Name: Oznaczanie inicjacji biofilmu na komórkach zakażonych wirusem przez bakterie i grzyby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Poznaj metodę oceny przyczepności bakterii i grzybów do komórek HeLa zakażonych wirusem HSV. Technika umożliwia badanie interakcji między patogenami przy inicjacji biofilmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) oraz Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. Szczepy HSV i postępowanie z nimi
Uwaga: Rekombinowane, nierozprzestrzeniające się HSV-1(KOS) gL86 i HSV-2 (KOS) 333gJ- z zastosowaną aktywnością reporterową beta-galaktozydazy zostały dostarczone przez V. Twiari36,37.
<ol>
	<li>Użyć wirusa z jednej partii i przechowywać w temperaturze -80 °C w stosunku 1:1 zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i odtłuszczonym mlekiem do czasu użycia. Przed przechowywaniem partii wirusa należy oznaczyć stężenie wirusa za pomocą testu o-nitrofenylo-β-D-galaktopyranozydu (ONPG) i 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozydu (X-Gal).</li>
	<li>Określ żywotność wirusa i wielokrotność infekcji (MOI) przez barwienie X-Gal dla każdego testu eksperymentalnego przy użyciu testu reporterowego wnikania wirusa, jak opisano wcześniej (Figura 1)14.</li>
	<li>Rozcieńczyć wirusa (Opt-MEM) do pożądanego MOI. Utrwal monowarstwy (paraformaldehyd; 0,5 ml / studzienkę) przed barwieniem. Umieścić kontrole żywotności wirusa na oddzielnej płytce do mikromiareczkowania równolegle z płytkami do oznaczania wielomikrobiologicznego.</li>
</ol>
2. Obsługa komórek HeLa 299
<ol>
	<li>Rośnie w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w DMEM z 4,5 g / L glukozy, 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), gentamycyny (50 μg / ml) i L-glutaminy. Komórki pasażowe w 80% zbiegu z roztworem trypsyny (kwas etylenodiaminotetraoctowy, 0,53 M EDTA; 0,05% trypsyna; 5 ml / kolbę).</li>
</ol>
3. Obsługa C. albicans
Uwaga: C. albicans uzyskany z klinicznego źródła laboratoryjnego jest przechowywany w temperaturze -80 °C w odtłuszczonym mleku Remmel 2x pożywka.
<ol>
	<li>Hodowla zamrożonego bulionu na pożywce dekstrozy Sabouraud (37 °C). Po 24 godzinach subkultura C. albicans na pożywce Fungisel (37 °C; 48 godzin) do użycia.</li>
	<li>Generowanie form probówki zarodkowej (GT) (pobranie reprezentatywnych kolonii; 3 ml FBS; 3 godz.; 37 °C; Abs600, 0,3). Po inkubacji przemyć GT (HBSS; 2x; 4 000 x g). Umyty GT dodać do podgrzanego HBSS (37 °C; 0,32 Abs600). Formy GT powinny stanowić 99% obserwowanych komórek, jak określono za pomocą liczby hemocytometrów.</li>
	<li>Przygotuj zawiesiny wyjściowe z drożdży (YF), wybierając reprezentatywne kolonie grzybów (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs600). Policz liczbę form YF / ml pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Formy YF powinny stanowić 99% obserwowanych komórek, jak określono za pomocą liczby hemocytometrów.</li>
	<li>Przygotować wywar z grzybów roboczych (250 μl bulionu GT lub YF w 25 ml HBSS; 37 °C; 105 CFU/ml)</li>
</ol>
4. Obchodzenie się z S. aureus
<ol>
	<li> Przechowywać S. aureus ATCC 25923 (-80 °C; Mleko odtłuszczone Remmel 2x). Posiew na agarze z krwią owczą (5%; 37 °C; 24 godz.). Zebrać reprezentatywne kolonie i przenieść do pożywki z soli mannitolu w ciągu 2 dni dla stada (37 °C; 18 godzin).</li>
	<li>Zrobić zawiesinę rosołu S. aureus (3 ml HBSS; 1,32 Abs600 ;108 jtk/ml)
	<ol>
		<li>Przygotować wywar roboczy z S. aureus (100 μl bulionu w 25 ml HBSS; 105 CFU/ml).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zawiesiny Candida i S. aureus 
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę zawiesiny C. albicans i S. aureus (250 μl bulionu YF lub GT i 100 μl bulionu S. aureus w 25 ml HBSS).</li>
</ol>
6. Test biofilmu wielomikrobiologicznego
<ol>
	<li>Wysiewaj 96-dołkowe płytki z 200 μl 2 x 105 komórek HeLa/ml (85% poziom konfluencji). Płyty skalne (30 - 45 min; 37 °C) przed inkubacją (37 °C; inkubator 5% CO2 ; 18 godz.). Umyj monowarstwy (1x; Opt-MEM ), a następnie wysiewaj HSV (HSV-1 (KOS) gL86 lub HSV-2 (KOS) 33 gJ- w 100 μl Opt-MEM ; MOI 50 i 10). Inkubować płytki (3 godz.; 37 °C; 5% CO2 ). Używaj tylko jednego szczepu wirusa dziennie.</li>
	<li>Przemyć zainfekowane monowarstwy (1x; sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z Mg+2 i Ca+2; 100 μl). Zastąp PBS ciepłym HBSS, pozostawiając 25 μl w każdym dołku.
	<ol>
		<li>Dodać zawiesiny robocze YF, GT i/lub S. aureus (100 μl; stosunek docelowy do komórek = 5:1; n = 16), jak wskazano w tabeli 1. Inkubować płytki (statycznie; 30 min; 37 °C; 5% CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji odsysać po jednej kolumnie na raz, natychmiast napełniając 300 μl PBS Mg+2 i Ca+2. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, a następnie dodać bufor do oznaczania radioimmunoprecypitacji (RIPA; filtr sterylizowany; 200 μl rozcieńczenia 1:50).</li>
	<li>Szybko rozcierać lizat komórek HeLa, a następnie umieścić 50 μl na solach mannitolu (MS) i/lub pożywkach grzybowych (F) (ryc. 2). Rozprowadzić lizat za pomocą szklanego pręta wygiętego pod kątem 90°. Inkubować płytki (18 godzin w temperaturze 37 °C). Ręcznie policz liczbę kolonii na płytce. Kontrola polega na przyleganiu S. aureus i/lub C. albicans do komórek HeLa niezakażonych HSV.</li>
</ol>
7. Badania obrazowe
<ol>
	<li>Umyć każde okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (12 mm; 50 ml acetonu w zlewce o pojemności 100 ml). Wysuszyć i wysterylizować szkiełka nakrywkowe (chusteczki Kimwipes; szklane szalki Petriego). Umieść suche sterylne szkiełka nakrywkowe w dołkach sterylnych 24-dołkowych płytek za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem alkoholu.</li>
	<li>Dodać komórki HeLa (1 ml; 5 razy większa objętość używana na płytki 96-dołkowe) do studzienek 24-dołkowych zawierających przemyte sterylne okrągłe szkiełka nakrywkowe. Dodać wirusa, bakterie i grzyby zgodnie z szablonem (tabela 2) w ilości 5-krotności objętości użytej dla płytek 96-dołkowych, a następnie inkubować i przetwarzać zgodnie z opisem w krokach 6.2.1-6.4 powyżej.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu utrwal komórki do mikroskopii, zalewając szkiełko metanolem i pozwalając mu odparować. Przechowuj płytki w temperaturze pokojowej do czasu zabarwienia.</li>
	<li>W przypadku mikroskopii w jasnym polu (1000x końcowe pierwotne powiększenie) napełnij studzienki zawierające szkiełka nakrywkowe utrwalone metanolem wodą dejonizowaną. Natychmiast zassać wodę. Przykryj każde szkiełko nakrywkowe fioletem krystalicznym Grams. Umyj szkiełka nakrywkowe wolne od niezwiązanych plam (woda dejonizowana). Wysuszyć szkiełka nakrywkowe na miejscu, a następnie przykleić je twardym środkiem montażowym do oznaczonego szkiełka (Rysunek 3).</li>
	<li>W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej (obiektyw 100x; 1 000x końcowe pierwotne powiększenie) umyj szkiełka nakrywkowe z metanolu, zasadniczo tak, jak opisano w kroku 7.4. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe w studzienkach.
	<ol>
		<li>Po wyschnięciu usuń szkiełka nakrywkowe i umieść je na oznaczonych szkiełkach. Następnie dodać odpowiednią ilość rozcieńczenia 1:20 przeciwciała wirusa opryszczki pospolitej typu 1 sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) + 2 gD, aby pokryć szkiełko nakrywkowe (1 - 5 μl).</li>
		<li>Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji umyć szkiełka nakrywkowe w 4 zmianach PBS.</li>
		<li>Po ostatnim praniu umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem na oznaczonym szkiełku. Barwienie 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI; komora wilgotnościowa; 37 °C przez 30 min). Po inkubacji umyć szkiełka nakrywkowe w 4 zmianach PBS, a następnie przymocować do oznakowanego szkiełka za pomocą twardego podłoża mocującego.</li>
		<li>Pozostawić podłoże montażowe do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Zbadaj szkiełka nakrywkowe pod obiektywem olejowym pod mikroskopem jasnego pola lub mikroskopem fluorescencyjnym z filtrami odcinającymi FITC i DAPI. Przeanalizuj obrazy co najmniej 50 pól (minimum 100 komórek na organizm) pod kątem kolokalizacji (ryc. 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecnie nie ma dostępnych informacji na temat złożonych interakcji między stałymi i półstałymi członkami mikrobiomu gospodarza, które krzyżują się z wieloma domenami taksonomicznymi, tj. prokariotycznymi, eukariotycznymi i wirusowymi. W związku z tym opracowaliśmy nowatorski system modelowy in vitro do badania inicjacji biofilmu przez S. aureus i C. albicans na komórkach HeLa 229 (HeLa) zakażonych HSV-1 lub HSV-2 38. System modelowania komórek HeLa ma wyjątkową zaletę. Wynik...

Ludzki mikrobiom obejmuje różnorodne organizmy z wielu królestw taksonomicznych, które dzielą regiony geograficzne w ciele. Przyleganie do powierzchni komórek jest niezbędnym pierwszym krokiem w tworzeniu biofilmu, który jest częścią procesu kolonizacji mikrobiomu. W skład mikrobiomu mogą wchodzić wirusy, które powodują przewlekłe i uporczywe infekcje. Przewlekłe zakażenie komórek tymi wirusami może powodować zmianę w przypuszczalnej dostępności receptorów. 1,2 Ponadto wnikanie do komórek przez patogeny wewnątrzkomórkowe może również wpływać na płynność/hydrofobowość błony gospodarza, co z kolei może zmieniać przyczepianie się innych członków mikrobiomu, w tym bakterii i grzybów. Aby zrozumieć interakcje, które mogą zachodzić między tymi wieloma patogenami, które kolokalizują się w tych samych regionach geograficznych ludzkiego gospodarza, musimy być w stanie zbadać interakcję patogenów, które reprezentują spektrum królestw taksonomicznych obecnych na powierzchni błony śluzowej.
Herpesviridae to rodzina mikrobów obecnych u 100% ludzi jako stali członkowie mikrobiomu3,4. Ponadto mogą być również uporczywie wydalane zarówno w obecności, jak i bez objawów. W szczególności wirus opryszczki pospolitej-1 i wirus opryszczki pospolitej-2 (odpowiednio HSV-1 i HSV-2) są stałymi członkami mikrobiomu w jamie ustnej gardła i drogach rodnych. U osób immunokompetentnych zarówno HSV-1, jak i HSV-2 powodują zapalenie dziąseł i jamy ustnej, a także opryszczkę narządów płciowych5-8. W tych miejscach HSV powoduje utajone zakażenie charakteryzujące się przewlekłym, uporczywym, bezobjawowym wydalaniem wirusa9. Wnikanie HSV do komórek powoduje zmiany w powierzchniowej ekspresji nektyn, siarczanu heparanu, tratw lipidowych i mediatora wnikania wirusa opryszczki / receptora czynnika martwicy nowotworu (HVEM / TNFr)10-25. Potencjalnie reprezentują one wspólne receptory dla niektórych bakterii i grzybów, np. S. aureus i C. albicans, które będąc patogenami oportunistycznymi, mogą również znajdować się jako członkowie mikrobiomu błony śluzowej jamy ustnej gardła 26,27. W obrębie gardła ustnego S. aureus i C. albicans zajmują dwa odrębne miejsca kolonizacji. U żywicieli z naturalnymi zębami błona śluzowa jamy ustnej jest wspólna dla HSV-1 i C. albicans, podczas gdy przednie nozdrza są zajęte przez S. aureus28. Jednak pomimo ustaleń in vitro, że S. aureusprzylega do komórek nabłonka jamy ustnej, 29,30 S. aureus jest rzadko izolowany z próbek jamy ustnej, gdy obecna jest normalna tkanka29,30. Niewiele wiadomo na temat nisz kokolonizacyjnych dróg rodnych poza wynikami klinicznymi, że S. aureus jest związany z tlenowym zapaleniem pochwy, charakteryzującym się zapaleniem narządów płciowych, upławą i dyspareunią, podczas gdy C. albicans powoduje zmiany błony śluzowej podobne do obserwowanych w jamie ustnej31-35. Tak więc, chociaż ci członkowie mikrobiomu jamy ustnej i narządów płciowych krzyżują się z królestwami taksonomicznymi, niewiele wiadomo na temat ich interakcji, ponieważ wpływa to na ich zdolność do inicjowania tworzenia biofilmu poprzez przyleganie do powierzchni komórki gospodarza5. Protokół ten został skutecznie zastosowany do określenia funkcjonalnych konsekwencji kokolonizacji/infekcji.

<table><tbody><tr><td>C.albicans</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>S.aureus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Agar z krwią owczą</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>Hela cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, z 4,5 g/L glukozy i L-glutaminą, bez pirogronianu sodu</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &micro; g / ml końcowe stężenie w kompletnym roztworze DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0,05% trypsyny, 0,53 M EDTA) 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% stężenie końcowe w kompletnym DMEM</td></tr><<tr><td>strong>Inne podłoże i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Zrównoważony roztwór soli Hanksa)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Barwienie</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1& 2, specyficzne dla gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri szalka 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Koła szkiełek nakrywkowych, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie inicjacji biofilmu na komórkach zakażonych wirusem przez bakterie i grzyby

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Badanie interakcji wielomikrobiologicznych w królestwach taksonomicznych, które obejmują grzyby, bakterie i wirusy, nie zostało wcześniej zbadane pod kątem tego, jak wirusowi członkowie mikrobiomu wpływają na późniejsze interakcje mikroorganizmów z tymi zakażonymi wirusem komórkami gospodarza. Współzamieszkiwanie wirusa z bakteriami i grzybami występuje głównie na powierzchniach błony śluzowej jamy ustnej i dróg rodnych. Komórki błony śluzowej, szczególnie te z uporczywymi przewlekłymi lub uporczywymi utajonymi infekcjami wirusowymi, mogą mieć znaczący wpływ na członków mikrobiomu poprzez zmianę liczby i rodzaju receptorów wyrażanych przez wirusa. Modyfikacja w architekturze błony komórkowej gospodarza skutkowałaby zmianą zdolności kolejnych członków normalnej flory i patogenów oportunistycznych do zainicjowania pierwszego etapu tworzenia biofilmu, tj. przylegania. W pracy opisano metodę ilościowego i wizualnego badania wpływu HSV na inicjację tworzenia (przylegania) do biofilmu S. aureus i C. albicans.

Poziom wiarygodności danych uzyskiwanych z systemu opisanego w niniejszym raporcie przedstawiono na Rysunku 2 a-f 38. Dzięki zastosowaniu tego systemu można określić modulację interakcji gronkowców i grzybów z komórkami zainfekowanymi wirusem oraz ich wzajemny wpływ na adhezję. tego rodzaju badania wymagają badania mikroskopowego interakcji, jak pokazano na Rysunkach 3 i 4 38, aby ustalić, czy interakcja polimikrobow...

Opisano tutaj metodę określania międzykrólestwowych asocjacji i konkurencji (bakteryjnej i grzybiczej) o przyleganie do monowarstw komórek HeLa zakażonych wirusem. Protokół ten można rozszerzyć na wiele kombinacji prokariontów, eukariontów i wirusów.

Oznaczanie inicjacji biofilmu na komórkach zakażonych wirusem przez bakterie i grzyby

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zmierzenie wpływu komórek uprzednio zainfekowanych HSV na późniejszą adhezję oportunistycznych patogenów bakteryjnych i grzybiczych, na przykład Staphylococcus aureus i Candida albicans. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące roli, jaką przewlekła infekcja wirusowa odgrywa w regulacji poszczególnych przedstawicieli mikrobiomu gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zbadania i ilościowego określenia interakcji wielu organizmów na etapie inicjacji tworzenia biofilmu, a mianowicie podczas adhezji.Zastosowania tej techniki obejmują kontrolę kolonizacji przez patogeny oportunistyczne, ponieważ warunek wstępny infekcji HSV z bezobjawowym wydzielaniem wirusa występuje u większości populacji ludzkiej. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat kontroli przylegania kolejnych drobnoustrojów przez HSV, można ją również zastosować w innych układach, takich jak infekcje CMV oraz adenowirusami. W pierwszej kolejności należy określić żywotność wirusa HSV1 lub HSV2 oraz wielokrotność infekcji (MOI) za pomocą barwienia x-gal dla każdego przeprowadzanego testu eksperymentalnego, wykorzystując test wnikania wirusa reporterowego.Rozcieńczyć wirusa do pożądanego MOI i umieścić kontrole żywotności wirusa w oddzielnej płytce mikrotitracyjnej równolegle z płytkami do analizy polimikrobowej. Następnie użyć 100 µL buforu paraformaldehydowo-glutaraldehydowego do utrwalenia monowarstw przed barwieniem. W celu utrzymania komórek HeLa, hodować je w DMEM z 4,5 g/L glukozy, 10% inaktywowanego termicznie FBS, 50 µg/L gentamycyny oraz L-glutaminą.Użyj roztworu trypsyny do pasażowania komórek przy 80% konfluencji. W celu przygotowania C.albicans, wyhoduj zamrożony stok na podłożu Sabouraud dextrose w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach przenieś subkulturę C.albicans na podłoże Fungicell i inkubuj przez 48 godzin przed użyciem.Wytwórz formy rurki zarodnika lub GT C.albicans, pobierając reprezentatywne kolonie fungicell i hodując je w 3 mL FPS w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Po inkubacji odwiruj kulturę z prędkością 4 000 ×g przez 10 minut. Następnie dwukrotnie przemyj komórki roztworem HBSS.Po policzeniu komórek za pomocą hemocytometru, dodać wypłukany GT do HBSS o temperaturze 37 °C, aż do uzyskania OD 600 wynoszącego 0,32. Aby przygotować zawiesiny stokowe form drożdżakowych (YF), wybrać reprezentatywne kolonie fungicell i wykorzystać je do zaszczepienia 3 ml HBSS. Hodować kultury do uzyskania OD 600 wynoszącego 0,32; za pomocą hemocytometru policzyć liczbę form YF na ml, które powinny stanowić 99% komórek obserwowanych pod mikroskopem.Przygotuj roboczy stok grzybowy, przenosząc 250 µL stoku GT lub YF do 25 mL HBSS o temperaturze 37 °C. Wynikiem jest stężenie 10⁵ CFU/mL. Aby przygotować SRES ATCC 25923, wyizoluj stok mrożony na agar z 5% krwią owczą i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.W ciągu dwóch dni należy wybrać reprezentatywne kolonie, przenieść je na podłoże z solami mannitolu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin. Aby przygotować zapas SRES, należy zawiesić reprezentatywne kolonie w 3 mL HBSS o temperaturze 37 °C do uzyskania OD 600 wynoszącej 0,132 lub 10⁸ CFU/mL. W celu przygotowania roztworu roboczego należy przenieść 100 µL zawiesiny zapasowej do 25 mL HBSS.Daje to dziesięć do piątej mocy CFU na mililitr. Początkowym, krytycznym krokiem przy stosowaniu tej metody do innych organizmów lub szczepów drobnoustrojów jest określenie właściwej liczby bakterii i grzybów do dodania, tak aby uzyskano wystarczającą liczbę kolonii do zliczenia. Aby przeprowadzić analizę polimikrobowego biofilmu, zasiać na płytki 96-dołkowe 200 µL komórek HeLa w stężeniu dwie razy dziesięć do 15. mocy na mililitr.Płytki należy inkubować na kołysarce w temperaturze 37 °C przez 30 do 45 minut, a następnie inkubować w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 18 godzin. Do przemycia monowarstw należy użyć roztworu One X optimum, a następnie zasiać je pojedynczym szczepem HSV. Należy testować tylko jeden szczep jednocześnie.Inkubować płytki w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 przez trzy godziny. Zakażone monowarstwy przemyć 100 µL roztworu PBS w temperaturze 37°C z dodatkiem magnezu i wapnia. Następnie zastąpić PBS roztworem HBSS w temperaturze 37°C.Pozostaw 25 µL HBSS w każdej studzience. Następnie dodaj roboczą zawiesinę YF, GT i/lub SRES i inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 30 minut. Po inkubacji odessaj zawartość płytki, kolumna po kolumnie.Natychmiast napełnij dopełnij studzienki 300 µL PBS z dodatkiem magnezu i wapnia. Po dwukrotnym powtórzeniu tego etapu płukania, dodaj do każdej studzienki 200 µL buforu lizującego RIPA filtrowanego sterylnie w rozcieńczeniu 1:50. Podczas pracy z innymi szczepami bakterii lub grzybów należy upewnić się, że zastosowane stężenie RIPA jest wystarczające do lizy komórek, a jednocześnie dopuszczalne dla testów żywotności drobnoustrojów.Szybko utrzyturuj lizat komórek HeLa i nanieś pipetą 50 µL na podłoże z solami mannitu oraz/lub podłoże Fungicell. Następnie, używając szklanej wymazówki zagiętej pod kątem 90 stopni, rozprzestrzen lizat po powierzchni płytki. Po inkubacji płytek przez 18 godzin, ręcznie oblicz liczbę kolonii na płytce.Kontrole stanowią SRES lub C.albicans przylegające do niezakażonych HSV komórek HeLa. Aby przeprowadzić badania obrazowe, każdą okrągłą szkiełko podstawowe należy przemyć acetonem przed sterylizacją. Następnie, używając pęsety wysterylizowanej alkoholem i płomieniem, należy umieścić suche, sterylne szkiełka w dołkach sterylnych płytek 24-dołkowych.Dodaj komórki HeLa do studzienek płytek zawierających szkiełka podstawowe. Następnie zainfekuj komórki wirusem. Po infekcji dodaj bakterie i grzyby zgodnie z szablonem, a następnie inkubuj i przetwórz komórki w sposób opisany wcześniej dla płytki 96-dołkowej.Po ostatnim przemyciu utrwal komórki do badania mikroskopowego, zalewając szkiełka podstawowe metanolem, a następnie pozwalając mu odparować. W przypadku mikroskopii w polu jasnym napełnij dołki zawierające utrwalone szkiełka wodą dejonizowaną. Natychmiast odessij wodę i dodaj wystarczającą ilość fioletu krystalicznego, aby pokryć każde szkiełko.Po przemyciu szkiełek podstawkowych zabarwionych fioletem krystalicznym wodą dejonizowaną, należy je wysuszyć w C2 przed przytwierdzeniem ich do opisanego preparatu za pomocą utwardzającego medium montażowego. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej, po wypłukaniu metanolu ze szkiełek podstawkowych, należy je wysuszyć w dołkach przed zamontowaniem ich na opisanych preparatach za pomocą utwardzającego medium montażowego. Należy dodać wystarczającą ilość przeciwciała anty-HSV1 plus 2GD sprzężonego z FITC w rozcieńczeniu od 1:10 do 1:20, aby pokryć szkiełko podstawkowe.Inkubować preparaty w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji przemyć szkiełka podstawowe czterokrotnie za pomocą PBS. Po ostatnim płukaniu umieścić preparaty z powrotem w komorze wilgotnościowej.Dodać dab B i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji przemyć preparaty cztery razy roztworem PBS. Pozostawić medium montażowe do utwardzenia na 24 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.Następnie, korzystając z obiektywu imersyjnego, w mikroskopie w polu jasnym lub fluorescencyjnym, należy zbadać co najmniej 50 pól pod kątem kolokalizacji. Tutaj przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu HSV na adhezję Staphylococcus i lub Candida albicans. Obecność HSV1 hamowała adhezję gronkowców do komórek HeLa.Obecność form strzępek Candida, ale nie form drożdżowych, przywróciła poziom adhezji gronkowców. Podobne wyniki odnotowano dla komórek HeLa zainfekowanych HSV2. Jak widać na tej rycinie, poziom adhezji form strzępek Candida jest znacznie wyższy dla komórek zainfekowanych HSV2 niż dla komórek zainfekowanych HSV1.Efekt odwrotny zmierzono dla HSV1 w porównaniu z HSV2 w odniesieniu do form drożdżakowych Candida. Wzorce przylegania określono za pomocą barwienia monowarstw fioletem krystalicznym w celu wizualizacji interakcji między bakteriami a grzybem. Następnie wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną, aby określić obecność HSV w relacji do pozostałych drobnoustrojów.W przypadku braku HSV, gronkowce oraz drożdżakowe i strzępkowe formy Candida kolokalizowały na komórkach HeLa. Jednakże, na komórkach zainfekowanych HSV zaobserwowano wyłącznie Candida. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w osiem do dziewięciu godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak różnicowe barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące różnicowej ekspresji receptorów powierzchniowych obecnych po wniknięciu wirusa do komórki. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z zakresu mikrobiomu ludzkiego do badania interakcji poinfekcyjnych w hodowlach tkankowych, a także w systemach hodowli organów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak opracować model interakcji polimikrobowych obejmujący różne królestwa taksonomiczne.Należy pamiętać, że praca z patogenami może być niezwykle niebezpieczna i wymagane jest stosowanie środków ostrożności, takich jak użycie szczepów wirusów nie rozprzestrzeniających się oraz technik barierowych.

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Źródło: Tay, S. B. i in. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Film demonstruje metodę ilościowego określenia biomasy biofilmu w patogennej bakterii, porównując nieleczone grupy kontrolne z próbkami objętymi enzymem gaszczącym kworum. Enzym zakłóca sygnalizację bakteryjną podczas wczesnej inkubacji, zmniejszając przyczepność komórek. Po płukaniu i dalszej inkubacji studnie kontrolne tworzą gęste biofilmy,...

Ilościowe tłumienie biofilmu indukowanego enzymami u bakterii patogennych

Źródło: Schlafer, S, i Frost Kristensen, M. Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzykrólestwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje hodowlę biofilmów Streptococcus mutans i Candida albicans w międzykrólestwowych warunkach w warunkach podobnych do jamy ustnej, aby modelować interakcje bakteria-grzyb, umożliwiając badanie synergii mikroorganizmów, adhezji pośredniczonej glukanem oraz kwasowej zjadliwości w patogenezie jamy ustnej.

Ustanowienie biofilmów międzykrólestwowych bakterii i grzybów do badania patogenezy jamy ustnej

Źródło: Miquel Guennoc, C. i inni. Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów włóknistych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje przygotowanie hodowli grzybów na poddanych leczeniu błon celofanowych, aby wspierać tworzenie kolonii i wzrost promieniowy. Następnie pokazuje uprawę i przygotowanie komórek bakteryjnych glebowych do testów interakcji. Na koniec ilustruje, jak komórki bakteryjne...

Ustanowienie współkultury grzybowo-bakteryjnej do tworzenia biofilmu

Ten film ilustruje inicjację tworzenia polimikrobiologicznego biofilmu na komórkach zakażonych wirusem przez bakterie i grzyby. Zakażenie wirusem opryszczki pospolitej utrudnia przyczepianie się bakterii do komórek, zapobiegając kolokalizacji bakteryjno-grzybiczej. Natomiast niezakażone komórki wykazują kolokalizację bakteryjno-grzybiczą i inicjację tworzenia biofilmu.

Test do określenia inicjacji biofilmu wielodrobnoustrojowego na komórkach zakażonych wirusem

Ten film opisuje metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii. Biofilmy bakteryjne często tworzą się na powierzchniach grzybów i obejmują liczne procesy interakcji bakteryjno-grzybiczych, takie jak współpraca metaboliczna, konkurencja lub drapieżnictwo.

Metoda przygotowania próbki w celu wizualizacji bakterii tworzących biofilm na strzępkach grzybów

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Ten protokół umożliwia czytelnikowi analizę powstawania biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych przy użyciu wieloaspektowego podejścia do uchwycenia dynamicznej natury biofilmów bakteryjnych poprzez ocenę przylegania, tworzenia matrycy substancji polimerowej zewnątrzkomórkowej i dyspersji.

Tworzenie biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych: techniki identyfikacji i kwantyfikacji

Ten protokół opisuje przygotowanie inokulum, kwantyfikację biofilmu na płytkach mikromiareczkowych za pomocą barwnika fioletu krystalicznego, liczenie żywotnych w biofilmach oraz wizualizację biofilmów Acinetobacter.

Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter

Poznaj metodę oceny przyczepności bakterii i grzybów do komórek HeLa zakażonych wirusem HSV. Technika umożliwia badanie interakcji między patogenami przy inicjacji biofilmu.

Oznaczanie inicjacji biofilmu na komórkach zakażonych wirusem przez bakterie i grzyby

Przeglądaj więcej filmów