Pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tych procedur jest wizualizacja i śledzenie postępu przeprogramowania komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub iPSC. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie iPSC, takie jak to, w jaki sposób kinetyka przeprogramowania i wydajność przeprogramowania są zmieniane przez użyte tkanki somatyczne, zastosowane technologie przeprogramowania oraz stosowane z nią kombinacje matryc i pożywek. Główną zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje ona markery powierzchni komórek do przyjrzenia się przemianom komórek somatycznych w iPSC, dzięki czemu można wykorzystać tę technologię, aby móc monitorować w czasie rzeczywistym zdarzenia przeprogramowania.

W siódmym dniu po transdukcji przemyj fibroblasty dwoma mililitrami DPBS na studzienkę i dodaj 0,5 mililitra 37 stopni Celsjusza 05% EDTA do każdej studzienki na trzy do pięciu minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki się zaokrąglą, zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch mililitrów pożywki fibroblastowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dołek i delikatnie pipetuj pożywkę na dnie każdej studzienki, aby usunąć komórki. Przenieś fibroblasty z każdej studzienki do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów i zbierz je przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osady w dwóch mililitrach świeżej pożywki fibroblastowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i policzyć komórki z każdego warunku hodowli. Następnie wysiewaj jedną komórkę razy 10 do piątej komórki do wcześniej przygotowanych, niezależnych od karmiciela studzienek kondycjonowanych na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej i inkubuj transdukowane komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez noc. Następnego dnia zastąp pożywkę w każdym dołku odpowiednim podłożem do aplikacji komórkowej.

Następnie umieść płytkę w imagerze i ustaw oprogramowanie tak, aby rejestrowało ciągłe obrazy kontrastu fazowego i fluorescencji dla każdej studzienki co sześć do ośmiu godzin przez następne 14 dni. Pod koniec eksperymentu przeprogramowania umyj studzienki jeden raz dwoma mililitrami pożywki DMEM/F12 o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyrzucić popłuczynę i oznaczyć komórki jednym mililitrem na studzienkę odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych w świeżej pożywce DMEM/F12 przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.

Pod koniec inkubacji umyj komórki dwukrotnie pożywką DMEM/F12 o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć płuczkę i oznacz komórki jednym mililitrem odpowiednich przeciwciał drugorzędowych w pożywce DMEM/F12 o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć komórki jeszcze dwa razy pożywką DMEM/F12.

Następnie zastąp mycie w każdej studzience dwoma mililitrami świeżego podłoża DMEM/F12 o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść naczynie w imagerze i otwórz oprogramowanie do obrazowania. Aby skonfigurować skanowanie w oprogramowaniu systemu obrazowania, najpierw wybierz pozycję tacy, która ma być używana, i wybierz typ naczynia, które ma być skanowane.

Następnie wybierz obrazowanie całej studni, wzór skanowania żądanych studzienek oraz odpowiednie kanały fluorescencyjne do identyfikacji w czasie rzeczywistym interesujących markerów powierzchniowych. Następnie oznacz eksperyment do skanowania i ustaw punkty czasowe i interwały dla próbek, które mają być skanowane każdego dnia. Aby przeanalizować zestaw zeskanowanych eksperymentów, wybierz interesujący Cię eksperyment i wybierz pozycję Uruchom nowe zadanie analizy.

Następnie należy wybrać odpowiednią definicję przetwarzania dla typu analizy zgodnie z kanałami używanymi do obrazowania, na przykład liczba kolonii w fazie PSC. Nazwij zadanie analizy. I wybierz zakres czasowy analizy i odwierty, które mają być analizowane.

Następnie uruchom zadanie analizy. Aby zmierzyć żądane punkty czasowe przeprogramowania z poszczególnych studzienek, umyj interesującą Cię studnię jednorazowo dwoma mililitrami DPBS. Następnie zastąp pranie jednym mililitrem wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA o temperaturze 37 stopni Celsjusza 05%.

Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza spłucz trypsynę na dnie studzienki, aby zdysocjować komórki do zawiesiny jednokomórkowej i przenieść komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Używając trzech mililitrów DPBS, umyj pozostałe komórki ze studzienki i wciągnij je do 15-mililitrowej probówki. Dodaj dodatkowe 10 mililitrów DPBS do komórek i odwiruj je przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki DMEM/F12 w celu zliczenia. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek do jednej dziesiątej z sześciu komórek na mililitr stężenia i poddzielić jeden mililitr komórek na probówkę na odpowiednią liczbę próbek. Następnie oznacz komórki pierwszorzędowymi przeciwciałami w jednym mililitrze pożywki DMEM / F12 przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

Pod koniec inkubacji umyj komórki dwa razy w pożywce DMEM/F12 o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze DPBS i przenieść próbki do indywidualnych probówek FACS. Uzyskaj profile cytometrii przepływowej przeprogramowanych płytek.

Następnie przenieś pliki FCS do komputera i zaimportuj je do odpowiedniego oprogramowania analitycznego. Otwórz pierwszy plik kontrolny na wykresie punktowym do przodu i ustaw oś y na skalę logarytmiczną. Następnie utwórz wielokątną bramę wokół żywej populacji.

Następnie utwórz boczny obszar rozproszenia za pomocą wykresu wysokości punktu z aktywnymi komórkami i ustaw prostokątną bramkę, aby wykluczyć dublety. Następnie użyj tych bramek do analizy plików próbek eksperymentalnych w odpowiednich kanałach fluorescencyjnych, aby zidentyfikować interesujące populacje w odpowiednich kwadrantach. Przeprogramowanie fibroblastów BJ za pomocą wirusów Sendai powoduje wygenerowanie komórek SSEA4 + CD44 w innym tempie niż przeprogramowanie fibroblastów DF1, co pokazuje, że wczesne porównanie procentu pluripotencjalnych komórek macierzystych podobnych do komórek macierzystych SSEA4 + CD44 można wykorzystać do śledzenia postępu przeprogramowania.

W przebiegu czasowym cytometrii przepływowej fibroblasty CD24-CD44 + i EpCAM ujemne CD44 + tworzą podwójnie ujemne populacje, które później przekształcają się odpowiednio w CD24 + CD44 i EpCAM dodatnie CD44-pluripotencjalne komórki macierzyste, co dodatkowo nakreśla postęp przeprogramowania. Obrazowanie w czasie rzeczywistym przeprogramowanych kultur po ponownym wysiewie pokazuje stopniowe tworzenie się kolonii odpowiadające logarytmicznemu wzrostowi ich zbiegania i demonstruje ostateczną ekspresję pluripotencjalnych markerów dodatnich i ujemnych fibroblastów po zakończeniu przeprogramowania. Co więcej, użycie genu reporterowego pozwala na pomiar konfluencji w kontraście fazowym z bardziej stopniowym wzrostem obserwowanego zbiegu GFP w porównaniu z całkowitym zsumowaniem.

Rzeczywiście, w tym reprezentatywnym eksperymencie konfluencja GFP w dniu 19 była mniejsza niż połowa całkowitej konfluencji odpowiadającej całkowitemu przeprogramowaniu. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do wyjaśnienia informacji o zdarzeniach przeprogramowania i śledzenia kinetyki przeprogramowania ludzkich fibroblastów. Technika ta może być również wykorzystana do przyjrzenia się różnym początkowym tkankom komórek somatycznych, zastosowanym technologiom przeprogramowania i kombinacjom matryc pośrednich w celu wyjaśnienia zdarzeń przeprogramowania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać monitorowanie w czasie rzeczywistym i ekspresję markerów na powierzchni komórki, aby móc śledzić przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w iPSC.