Name: Wykrywanie białek wiążących RNA metodą in vitro RNA pull-down w hodowli adipocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj metodę RNA pull-down do wykrywania białek wiążących RNA w hodowli adipocytów brunatnych. Technika ta pozwala izolować i badać interakcje RBP z transkryptami RNA in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace zostały sfinansowane przez Singapore NRF fellowship (NRF-2011NRF-NRFF001-025) oraz CBRG (NMRC/CBRG/0070/2014).

UWAGA: RNA, które jest przedmiotem zainteresowania w kontekście tego badania, to fragment AR 3'UTR.
1. Przygotowanie RNA znakowanego biotyną
<ol>
	<li>Aby uzyskać RNA, należy amplifikować T7-AR-oligo metodą PCR, a następnie transkrypcję in vitro przy użyciu zestawu komercyjnego i postępować zgodnie z instrukcjami producenta11. 
	UWAGA: Startery do PCR są wymienione w Tabeli 4: T7-AR-F i T7-AR-R.</li>
	<li>W celu kontroli niespecyficznego wiązania, amplifikuj częściową sekwencję DNA lucyferazy świetlika (FL) metodą PCR z plazmidu psiCHECK-2, a następnie transkrypcję in vitro. 
	UWAGA: Startery do PCR są wymienione w Tabeli 4: hluc(+)-T7-probe-F i hluc(+)-probe-R. Tabela 4. Sekwencje matrycy i starterów do amplifikacji PCR.</li>
	<li>W przypadku reakcji PCR 50 μl wymieszaj 50 ng DNA (oligo lub plazmid), 4 μl dNTP (2,5 mM każdego pojedynczego dNTP), 5 μl 10x buforu reakcyjnego, 1 μl polimerazy DNA 2,5 U/μl, 2 μl 10 μM startera do przodu, 2 μl 10 μM startera odwrotnego i wodę wolną od nukleaz.
	<ol>
		<li>Uruchom amplifikację PCR w termocyklerze za pomocą następującego programu. KROK 1: jeden cykl w temperaturze 95 °C przez 2 minuty; KROK 2: 35 cykli po 95 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 30 sekund (AR) lub 60 sekund (FL); KROK 3: jeden cykl w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsyntetyzuj biotynylowane RNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro zgodnie z instrukcjami producenta11. W tym eksperymencie użyj produktów PCR jako matryc do syntezy RNA. W przypadku 20 μl reakcji transkrypcji in vitro wymieszaj 200 ng amplifikowanego DNA PCR, 2 μl każdego pojedynczego NTP, 1 μl 10mM biotyny-CTP, 2 μl 10x buforu reakcyjnego i 2 μl polimerazy T7 RNA. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Po transkrypcji in vitro mieszaninę reakcyjną należy traktować 1 μl 2 U/μl DNazy w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu degradacji matrycowego DNA. Na koniec rozcieńczyć biotynylowane RNA do całkowitej objętości 60 μl w celu późniejszego oczyszczenia.</li>
	<li>Oczyść biotynylowane RNA w celu usunięcia soli i nieinkorporowanych nukleotydów za pomocą kolumn oczyszczających zgodnie z instrukcjami producenta12. Zmierzyć stężenie RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C do kolejnych testów pull-down.</li>
	<li>Aby zapewnić prawidłową strukturę drugorzędową dla RNA będącego przedmiotem zainteresowania w interakcji RNA-białko, należy podgrzać 50 μl biotynylowanego RNA (50 pM) w temperaturze 90 °C przez 2 min, schłodzić na lodzie przez 2 min, a następnie dostarczyć 50 μl bufora struktury 2x RNA (Tabela 3) i pozwolić na fałdowanie RNA w temperaturze RT przez 30 min13,14.</li>
</ol>
2. Przygotowanie koralików sprzężonych z RNA
UWAGA: Użyj magnetycznego stojaka do oddzielenia kulek magnetycznych od supernatantu.
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić kulki magnetyczne pokryte streptawidyną w oryginalnej fiolce, krótko wirując, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś 150 μl zawieszonych kulek do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę. Wyrzuć supernatant. Zachowaj granulat koralików. 
	UWAGA: W testach RNA pull-down, podczas podawania zawieszonych kulek z oryginalnej fiolki, użyj kulek 50 μl do testu, a następnie western blotting i 200 μl kulek do testu, po którym następuje MS.</li>
	<li>Umyj koraliki raz, ponownie zawieszając granulat kulki z 1 ml zalecanego przez producenta bufora 1x W&B (wiążącego i myjącego) (Tabela 3), a następnie obracając rurkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej w rotatorze. Odrzucić supernatant. Zachowaj granulkę koralików.</li>
	<li>Aby dezaktywować RNazę na kulkach, umyj kulki dwukrotnie, za każdym razem poprzez ponowne zawieszenie granulki z 400 μl buforu A. Bufor A jest roztworem alkalicznym zawierającym 0,1 M NaOH i 0,05 M NaCl (Tabela 3). Obracaj rurkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w rotatorze. Odrzucić supernatant. Zachowaj granulkę koralików.</li>
	<li>Aby usunąć NaOH z kulek, należy umyć kulki dwukrotnie, za każdym razem poprzez ponowne zawieszenie granulatu kulek z 400 μl buforu B (Tabela 3), a następnie obracanie rurki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w rotatorze. Odrzucić supernatant. Zachowaj granulkę koralików.</li>
	<li>Zawiesić granulat kulek za pomocą 300 μl bufora 2x W&B, równo podzielić kulki i przenieść do trzech probówek o pojemności 1,5 ml (100 μl kulek na probówkę). Zaopatrz probówki zawierające kulki odpowiednio w 100 μl wody wolnej od RNazy, 100 μl biotynylowanego FL RNA i 100 μl biotynylowanego AR 3'UTR RNA.</li>
	<li>Inkubuj każdą mieszaninę kulek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z rotacją. Umieść rurki na magnesie na 1 minutę. Odrzucić cały supernatant. Zachowaj granulki koralików.</li>
	<li>Umyj koraliki dwukrotnie, za każdym razem ponownie zawieszając każdą granulkę kulki za pomocą 400 μl 1x bufor W&B, a następnie obracając rurki przez 5 minut w temperaturze pokojowej w rotatorze.</li>
	<li>Umieść probówki na magnesie na 1 minutę. Wyrzuć cały supernatant. Zawiesić każdą granulkę kulki za pomocą 50 μl buforu do izolacji jądrowej (tabela 3).</li>
</ol>
3. Izolacja preadipocytów i indukcja adipogenezy
<ol>
	<li>Jak opisano w poprzednich publikacjach5, wypreparuj preadipocyty z brązowej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami (myszy C57BL6 typu dzikiego, 3 tygodnie).</li>
	<li>Wzrost i in vitro różnicowanie preadipocytów5. Komórki są gotowe do dalszej aplikacji 4-5 dni po rozpoczęciu różnicowania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie lizatu komórkowego z pierwotnych adipocytów
UWAGA: Upewnij się, że wszystkie procedury przygotowania lizatu komórkowego są wykonywane na lodzie, a wszystkie są schładzane na lodzie. Homogenizatory szklane do odbijania przed schładzaniem na lodzie.
<ol>
	<li>Hodować i różnicować preadipocyty w 15-centymetrowych szalkach5 (patrz punkt 3.2). Każda szalka dostarcza odpowiednich komórek do jednego testu ściągania RNA. W 4 lub 5 dniu różnicowania odrzuć pożywkę do hodowli komórkowych i przemyj komórki raz 1x PBS.</li>
	<li>Aby zebrać komórki, dodać 10-15 ml 1x PBS do komórek, zeskrobać, aby zebrać komórki w probówce o pojemności 50 ml i granulować komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu hipotonicznego (Tabela 3) i inkubować komórki na lodzie przez 15 minut. Przenieść komórki do homogenizatora szklanego o pojemności 15 ml i mechanicznie ścinać komórki na lodzie za pomocą 20 uderzeń.</li>
	<li>Osadzać jądra komórkowe przez odwirowanie w stężeniu 3 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Osad jądra komórkowego przechowywać na lodzie do dalszego użycia (patrz sekcja 4.6). Przenieść supernatant do probówek o pojemności 1,5 ml, dodać 3M KCl do supernatantu do uzyskania końcowego stężenia 150 mM i wirować przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie usuń warstwę lipidową na wierzchu za pomocą pipety o pojemności 1 ml i zbierz supernatant jako cytoplazmatyczny lizat komórkowy.</li>
	<li>Zawiesić osad jądrowy (patrz sekcja 4.4) w 1 ml buforze do izolacji jądrowej. Przenieść jądra do homogenizatora ze szkła o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i mechanicznie ścinać jądra na lodzie za pomocą 100 uderzeń. Osadzać szczątki jądrowe przez odwirowywanie w temperaturze 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant jako jądrowy lizat komórkowy.</li>
	<li>Albo połącz jądrowe i cytoplazmatyczne lizaty komórkowe, albo użyj każdej frakcji osobno, do dalszej aplikacji pull-down. W tym eksperymencie demonstracyjnym te dwie frakcje lizatu komórkowego połączono w stosunku objętościowym 1:1.</li>
	<li>Dodaj inhibitor RNazy do tego niefrakcjonowanego lizatu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 U/μl. Odłóż 100 μl lizatu komórkowego jako kontrolę wejściową do western blotting15.</li>
</ol>
5. Wiązanie i elucja RBP
<ol>
	<li>Podzielić lizat komórkowy na trzy równe podwielokrotności (1 ml lizatu komórkowego w probówce o pojemności 1,5 ml) i inkubować z kulkami ślepymi, odpowiednio sprzężonymi z FL RNA i AR 3'UTR RNA (patrz sekcja 2.8) przez 3 godziny w temperaturze 4 °C z rotacją.</li>
	<li>Umieść probówki na magnesie na 1 minutę. Zebrać supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml, a następnie wyizolować RNA z supernatantu, aby potwierdzić integralność RNA. Wyizolować RNA za pomocą kwaśnego roztworu tiocyjanianu guanidyny-fenolu zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela 2). Oceń nienaruszoność RNA, analizując podjednostki 28S i 18S rybosomalnego RNA. Trzymaj granulki koralików na lodzie.</li>
	<li>Umyj kulki magnetyczne sześć razy, za każdym razem przez ponowne zawieszenie każdej granulki z 1 ml buforu izolacji jądrowej zawierającego 40 U inhibitor RNazy i 0,25% IGEPAL, a następnie obracaj probówki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w rotatorze. Użyj stojaka magnetycznego do oddzielenia kulek magnetycznych i supernatantu. Odrzucić cały supernatant. Trzymaj granulki koralików na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj następujące czynności, aby wymyć kompleksy RNA-białko z kulek do western blot. Po pierwsze, ponownie zawieś każdą granulkę kulki w buforze izolacji jądrowej o pojemności 75 μl; następnie dodać 25 μl 4x western blot bufor ładujący (zawierający SDS), aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl. Na koniec gotuj kulki w tym 100 μl roztworu w temperaturze 95 °C przez 5 min. 
	UWAGA: Wykonaj następujące kroki, aby wymyć kompleksy RNA-białko z kulek dla SM. KROK 1: ponownie zawiesić każdą osadkę kulki w 100 μl buforu elucyjnego (Tabela 3); KROK 2: inkubować próbki kulek przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej z rotacją; KROK 3: odwirować i zebrać supernatant zawierający białko; KROK 4: Skoncentrować roztwory białkowe do 20-30 μl przed złożeniem do stwardnienia rozsianego.</li>
	<li>Odwirować każde 100 μl próbki kulki o sile 12 000 x g przez 30 sekund w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant. Podwielokrotność 15 μl supernatantu do analizy western blot (patrz punkty 6.1 i 6.2). Zbadaj powstałą błonę rozcieńczonym mysim przeciwciałem monoklonalnym HuR (rozcieńczenie 1:1,000) przez noc.</li>
</ol>
6. Western Blotting do weryfikacji RBP
<ol>
	<li>Oddziel RBP za pomocą SDS-PAGE przy użyciu standardowych technik.</li>
	<li>Przeprowadź western blot przy użyciu standardowych technik, sondując RBP związane z interesującym RNA. 
	UWAGA: W tym eksperymencie demonstracyjnym mysie przeciwciało monoklonalne HuR zostało użyte do immunodetekcji białka HuR.</li>
	<li>Powstałą błonę inkubować z rozcieńczonym przeciwciałem HuR (rozcieńczenie 1:1 000) w beztłuszczowym mleku w proszku o stężeniu 5% wag., 1x TBS, 0,1% Tween-20 w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając, przez noc. Umyj membranę trzykrotnie za pomocą 1x TBST. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym (kozie przeciwciało anty-mysie IgG-HRP) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przemyć membranę. Rozwijaj i nagrywaj sygnał.</li>
</ol>

<ol><li>Huot, M. É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973(2013).</li>
<li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li>
<li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li>
<li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HADHB%2C+HuR%2C+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li>
<li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+binding+of+HuR+and+poly%28C%29-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3%C2%B4+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li>
<li>König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-RNA+interactions%3A+new+genomic+technologies+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li>
<li>Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein-lncRNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203(2014).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li>
<li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

lncRNA i RBP odgrywają istotną rolę w zdrowiu i chorobie, jednak mechanizmy molekularne tych cząsteczek są słabo poznane. Identyfikacja białek, które oddziałują z cząsteczkami lncRNA, jest kluczowym krokiem w kierunku wyjaśnienia mechanizmów regulacyjnych. Wzbogacanie RBP za pomocą systemu testów pull-down RNA opiera się na wychwytywaniu w roztworze oddziałującego kompleksu, dzięki czemu białka z lizatu komórkowego mogą być selektywnie ekstrahowane przy użyciu biotynylowanych przynęt RNA związanych z kulkami magnetycznym...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBP to białka, które wiążą się z dwu- lub jednoniciowym RNA w komórkach i uczestniczą w tworzeniu kompleksów RNA-białko. RBP mogą wiązać różne gatunki RNA, w tym mRNA i długie niekodujące RNA (lncRNA), i wywierać wpływ na poziomie potranskrypcyjnym. Zarówno RBP, jak i lncRNA stają się nowymi regulatorami rozwoju i funkcji tkanki tłuszczowej1,2,3. Aby zrozumieć mechanizm regulacji szlaków komórkowych za pośrednictwem RBP i lncRNA, często konieczne jest wykrycie interakcji między określoną cząsteczką RNA a jednym lub kilkoma RBP, a czasami zidentyfikowanie pełnego spektrum partnerów białkowych transkryptu RNA. Jednak eksperyment może być trudny ze względu na wysoką zawartość lipidów w adipocytach. Opisany tutaj protokół RNA pull-down można zastosować do pobrania partnerów białkowych określonego RNA z lizatów adipocytów kultur pierwotnych4,5.
Uzasadnienie dla tego protokołu jest podsumowane w następujący sposób. Przynęta RNA jest transkrybowana in vitro z matrycy DNA, znakowana biotyną i sprzężona z kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną4. Przynęta RNA jest inkubowana z lizatami komórkowymi, aby umożliwić tworzenie kompleksów RNA-białko, które są następnie ściągane w dół na stojaku magnetycznym. Dokładniej rzecz ujmując, opisany poniżej protokół ściągania RNA wykorzystuje fragment RNA z AR 3'UTR jako przynętę do pobrania białka HuR, powszechnie wyrażanego RBP związanego z 3'UTR mRNA6,7, z teadipocytelizatu hodowli pierwotnej. Aby przetestować swoistość wiązania tego testu, jako kontrolę dołącza się nieistotny RNA, a także ślepe kulki streptawidyny. Protokół ten jest zgodny z western blotting lub spektrometrią mas (MS) w celu potwierdzenia wychwycenia określonego RBP lub identyfikacji pełnego repertuaru wychwyconych RBP, odpowiednio8.
Dostępnych jest kilka technik do badania interakcji RNA-białko. Aby ujawnić RNA związane przez daną RBP, MOŻNA ZASTOSOWAĆ RIP (immunoprecypitacja RNA) i CLIP (sieciowanie UV i immunoprecypitacja). Natomiast w celu identyfikacji partnerów białkowych danego RNA można zastosować pull-down RNA, ChIRP (izolacja chromatyny przez oczyszczanie RNA), CHART (analiza hybrydyzacji wychwytywania celów RNA) i RAP (oczyszczanie antysensowne RNA). W porównaniu z późniejszymi, technika ściągania RNA wymaga mniej wysiłku do skonfigurowania. Może być stosowany do wychwytywania białek in vitro i in vivo. Podejście in vivo polegające na ściąganiu RNA, które jest technicznie trudniejsze niż jego odpowiednik in vitro, zachowuje interakcje RNA-białko poprzez sieciowanie w komórkach, wychwytuje interesujące komórki RNA znakowane aptamerem, a następnie wykrywa związane RBP. Ściąganie RNA można wykorzystać do wzbogacenia mniej obfitych RBP oraz do izolowania i identyfikacji kompleksów RNA-białko, które odgrywają różne role funkcjonalne w kontrolowaniu regulacji komórkowej9,10.

<table><tbody><tr><td>Główne materiały użyte w tym badaniu.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&nbsp; Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-14-CTP&nbsp;</td><td>Kolumny spinowe Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway&nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptawidyna&nbsp;</td>Mysie przeciwciało monoklonalne <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) (sc-5261)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-mysie IgG-HRP (sc-2005)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Molecular Biology Grade Water (bez nukleaz)&nbsp;</td>Bufor fosforanowy <td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solanka (1 i razy; PBS)</td><td>&nbsp; Inhibitor</td> RNazy HyClone<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Inhibitor proteazy <td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Polimeraza DNA Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&nbsp; Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Główne urządzenia użyte w tym badaniu.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend Micro 21R&nbsp;</td><td>Wirówka Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td>Termocykler Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Rotator Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO Multi Bio RS-24&nbsp;</td><td>BOECO,Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy i bibuły w żelu białkowym&nbsp;</td><td>Magnes Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2&nbsp;</td><td>Technologie</td><td></td><td></td> życiowe</tr></tbody></table>

wykrywanie białek wiążących rna metodą in vitro rna pull-down w hodowli adipocytów

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Białka wiążące RNA (RBP) pojawiają się jako warstwa regulacyjna w rozwoju i funkcji tkanki tłuszczowej. RBP odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów na poziomie potranskrypcyjnym, wpływając na stabilność i wydajność translacyjną docelowych mRNA. Technika ściągania RNA jest szeroko stosowana do badania interakcji RNA-białko, która jest niezbędna do wyjaśnienia mechanizmu leżącego u podstaw funkcji RBP, a także długich niekodujących RNA (lncRNA). Jednak wysoka obfitość lipidów w adipocytach stanowi wyzwanie techniczne w przeprowadzeniu tego eksperymentu. Tutaj szczegółowy protokół ściągania RNA jest zoptymalizowany pod kątem pierwotnej hodowli adipocytów. Fragment RNA z nieuleganego translacji regionu 3' receptora androgenowego (AR) (3'UTR) zawierający element bogaty w adenylan-urydylan został wykorzystany jako przykład, aby zademonstrować, jak odzyskać jego partnera RBP, białko HuR, z listanu adipocytów. Opisana tutaj metoda może być stosowana do wykrywania interakcji między RBP a niekodującymi RNA, a także między RBP a kodującymi RNA.

W tym eksperymencie demonstracyjnym fragment RNA AR został użyty jako przynęta do wychwycenia wiążącego go białka HuR. Jako kontrole negatywne posłużyły zarówno przynęta RNA FL, która nie wykazuje powinowactwa do białka HuR, jak i alikwot niekondensowanych, pustych kulek streptawidyny. Oddziaływania RNA-białko mogą zachodzić w jądrze komórkowym lub w cytoplazmie, a ten protokół pull-down można zastosować zarówno do całkowitych, jak i frakcjonowanych (jądrowych lub cytoplazmatycznych) liza...

Protokół pull-down RNA jest tutaj zoptymalizowany do wykrywania interakcji między białkami wiążącymi RNA (RBP) a niekodującymi i kodującymi RNA. Fragment RNA z receptora androgenowego (AR) został wykorzystany jako przykład, aby zademonstrować, jak odzyskać jego RBP z listanu pierwotnych brązowych adipocytów.

Wykrywanie białek wiążących RNA metodą in vitro RNA pull-down w hodowli adipocytów

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wyizolowanie białek wiążących RNA z transkryptu RNA tkanki tłuszczowej brunatnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak mechanizmy regulacyjne długożyjącego kodującego RNA oraz powiązanych z nim białek RNA. Główną zaletą tej strategii jest łatwość jej wykonania.RNA wykorzystane do zaprezentowania tej procedury to fragment niekodującego regionu 3' receptora antygenowego, w dalszej części tekstu określany jako AR 3-Prime UTR. Należy rozpocząć od amplifikacji oligonukleotydu T7 AR oraz częściowej sekwencji DNA lucyferazy świetlikowej z plazmidu psiCHECK-2. Szczegółowe informacje dotyczące użytych starterów i parametrów znajdują się w dołączonym dokumencie.Po amplifikacji należy wykorzystać produkty PCR jako matryce do syntezy biotinylowanego RNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro, zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie mieszaninę należy inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Po transkrypcji in vitro do reakcji należy dodać 1 µL DNazy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu degradacji matrycowego DNA.Następnie uzupełnij objętość całkowitą do 60 µl wodą. Nał

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Znakowanie destiobiotyną syntetycznego oligo 25-nukleotydowego RNA, który zawiera motyw pierwiastka bogatego w adeninę (ARE), pozwala na specyficzne wiązanie cytozolowego białka wiążącego ARE.

Oczyszczanie białek oddziałujących z RNA za pośrednictwem powinowactwa do destiobiotyny i streptawidyny w komórkach międzybłoniaka

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Przedstawiono tutaj protokół dostarczania oligonukleotydów, takich jak mało-interferujące RNA (siRNA), mimiki mikro-RNA (miRs) lub anty-mikro-RNA (anty-miR) do dojrzałych adipocytów w celu modulacji ekspresji białek i mikro-RNA.

Model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-RNA na funkcję adipocytów

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj metodę RNA pull-down do wykrywania białek wiążących RNA w hodowli adipocytów brunatnych. Technika ta pozwala izolować i badać interakcje RBP z transkryptami RNA in vitro.

Wykrywanie białek wiążących RNA metodą in vitro RNA pull-down w hodowli adipocytów

Przeglądaj więcej filmów