Name: Optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj optymalną produkcję lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność transdukcji podczas różnicowania w pseudowarstwowy nabłonek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Life Alliance Organ Recovery Agency Uniwersytetu w Miami za dostarczenie płuc. Dziękujemy również dr Lisie Künzi za preparat DNA użyty w eksperymentach pokazanych na rycinie 2B i 3-D, dr Ben Gerovac i Lisie Novak za wirusa mCherry użytego w eksperymentach na rysunkach od 3A do C. Dziękujemy również Gabrielowi Gaidoshowi z zakładu obrazowania na Wydziale Okulistyki Uniwersytetu w Miami.
To badanie było sponsorowane przez granty z NIH, Fundacji CF i Flight Attendant Medical Research Institute dla dr Matthiasa Salathe.

1. Etap 1: Kultura HEK 293T
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę z komórek HEK (określaną jako pożywka HEK), dodając 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny do zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) o wysokim poziomie glukozy.</li>
	<li>Posmaruj jedno 10 cm naczynie do hodowli tkankowych kolagenem I. Wymieszaj 30 μl kolagenu I w 2 ml wody destylowanej. Rozprowadzić mieszankę na szalce i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wyjmij mieszankę i pozostaw naczynie do wyschnięcia w komorze z przepływem laminarnym na 15 minut.</li>
	<li>Umieścić komórki HEK na pokrytym naczyniu o gęstości 1 x 106 komórek w 10 ml pożywki HEK i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy komórki HEK zlewają się w 50-60% (ryc. 1a, 2-3 dni po posiewie, przejdź do etapu 2. Wizualna ocena zbiegania jest wystarczająca. Kwantyfikacja nie jest wymagana. 
	Uwaga: Komórki HEK są hodowane w pożywkach HEK (patrz wyżej). Gdy osiągną zbieg, można je rozłupać (np. 1/5) lub zamrozić do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
2. Etap 2: Produkcja i koncentracja lentiwirusów (LV) w komórkach HEK
Uwaga: Protokoły powinny być wykonywane zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi i rządowymi w warunkach BSL-2+ (enhanced BSL-2) w USA.
<ol>
	<li>Transfekcja przy użyciu procedury wytrącania wapnia (lipofektamina i inne środki do transfekcji nie były tak skuteczne jak procedura wytrącania wapnia). W celu zapewnienia odtwarzalności zaleca się użycie komercyjnego zestawu do transfekcji, chociaż procedura jest modyfikowana w następujący sposób. Doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej. To jest dzień 0.</li>
	<li>Na każde 10 cm naczynie komórek HEK293 wymieszaj 4,5 μ5 μg otoczki DNA pMD2-VSVG, 7,5 μg opakowania DNA pMDLg/pRRE, 3,75 μg DNA pRSV-rev, 10 μg DNA lentiwirusowego wektora ekspresyjnego, 86 μl 2 M roztworu wapnia i sterylnej wody w 15 ml probówce wirówkowej do końcowej objętości 700 μl (te dwa ostatnie roztwory znajdują się w komercyjnym zestawie do transfekcji).</li>
	<li>Kroplami dodaj 700 μl 2x soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (HBS, dostarczanej w zestawie do transfekcji) podczas wirowania (w komorze laminarnej) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut (wykonaj krok 4 podczas oczekiwania).</li>
	<li>We wczesnym okresie inkubacji umieścić 5 μl mieszanki na szkiełku. Sprawdź kroplę pod mikroskopem z obiektywem 10X, powoli ustawiając ostrość w górę iw dół. Powinien być widoczny drobny osad, potwierdzający proces wytrącania fosforanu wapnia (ryc. 1b).</li>
	<li>Zatrzymaj wytrącanie po 30 minutach, dodając 10 ml pożywki z komórek HEK i pipetując w górę iw dół, aby wymieszać.</li>
	<li>Weź szalkę z komórkami HEK z kroku 2.1-2.5 i usuń pożywkę (dzień 0). Ostrożnie i powoli dodaj roztwór osadu z kroku 2.5 wzdłuż krawędzi naczynia.</li>
	<li>Następnego dnia (dzień 1) usunąć i wyrzucić pożywkę zawierającą osad i zastąpić ją 10 ml pożywki HEK. Sprawdzić, czy pod mikroskopem nie ma drobnego osadu: powinien on być widoczny w naczyniu w pustych przestrzeniach między komórkami (ryc. 1c i d).</li>
	<li>W 2 dniu zebrać pożywkę za pomocą strzykawki, przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,45 μm do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 3,8 ml 40% roztworu glikolu polietylenowego (PEG). Odwrócić 5 razy, aby wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny (aby wytrącił się osad PEG, ale nie dłużej niż 5 dni), aż wszystkie zbiory wirusa zostaną zakończone.</li>
	<li>Powtórz krok 2.8 w dniach 3 i 4. W dniu 4 nie zastępuj go pożywką HEK, ale odkaż 10% wybielaczem i wyrzuć naczynie.</li>
	<li>Odwirować wszystkie probówki zbiorcze (zwykle wszystkie grupy razem w dniu 5) przy 1 650 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wirusa. Usunąć i wyrzucić supernatant i ponownie wirować w temperaturze 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania i usunięcia wszelkich pozostałości supernatantu PEG.</li>
	<li>Zawiesić osad z każdej probówki w 200 μl pożywki do wzrostu nabłonka oskrzeli (BEGM) bez amfoterycyny B 8. Połączyć je razem i podzielić na porcje w ilości 200 μl. Wirusa należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Podać dodatkowe 10 μl w celu przeprowadzenia testu ELISA na obecność antygenu HIV-1 Gag (p24).</li>
	<li>Korzystając z dostępnego w handlu zestawu ELISA, wykonaj test antygenu p24 zgodnie z protokołem producenta. Test daje oszacowanie wirusa p24 w pg/ml.</li>
</ol>
3. Etap 3: Hodowla pierwotnych komórek HBE
<ol>
	<li>Umieścić komórki HBE w 10 ml pożywce BEGM (ze 100 μl amfoterycyny B, jeśli stosuje się pasaż 0 komórek w celu wyeliminowania ewentualnego zanieczyszczenia grzybiczego) o gęstości 1 x 106 komórek w pokrytym kolagenem I naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia usunąć pożywkę i zastąpić ją 10 ml BEGM (ze 100 μl amfoterycyny B dla pasażu 0 komórek) w sumie przez 4 dni. Wróć do inkubatora.</li>
	<li>Po 4 dniach należy stosować wyłącznie BEGM bez amfoterycyny B. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
	<li>Gdy komórki są zlewane w 80-90% (ryc. 2a; ~ 7 dni po posiewie), przystąp do transdukcji (zwróć uwagę na 3,5 w celu przygotowania przed transdukcją). Ponownie, wizualna ocena zbiegu jest wystarczająca. Nie jest wymagana żadna kwantyfikacja.</li>
	<li>Przed transdukcją należy pokryć przepuszczalne wkładki nośne roztworem kolagenu dożylnym rozcieńczonym w stosunku 1/10 sterylną wodą destylowaną. Dodać 200 μl do każdej wkładki i pozostawić do wyschnięcia na noc w komorze z przepływem laminarnym.</li>
</ol>
4. Etap 4: Transdukcja komórek HBE
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę, dodać 3 ml 0,1% trypsyny do 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (EDTA/PBS) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Sprawdź pod mikroskopem (obiektyw 10X), czy wszystkie komórki są odłączone. Jeśli nie, wróć do inkubatora na dodatkowe 5 minut.</li>
	<li>Po odłączeniu wszystkich komórek dodać 3 ml inhibitora trypsyny sojowej (SBTI 1 mg/ml), wymieszać i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Granulować komórki, wirując z prędkością 460 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml BEGM i przystąpić do liczenia.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki HBE (teraz przejście 1 lub P1) w stosunku 2 x 105 komórek na jedną 12 mm przepuszczalną wkładkę nośną w 400 μl BEGM (patrz tabela 2). Ekstrapoluj te liczby na podstawie ilości przepuszczalnych wkładek podporowych, które zostaną przetransportowane.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Powierzchnia</td>
			<td>powierzchnia</td>
			<td>Liczba komórek</td>
			<td>media</td>
			<td>Objętość (nośnik)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naczynie 10 cm</td>
			<td>52,7 cm2</td>
			<td>1 x 106</td>
			<td>BEGM (Organizacja Zarządzania Rybami</td>
			<td>Pojemność 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtr 12 mm</td>
			<td>1,13 cm2</td>
			<td>2 x 105</td>
			<td>BEGM (Organizacja Zarządzania Rybami</td>
			<td>400 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtr 24 mm</td>
			<td>4,52 cm2</td>
			<td>8 x 105</td>
			<td>BEGM (Organizacja Zarządzania Rybami</td>
			<td>800 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Ekstrapolacja mediów na liczbę komórek.
<ol start="5">
	<li>Stosując współczynnik wielokrotności infekcji (MOI) wynoszący 4, dodaj odpowiednią objętość wirusa do zawiesiny komórki.</li>
	<li>Dodać bromek heksadimetryny do końcowego stężenia 2 μg/ml.</li>
	<li>Dozować 400 μl mieszaniny (BEGM, komórki HBE, wirus i bromek heksadimetryny) na przepuszczalną wkładkę podporową do komory wierzchołkowej i dodać 1 ml samego BEGM do komory podstawno-bocznej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zawsze umieszczaj komórki HBE bez wirusa jako kontroli i przetestuj wybór puromycyny, jeśli ma to zastosowanie.</li>
	<li>Następnego dnia usuń pożywkę wierzchołkową i podstawno-boczną, przemyj PBS i zastąp obie komory mediami na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) 8.</li>
	<li>Kiedy komórki zlewają się, usuń płyn wierzchołkowy (znany jako ustanowienie granicy faz powietrze-ciecz). Kontynuuj wymianę pożywki (ALI) w dolnej komorze co drugi dzień, aż osiągną pełną dojrzałość; zwykle 3 do 4 tygodni później. 
	Uwaga: Jeśli wektor lentiwirusowy zawiera gen selekcyjny, taki jak puromycyna, komórki można wybrać, dodając puromycynę zgodnie z krzywą stężenia selekcyjnego. W przypadku komórek HBE stężenie 1 μg/ml zostało określone jako idealne do konsekwentnej selekcji transdukowanych komórek. Jednak stężenie to może się różnić dla innych komórek lub warunków i powinno być określone za pomocą krzywych zabijania. Dodawanie puromycyny można rozpocząć już jeden dzień po zastąpieniu pożywki pożywką ALI lub później (2-3 dni), aby umożliwić pełną ekspresję genu selekcyjnego. Pamiętaj, aby dodać puromycynę do jednej wkładki, która nie została wyprodukowana. Puromycynę można dodawać do momentu, aż komórki zostaną w pełni zróżnicowane.</li>
</ol>

<ol><li>Ding, B., Kilpatrick, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+production%2C+titration%2C+and+transduction+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons.</a> Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).</li>
<li>Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+development+of+improved+lentiviral+and+retroviral+vectors--design%2C+biosafety%2C+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors--design, biosafety, and production.</a> Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).</li>
<li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnol. 13, (2013).</li>
<li>Delenda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+optimization+of+packaging%2C+transduction+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression.</a> J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).</li>
<li>Gresch, O., Altrogge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+difficult-to-transfect+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).</li>
<li>Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+electroporation+conditions+in+primary+and+other+difficult-to-transfect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells.</a> J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).</li>
<li>Castillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+well-differentiated+human+airway+surface+epithelium+by+spheroid+and+lentivirus+vector-transduced+airway+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells.</a> J Gene Med. 6, 846-856 (2004).</li>
<li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFulcher%2C+ML+%22Methods+Mol+Med%22">Methods Mol Med</a>. 107, 183-206 (2005).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+in+tight+junction+formation+between+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells.</a> Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).</li>
<li>Bals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+well-differentiated+airway+epithelium+by+recombinant+adeno-associated+virus+is+limited+by+vector+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry.</a> J Virol. 73, 6085-6088 (1999).</li>
<li>Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+lentiviral+transduction+of+mouse+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).</li>
<li>Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+retrovirus+gene+transfer+efficiency+by+enhancing+receptor-independent+virus+adsorption+on+target+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes.</a> Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).</li>
<li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+Basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).</li>
<li>Manzanares, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+apical+large+conductance%2C+Ca2%2B-activated%2C+and+voltage-dependent+K%2B+channels+are+required+for+maintenance+of+airway+surface+liquid+volume%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume.</a> J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+cAMP-mediated+regulation+of+ciliary+motility+in+single+primary+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells.</a> J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).</li>
<li>Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta1+and+cigarette+smoke+inhibit+the+ability+of+beta2-agonists+to+enhance+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnol. 6, (2006).</li>
<li>Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+decreasing+the+toxicity+of+polyethylene+glycol+in+mammalian+cell+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization.</a> Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+adenylyl+cyclase+is+localized+to+cilia+and+contributes+to+ciliary+beat+frequency+regulation+via+production+of+cAMP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP.</a> J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).</li>
<li>Manzanares, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+Surface+Dehydration+by+Transforming+Growth+Factor+beta+%28TGF-beta%29+in+Cystic+Fibrosis+Is+Due+to+Decreased+Function+of+a+Voltage-dependent+Potassium+Channel+and+Can+Be+Rescued+by+the+Drug+Pirfenidone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone.</a> J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).</li>
<li>Manzanares, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-mediated+reduction+of+large-conductance%2C+Ca2%2B-activated%2C+voltage-dependent+K%2B+%28BK%29+channel+activity+in+airway+epithelial+cells+leads+to+mucociliary+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soluble+adenylyl+cyclase+form+targets+to+axonemes+and+rescues+beat+regulation+in+soluble+adenylyl+cyclase+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).</li>
<li>Ransford, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin+1+contributes+to+ATP+release+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół zapewnia blisko 100% wydajność transdukcji. Istnieją jednak kroki w trakcie procesu, które są ważne, aby osiągnąć ten cel. Na przykład, podczas procesu transfekcji, obecność osadów w mieszaninie transdukcyjnej (kropla) lub w naczyniu następnego dnia po transdukcji (rysunki 1b i d) są istotne dla dobrej transfekcji. Brak osadu lub obecność aglomeratów może być spowodowana pominięciem jednego z odczynników do transfekcji, problemem z pH lub złym preparatem plaz...

Rozwój wadliwych replikacyjnie, pseudotypowanych lentiwirusów (LV) dostarczył badaczom bezpiecznej i efektywnej metody dostarczania transgenów in vitro 1. Ze względu na ich długotrwałą ekspresję, te LV mogą być również wykorzystywane do dostarczania środków terapeutycznych in vivo 2,3. Wytwarzanie LV wymaga kotransfekcji ludzkich embrionalnych komórek nerki (HEK) z kilkoma plazmidami: wektorem transferowym, opakowaniem GAG/POL, opakowaniem rev i plazmidami glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G). Systemy pakowania trzeciej generacji są uważane za bezpieczniejsze niż systemy drugiej generacji, ponieważ gen rev jest kodowany na oddzielnym plazmidzie pakującym, co zmniejsza możliwość rekombinacji w celu wytworzenia lentiwirusa kompetentnego do replikacji. Chociaż systemy pakowania drugiej generacji dają pięciokrotnie wyższe całkowite jednostki transdukcji, podział oryginalnego genomu wirusa w celu stworzenia systemu trzeciej generacji zmniejszył poziom transdukcji tylko minimalnie 3,4.
Podczas gdy linie komórkowe mogą być łatwiej i skuteczniej transdukowane, badacze skupili się na komórkach pierwotnych, ponieważ są one bardziej reprezentatywne dla tkanek in vivo 5,6. Jednak komórki pierwotne są oporne na transdukcję. Chociaż donoszono o transdukcji w pełni zróżnicowanych komórek nabłonka dróg oddechowych, ogólna skuteczność nie przekroczyła 15% 7.
Opisany tutaj jest protokół, który pozwala na produkcję LV o wysokim mianie. Przedstawiono podejście krok po kroku w celu osiągnięcia prawie 100% skuteczności transdukcji do pierwotnych komórek HBE. Dokładniej rzecz ujmując, w protokole opisano optymalne warunki hodowli, które mają zasadnicze znaczenie dla powodzenia 3. Krótko mówiąc, komórki HEK 293T są transfekowane przy użyciu lentiwirusowego wektora ekspresyjnego pCDH z promotorem EF-1 napędzającym ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP) lub mCherry, białka czerwonej fluorescencji i systemu pakowania trzeciej generacji. Wnioski o niskiej wartości uwalniane do pożywek są zbierane od 24 do 72 godzin później. Cząsteczki wirusa są zagęszczane za pomocą glikolu polietylenowego (PEG), wygodnej i łatwej metody zagęszczania wirusa, przed oszacowaniem miana przy użyciu zestawu do testu immunoenzymatycznego (ELISA) antygenu p24. Następnie niezróżnicowane pierwotne komórki HBE są transdukowane w pożywce proliferacyjnej (pożywka do wzrostu nabłonka oskrzeli lub BEGM) 8, podczas przyłączania (po trypsynizacji) przy współczynniku wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącym 4, dodając bromek heksadimetryny i inkubując przez 16 godzin (przez noc). Komórki mogą się następnie różnicować. Ponieważ transgen wirusowy ulega długotrwałej ekspresji (przy użyciu odpowiedniego promotora, patrz dyskusja), ekspresja będzie utrzymywana przez cały okres różnicowania w pseudostratyfikowany nabłonek dróg oddechowych lub może być indukowana (przy użyciu indukowalnego promotora) po różnicowaniu.
Ten protokół jest bardzo interesujący dla badaczy, którzy chcą używać pierwotnych komórek HBE zamiast linii komórkowych, i może być dostosowany do innych trudnych do transdukcji typów komórek.

<table><tbody><tr><td>HEK293T/17 komórek</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>12306C</td><td>stosować w 10%</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>stosować przy 1x</td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td>rozcieńczyć 1:75 w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Calphos</td><td>Clontech</td><td>631312</td><td>Zestaw do transfekcji zawierający 2 M roztwór wapnia, 2x roztwór buforowany przez HEPES (HBS) i sterylny glikol polietylenowy H2O</td></tr><tr><td>8000</td><td>VWR scientific</td><td>101108-210</td><td>zapas 40%</td></tr> <tr><td>amfoterycyny B</td><td>Sigma</td><td>A9528</td><td>do stosowania przy 1x</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 12 mm</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C7521</td><td>rozcieńczyć 1:10 w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>zapas 2 mg / ml</td></tr><tr><td>Puromycyna (10.000x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11138-03</td><td>stosować przy 1x</td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 ELISA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro</td><td>System Biosciences</td><td>CD532A-2</td><td>lentiwirusowy wektor ekspresyjny</td></tr><tr><td>pMD2-VSVG</td><td>Opakowanie Addgene</td><td>12259</td><td>DNA</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Opakowanie Addgene</td><td>12251</td><td>Opakowanie DNA</td></tr><tr><td>pRSV-rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td>opakowanie DNA</td></tr></tbody></table>

optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Hodowla in vitro pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (HBE) przy użyciu warunków granicy powietrze-ciecz dostarcza użytecznego modelu do badania procesów różnicowania i funkcjonowania komórek dróg oddechowych. W ciągu ostatnich kilku lat powszechną praktyką stało się stosowanie wektorów lentiwirusowych do dostarczania transgenów. Chociaż istnieją doniesienia o transdukcji w pełni zróżnicowanych komórek nabłonka dróg oddechowych z niektórymi lentiwirusami niebędącymi typami HIV, ogólna skuteczność transdukcji jest zwykle mniejsza niż 15%. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia niezawodną i wydajną metodę wytwarzania lentiwirusów i transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli. Wykorzystując niezróżnicowane komórki nabłonka oskrzeli, transdukcja w pożywce wzrostu nabłonka oskrzeli, podczas gdy komórki przyczepiają się, z wielokrotnością czynnika infekcji 4, zapewnia wydajność bliską 100%. Protokół ten opisuje krok po kroku przygotowanie i stężenie wektorów lentiwirusowych o wysokim mianie oraz proces transdukcji. Omówiono w nim eksperymenty, które określiły optymalne warunki hodowli w celu uzyskania wysoce wydajnych transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli.

Rysunek 1 przedstawia kluczowe etapy oceny komórek i roztworów podczas procesu transfekcji. Rysunek 1a pokazuje optymalną konfluencję komórek HEK293T przed transfekcją w celu produkcji wirusa. Ważne jest, aby komórki były rozmieszczone równomiernie na całej powierzchni naczynia. Rysunek 1b ukazuje osad w kropli mieszaniny do transfekcji przy użyciu optyki w jasnym polu i obiektywu 10X. Im bardziej osad przypomina ziarna piasku niż aglomer...

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli są trudne do transdukcji. Protokół ten opisuje produkcję lentiwirusów i ich koncentrację, a także optymalne warunki hodowli niezbędne do osiągnięcia wysoce wydajnych transdukcji w tych komórkach poprzez różnicowanie do pseudostratyfikowanego nabłonka.

Optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest osiągnięcie wysokiej wydajności transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli przy użyciu lentiwirusów. Metoda ta może pomóc badaczom, którzy chcą wykorzystać pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli zamiast linii komórkowych, i może być dostosowana do innych typów komórek trudnych do transdukcji. Główną zaletą tej techniki jest wysoka wydajność transdukcji utrzymująca się podczas różnicowania w nabłonek rzekomo wielowarstwowy.Protokół należy przeprowadzić zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i rządowymi w warunkach wzmocnionego poziomu BSL-2 w USA. Po przygotowaniu pożywki dla komórek HEK w naczyniu powlekanym kolagenem I, zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć 10 ml pożywki do wysiania jednego miliona komórek HEK do powlekanego naczynia. Naczynie należy inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, aż komórki osiągną 50 do 60% konfluencji.Dzień ten zostanie uznany za Dzień 0. W Dniu 0, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu komercyjnego zestawu do transfekcji, doprowadzić odczynniki do temperatury pokojowej. Dla każdej płytki 10 cm z komórkami HEK293, w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, połąc

optimal-lentivirus-production-cell-culture-conditions-necessary-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Produkcja lentiwirusa

W niniejszej pracy opisujemy szczegółową metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantów tkanki dróg oddechowych człowieka, w tym ich różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz. Metoda ta zapewnia obfite źródło pierwotnych komórek do badania roli nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobach ludzkich płuc.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane z eksplantatów

Lentiwirusy są cennym narzędziem badawczym w analizie funkcji genów; jednak badacze mogą chcieć uniknąć produkcji pantropowych lentiwirusów kodujących znane lub podejrzewane onkogeny. Jako alternatywę przedstawiamy bezpieczniejszy protokół wykorzystania ektropowych lentiwirusów w komórkach ludzkich zmodyfikowanych w celu ekspresji ektropowego receptora mSlc7a1.

Transdukcja komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem w kompleksie z polimerem w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

Lentiwirusowe wektory ekspresyjne są najskuteczniejszymi nośnikami do stabilnej ekspresji różnych cząsteczek efektorowych lub konstruktów reporterowych w dzielących się i niedzielących się komórkach ssaków oraz w całych organizmach. Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący pakowania lentiwirusowych konstruktów ekspresyjnych w pseudowirusowe cząstki oraz transdukcji komórek docelowych przy użyciu tych cząstek.

Pakowanie konstruktów ekspresyjnych lentiwektorów opartych na HIV lub FIV oraz transdukcja pseudotypowanych cząsteczek wirusowych VSV-G

Tutaj używamy transdukcji retrowirusowej i transfekcji konkategomerycznej, aby stworzyć linię komórkową, która może wyrażać składniki wektora lentiwirusowego (LV) przy braku tetracykliny. Ten LV koduje GFP i jest pseudotypowany glikoproteiną SVGmu, która jest specyficzna dla receptora na komórkach dendrytycznych.

Linia komórkowa regulowana tetracykliną wytwarza wektory lentiwirusowe o wysokim mianie, które są specyficznie ukierunkowane na komórki dendrytyczne

Tutaj prezentujemy protokoły, które oferują elastyczną i strategiczną podstawę do wirusowego manipulowania komórkami prekursorowymi oligodendrocytów w celu nadekspresji interesujących białek w celu specyficznego zbadania ich roli w oligodendrocytach za pomocą modelu mielinizacji ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Tutaj przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli mysiego prekursora mieloidu linii komórkowej 32D/G-CSF-R, przeprowadzania infekcji wirusowych oraz przeprowadzania testów proliferacji i różnicowania. Ta linia komórkowa nadaje się do badania rozwoju komórek szpikowych oraz roli genów będących przedmiotem zainteresowania we wzroście komórek szpikowych i różnicowaniu neutrofilów.

Proliferacja i różnicowanie mysich komórek prekursorowych mieloidu 32D/G-CSF-R

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół szczegółowo opisuje badanie wczesnych interakcji między wirusowo zakażonymi komórkami nabłonka nosa a aktywacją komórek wrodzonych. Poszczególne podzbiory komórek odpornościowych można rozróżnić na podstawie ich aktywacji w odpowiedzi na infekcje wirusowe. Następnie można je dalej badać w celu określenia ich wpływu na wczesne odpowiedzi przeciwwirusowe.

Bezkontaktowy model kohodowli do badania aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych podczas infekcji wirusem układu oddechowego

Poznaj optymalną produkcję lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność transdukcji podczas różnicowania w pseudowarstwowy nabłonek.

Optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (Wideo) | JoVE Journal

Optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

Przeglądaj więcej filmów