Name: Pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę pomiaru kinetycznego i wizualizacji przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia śledzenie markerów komórek iPSC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Chadowi MacArthurowi za pomocne dyskusje.

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+monitoring+of+hiPSC+generation+and+differentiation+using+differential+expression+of+endogenous+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs.</a> PLoS One. 5, e11834(2010).</li>
<li>Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+strategies+in+fluorescent+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Combinatorial strategies in fluorescent probe development.</a> Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+a+negative+cell+surface+marker+for+pluripotent+stem+cell+identification+during+human+fibroblast+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming.</a> PLoS One. 9, e85419(2014).</li>
<li>Papp, B., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+to+pluripotency%3A+stepwise+resetting+of+the+epigenetic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape.</a> Cell Res. 21, 486-501 (2011).</li>
<li>Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+marker+mediated+purification+of+iPS+cell+intermediates+from+a+reprogrammable+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model.</a> J Vis Exp. , e51728(2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+fibroblast-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+support+undifferentiated+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth.</a> Stem Cells. 22, 972-980 (2004).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+live+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).</li>
<li>Naujok, O., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-evaluation+of+CD24-positivity+of+human+embryonic+stem+cells+differentiated+into+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).</li>
<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy [RHQ, JSTA, KS i UL] są pracownikami firmy Thermo Fisher Scientific, która produkuje niektóre z odczynników i przyrządów użytych w tym artykule.

Badanie to dostarcza strategii monitorowania i śledzenia procesu przeprogramowywania przy użyciu cytometrii przepływowej i analizy opartej na obrazowaniu w czasie rzeczywistym. Krytycznymi krokami w protokole są inicjowanie przeprogramowywania, mierzenie postępu przeprogramowywania w oparciu o ekspresję znaczników oraz monitorowanie przeprogramowania w czasie rzeczywistym. Można zastosować dowolną metodę przeprogramowania, ale tutaj skupiamy się na przeprogramowaniu ludzkich fibroblastów na podstawie Sendai. Zaletą tej m...

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące od pacjentów są obiecującymi narzędziami do terapii komórkowej i badań przesiewowych leków. Stanowią autologiczne źródło komórek do terapii. Ponadto obejmują one bardzo szeroki zestaw tła genetycznego, umożliwiając szczegółową analizę chorób genetycznych in vitro w zakresie wykraczającym poza to, co pozwoliłyby obecne linie embrionalnych komórek macierzystych (ESC). Ostatnie postępy doprowadziły do opracowania kilku metod generowania iPSC, w tym przeprogramowania za pomocą wirusa Sendai, plazmidów episomalnych lub mRNA 1,2. Warto zauważyć, że różne metody przeprogramowania wiążą się z różnymi poziomami wydajności i bezpieczeństwa oraz prawdopodobnie będą się różnić pod innymi względami, które wpływają na ich przydatność do różnych zastosowań. Ze względu na dostępność różnorodnych technologii przeprogramowywania ważne stało się opracowanie metod oceny procesu przeprogramowywania. Większość istniejących metod opiera się na jakościowej kontroli morfologii lub barwieniu barwnikami i przeciwciałami specyficznymi dla komórek macierzystych. Jedna z niedawno opracowanych metod wykorzystuje reportery fluorescencji lentiwirusowej, które są wrażliwe na miRNA specyficzne dla PSC lub zróżnicowane mRNA specyficzne dla komórek 3. Takie metody monitorowania ułatwiają wybór i optymalizację technik przeprogramowania dla różnych sytuacji. Na przykład CDy1 był używany jako sonda fluorescencyjna dla wczesnych iPSC w celu przeprogramowania modulatorów 4. Możliwość obserwowania i porównywania różnych eksperymentów związanych z przeprogramowywaniem ma również kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia samego procesu. Na przykład obecnie wiadomo, że niektóre typy komórek somatycznych są łatwiejsze do przeprogramowania niż inne5 i że komórki przechodzą przez stany pośrednie podczas przeprogramowania 6-8. Niestety, mechanizmy leżące u podstaw procesu przeprogramowania wciąż nie są do końca poznane, a co za tym idzie, dokładne różnice między metodami przeprogramowania również pozostają do zdefiniowania. W związku z tym metody monitorowania, oceny i porównywania zdarzeń związanych z przeprogramowaniem nadal mają kluczowe znaczenie dla dziedziny komórek macierzystych.
Metody opisane w tym protokole pozwalają na monitorowanie i ocenę procesu przeprogramowania oraz ilustrują, jak te techniki mogą być używane do porównywania różnych zestawów odczynników do przeprogramowywania. Pierwsze podejście polega na analizach cytometrii przepływowej z wykorzystaniem kombinacji przeciwciał przeciwko dodatnim i ujemnym markerom pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Drugie podejście łączy obrazowanie w czasie rzeczywistym i pomiar całkowitej konfluencji (procentowej powierzchni pokrytej przez komórki) i zbieżności sygnałów markerowych (procentowej powierzchni pokrytej sygnałami fluorescencyjnymi).

<table><tbody><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, GlutaMAXSplement, pirogronian</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana do embrionalnych komórek macierzystych, pochodzenie amerykańskie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Mysz (ICR) Inaktywowane fibroblasty embrionalne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>Białko czynnika przyczepu (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum KnockOut</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-merkaptoetanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, Typ IV, proszek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x), bez fenolu czerwony&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, hESC, matryca membrany podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinowane białko ludzkie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca frakcja V (7,5% roztwór)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Milipore 688001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przeprogramowania CytoTune-iPS Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przeprogramowania CytoTune-iPS 2.0 Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Prowadnice komory do liczenia komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC Ludzkie fibroblasty napletka, noworodki</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Dorosły ludzki fibroblast skórny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG Wariant komórek hESC hOct4-GFP Komórki reporterowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało SSEA-4, koniugat Alexa Fluor 647 (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało SSEA-4, koniugat Alexa Fluor 488 (eBioMC-813-70 (MC-813-70))Przeciwciało</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 (MC813-70)</td><td>Przeciwciało Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 (kl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 MAb anty-ludzka/mysia szczura (klon IM7), koniugat PE-Cy5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 Zestaw sprzężony do obrazowania żywych komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 MAb anty-ludzka/mysia szczura (klon IM7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700 (już niedostępny)</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H+L) Drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11007</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna Live Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Zestaw koniugatów do obrazowania żywych komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 Mysi anty-ludzki mAb (klon SN3), koniugat FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało mikroglobuliny beta-2, koniugat FITC (B2M-01)</td><td>Thermo Fisher Przeciwciało Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326, koniugat FITC (VU-1D9)</td><td>Przeciwciało Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Zestaw substratów czerwonej fosfatazy alkalicznej (AP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Axio Observer.Z1&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych FlowJo</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune Cytometr z akustycznym ogniskowaniem, niebiesko-czerwony laser</td><td>Thermo Fisher Zastosowanie naukowe</td><td>Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ Sorter komórek (488/561 nm)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Probówka z filtrem siatkowym</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, o wysokiej przejrzystości, nakrętka z uszczelką kopułkową</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 Kolba</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175 Kolba</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Miska 6-dołkowa Falcon</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Inkubator rolkowy Heracell CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofuge, 1,5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik</td><td></td> próbek HulaMixer <td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatyczne przeprogramowanie umożliwiło konwersję dorosłych komórek do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z różnych środowisk genetycznych i fenotypów chorobowych. Ostatnie postępy pozwoliły zidentyfikować bardziej efektywne i bezpieczne metody wprowadzania czynników przeprogramowujących. Istnieje jednak kilka narzędzi do monitorowania i śledzenia postępu przeprogramowywania. Obecne metody monitorowania przeprogramowania opierają się na jakościowej kontroli morfologii lub barwieniu barwnikami i przeciwciałami specyficznymi dla komórek macierzystych. Narzędzia do analizy progresji wytwarzania iPSC mogą pomóc w lepszym zrozumieniu procesu w różnych warunkach pochodzących z różnych źródeł komórkowych. 
To badanie przedstawia kluczowe podejścia do kinetycznego pomiaru progresji przeprogramowania za pomocą cytometrii przepływowej, jak również monitorowania w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania. Aby zmierzyć kinetykę przeprogramowania, przeprowadzono analizę przepływu w dyskretnych punktach czasowych przy użyciu przeciwciał przeciwko dodatnim i ujemnym markerom pluripotencjalnych komórek macierzystych. Połączenie wizualizacji w czasie rzeczywistym i analizy przepływu umożliwia ilościowe badanie przeprogramowania na różnych etapach i zapewnia dokładniejsze porównanie różnych systemów i metod. Analiza obrazu w czasie rzeczywistym została wykorzystana do ciągłego monitorowania fibroblastów podczas ich przeprogramowywania w systemie pożywki bez zasilania. Kinetykę powstawania kolonii mierzono na podstawie konfluencji w kanałach kontrastu fazowego lub fluorescencji po barwieniu żywym barwnikiem fosfatazy alkalicznej lub przeciwciałami przeciwko SSEA4 lub TRA-1-60. Wyniki wskazują, że pomiar konfluencji dostarcza półilościowych wskaźników do monitorowania postępu przeprogramowania.

Monitorowanie kinetyki reprogramowania za pomocą cytometrii przepływowej
CD44 jest markerem fibroblastów, podczas gdy SSEA4 jest markerem PSC 6,10. Zgodnie z tym wzorcem ekspresji, cytometria przepływowa fibroblastów BJ wykazuje populację SSEA4- CD44+, co w połączeniu z próbką niebarwioną ułatwia tworzenie bram kwadrantowych. Podczas przeprogramowania fibroblastów DF1 za pomocą wirusów S...

Protokół przedstawiony w tym badaniu opisuje metody monitorowania postępu przeprogramowania w czasie rzeczywistym poprzez pomiar kinetyczny dodatnich i ujemnych markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Protokół obejmuje również obrazową ocenę morfologii oraz ekspresję markera lub reportera podczas generowania iPSC.

Pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Ogólnym celem tych procedur jest wizualizacja i śledzenie postępów przeprogramowania komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie iPSC, takie jak wpływ rodzaju wykorzystanych tkanek somatycznych, zastosowanych technologii przeprogramowania oraz kombinacji macierzy i pożywek na kinetykę i wydajność przeprogramowania. Główną zaletą tej metody jest wykorzystanie markerów powierzchniowych komórek do badania przejść komórek somatycznych w iPSC, co umożliwia monitorowanie procesów przeprogramowania w czasie rzeczywistym.Siódmego dnia po transdukcji przemyć fibroblasty dwiema mililitrami DPBS na dołek i dodać 0,5 mililitra 0,5% EDTA o temperaturze 37°C do każdego dołka, inkubując przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37°C. Po zaokrągleniu się komórek zatrzymać reakcję, dodając do każdego dołka dwa mililitry podgrzanego do 37°C medium do fibroblastów, a następnie delikatnie pipetować medium po dnie każdego dołka, aby odczepić komórki. Przenieść fibroblasty z każdego dołka do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml i zebrać je poprzez wirowanie.Resuspender osady w dwóch mililitrach świeżego medium do fibroblastów o temperaturze 37 °C i policzyć komórki z każdego warunku hodowli. Następnie wysiać 1 × 10⁵ komórek do wcześniej przygotowanych studzienek z medium warunkującym, niezależnych od komórek karmicieli, w sześciostudzienkowej płytce do hodowli tkanek i inkubować przetransdukowane komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej przez noc. Następnego dnia wymienić medium w każdej studzience na medium odpowiednie dla danej aplikacji komórkowej.Następnie umieść płytkę w obrazowniku i skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rejestrowało ciągłe obrazy całych studzienek w kontraście fazowym oraz obrazy fluorescencyjne dla każdej studzienki co sześć do ośmiu godzin przez kolejne 14 dni. Po zakończeniu eksperymentu z reprogramowaniem przemyj studzienki raz dwoma mililitrami pożywki DMEM/F12 o temperaturze 37 °C. Odlej ciecz płuczącą i znakuj komórki jednym mililitrem na studzienkę odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych w świeżej pożywce DMEM/F12 przez 45 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.Po zakończeniu inkubacji przemyć komórki dwukrotnie pożywką DMEM/F12 o temperaturze 37 °C. Następnie odlać roztwór płuczący i przeprowadzić znakowanie komórek za pomocą 1 mL odpowiednich przeciwciał wtórnych w pożywce DMEM/F12 o temperaturze 37 °C przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu inkubacji przemyć komórki jeszcze dwa razy pożywką DMEM/F12.Następnie zastąp płyn do płukania w każdej studzience dwoma mililitrami świeżej pożywki DMEM/F12 o temperaturze 37 °C. Umieść naczynie w obrazowniku i uruchom oprogramowanie do obrazowania. Aby skonfigurować skanowanie w oprogramowaniu systemu obrazowania, najpierw wybierz pozycję tacki, która będzie używana, a następnie wybierz typ naczynia do zeskanowania.Następnie wybierz opcję Whole Well Imaging (obrazowanie całych studzienek), wzór skanowania wybranych studzienek oraz odpowiednie kanały fluorescencyjne do identyfikacji markerów powierzchniowych w czasie rzeczywistym. Następnie opisz eksperyment do zeskanowania oraz określ punkty czasowe i odstępy dla próbek skanowanych każdego dnia. Aby przeanalizować zestaw zeskanowanych eksperymentów, wybierz interesujący eksperyment i wybierz opcję Launch New Analysis Job (uruchom nową analizę).Następnie wybierz odpowiednią definicję przetwarzania dla danego rodzaju analizy, zgodnie z kanałami użytymi do obrazowania, na przykład PSC Phase Colony Count. Nadaj nazwę zadaniu analitycznemu. Następnie wybierz zakres czasu dla analizy oraz studzienki, które mają zostać przeanalizowane.Następnie uruchom proces analizy. Aby zmierzyć pożądane punkty czasowe reprogramowania z poszczególnych studzienek, przemyj wybraną studzienkę raz dwiema mililitrami DPBS. Następnie zastąp płuczkę jednym mililitrem podgrzanego do 37 °C 0,5% roztworu trypsyny-EDTA.Po pięciu minutach w temperaturze 37 °C wypłucz trypsynę z dna studzienki, aby rozbić komórki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Używając 3 ml DPBS, wypłucz pozostałe w studzience komórki i pobierz je do probówki 15 ml. Dodaj do komórek kolejne 10 ml DPBS i odwiruj je w wirówce.Resuspenduj osad w jednym mililitrze medium DMEM/F12 w celu policzenia komórek. Następnie rozcieńcz zawiesinę komórkową do stężenia 1×10⁶ komórek na mililitr i rozdziel po jednym mililitrze komórek do probówek dla odpowiedniej liczby próbek. Następnie oznakuj komórki za pomocą odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych w jednym mililitrze medium DMEM/F12 przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej, mieszając zawiesinę.Po zakończeniu inkubacji przemyć komórki dwukrotnie w pożywce DMEM/F12 w temperaturze 37 °C. Osady zawiesić w 1 mL DPBS i przenieść próbki do oddzielnych probówek do FACS. Pozyskać profile cytometrii przepływowej z płytek z przeprogramowanymi komórkami.Następnie przenieś pliki FCS na komputer i zaimportuj je do odpowiedniego oprogramowania analitycznego. Otwórz pierwszy plik kontrolny na wykresie rozproszenia forward scatter względem side scatter i ustaw skalę logarytmiczną na osi y. Następnie utwórz bramkę wielokątna wokół populacji żywych komórek.Następnie należy utworzyć wykres rozrzutu wysokości bocznego rozproszenia (side scatter height) dla żywych komórek i ustawić bramkę prostokątną w celu wykluczenia dubletów. Następnie należy wykorzystać te bramki do analizy plików z próbek doświadczalnych w odpowiednich kanałach fluorescencyjnych, aby zidentyfikować interesujące populacje w ich odpowiednich kwadrantach. Reprogramowanie fibroblastów BJ za pomocą wirusów Sendai generuje komórki SSEA4+CD44- w innym tempie niż reprogramowanie fibroblastów DF1, co wykazuje, że wczesne porównanie odsetka pluripotencyjnych komórek przypominających komórki macierzyste SSEA4+CD44- może być wykorzystane do śledzenia postępu reprogramowania.W przebiegu czasowym cytometrii przepływowej fibroblasty CD24-CD44+ i EpCAM-ujemne CD44+ tworzą populacje podwójnie ujemne, które następnie przekształcają się odpowiednio w CD24+CD44- oraz EpCAM-dodatnie CD44- pluripotencjalne komórki przypominające komórki macierzyste, co dodatkowo obrazuje postępy przeprogramowania. Obrazowanie w czasie rzeczywistym kultur poddanych przeprogramowaniu po ponownym wysianiu wykazuje stopniowe tworzenie kolonii, co odpowiada logarytmicznemu wzrostowi ich konfluencji i potwierdza końcową ekspresję markerów pluripotencjalnych dodatnich oraz fibroblastycznych ujemnych po zakończeniu procesu przeprogramowania. Ponadto zastosowanie genu reporterowego pozwala na pomiar konfluencji w kontraście fazowym, przy czym w przypadku konfluencji GFP zaobserwowano bardziej stopniowy wzrost w porównaniu do konfluencji całkowitej.Rzeczywiście, w tym reprezentatywnym eksperymencie konfluencja GFP w 19. dniu stanowiła mniej niż połowę całkowitej konfluencji odpowiadającej pełnemu przeprogramowaniu. Po opanowaniu, technika ta mogłaby zostać wykorzystana do wyjaśnienia informacji o zdarzeniach związanych z przeprogramowaniem oraz do śledzenia kinetyki przeprogramowania ludzkich fibroblastów. Metodę tę można by również zastosować do badania różnych wyjściowych tkanek komórek somatycznych, stosowanych technologii przeprogramowania oraz kombinacji pożywek i macierzy w celu wyjaśnienia przebiegu procesów przeprogramowania.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania monitorowania w czasie rzeczywistym oraz ekspresji markerów powierzchniowych komórek, aby móc śledzić proces przeprogramowania ludzkich fibroblastów w iPSC.

kinetic-measurement-real-time-visualization-somatic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

FIM to nowatorski, ekonomiczny system obrazowania przeznaczony do śledzenia małych poruszających się obiektów, takich jak C. elegans, planaria czy larwy Drosophila. Towarzyszący mu program FIMTrack został zaprojektowany tak, aby zapewnić szybką i wydajną analizę danych. Razem narzędzia te umożliwiają wysokoprzepustową analizę cech behawioralnych.

FIM Imaging i FIMtrack: dwa nowe narzędzia umożliwiające wysokowydajną i ekonomiczną analizę lokomocji

Przezczaszkowa stymulacja magnetyczna, elektromiografia i przechwytywanie ruchu 3D są powszechnie stosowanymi nieinwazyjnymi technikami badania funkcji nerwowo-mięśniowych u ludzi. W tym artykule opisujemy protokół, który synchronicznie próbkuje dane generowane przez wszystkie trzy z tych narzędzi wraz z unikalnym dodatkiem prezentacji bodźców rzeczywistości wirtualnej i informacji zwrotnych.

Wielofunkcyjny zestaw do badania kontroli motorycznej człowieka za pomocą przezczaszkowej stymulacji magnetycznej, elektromiografii, przechwytywania ruchu i rzeczywistości wirtualnej

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Prezentujemy nowatorski protokół połączonego obrazowania behawioralnego i neuroobrazowego, wykorzystujący projekcję wideo w czasie rzeczywistym w celu scharakteryzowania neuronalnych korelatów związanych z terapią lustrzaną w środowisku skanera rezonansu magnetycznego u osób po amputacji nogi z bólem fantomowym.

Projekcja wideo w czasie rzeczywistym w rezonansie magnetycznym w celu scharakteryzowania korelatów neuronalnych związanych z terapią lustrzaną w przypadku bólu fantomowego kończyn

Przedstawiono procedurę wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się jak myszy. Ulepszony reporter aktywności kinazy A, tAKARα, ulega ekspresji w neuronach korowych i jest dostępny do obrazowania przez okno czaszkowe. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej służy do wizualizacji aktywności PKA in vivo podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

Prezentujemy protokoły i metody analiz do budowy współadaptacyjnych interfejsów, które strumieniują, parametryzują, analizują i modyfikują sygnały ludzkiego ciała i serca w zamkniętej pętli. Ta konfiguracja łączy sygnały pochodzące z obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego osoby z zewnętrznymi bodźcami sensorycznymi, aby pomóc w śledzeniu zmian biofizycznych.

Sterowanie proxy w czasie rzeczywistym ponownie sparametryzowanych sygnałów peryferyjnych za pomocą interfejsu zamkniętej pętli

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę pomiaru kinetycznego i wizualizacji przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia śledzenie markerów komórek iPSC.

Pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów