Wykrywanie białek wiążących RNA metodą in vitro RNA pull-down w hodowli adipocytów

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wyizolowanie białek wiążących RNA z transkryptu RNA tkanki tłuszczowej brunatnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak mechanizmy regulacyjne długożyjącego kodującego RNA oraz powiązanych z nim białek RNA. Główną zaletą tej strategii jest łatwość jej wykonania.

RNA wykorzystane do zaprezentowania tej procedury to fragment niekodującego regionu 3' receptora antygenowego, w dalszej części tekstu określany jako AR 3-Prime UTR. Należy rozpocząć od amplifikacji oligonukleotydu T7 AR oraz częściowej sekwencji DNA lucyferazy świetlikowej z plazmidu psiCHECK-2. Szczegółowe informacje dotyczące użytych starterów i parametrów znajdują się w dołączonym dokumencie.

Po amplifikacji należy wykorzystać produkty PCR jako matryce do syntezy biotinylowanego RNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro, zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie mieszaninę należy inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Po transkrypcji in vitro do reakcji należy dodać 1 µL DNazy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu degradacji matrycowego DNA.

Następnie uzupełnij objętość całkowitą do 60 µl wodą. Nałóż biotynilowane RNA na kolumny oczyszczające w celu usunięcia soli i nieprzyłączonych nukleotydów. Następnie, po zmierzeniu stężenia RNA, przechowuj RNazę w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz pull-down.

W dniu przeprowadzenia analizy rozmrozić zamrożone biotynilowane RNA na lodzie. Następnie, aby upewnić się, że badane RNA posiada odpowiednią strukturę drugorzędową, podgrzać 50 µL roztworu w temperaturze 90 °C przez dwie minuty. Schłodzić na lodzie przez dwie minuty.

Następnie dodaj 50 µL buforu do struktur RNA 2X i pozostaw RNA do sfałdowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie resuspenduj magnetyczne kulki pokryte streptawidyną w oryginalnej fiolce, krótko mieszając je na wirówce typu vortex. Potem przenieś 150 µL zresuspendowanych kulek do probówki o pojemności 1,5 ml.

Umieść probówkę w statywie magnetycznym na jedną minutę, aby oddzielić kuleczki magnetyczne od supernatantu. Za pomocą pipety usuń i odrzuć supernatant. Zachowaj osad z kuleczek.

Przemyj kulek raz, resuspendując osad z kulek w jednym mililitrze zalecanego przez producenta 1X buforu do wiązania i płukania, a następnie umieść probówkę na rotatorze na pięć minut w temperaturze pokojowej. Przemyj dwukrotnie buforem A oraz buforem B. Po inkubacji odrzuć nadsącz i zachowaj osad z kulek.

Następnie resuspender osad z kulek w 300 µL 2X buforu do płukania i wiązania. Podzielić kulki równomiernie do trzech probówek o pojemności 1,5 ml, tak aby w każdej probówce znalazło się 100 µL kulek. Dodać 100 µL wody wolnej od RNaz, 100 µL biotynilowanego RNA lucyferazy świetlikowej oraz 100 µL biotynilowanego RNA 3-Prime UTR AR.

Inkubuj każdą mieszaninę kulek przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy stałym obracaniu. Następnie umieść probówki na magnesie na jedną minutę. Usuń i odrzuć nadsącz.

Zachować osady z kulek. Następnie przemyć kulki dwukrotnie, za każdym razem resuspendując osady w 400 µL buforu piorącego i wiążącego 1X, a następnie umieszczając je na rotatorze przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieścić probówki na magnesie na jedną minutę.

Następnie należy usunąć i odrzucić cały nadsącz. Każdy osad kulek należy resuspendować w 50 µl buforu do izolacji jąder. W ramach przygotowania do kolejnej części protokołu należy upewnić się, że wszystkie bufory, jak i szklane homogenizatory Dounce są schłodzone na lodzie.

Przygotowanie lizatu komórkowego powinno odbywać się w warunkach chłodzenia na lodzie. Dla każdego zaplanowanego testu RNA pull-down należy przygotować jedną szalkę o średnicy 15 cm z zróżnicowanymi preadipocytami pochodzącymi od trzytygodniowych myszy szczepu C57 Black Six typu dzikiego. Po czterech lub pięciu dniach, w celu zebrania komórek, należy dodać od 10 do 15 ml PBF, a następnie użyć skrobaka do komórek, aby usunąć je z szalki.

Przenieś je do probówki o pojemności 50 ml, a następnie odwiruj w wirowarce z przyspieszeniem 200 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odessij i usuń supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Następnie resuspenduj osad komórkowy w 2 ml buforu hipotonicznego i inkubuj komórki na lodzie przez piętnaście minut.

Przenieś komórki do szklanego homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml i poddaj je mechanicznemu rozdarciu na lodzie, wykonując 20 ruchów tłokiem. Osadź jądra komórkowe poprzez wirowanie przy 3300 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu przenieś nadsącz do probówek o pojemności 1,5 ml, a osad pozostaw na lodzie do późniejszego użycia.

Do supernatantu dodać KCl o stężeniu 3 M, aby uzyskać stężenie końcowe 150 mM. Wirować z prędkością 20 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu na górze pojawi się warstwa lipidowa.

Używając pipety o pojemności 1 ml, ostrożnie go usuń. Następnie pobierz nadsącz lizatu cytoplazmatycznego komórek. W kolejnym kroku, za pomocą pipety o pojemności 1 ml, resuspenduj osad jąder w 1 ml buforu do izolacji jąder i przenieś go do szklanego homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml.

Mechanicznie rozbij jądra komórkowe na lodzie, wykonując 100 pociągnięć. Odwiruj pozostałości jądrowe w wirowce przy 20 000 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz nadsącz jako lizat komórkowy jąder.

Można je połączyć z wcześniej pobranym lizatem cytoplazmatycznym lub przechowywać oddzielnie do późniejszych zastosowań. W tym przypadku próbki łączy się w stosunku jeden do jednego. Do niefrakcjonowanego lizatu komórkowego należy dodać inhibitor RNazy, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5 units per µL.

Następnie odstaw 100 µL lizatu komórkowego na lód jako kontrolę wejściową do western blottingu. Podziel lizat komórkowy na trzy równe aliquoty, przelewając 1 mL lizatu do każdej probówki 1,5-ml, a następnie inkubuj odpowiednio z koniugatem pustego RNA lucyferazy świetlika oraz koralikami skoniugowanymi z AR 3-Prime UTR przez trzy godziny w temperaturze 4 °C przy jednoczesnym rotowaniu. Po inkubacji umieść probówki na magnesie na jedną minutę.

Użyj pipety o objętości jednego mililitra, aby zebrać supernatant, następnie wyizoluj RNA i oceń jego integralność zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. Przechowuj osady z kulek na lodzie. Przemyj kulki magnetyczne sześć razy.

Za każdym razem resuspender granulki kulek w jednym mililitrze buforu do izolacji jąder zawierającego 40 units inhibitora RNazy i 0,25 percent igepalu. Rotować probówki przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Umieścić probówki w statywie magnetycznym, aby oddzielić kulki magnetyczne od supernatantu.

Po jednej minucie odessać i odrzucić nadsącz, a następnie umieścić osady kulek na lodzie. Aby eluować kompleksy białkowo-RNA z kulek do analizy western blotting, najpierw zawiesić każdy osad kulek w 75 µl buforu do izolacji jąder komórkowych. Następnie dodać 25 µl 4X buforu do ładowania w western blotting.

zawierającej SDS, aby uzyskać objętość całkowitą 100 µL. Na koniec gotować koraliki w tym 100-mikrolitrowym roztworze w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Przeprowadzić western blotting w celu weryfikacji RBP zgodnie z opisem w załączonym dokumencie.

W tym eksperymencie fragment RNA receptora antygenowego został wykorzystany jako przynęta do wychwycenia wiążącego się z nim białka HuR. W charakterze kontroli negatywnych zastosowano zarówno przynętę RNA lucyferazy świetlikowej, niezwiązaną z białkiem HuR, jak i porcję nieukonjugowanych pustych kulek streptawidynowych. Oddziaływania RNA-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze komórkowym, jak i w cytoplazmie, a niniejszy protokół pull-down można zastosować zarówno do całkowitych, jak i frakcjonowanych lizatów komórkowych z jąder lub cytoplazmy.

Analiza metodą western blottingu wykazała obecność białka HuR w niefrakcjonowanym lizacie komórkowym (input) z wykorzystaniem przeciwciała monoklonalnego. Frakcja elucji RNA receptora antygenowego również dała wynik dodatni, co wskazuje na obecność białka HuR w lizacie adipocytów przy zastosowaniu kuleczek sprzężonych z RNA receptora antygenowego w teście RNA pull-down. Zarówno frakcja elucji RNA lucyferazy świetlikowej, jak i próbka z pustymi kuleczkami dały wyniki negatywne, co wskazuje, że interakcje nieswoiste nie były wykrywalne przy użyciu tej metody.

Wzięte razem, wyniki te sugerują, że oddziaływanie między fragmentem RNA receptora antygenowego a białkiem HuR było specyficzne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować białka wiążące RNA z transkryptu RNA z brunatnej tkanki tłuszczowej. Po opanowaniu tej techniki proces ten można przeprowadzić w ciągu 24 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.