest niezbędna dla zdrowia błony śluzowej, nadmierna koncentracja mucyny i/lub nieprawidłowe właściwości śluzu mogą prowadzić do niedrożności przewodów, kolonizacji bakteryjnej i przewlekłego stanu zapalnego, co może spowodować nieodwracalne uszkodzenie tkanek. Podobną kaskadę zdarzeń obserwuje się w kilku chorobach, np. mukowiscydozie1, przewlekłym zapaleniu ucha środkowego2 i zakażeniu szyjki macicy i pochwy3. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć rolę mucyn w zdrowiu i chorobie oraz ustalić rutynowe protokoły identyfikacji białek.
Do tej pory zidentyfikowano 19 genów mucyn, które kodują duże łańcuchy polipeptydowe od 1 200 (np. MUC1) do 22 000 (np. MUC16) aminokwasów. Rodzinę genów mucyny można podzielić na dwa podtypy: mucyny związane z błoną, zaangażowane w sygnalizację komórkową i ekranowanie powierzchni, oraz mucyny tworzące żel, odpowiedzialne za lepkosprężyste właściwości żeli śluzowych. Mucyny związane z błoną są w większości monomeryczne i przyczepiają się do powierzchni komórki za pośrednictwem hydrofobowej domeny obejmującej błonę. W przeciwieństwie do tego, mucyny tworzące żel posiadają kilka domen podobnych do czynnika von Willebranda (vWF) i bogatych w cysteinę, które są niezbędne do tworzenia dynamicznych sieci polimerowych. Duże glkany są przyłączone do reszt seryny i treoniny rozmieszczonych w apomucynie. Te gęste oligosacharydy związane z O mogą przyczyniać się do 80% masy cząsteczkowej4. Wewnątrz- i międzycząsteczkowe wiązania dwusiarczkowe łączące monomery mucyny zapewniają integralność sieci żelu mucynowego. W wyniku ciężkiej glikozylacji i multimeryzacji mucyny należą do największych cząsteczek w świecie zwierząt i nie mogą być analizowane za pomocą standardowej elektroforezy żelowej przy użyciu konwencjonalnego żelu poliakrylamidowego SDS-PAGE i standardowych drabinek białkowych. Metody te rozpuszczają/rozdzielają białka o masie cząsteczkowej mniejszej niż 250 kDa, podczas gdy monomery mucyny mogą osiągać do 2 MDa w przypadku MUC16. Jednak drabinki białkowe o wysokiej masie cząsteczkowej mogą być używane do badania małych monomerów mucyny (tj. MUC1).
Do badania wielkości, budowy i interakcji mucyny można zastosować różne techniki. Tradycyjnie, biochemiczną charakterystykę mucyn uzyskuje się poprzez izolację mucyny poprzez izopikniczne wirowanie w gradiacji gęstości w buforze denaturującym, a następnie chromatografię wykluczającą wielkość i immunodetekcję (np. Blotting slotping)5. Dynamiczne i/lub wielokątowe rozpraszanie światła dostarcza informacji o stanie oligomerycznym próbek bogatych w mucynę1. Ponadto wirowanie strefowe w połączeniu z immunodetekcją i transmisyjną mikroskopią elektronową jest powszechnie stosowane do określania konformacji makrocząsteczkowej mucyn6. Spektrometria mas jest również wykorzystywana do ilościowego oznaczania mucyn, wykrywania rozszczepienia proteoliolitycznego i analizy składu oligosacharydów1,7,8. Takie techniki są kosztowne, czasochłonne i często wymagają dużych objętości i/lub wysokich stężeń próbki. Opisana tu metodologia, tj. separacja mucyny za pomocą elektroforezy, jest powtarzalna, tania i może być stosowana w badaniach wysokoprzepustowych w celu zapewnienia względnej kwantyfikacji mucyny i zbadania składania polimerów. Jednak ten test wymaga przeciwciał mucyny o wysokim powinowactwie i swoistości, które mogą nie być dostępne dla rzadkich mucyn (np. MUC19) lub niektórych gatunków (np. świni, fretki).
Western blotting agarozy jest odpowiedni do rozpoznawania szerokiej gamy próbek bogatych w mucynę o stężeniach od 50 μg/ml (np. płukanie komórek) do 5 mg/ml (np. plwocina). Test ten został wprowadzony w latach 90. i był wykonywany tylko w kilku specjalistycznych laboratoriach9,10. Początkowo technika ta pomogła zidentyfikować subpopulacje monomerów mucyny w ludzkich wydzielinach oddechowych11,12 i potwierdziła proces oligomeryzacji w komórkach kubkowych, który polega na tworzeniu dimerów w retikulum endoplazmatycznym, a następnie multimeryzacji dimerów w aparacie Golgiego13. Niedawne wytworzenie przeciwciał poliklonalnych przeciwko mysim mucynom ułatwiło badania na małych modelach zwierzęcych (np. z niedoborem mucyny, βENaC, mysimi modelami z OVA) i otworzyło nowe pole badań dla badań przedklinicznych testujących związki farmakologiczne mające na celu usuwanie śluzu z płuc14-17. W wyniku rosnącego zainteresowania biologią mucyny i wytwarzaniem nowych, bardziej specyficznych przeciwciał mucynowych, opisano w niniejszym artykule metodologię rozdzielania mucyn za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, transferu próżniowego do nitrocelulozy i detekcji dwukolorowej fluorescencji w podczerwieni.

<table><tbody><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T6060-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Lodowaty Kwas Octowy</td><td>Sigma</td><td>ARK2183-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-100g</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Sigma</td><td>114391-5g</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SDS (Dodecyl Siarczan Sodu)</td><td>Sigma</td><td>L6026-50g</td><td>50 g</td></tr><tr><td>20x bufor SSC (cytrynian soli sodu)</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>1 L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>cytrynian trisodowy (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma</td><td>W302600-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>10 mM DTT (ditiotreitol)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Mleko w proszku</td><td>Saco</td><td></td><td>Instant beztłuszczowe mleko w proszku</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS)</td><td>Gibco lifetechnologies</td><td>14200-025</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne kozie anty-GFP (próbki myszy)</td><td>Przeciwciała i testy Rockland</td><td>600-101-215</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>UNC 222 Przeciwciało pierwszorzędowe anty-Muc5b królika (próbki myszy)</td><td>UNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwotne H300 anty-MUC5B (próbki ludzkie)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20119</td><td>200 i #956; g</td></tr><tr><td>45M1 Przeciwciała pierwotne anty-MUC5AC (próbki ludzkie)</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td>100 &#956; g</td></tr><tr><td>Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32213</td><td>0,5 mg</td></tr><tr><td>Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68022</td><td>0,5 mg</td></tr><tr><td>Żel do elektroforezy i taca odlewnicza</td> Systemy <td></td><td></td><td>separacji sowy</td></tr><tr><td>Skrzynka zasilająca</td><td>Biorad</td><td>Model 200/20</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła membranowa</td><td>Amersham&nbsp;</td><td>10600016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Papier i membrana nitrocelulozowa&nbsp;</td><td>GE&nbsp;</td><td>10 439 196</td><td></td></tr><tr><td>Boekel/Appligene Bibuła próżniowa 230 v</td><td>Expotech USA</td><td>230600-2</td><td></td></tr><tr><td>System fluorescencji na podczerwień Odyssey</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elektroforeza w żelu mucynowo-agarozowym: western blotting dla glikoprotein o dużej masie cząsteczkowej

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucyny, silnie glikozylowane białka wyściełające powierzchnię błony śluzowej, ewoluowały jako kluczowy składnik wrodzonej obrony, chroniąc nabłonek przed atakującymi patogenami. Główną rolą tych makrocząsteczek jest ułatwianie wychwytywania i usuwania cząstek, przy jednoczesnym wspomaganiu smarowania błony śluzowej. Podczas syntezy białek mucyny ulegają intensywnej O-glikozylacji i multimeryzacji, co radykalnie zwiększa masę i wielkość tych cząsteczek. Te modyfikacje potranslacyjne mają kluczowe znaczenie dla lepkosprężystych właściwości śluzu. Ze względu na złożony biochemiczny i biofizyczny charakter tych cząsteczek, praca z mucynami wiąże się z wieloma wyzwaniami, których nie można pokonać konwencjonalnymi metodami analizy białek. Na przykład ich wysoka masa cząsteczkowa zapobiega migracji elektroforetycznej przez zwykłe żele poliakrylamidowe, a ich lepki charakter powoduje przyleganie do eksperymentalnych rurek. Jednak badanie roli mucyn w zdrowiu (np. Utrzymanie integralności błony śluzowej) i chorobach (np. Nadmierna koncentracja, śluzówka, rak) zyskało ostatnio zainteresowanie, a mucyny są badane jako cel terapeutyczny. Lepsze zrozumienie produkcji i funkcji makrocząsteczek mucyny może doprowadzić do opracowania nowych metod farmaceutycznych, np. inhibitorów egzocytozy granulek mucyny i/lub środków mukolitycznych. Dlatego spójne i wiarygodne protokoły badania biologii mucyny mają kluczowe znaczenie dla postępu naukowego. W tym miejscu opisujemy konwencjonalne metody rozdzielania makrocząsteczek mucyny za pomocą elektroforezy przy użyciu żelu agarozowego, przenoszenia białka do błony nitrocelulozowej i wykrywania sygnału za pomocą przeciwciał specyficznych dla mucyny, a także czytnika żelu fluorescencyjnego na podczerwień. Techniki te mają szerokie zastosowanie do oznaczania ilościowego mucyny, multimeryzacji oraz do testowania wpływu związków farmakologicznych na mucyny.

Przedstawiamy reprezentatywne wyniki ekspresji mucyn po elektroforezie w żelu agarozowym w płyku z przemywania pęcherzyków płucnych (BALF) pobranym z płuc myszy (Rysunek 1). W tym przykładzie wykorzystaliśmy żel agarozowy do wykazania zwiększenia produkcji mucyn po zastosowaniu IL-13 w modelu mysim Tg-Muc5ac. Western blot stanowi wizualną reprezentację ekspresji mucyn, która może zostać wykorzystana do ilościowej analizy natężenia sygnału prążków multimerów lub monomerów ...

Mucyny to glikokoniugaty o dużej masie cząsteczkowej, o rozmiarach od 0,2 do 200 megadaltonów (MDa). Ze względu na swój rozmiar mucyny nie przenikają do konwencjonalnych żeli poliakrylamidowych i wymagają większych porów do separacji. Zapewniamy szczegółowy protokół elektroforezy w żelu agarozowym mucyny w celu oceny względnej kwantyfikacji i zbadania składania polimerów.

Elektroforeza w żelu mucynowo-agarozowym: Western Blotting dla glikoprotein o dużej masie cząsteczkowej


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Ogólnym celem tej techniki western blottingu dla glikoprotein o wysokiej masie cząsteczkowej jest elektroforetyczne rozdzielenie mucyn zawartych w próbkach bogatych w śluz. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii mucyn, takie jak badanie stanu polimerycznego w odniesieniu do stężeń konkretnych mucyn pozyskanych z różnych powierzchni błon śluzowych. Główną zaletą tej techniki jest łatwość jej wdrożenia, stosunkowo niskie koszty oraz minimalne wymagania dotyczące wyposażenia laboratoryjnego.Procedurę tę zaprezentuje Sophia Samir, specjalistka ds. badań z mojego laboratorium. Eksperyment należy rozpocząć od przygotowania żelu. Do kolby Erlenmeyera nadającej się do podgrzewania w kuchence mikrofalowej wlać 150 mililitrów buforu 1x TAE 0.1%SDS, aby przygotować żel o grubości sześciu milimetrów, a następnie dodać 1,2 grama agarozy w proszku.Podgrzewaj kolbę w kuchence mikrofalowej w 30-sekundowych odstępach, okresowo nią potrząsając, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Pozostaw roztwór agarozy do ostygnięcia na maksymalnie 10 minut. Następnie umieść tackę do odlewania żelu do elektroforezy o wymiarach 10 na 15 centymetrów w formie do odlewania żeli.Powoli

mucin-agarose-gel-electrophoresis-western-blotting-for-high-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł techniczny opisuje standardową procedurę western-blottingu z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu elektroforezy Mini-Gel NuPAGE firmy Invitrogen.

Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Ten film demonstruje procedurę separacji siarczanów heparanu wyizolowanych z tkanki płucnej myszy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika analityczna do wykrywania siarczanów heparanu o różnej długości łańcucha wyizolowanych z tkanki płucnej myszy

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Tutaj używamy dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność włókien podobnych do amyloidu o niejednorodnej wielkości i wykluczyć możliwość, że niejednorodność wielkości jest spowodowana dysocjacją włókien amyloidowych podczas procesu działania żelu.

Zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Ten protokół opisuje różne metody, które mogą pomóc w badaniu biologii ATG9A, w tym immunofluorescencję, po której następuje analiza obrazu, rozważania dotyczące przejściowej nadekspresji i badanie statusu glikozylacji ATG9A za pomocą western blot.

Obrazowanie ATG9A, wielozakresowego białka błonowego

Poznaj elektroforezę w żelu agarozowym do analizy mucyn o dużej masie cząsteczkowej metodą Western blotting. Technika umożliwia separację i ilościową ocenę stanu polimeryzacji glikoprotein w próbkach bogatych w śluz.

Elektroforeza w żelu mucynowo-agarozowym: Western Blotting dla glikoprotein o dużej masie cząsteczkowej

Przeglądaj więcej filmów