Wykrywanie białek wiążących RNA metodą in vitro RNA pull-down w hodowli adipocytów

Ogólnym celem tego eksperymentu jest pobranie białek wiążących RNA transkryptu RNA z brunatnej tkanki tłuszczowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak, jakie są mechanizmy regulacyjne długotrwałego kodowania RNA i związanych z nim białek RNA. Główną zaletą tej taktyki jest to, że jest łatwa do wykonania.

RNA użyte do zademonstrowania tej procedury jest fragmentem nieulegającego translacji regionu receptora antygenowego 3-Prime, zwanego dalej AR 3-Prime UTR. Zacznij od amplifikacji oligo T7 AR i częściowej sekwencji DNA lucyferazy świetlika z plazmidu psiCHECK-2. Zastosowane podkłady i parametry są szczegółowo opisane w dokumencie towarzyszącym.

Po amplifikacji należy użyć produktów PCR jako matryc do syntezy biotynylowanych RNA przy użyciu zestawu do transkrypcji in vitro, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po transkrypcji in vitro dodaj jeden mikrolitr Dnazy do reakcji i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby zdegradować matrycę DNA.

Następnie uzupełnij wodą całkowitą objętość do 60 mikrolitrów. Zastosuj biotynylowane RNA do kolumn oczyszczających, aby usunąć sól i nieinkorporowane nukleotydy. Następnie, po zmierzeniu stężenia RNA, przechowuj RNazę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do kolejnych testów ściągających.

W dniu testu rozmrozić zamrożone biotynylowane RNA na lodzie. Następnie, aby upewnić się, że interesujący nas RNA ma odpowiednią strukturę drugorzędową, podgrzej 50 mikrolitrów w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Schłodzić na lodzie przez dwie minuty.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów bufora struktury 2X RNA i pozwól RNA złożyć się w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie ponownie zawieś kulki magnetyczne pokryte streptawidyną w ich oryginalnej fiolce, krótko je wirując. Następnie przenieś 150 mikrolitrów zawieszonych kulek do 1,5 mililitrowej tuby.

Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby oddzielić kulki magnetyczne i supernatant. Za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant. Zachowaj granulkę koralików.

Umyj koraliki raz, ponownie zawieszając granulat kulki w jednym mililitrze zalecanego przez producentów bufora do wiązania i mycia 1X, a następnie umieść rurkę na obracaczu na pięć minut w temperaturze pokojowej. Przemyć dwukrotnie buforem A i buforem B. Po inkubacji odrzucić supernatant i zachować osad kulkowy.

Następnie ponownie zamieszaj granulat kulki w 300 mikrolitrach 2X bufora myjącego i wiążącego. Podziel koraliki równo na trzy 1,5-mililitrowe rurki po 100 mikrolitrów kulek na tubę. Dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od RNaz, 100 mikrolitrów biotynylowanego RNA lucyferazy świetlika i 100 mikrolitrów biotynylowanego AR 3-Prime UTR RNA.

Inkubuj każdą mieszaninę kulek przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z rotacją. Następnie umieść rurki na magnesie na jedną minutę. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.

Zachowaj granulki koralików. Następnie umyj kulki dwukrotnie, za każdym razem ponownie zawieszając granulki kulek za pomocą 400 mikrolitrów buforu myjącego i wiążącego 1X, a następnie umieszczając je na obracaczu na pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść rurki na magnesie na jedną minutę.

Następnie usunąć i wyrzucić cały supernatant. Zawiesić każdą granulkę kulki w 50 mikrolitrach bufora izolacji jądrowej. Przygotowując się do następnej części protokołu, upewnij się, że wszystkie, a także homogenizatory ze szkła odbijającego są schłodzone na lodzie.

Przygotowanie lizatu komórkowego powinno przebiegać na lodzie. Dla każdego testu ściągania RNA, który ma zostać wykonany, przygotuj jedną 15-centymetrową miskę ze zróżnicowanymi preadipocytami od trzytygodniowych myszy C57 Black Six typu dzikiego. Cztery do pięciu dni później, aby zebrać komórki, dodaj od 10 do 15 mililitrów PBF, a następnie użyj skrobaka do komórek, aby usunąć komórki z naczynia.

Przenieś je do 50-mililitrowej probówki, a następnie granuluj przez odwirowanie w temperaturze 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby zassać i wyrzucić supernatant. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w dwóch mililitrach buforu hipotonicznego i inkubuj komórki na lodzie przez piętnaście minut.

Przenieś komórki do 15-mililitrowego homogenizatora ze szkła odbijającego i ścinaj komórki mechanicznie na lodzie za pomocą 20 uderzeń. Osadzać jądra komórkowe przez odwirowanie w temperaturze 3300 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu przenieś supernatant do 1,5-mililitrowych probówek i trzymaj pelety na lodzie do późniejszego wykorzystania.

Do supernatantu dodać 3-molowy chlorek potasu, aby uzyskać końcowe stężenie 150 milimolów. Wiruj z prędkością 20 000 razy G przez 15 minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu na wierzchu pojawi się warstwa lipidowa.

Użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie go usunąć. Następnie zbierz supernatant cytoplazmatycznego lizatu komórkowego. Następnie, za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, ponownie zawiesić osad jądrowy w jednym mililitrze bufora izolacji jądrowej i przenieść do 15-mililitrowego homogenizatora ze szkła odbijanego.

Ścinaj jądra mechanicznie na lodzie za pomocą 100 uderzeń. Granulować szczątki jądrowe przez odwirowanie w temperaturze 20 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant w postaci jądrowego lizatu komórkowego.

Mogą one być łączone z lizatem cytoplazmatycznym pobranym wcześniej lub przechowywane oddzielnie do późniejszych zastosowań. W tym przypadku próbki są łączone w stosunku jeden do jednego. Dodaj inhibitor RNazy do niefrakcjonowanego lizatu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 jednostki na mikrolitr.

Następnie odłóż 100 mikrolitrów lizatu komórkowego na lodzie jako kontrolę wejściową do western blotting. Podziel lizat komórkowy na trzy równe podwielokrotności z jednym mililitrem lizatu komórkowego w każdej 1,5-mililitrowej probówce i inkubuj z ślepymi kulkami sprzężonymi RNA lucyferazy świetlika i sprzężonymi AR 3-Prime UTR przez trzy godziny w czterech stopniach Celsjusza z rotacją. Po inkubacji umieść probówki na magnesie na jedną minutę.

Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra pobrać supernatant, a następnie wyizolować RNA i ocenić nienaruszoność RNA zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym. Trzymaj granulki na lodzie. Umyj koraliki magnetyczne sześć razy.

Za każdym razem ponownie zawieś granulki kulek w jednym mililitrze bufora izolacji jądrowej zawierającego 40 jednostek inhibitora RNazy i 0,25 procent igepalu. Obracaj rurki przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki magnetyczne i supernatant.

Po jednej minucie odessać i wyrzucić supernatant, a następnie umieścić granulki kulek na lodzie. Aby wymyć kompleksy białkowe RNA z kulek do western blot, najpierw ponownie zawieś każdą pastylkę kulki w 75 mikrolitrach bufora izolacji jądrowej. Następnie dodaj 25 mikrolitrów buforu ładującego 4X western blot.

zawierających SDS, aby uzyskać całkowitą objętość 100 mikrolitrów. Na koniec gotuj koraliki w tym 100-mikrolitrowym roztworze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Przeprowadzić western blot w celu weryfikacji RBP zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym.

W tym eksperymencie fragment RNA receptora antygenowego został użyty jako przynęta do wychwycenia białka wiążącego, HuR. Zarówno przynęta RNA lucyferazy świetlika niezwiązana z białkiem HuR, jak i podwielokrotność niesprzężonych ślepych kulek streptawidyny służyły jako kontrole negatywne. Interakcje białek RNA mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie, a ten protokół pull-down może być stosowany do całkowitych lub frakcjonowanych lizatów komórek jądrowych lub cytoplazmatycznych.

Analiza metodą western blotting wykazała obecność białka HuR w niefrakcjonowanym lizacie komórkowym lub wejściu przy użyciu przeciwciała monoklonalnego. Frakcja elucji RNA receptora antygenowego również dała wynik pozytywny, wskazując na obecność białka HuR w lizacie adipocytów przy użyciu kulek sprzężonych z RNA receptora antygenowego do testu ściągania RNA. Zarówno frakcja elucyjna lucyferazy świetlika, jak i próbka ślepej kulki dały wyniki negatywne, co wskazuje, że niespecyficzne interakcje nie były wykrywalne przy użyciu tego podejścia.

Podsumowując, wyniki te sugerują, że interakcja między fragmentem RNA receptora antygenu a białkiem HuR była specyficzna. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odzyskać białka wiążące RNA z transkryptu RNA z brunatnej tkanki tłuszczowej. Po opanowaniu można to zrobić w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.