Oznaczanie inicjacji biofilmu na komórkach zakażonych wirusem przez bakterie i grzyby

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zmierzenie wpływu komórek wstępnie zakażonych HSV na późniejsze przyczepianie się oportunistycznych patogenów bakteryjnych i grzybiczych, na przykład Staphylococcus aureus i Candida albicans. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli, jaką przewlekła infekcja wirusowa odgrywa w regulacji poszczególnych członków mikrobiomu gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że interakcja wielu organizmów może być badana i określana ilościowo na etapie inicjacji tworzenia biofilmu, czyli przylegania.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku kontroli kolonizacji oportunistycznych patogenów, ponieważ warunek wstępny zakażenia HSV z bezobjawowym wydalaniem jest obecny u większości populacji ludzkiej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w kontrolę HSV w przypadku późniejszego przyczepiania się drobnoustrojów, może być również stosowana do innych systemów, takich jak zakażenie CMV i adenowirusem. Na początek należy określić żywotność wirusa HSV1 lub HSV2 i wielokrotność infekcji lub MOI przez barwienie x-gal dla każdego testu eksperymentalnego przeprowadzanego przy użyciu testu wprowadzania wirusa reporterowego.

Rozcieńczyć wirusa do pożądanego MOI i umieścić kontrole żywotności wirusa na oddzielnej płytce do mikromiareczkowania równolegle z płytkami do testów wielomikrobiologicznych. Następnie użyj 100 mikrolitrów buforu aldehydu glutarowego paraformaldehydu, aby utrwalić monowarstwy przed barwieniem. Aby utrzymać komórki HeLa, hoduj je w DMEM z czterema pięcioma gramami na metr glukozy, dziesięcioprocentową inaktywowaną termicznie FBS, 50 mikrogramami na litr gentamizyny i l glutaminy.

Użyj roztworu trypsyny, aby przejść przez komórki przy 80-procentowej konfluencji. Aby poradzić sobie z C.albicans, hoduj zamrożony bulion na podłożu wokół zręcznej pożywki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach należy przeprowadzić subkulturę C.albicans na pożywce dla komórek grzybowych i inkubować przez 48 godzin przed użyciem.

Wygeneruj formy C.albicans w kształcie rurki rozrodczej lub GT, wybierając reprezentatywne kolonie komórek grzybowych i hodując je w trzech mililitrach FPS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji odwiruj kulturę z prędkością 4 000 g przez dziesięć minut. Następnie użyj HBSS, aby dwukrotnie umyć komórki.

Po użyciu hemocytometru do policzenia komórek, dodaj umyty GT do 37 stopni Celsjusza HBSS do OD 600 punktu zerowego trzy dwa. Aby uzyskać formę drożdży lub zawiesiny wyjściowej YF, wybierz reprezentatywne kolonie komórek grzybowych i użyj ich do zaszczepienia trzech mililitrów HBSS. Wyhoduj kultury do OD 600 punktu zerowego trzy dwa za pomocą hemocytometru, policz liczbę form YF na mililitr, co powinno wynosić 99 procent komórek obserwowanych pod mikroskopem.

Zrób działający wywar grzybowy, przenosząc 250 mikrolitrów bulionu GT lub YF do 25 mililitrów HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Daje to od dziesięciu do piątych CFU na mililitr. Aby przygotować SRES ATCC 25923, rozłóż zamrożony bulion na pięcioprocentowym agarze z krwią owczą i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

W ciągu dwóch dni zbierz reprezentatywne kolonie, przenieś do pożywki z solami mannitolu i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Aby wytworzyć zapas SRES, zawieś reprezentatywne kolonie w trzech mililitrach 37 stopni Celsjusza HBSS do OD 600 punktu zerowego, jednego, trzech, dwóch lub dziesięciu do ósmej CFU na mililitr. Aby przygotować zapas roboczy, przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny kolby na 25 mililitrów HBSS.

Daje to od dziesięciu do piątych CFU na mililitr. Pierwszym krytycznym krokiem przy stosowaniu tej metody do innych organizmów lub szczepów drobnoustrojów jest określenie prawidłowej liczby bakterii i grzybów do dodania, aby liczba kolonii była wystarczająca do policzenia. Aby przeprowadzić test biofilmu wielodrobnoustrojowego, wysiewaj 96-dołkowe płytki z 200 mikrolitrami dwa razy dziesięć do 15 komórek HeLa na mililitr.

Kołysz płytkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut, a następnie inkubuj w pięcioprocentowym dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Użyj One X optimum do umycia monowarstw, a następnie wysiew pojedynczym szczepem HSV. Testuj tylko jeden szczep na raz.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięcioprocentowym dwutlenku węgla przez trzy godziny. Używając 100 mikrolitrów PPS o temperaturze 37 stopni Celsjusza z magnezem i wapniem, umyj zainfekowane monowarstwy. Następnie użyj HBSS o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zastąpić PBS.

Pozostaw 25 mikrolitrów HBSS w każdym dołku. Następnie dodaj zawiesinę roboczą YF, GT i / lub SRES i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięcioprocentowym dwutlenku węgla przez 30 minut. Po inkubacji odsysać po jednej kolumnie płytki na raz.

Natychmiast napełnij studzienki za pomocą 300 mikrolitrów PBS magnezem i wapniem. Po dwukrotnym powtórzeniu tego kroku płukania dodaj 200 mikrolitrów w rozcieńczeniu od jednego do 50 wysterylizowanego przez filtr buforu do lizy RIPA do każdej studzienki. Podczas pracy z innymi szczepami bakterii lub grzybów należy upewnić się, że stężenie zastosowanego RIPA jest wystarczające do lizy komórek, ale nadal dopuszczalne do badania żywotności drobnoustrojów.

Szybko trytoratować lizat komórek HeLa i pipetować 50 mikrolitrów na solach mannitolu i/lub pożywce grzybowo-komórkowej. Następnie za pomocą szklanego pręta wygiętego pod kątem 90 stopni rozprowadź lizat po powierzchni płytki. Po inkubacji płytek przez 18 godzin ręcznie policz liczbę kolonii na płytce.

Kontrola składa się z SRES an lub C.albicans przylegających do niezakażonych komórek HeLa HSV. Aby przeprowadzić badania obrazowe, przed sterylizacją umyj w acetonie każde okrągłe szkiełko nakrywkowe. Następnie, za pomocą kleszczy sterylizowanych alkoholem i płomieniem, umieść suche sterylne szkiełka osłonowe w dołkach sterylnych płytek 24-dołkowych.

Dodać komórki HeLa do dołków płytek zawierających szkiełka nakrywkowe. Następnie zainfekuj komórki wirusem. Po infekcji dodać bakterie i grzyby zgodnie z szablonem oraz inkubować i przetwarzać komórki, jak pokazano wcześniej dla płytki 96-dołkowej.

Po ostatnim umyciu utrwal komórki do mikroskopii, zalewając szkiełka nakrywkowe metanolem, a następnie pozwalając mu odparować. W przypadku mikroskopii w jasnym polu należy napełnić studzienki zawierające stałe szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną. Natychmiast zassaj wodę i dodaj tyle gramów fioletu krystalicznego, aby pokryć każde szkiełko nakrywkowe.

Po umyciu krystalicznie fioletowych szkiełek nakrywkowych wodą dejonizowaną, należy je wysuszyć w C2, a następnie przykleić twardym środkiem montażowym do oznakowanego szkiełka. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej, po umyciu szkiełek nakrywkowych wolnych od metanolu, należy je wysuszyć w studzienkach przed zamontowaniem ich na oznakowanych szkiełkach z twardym środkiem montażowym. Dodać wystarczającą ilość rozcieńczenia jeden do 20 sprzężonego z FITC przeciwciała HSV1 plus 2GD, aby pokryć szkiełko nakrywkowe.

Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji użyć PBS do czterokrotnego umycia szkiełek nakrywkowych. Po ostatnim umyciu włóż szkiełka z powrotem do komory wilgotnościowej.

Dodaj dab B i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyć szkiełka czterokrotnie PBS. Pozostawić podłoże montażowe do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.

Następnie, pod obiektywem olejowym, w jasnym polu lub mikroskopie fluorescencyjnym zbadaj co najmniej 50 pól pod kątem kolokalizacji. Reprezentatywne wyniki dotyczące wpływu HSV na adherację Staphylococcus i/lub Candida albicans przedstawiono tutaj. Obecność HSV1 hamowała przyleganie gronkowca do komórek HeLa.

Obecność form rurki rozrodczej Candida, ale nie form drożdżakowych, przywróciła poziom przylegania gronkowca. Podobne wyniki uzyskano dla komórek HeLa zakażonych wirusem HSV2. Jak widać na tym rysunku, poziom przylegania form rurki rozrodczej Candida jest znacznie wyższy w przypadku komórek zakażonych HSV2 niż w przypadku komórek zakażonych HSV1.

Odwrotny efekt mierzono dla HSV1 i HSV2 na formy drożdży Candida. Wzorce przylegania określono za pomocą barwienia monowarstw fioletem krystalicznym w celu wizualizacji interakcji między bakteriami a grzybami. Następnie wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną do określenia obecności HSV w stosunku do innych drobnoustrojów.

W przypadku braku HSV, gronkowce oraz drożdże i formy rurki rozrodczej Candida kolokalizowały się na komórkach HeLa. Jednak tylko Candida obserwowano na komórkach zakażonych HSV. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu ośmiu do dziewięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak różnicowe barwienie przeciwciał fluorescencyjnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak różnicowa ekspresja receptorów powierzchniowych, które są obecne po wniknięciu do komórek wirusa. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrobiomem człowieka do badania interakcji postmikrobiologicznych w hodowlach tkankowych, a także w systemach hodowli narządów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować model interakcji wielodrobnoustrojowej, który obejmuje królestwa taksonomiczne.

Nie zapominaj, że praca z patogenami może być niezwykle niebezpieczna i wymagane są środki ostrożności, takie jak stosowanie nierozprzestrzeniających się szczepów wirusa i technik barierowych.